Name: Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę immunologicznego wykrywania dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych. Technika umożliwia badanie mechanosygnałowania i modyfikacji białkowych w erytrocytach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LK dziękuje za wsparcie Programu Szkolenia Badawczego Rządu Australijskiego.

<ol><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li>
<li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+%28RBC%29+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li>
<li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+red+blood+cells+die%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">How do red blood cells die?</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393(2021).</li>
<li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells%3A+organelle+clearance+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076(2017).</li>
<li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells%3A+chasing+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945(2019).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li>
<li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218(2020).</li>
<li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+%26%2334%3Bsignatures%26%2334%3B+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &#34;signatures&#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li>
<li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+organization+of+a+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103(2022).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity%2C+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982(2012).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36(2019).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759(2013).</li>
<li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+vasodilation+and+the+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li>
<li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+exercise+induces+changes+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+pattern+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+red+blood+cell+deformability+is+independent+of+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).</li>
<li>Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47(2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+NOS%3A+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li>
<li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li>
<li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+deformability%2C+vasoactive+mediators%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417(2019).</li>
<li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease%3A+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206(2015).</li>
<li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li>
<li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li>
<li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology%3A+Impact+on+RBC+deformability%2C+oxidative+stress%2C+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li>
<li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li>
<li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans%3A+a+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36(2021).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813(2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Nitric+Oxide+Research%22">Methods in Nitric Oxide Research</a>. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).</li>
<li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+red+blood+cells+at+work%3A+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%3E%22%5BJournal%5D)">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy ujawnili, że nie ma konfliktu interesów.

Najnowsza literatura wysoce sugeruje, że białko RBC-NOS ma kluczowe znaczenie dla regulacji odkształcalności RBC 15,22,23, co z kolei ułatwia ich przejście przez wąskie naczynia włosowate 24. Aktywność białek w dużym stopniu zależy od potranslacyjnych modyfikacji białek, w szczególności od fosforylacji niektórych reszt18. W centrum zainteresowania znajduje się miejsce fosforylacji ...

Czerwone krwinki (RBC) przechodzą przez układ sercowo-naczyniowy przez 70 do 140 dni, przy średnim wieku RBC wynoszącym około 115 dni1,2. Starcze lub uszkodzone erytrocyty są usuwane z krążenia przez erytrofagocytozę, skuteczny proces oczyszczania napędzany przez makrofagi3. Z góry określona długość życia tych komórek jest jedną z konsekwencji rezygnacji z organelli komórkowych, w tym jądra, mitochondriów i rybosomów, podczas różnicowania i dojrzewania4. W związku z tym krążące erytrocyty są pozbawione maszynerii translacyjnej, co wyklucza syntezę nowych białek3. Wynika z tego, że dynamiczne, potranslacyjne modyfikacje istniejących białek stanowią jedyny realny mechanizm ostrej, biochemicznej regulacji w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe stresory działające na RBC5.
Siły mechaniczne wydają się być głównymi sygnałami zewnątrzkomórkowymi, które powodują aktywację lub modulację szlaków biochemicznych w krwinkach czerwonych. Odkrycie mechanowrażliwego białka, Piezo1, w błonach RBC6 zainspirowało kilka linii badań nad mechanicznie aktywowaną sygnalizacją w tych komórkach7. Na przykład ostatnie postępy wykazały, że właściwości fizyczne erytrocytów są aktywnie regulowane przez ostre i dynamiczne zmiany białek8, co obejmuje fosforylację potranslacyjną i ubikwitynację9. Ponieważ te normalne modyfikacje różnią się w zależności od niektórych chorób9,10,11, wydaje się, że określenie stanu aktywacji białek RBC, szczególnie w odniesieniu do procesów mechanobiologicznych, wydaje się być interesujące naukowo i klinicznie.
Określenie ostrych zmian w stanach aktywacji białka RBC stanowi pewne wyzwanie metodologiczne. Na przykład przechowywanie próbek RBC do późniejszej analizy wymaga zachowania zmodyfikowanych białek RBC, ponieważ modyfikacje potranslacyjne są nietrwałe. Co więcej, klasyczne metody wykrywania białek (np. western blotting) są notorycznie trudne do standaryzacji w krwinkach czerwonych ze względu na niską obfitość białek w stosunku do hemoglobiny, która stanowi ~98% zawartości białka w tych komórkach12. W związku z tym barwienie chemicznie konserwowanych erytrocytów na podstawie przeciwciał było metodą z wyboru podczas badania ostrych modyfikacji ważnych białek RBC, takich jak specyficzna dla RBC izoforma syntazy tlenku azotu (RBC-NOS)13,14. Wykazano, że RBC-NOS enzymatycznie wytwarza tlenek azotu (NO), który wydaje się niezbędny dla podstawowych właściwości RBC, w tym odkształcalności RBC15,16,17. Potranslacyjne modyfikacje RBC-NOS regulują aktywność enzymów katalitycznych, przy czym fosforylacja reszty seryny 1177 jest opisana w celu zwiększenia aktywności enzymu, podczas gdy fosforylacja reszt seryny 114 lub treoniny 495 została powiązana ze zmniejszoną aktywnością RBC-NOS18,19.
Łącznie, tymczasowe modyfikacje białek RBC przyczyniają się do ważnych funkcji komórkowych, a standaryzowane protokoły, które umożliwiają wykrywanie tych zmodyfikowanych białek, mają wysoką wartość. W tym miejscu przedstawiamy dwa odrębne protokoły, które wykorzystują specyficzne przeciwciała w celu ułatwienia wykrywania aktywacji białka RBC-NOS oraz omawiamy zalecenia dotyczące analizy i interpretacji danych.
Wydajność opisanych protokołów została oceniona poprzez pomiar dobrze opisanego wzrostu fosforylacji RBC-NOS przy reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na siły mechaniczne odzwierciedlające te występujące w ludzkim układzie naczyniowym (5 Pa).

