Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych
17 marca 2023
Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.
Nasza metoda umożliwia mechanistyczne badania subkomórkowe w szybko rozwijającej się dziedzinie mechanobiologii poprzez utrwalenie tymczasowych modyfikacji białek, a następnie wykrycie ich za pomocą specyficznych przeciwciał. Ta metoda jest technicznie łatwa do zastosowania. Wyniki są bardzo ważne i powtarzalne.
Ponadto, w porównaniu z innymi technikami, nasza metoda może być naprawdę skutecznie wykorzystana w rozwijającej się dziedzinie potranslacyjnej sygnalizacji czerwonych krwinek, która jest zależna od tymczasowych modyfikacji białek, zwłaszcza mechanosygnalizacji krwinek czerwonych. Aby wykonać wiązanie białka RBC, rozcieńczyć krew pełną w stosunku jeden do dwóch w 4% roztworze paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować roztwór krwi o stężeniu 132 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant.
Zawiesić osad RBC w dwóch objętościach 0,1 molowego PBS i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwirować próbkę i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu RBC w jednej objętości 0,1 molowego PBS. Oznaczyć szkiełko mikroskopowe identyfikatorem próbki i przeciwciałem nałożonym za pomocą pisaka odpornego na alkohol.
Dodać 10 mikrolitrów przygotowanego roztworu RBC. Umieścić drugi szkiełko na próbce pod kątem 45 stopni i równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż szkiełka. Utrwal szkiełko na gorąco, unosząc próbkę nad palnikiem Bunsena ciągłym ruchem przez pięć do siedmiu sekund.
W przypadku barwienia immunohistochemicznego należy oznaczyć 2/3 obszaru szkiełka jako test i 1/3 jako kontrolę za pomocą ołówka do smarowania. Następnie umyj próbki dwukrotnie przez nałożenie TBS na 30 sekund. Po drugim myciu dodaj 0,1% trypsyny i przykryj szkiełko za pomocą specjalnie zbudowanej komory inkubacyjnej z pokrywką.
Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Napełnij zlewkę wodą z kranu i zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając wodę z kranu ze zlewki na szkiełko. Odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS.
Po ostatnim umyciu dodaj roztwór blokujący peroksydazę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% roztwór odtłuszczonego mleka i inkubuj przez 30 minut.
Po inkubacji odlej roztwór i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do obszaru testowego. Dodaj roztwór kontrolny przeciwciał do obszaru kontrolnego. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia odlej roztwór przeciwciał i przemyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% normalny roztwór surowicy koziej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 30 minut. Po inkubacji dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować przez 30 minut.
Odlej roztwór przeciwciała i umyj obszary trzykrotnie TBS przed przystąpieniem do tworzenia barwienia. Następnie, aby przeprowadzić reakcję peroksydazy chrzanowej sprzężonej z awidyną, dodaj rozcieńczony roztwór peroksydazy awidynowej i inkubuj przez 30 minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem w 200-krotnym powiększeniu i dodaj świeżo przygotowany roztwór DAB do obu obszarów.
Stale monitoruj barwienie krwinek czerwonych i zatrzymaj barwienie, usuwając roztwór DAB jednorazową pipetą, zanim tło zacznie się kolorować. Aby przeprowadzić odwodnienie próbki, umieść szkiełko w szklanym stojaku i zanurz na pięć sekund w rosnącym stężeniu etanolu, a na koniec w ksylolu. Po odwodnieniu umieść szkiełko na bibułce z krwinkami czerwonymi u góry, aby wchłonąć nadmiar płynu.
Dodać dwie lub trzy krople podłoża montażowego na szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego. W celu wizualizacji i obrazowania umieść szkiełko w mikroskopie światła przechodzącego sprzężonym z kamerą. Włącz źródło światła i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie.
W trybie jasnego pola ustaw ostrość RBC, obracając pokrętła regulacji ostrości zgrubnej i precyzyjnej. Podobnie skup się na krwinkach czerwonych w trybie fluorescencyjnym. Aby przeanalizować wartość szarości RBC, zaznacz krawędź każdego RBC za pomocą narzędzia Oval Selection Tool w oprogramowaniu ImageJ.
