Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych
March 17th, 2023
Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.
Nasza metoda umożliwia mechanistyczne badania subkomórkowe w szybko rozwijającej się dziedzinie mechanobiologii poprzez utrwalenie tymczasowych modyfikacji białek, a następnie wykrycie ich za pomocą specyficznych przeciwciał. Ta metoda jest technicznie łatwa do zastosowania. Wyniki są bardzo ważne i powtarzalne.
Ponadto, w porównaniu z innymi technikami, nasza metoda może być naprawdę skutecznie wykorzystana w rozwijającej się dziedzinie potranslacyjnej sygnalizacji czerwonych krwinek, która jest zależna od tymczasowych modyfikacji białek, zwłaszcza mechanosygnalizacji krwinek czerwonych. Aby wykonać wiązanie białka RBC, rozcieńczyć krew pełną w stosunku jeden do dwóch w 4% roztworze paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować roztwór krwi o stężeniu 132 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant.
Zawiesić osad RBC w dwóch objętościach 0,1 molowego PBS i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwirować próbkę i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu RBC w jednej objętości 0,1 molowego PBS. Oznaczyć szkiełko mikroskopowe identyfikatorem próbki i przeciwciałem nałożonym za pomocą pisaka odpornego na alkohol.
Dodać 10 mikrolitrów przygotowanego roztworu RBC. Umieścić drugi szkiełko na próbce pod kątem 45 stopni i równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż szkiełka. Utrwal szkiełko na gorąco, unosząc próbkę nad palnikiem Bunsena ciągłym ruchem przez pięć do siedmiu sekund.
W przypadku barwienia immunohistochemicznego należy oznaczyć 2/3 obszaru szkiełka jako test i 1/3 jako kontrolę za pomocą ołówka do smarowania. Następnie umyj próbki dwukrotnie przez nałożenie TBS na 30 sekund. Po drugim myciu dodaj 0,1% trypsyny i przykryj szkiełko za pomocą specjalnie zbudowanej komory inkubacyjnej z pokrywką.
Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Napełnij zlewkę wodą z kranu i zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając wodę z kranu ze zlewki na szkiełko. Odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS.
Po ostatnim umyciu dodaj roztwór blokujący peroksydazę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% roztwór odtłuszczonego mleka i inkubuj przez 30 minut.
Po inkubacji odlej roztwór i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do obszaru testowego. Dodaj roztwór kontrolny przeciwciał do obszaru kontrolnego. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia odlej roztwór przeciwciał i przemyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% normalny roztwór surowicy koziej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 30 minut. Po inkubacji dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować przez 30 minut.
Odlej roztwór przeciwciała i umyj obszary trzykrotnie TBS przed przystąpieniem do tworzenia barwienia. Następnie, aby przeprowadzić reakcję peroksydazy chrzanowej sprzężonej z awidyną, dodaj rozcieńczony roztwór peroksydazy awidynowej i inkubuj przez 30 minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem w 200-krotnym powiększeniu i dodaj świeżo przygotowany roztwór DAB do obu obszarów.
Stale monitoruj barwienie krwinek czerwonych i zatrzymaj barwienie, usuwając roztwór DAB jednorazową pipetą, zanim tło zacznie się kolorować. Aby przeprowadzić odwodnienie próbki, umieść szkiełko w szklanym stojaku i zanurz na pięć sekund w rosnącym stężeniu etanolu, a na koniec w ksylolu. Po odwodnieniu umieść szkiełko na bibułce z krwinkami czerwonymi u góry, aby wchłonąć nadmiar płynu.
Dodać dwie lub trzy krople podłoża montażowego na szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego. W celu wizualizacji i obrazowania umieść szkiełko w mikroskopie światła przechodzącego sprzężonym z kamerą. Włącz źródło światła i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie.
W trybie jasnego pola ustaw ostrość RBC, obracając pokrętła regulacji ostrości zgrubnej i precyzyjnej. Podobnie skup się na krwinkach czerwonych w trybie fluorescencyjnym. Aby przeanalizować wartość szarości RBC, zaznacz krawędź każdego RBC za pomocą narzędzia Oval Selection Tool w oprogramowaniu ImageJ.
Za pomocą polecenia Zmierz zmierz wartości szarości 50 RBC z testu i 10 RBC z kontrolki. W celu barwienia immunofluorescencyjnego białek RBC próbkę należy inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym fluorescencyjnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. Po inkubacji odlać roztwór przeciwciała i trzykrotnie przemyć szkiełko TBS.
Pozostawić TBS na próbce po ostatnim umyciu. Odwodnić próbkę i przygotować szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym do oceny mikroskopowej, jak pokazano. Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, a następnie ustaw ostrość erytrocytów w trybie jasnego pola.
Uchwyć obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne w co najmniej trzech odrębnych obszarach obszaru testowego szkiełka wybranego losowo. Ustaw czas naświetlania na jedną sekundę dla obrazów fluorescencyjnych i zrób zdjęcie. Następnie przełącz się w tryb jasnego pola, ustaw czas ekspozycji na Auto i uchwyć odpowiedni obraz w jasnym polu.
Zapisz obrazy w formacie TIFF. Uchwyć obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu w co najmniej dwóch odrębnych, losowo wybranych obszarach obszaru kontrolnego slajdu. Zapisz obrazy w formacie TIFF, aby zachować oryginalne wartości szarości pikseli, zapobiec kompresji i przenieść metadane akwizycji.