<table><tbody><tr><td>3,3&prime;-diaminobenzydyna-tetrachlorowodorek hydrat</td><td>Sigma/Merck</td><td>D5637</td><td>DAB</td></tr><tr><td>Chlorek amonu&nbsp;</td><td>Wirówka Merck /Millipore</td><td>101145</td><td>NH4Cl</td></tr><tr><td>5427 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5409000010</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-0147&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-sodowy dwuwodny&nbsp;</td><td>Merck /Millipore</td><td>106580</td><td>Na2HPO4. 2 H2O</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>VWR</td><td>612-6803</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck /Millipore</td><td>107961</td><td>medium do szybkiego montażu do mikroskopii</td></tr><tr><td>Etanol denaturowany przy użyciu 1 % ketonu metylowo-etylowego (MEK)</td><td>Hofmann</td><td>642</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma/Merck</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Ołówek do smarowania&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S 2002</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanu/ExtrAvidin&minus; Peroksydaza</td><td>Sigma/Merck</td><td>E-2886</td><td>HRP</td></tr><tr><td>Kwas solny&nbsp;</td><td>Merck /Millipore</td><td>109057</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td><td>Merck /Millipore</td><td>107203</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Darmowe</td><td></td><td></td>oprogramowanie</tr><tr><td>Laserowy analizator optycznych komórek rotacyjnych (LORCA)</td><td>RR Mechatronik</td><td></td><td>Ektacytometr używany do ścinania</td></tr><tr><td>metanolu</td><td>Merck /Millipore</td><td></td><td></td>106009</tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan niklu(II) sześciowodny&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>N4882</td><td>NiSO4.6H2O</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Agilent/DAKO</td><td>X0907</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck /Pipety Millipore</td><td>818715</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Eppendorf Reference 2</td><td>VWR</td><td>613-5836/ 613-5839</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-fosfo eNOS (Ser1177)</td><td>Merck/Millipore</td><td>07-428-I</td> Probówki reakcyjne <td>przeciwciał pierwotnych</td></tr><tr><td>, 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne koza anty królik</td><td>Agilent/DAKO</td><td>E0432</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Merck /Millipore 106404</td><td></td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Monohydrat diwodorofosforanu sodu</td><td>Merck /Millipore</td><td>106346</td><td>NaH2PO4. H2O</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 1 M</td><td>Merck /Milipore</td><td>150706</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan</td><td>Merck /Millipore</td><td>108382</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma/Merck</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td>Filtr z mikrofibry <td>Merck /Millipore</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Glas, jakość GF/F</td><td>Merck /Millipore</td><td>WHA1825047</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR Chemicals</td><td>2,89,73,465</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-D-Glukoza monohydrat</td><td>Merck /Millipore</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr></tbody></table>

immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

Oznaczanie przeciwciałami białek krwinek czerwonych (RBC) jest powszechnie stosowaną, półilościową metodą wykrywania zmian w ogólnej zawartości białka lub ostrych zmian w stanach aktywacji białek. Ułatwia ocenę leczenia erytrocytami, charakterystykę różnic w niektórych stanach chorobowych oraz opis koherencji komórkowych. Wykrycie gwałtownie zmienionej aktywacji białka (np. poprzez mechanotransdukcję) wymaga odpowiedniego przygotowania próbki, aby zachować tymczasowe modyfikacje białek. Podstawowa zasada obejmuje unieruchomienie docelowych miejsc wiązania pożądanych białek RBC, aby umożliwić początkowe wiązanie określonych przeciwciał pierwotnych. Próbka jest dalej przetwarzana w celu zagwarantowania optymalnych warunków wiązania przeciwciała drugorzędowego z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym. Wybór niefluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych wymaga dodatkowego traktowania, w tym sprzężenia biotyny-awidyny i zastosowania tetrachlorowodorku 3,3-diaminobenzydyny (DAB) w celu uzyskania barwienia, które należy kontrolować w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, aby zatrzymać utlenianie, a tym samym intensywność barwienia, na czas. W celu wykrycia intensywności barwienia obrazy są wykonywane za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego. W modyfikacji tego protokołu można zamiast tego zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoresceiną, co ma tę zaletę, że nie jest konieczny żaden dalszy etap rozwoju. Procedura ta wymaga jednak obiektywu fluorescencyjnego przymocowanego do mikroskopu w celu wykrywania barwienia. Biorąc pod uwagę półilościowy charakter tych metod, konieczne jest zapewnienie kilku barwień kontrolnych w celu uwzględnienia nieswoistych reakcji przeciwciał i sygnałów tła. Przedstawiamy tutaj zarówno protokoły barwienia, jak i odpowiadające im procesy analityczne, aby porównać i omówić odpowiednie wyniki i zalety różnych technik barwienia.

Przedstawiony protokół, opisujący metody ułatwiające wykrywanie ostrych zmian w białkach erytrocytów (RBC), został przetestowany na dobrze znanej mechanicznie wrażliwej modyfikacji białka: fosforylacji RBC-NOS w reszcie seryny 1177. Krew pełną pobrano od zdrowych ochotników, a następnie podzielono na dwie oddzielne alikwoty. Wybraną próbkę krwi poddano mechanicznemu naprężeniu ścinającemu o wartości fizjologicznej (5 Pa) przez 300 s, co w badaniach wcześniej wykazano jako czynnik indukujący fosforylację RBC-NOS w serynie...