Za pomocą polecenia Zmierz zmierz wartości szarości 50 RBC z testu i 10 RBC z kontrolki. W celu barwienia immunofluorescencyjnego białek RBC próbkę należy inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym fluorescencyjnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. Po inkubacji odlać roztwór przeciwciała i trzykrotnie przemyć szkiełko TBS.
Pozostawić TBS na próbce po ostatnim umyciu. Odwodnić próbkę i przygotować szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym do oceny mikroskopowej, jak pokazano. Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, a następnie ustaw ostrość erytrocytów w trybie jasnego pola.
Uchwyć obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne w co najmniej trzech odrębnych obszarach obszaru testowego szkiełka wybranego losowo. Ustaw czas naświetlania na jedną sekundę dla obrazów fluorescencyjnych i zrób zdjęcie. Następnie przełącz się w tryb jasnego pola, ustaw czas ekspozycji na Auto i uchwyć odpowiedni obraz w jasnym polu.
Zapisz obrazy w formacie TIFF. Uchwyć obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu w co najmniej dwóch odrębnych, losowo wybranych obszarach obszaru kontrolnego slajdu. Zapisz obrazy w formacie TIFF, aby zachować oryginalne wartości szarości pikseli, zapobiec kompresji i przenieść metadane akwizycji.
Aby zmierzyć wartości szarości przechwyconych krwinek czerwonych, otwórz ImageJ. Zaznacz każdą komórkę za pomocą narzędzia Zaznaczanie owalne i przeanalizuj ją za pomocą polecenia Zmierz. Podświetl od trzech do pięciu obszarów wolnych od erytrocytów i określ wartości szarości, aby zmierzyć sygnał tła.
Aby przeprowadzić alternatywną analizę danych przechwyconych obrazów, należy utworzyć makropolecenie za pomocą wersji ImageJ dla Fidżi w celu automatycznego zaznaczania, korekcji tła i analizy wartości szarości danego obrazu. Otwórz obraz w formacie TIFF do analizy w Fidżi. Następnie otwórz fluorescencję RBC.
ijm i kliknij przycisk Uruchom. Sygnał przeciwciał skierowanych przeciwko syntazie tlenku azotu RBC (NOS) fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w spoczynku i w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną oceniano zarówno za pomocą immunohistochemii, jak i immunofluorescencji. Wykryto trzykrotny wzrost sygnału przeciwciał skierowanych przeciwko RBC-NOS fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną erytrocytów w porównaniu z odpowiednimi komórkami nieściętymi, gdy oceniano je metodą immunohistochemiczną lub immunofluorescencyjną.
Użytkownik musi upewnić się, że przeciwciało jest nakładane tylko na obszar testowy. W przeciwnym razie próbka nie może być analizowana z powodu brakującej kontroli. Biorąc pod uwagę dostępność szerokiej gamy przeciwciał, przy użyciu tej metody możliwe jest celowanie w wiele różnych białek i procesów sygnalizacyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę rejestrowania dynamicznych zmian w aktywacji białek w enukleowanych erytrocytach, rozwiązując problemy związane z utrwaleniem tych zmian na potrzeby analizy. Protokół ten umożliwia badania mechanistyczne mechanosygnalizacji w erytrocytach poprzez skuteczną fiksację i detekcję przejściowych modyfikacji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanobiologia
- Sygnalizacja w erytrocytach
- Modyfikacje białek
Wstęp
- Badanie aktywacji białek w erytrocytach jest kluczowe dla zrozumienia mechanotransdukcji.
- Tymczasowe modyfikacje białek odgrywają istotną rolę w odpowiedziach komórkowych.
- Istniejące metody napotykają trudności w zachowaniu dynamicznych zmian podczas analizy.
- Niniejsze badanie wprowadza niezawodny protokół utrwalania i detekcji białek.
Cel badania
- Opracowanie metody utrwalania przejściowych modyfikacji białek w erytrocytach.
- Umożliwienie powtarzalnej analizy aktywacji białek w odpowiedzi na bodźce.
- Rozwój badań nad modyfikacjami potranslacyjnymi i mechanosygnalizacją.