Aby zmierzyć wartości szarości przechwyconych krwinek czerwonych, otwórz ImageJ. Zaznacz każdą komórkę za pomocą narzędzia Zaznaczanie owalne i przeanalizuj ją za pomocą polecenia Zmierz. Podświetl od trzech do pięciu obszarów wolnych od erytrocytów i określ wartości szarości, aby zmierzyć sygnał tła.
Aby przeprowadzić alternatywną analizę danych przechwyconych obrazów, należy utworzyć makropolecenie za pomocą wersji ImageJ dla Fidżi w celu automatycznego zaznaczania, korekcji tła i analizy wartości szarości danego obrazu. Otwórz obraz w formacie TIFF do analizy w Fidżi. Następnie otwórz fluorescencję RBC.
ijm i kliknij przycisk Uruchom. Sygnał przeciwciał skierowanych przeciwko syntazie tlenku azotu RBC (NOS) fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w spoczynku i w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną oceniano zarówno za pomocą immunohistochemii, jak i immunofluorescencji. Wykryto trzykrotny wzrost sygnału przeciwciał skierowanych przeciwko RBC-NOS fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną erytrocytów w porównaniu z odpowiednimi komórkami nieściętymi, gdy oceniano je metodą immunohistochemiczną lub immunofluorescencyjną.
Użytkownik musi upewnić się, że przeciwciało jest nakładane tylko na obszar testowy. W przeciwnym razie próbka nie może być analizowana z powodu brakującej kontroli. Biorąc pod uwagę dostępność szerokiej gamy przeciwciał, przy użyciu tej metody możliwe jest celowanie w wiele różnych białek i procesów sygnalizacyjnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę rejestrowania dynamicznych zmian w aktywacji białek w wyjąkowanych czerwonych krwinkach, rozwiązując problemy z zachowaniem tych zmian na potrzeby analizy. Protokół umożliwia badania mechanistyczne w dziedzinie mechanosignalingu czerwonych krwinek poprzez efektywne fiksowanie i wykrywanie tymczasowych modyfikacji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanobiologia
- Signaling czerwonych krwinek
- Modyfikacje białek
Tło
- Badanie aktywacji białek w czerwonych krwinkach jest kluczowe dla zrozumienia mechanosignalingu.
- Tymczasowe modyfikacje białek odgrywają istotną rolę w reakcjach komórkowych.
- Istniejące metody napotykają na trudności w zachowaniu dynamicznych zmian podczas analizy.
- To badanie wprowadza niezawodny protokół fiksacji i wykrywania białek.
Cel badania
- Opracowanie metody fiksacji tymczasowych modyfikacji białek w czerwonych krwinkach.
- Umożliwienie reproduktybilnej analizy aktywacji białek w odpowiedzi na bodźce.
- Promocja badań nad modyfikacjami post-translacyjnymi i mechanosignalingiem.
Zastosowane metody
- Rozcieńczanie pełnej krwi w 4% paraformaldehydzie do fiksacji.
- Centryfugacja w celu separacji składników komórkowych.
- Techniki barwienia do wykrywania specyficznych białek.
- Zastosowanie specyficznych przeciwciał do analizy.
Główne wyniki
- Metoda jest łatwa w zastosowaniu i daje ważne, reproduktybilne wyniki.
- Skuteczna w rejestrowaniu tymczasowych modyfikacji białek w czerwonych krwinkach.
- Ułatwia badania w nowej dziedzinie mechanosignalingu czerwonych krwinek.
- Demonstruje zalety w porównaniu z istniejącymi technikami w zachowaniu dynamicznych zmian.
Wnioski
- Przedstawiony protokół znacząco poprawia badania dynamiki białek w czerwonych krwinkach.
- Otwiera nowe drogi badań w dziedzinie mechanobiologii i signallingu komórkowego.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę metodę do głębszego zrozumienia funkcji czerwonych krwinek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Immunostaining-based detection of dynamic red blood cell (RBC) protein alterations enables mechanistic interrogation of transient protein modifications critical for mechanobiology and post-translational signaling research. This capability supports early-stage target validation and de-risking in discovery pipelines where acute protein activation states inform therapeutic hypotheses. The method's reproducibility and semi-quantitative outputs facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of acute protein activation states relevant to mechanotransduction and signaling pathways.
- Supports functional target validation by capturing transient post-translational modifications in RBCs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific protein responses to experimental stimuli.
- Provides semi-quantitative data for hypothesis-driven portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RBC samples for downstream screening of protein activation or inhibition.
- Standardizes antibody-based detection workflows for reproducible and comparable results.
- Enables quantitative image-based readouts suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability through protocol adaptability to different antibody targets and detection modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by enabling detection of protein changes in response to physiological or pathological stimuli.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker identification in RBCs.
- Reduces translational risk by ensuring that observed protein modifications are robust and reproducible across conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This immunostaining protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational biomarker exploration in RBC systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting specific protein activation events.
- Screening: Delivers reproducible, semi-quantitative outputs for compound or condition evaluation.
- Analytics: Provides image-based gray value measurements and background correction for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by capturing disease- or treatment-relevant protein modifications.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse antibody targets and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies by preserving transient protein states.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and detection for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by providing robust, semi-quantitative data on protein activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying biological mechanisms and reducing late-stage uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, sample preparation, and microscopy-based imaging.
- Needs access to light and fluorescence microscopy, as well as image analysis software such as ImageJ or Fiji.
- Demands rigorous control staining to account for non-specific antibody binding and background signals.
- Adaptable to various RBC protein targets and signaling pathways with appropriate antibody validation.
- Limited to semi-quantitative analysis; absolute quantification may require complementary methods.