Zastosowane metody
- Rozcieńczanie krwi pełnej w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia.
- Wirowanie w celu oddzielenia składników komórkowych.
- Techniki barwienia do detekcji specyficznych białek.
- Zastosowanie specyficznych przeciwciał do analizy.
Główne wyniki
- Metoda jest łatwa w zastosowaniu i daje wiarygodne, powtarzalne wyniki.
- Skuteczna w wychwytywaniu przejściowych modyfikacji białek w erytrocytach.
- Ułatwia badania w rozwijającej się dziedzinie mechanosygnalizacji erytrocytów.
- Wykazuje przewagę nad istniejącymi technikami w zachowaniu zmian dynamicznych.
Wnioski
- Przedstawiony protokół znacząco usprawnia badanie dynamiki białek w erytrocytach.
- Otwiera on nowe kierunki badań w dziedzinie mechanobiologii i sygnalizacji komórkowej.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do uzyskania głębszego wglądu w funkcje erytrocytów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykrywanie dynamicznych zmian białek w czerwonych krwinkach (RBC) oparte na barwieniu immunologicznym umożliwia mechanistyczną analizę przejściowych modyfikacji białek, które są kluczowe dla badań nad mechanobiologią i sygnalizacją potranslacyjną. Możliwość ta wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka w procesach odkrywania leków, w których ostre stany aktywacji białek stanowią podstawę hipotez terapeutycznych. Powtarzalność tej metody oraz półilościowe wyniki ułatwiają rzetelną selekcję projektów z portfela oraz porównywalność między różnymi programami badawczymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia wykrywanie ostrych stanów aktywacji białek istotnych dla mechanotransdukcji i szlaków sygnalizacyjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wychwytywanie przejściowych modyfikacji potranslacyjnych w RBC.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie specyficznych odpowiedzi białek na bodźce eksperymentalne.
- Dostarcza danych półilościowych dla decyzji dotyczących rozwoju portfolio opartych na hipotezach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki RBC do dalszego przesiewowego badania aktywacji lub inhibicji białek.
- Standaryzuje procesy detekcji oparte na przeciwciałach w celu uzyskania powtarzalnych i porównywalnych wyników.
- Umożliwia ilościowe odczyty obrazowe odpowiednie do opracowania i optymalizacji testów.
- Wspiera skalowalność dzięki możliwości dostosowania protokołu do różnych celów przeciwciał i modalności detekcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera badania nad mechanizmami powiązany z chorobami, umożliwiając wykrywanie zmian białek w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne lub patologiczne.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie identyfikacji biomarkerów w RBC.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, zapewniając, że obserwowane modyfikacje białek są stabilne i powtarzalne w różnych warunkach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół immunobarwienia wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne badania mechanistyczne, opracowywanie testów oraz poszukiwanie biomarkerów translacyjnych w układach RBC.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wykrywanie specyficznych zdarzeń aktywacji białek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, półilościowe wyniki do oceny związków lub warunków doświadczalnych.
- Analityka: Zapewnia pomiary wartości szarości na podstawie obrazów oraz korekcję tła w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez rejestrację modyfikacji białek istotnych dla choroby lub leczenia.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Oferuje elastyczną platformę, którą można dostosować do różnych celów przeciwciał oraz pytań dotyczących mechanizmów działania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i badaniach mechanistycznych poprzez zachowanie przejściowych stanów białek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i detekcję w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu solidnych, półilościowych danych na temat aktywacji białek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez wyjaśnienie mechanizmów biologicznych i redukcję niepewności na późnych etapach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w doborze przeciwciał, przygotowaniu próbek oraz obrazowaniu mikroskopowym.
- Wymaga dostępu do mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej, a także oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ lub Fiji.
- Wymaga rygorystycznego barwienia kontrolnego w celu uwzględnienia niespecyficznego wiązania przeciwciał oraz sygnałów tła.
- Metoda jest dostosowalna do różnych białek docelowych RBC i szlaków sygnalizacyjnych, pod warunkiem odpowiedniej walidacji przeciwciał.
- Ograniczona do analizy półilościowej; ilościowanie bezwzględne może wymagać zastosowania metod komplementarnych.