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Nasza metoda umożliwia mechanistyczne badania subkomórkowe w szybko rozwijającej się dziedzinie mechanobiologii poprzez utrwalenie tymczasowych modyfikacji białek, a następnie wykrycie ich za pomocą specyficznych przeciwciał. Ta metoda jest technicznie łatwa do zastosowania. Wyniki są bardzo ważne i powtarzalne.Ponadto, w porównaniu z innymi technikami, nasza metoda może być naprawdę skutecznie wykorzystana w rozwijającej się dziedzinie potranslacyjnej sygnalizacji czerwonych krwinek, która jest zależna od tymczasowych modyfikacji białek, zwłaszcza mechanosygnalizacji krwinek czerwonych. Aby wykonać wiązanie białka RBC, rozcieńczyć krew pełną w stosunku jeden do dwóch w 4% roztworze paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować roztwór krwi o stężeniu 132 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant.Zawiesić osad RBC w dwóch objętościach 0,1 molowego PBS i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwirować próbkę i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu RBC w jednej objętości 0,1 molowego PBS. Oznaczyć szkiełko mikroskopowe identyfikatorem próbki i przeciwciałem nałożonym za pomocą pisaka odpornego na alkohol.Dodać 10 mikrolitrów przygotowanego roztworu RBC. Umieścić drugi szkiełko na próbce pod kątem 45 stopni i równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż szkiełka. Utrwal szkiełko na gorąco, unosząc próbkę nad palnikiem Bunsena ciągłym ruchem przez pięć do siedmiu sekund.W przypadku barwienia immunohistochemicznego należy oznaczyć 2/3 obszaru szkiełka jako test i 1/3 jako kontrolę za pomocą ołówka do smarowania. Następnie umyj próbki dwukrotnie przez nałożenie TBS na 30 sekund. Po drugim myciu dodaj 0,1% trypsyny i przykryj szkiełko za pomocą specjalnie zbudowanej komory inkubacyjnej z pokrywką.Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Napełnij zlewkę wodą z kranu i zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając wodę z kranu ze zlewki na szkiełko. Odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS.Po ostatnim umyciu dodaj roztwór blokujący peroksydazę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odlej roztwór i umyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% roztwór odtłuszczonego mleka i inkubuj przez 30 minut.Po inkubacji odlej roztwór i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do obszaru testowego. Dodaj roztwór kontrolny przeciwciał do obszaru kontrolnego. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia odlej roztwór przeciwciał i przemyj oba obszary trzykrotnie TBS. Następnie dodaj 3% normalny roztwór surowicy koziej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 30 minut. Po inkubacji dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować przez 30 minut.Odlej roztwór przeciwciała i umyj obszary trzykrotnie TBS przed przystąpieniem do tworzenia barwienia. Następnie, aby przeprowadzić reakcję peroksydazy chrzanowej sprzężonej z awidyną, dodaj rozcieńczony roztwór peroksydazy awidynowej i inkubuj przez 30 minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem w 200-krotnym powiększeniu i dodaj świeżo przygotowany roztwór DAB do obu obszarów.Stale monitoruj barwienie krwinek czerwonych i zatrzymaj barwienie, usuwając roztwór DAB jednorazową pipetą, zanim tło zacznie się kolorować. Aby przeprowadzić odwodnienie próbki, umieść szkiełko w szklanym stojaku i zanurz na pięć sekund w rosnącym stężeniu etanolu, a na koniec w ksylolu. Po odwodnieniu umieść szkiełko na bibułce z krwinkami czerwonymi u góry, aby wchłonąć nadmiar płynu.Dodać dwie lub trzy krople podłoża montażowego na szkiełko nakrywkowe i przykryć szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego. W celu wizualizacji i obrazowania umieść szkiełko w mikroskopie światła przechodzącego sprzężonym z kamerą. Włącz źródło światła i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie.W trybie jasnego pola ustaw ostrość RBC, obracając pokrętła regulacji ostrości zgrubnej i precyzyjnej. Podobnie skup się na krwinkach czerwonych w trybie fluorescencyjnym. Aby przeanalizować wartość szarości RBC, zaznacz krawędź każdego RBC za pomocą narzędzia Oval Selection Tool w oprogramowaniu ImageJ.Za pomocą polecenia Zmierz zmierz wartości szarości 50 RBC z testu i 10 RBC z kontrolki. W celu barwienia immunofluorescencyjnego białek RBC próbkę należy inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym fluorescencyjnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. Po inkubacji odlać roztwór przeciwciała i trzykrotnie przemyć szkiełko TBS.Pozostawić TBS na próbce po ostatnim umyciu. Odwodnić próbkę i przygotować szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym do oceny mikroskopowej, jak pokazano. Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, a następnie ustaw ostrość erytrocytów w trybie jasnego pola.Uchwyć obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne w co najmniej trzech odrębnych obszarach obszaru testowego szkiełka wybranego losowo. Ustaw czas naświetlania na jedną sekundę dla obrazów fluorescencyjnych i zrób zdjęcie. Następnie przełącz się w tryb jasnego pola, ustaw czas ekspozycji na Auto i uchwyć odpowiedni obraz w jasnym polu.Zapisz obrazy w formacie TIFF. Uchwyć obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu w co najmniej dwóch odrębnych, losowo wybranych obszarach obszaru kontrolnego slajdu. Zapisz obrazy w formacie TIFF, aby zachować oryginalne wartości szarości pikseli, zapobiec kompresji i przenieść metadane akwizycji.Aby zmierzyć wartości szarości przechwyconych krwinek czerwonych, otwórz ImageJ. Zaznacz każdą komórkę za pomocą narzędzia Zaznaczanie owalne i przeanalizuj ją za pomocą polecenia Zmierz. Podświetl od trzech do pięciu obszarów wolnych od erytrocytów i określ wartości szarości, aby zmierzyć sygnał tła.Aby przeprowadzić alternatywną analizę danych przechwyconych obrazów, należy utworzyć makropolecenie za pomocą wersji ImageJ dla Fidżi w celu automatycznego zaznaczania, korekcji tła i analizy wartości szarości danego obrazu. Otwórz obraz w formacie TIFF do analizy w Fidżi. Następnie otwórz fluorescencję RBC.ijm i kliknij przycisk Uruchom. Sygnał przeciwciał skierowanych przeciwko syntazie tlenku azotu RBC (NOS) fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w spoczynku i w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną oceniano zarówno za pomocą immunohistochemii, jak i immunofluorescencji. Wykryto trzykrotny wzrost sygnału przeciwciał skierowanych przeciwko RBC-NOS fosforylowanych na reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na ekspozycję na siłę mechaniczną erytrocytów w porównaniu z odpowiednimi komórkami nieściętymi, gdy oceniano je metodą immunohistochemiczną lub immunofluorescencyjną.Użytkownik musi upewnić się, że przeciwciało jest nakładane tylko na obszar testowy. W przeciwnym razie próbka nie może być analizowana z powodu brakującej kontroli. Biorąc pod uwagę dostępność szerokiej gamy przeciwciał, przy użyciu tej metody możliwe jest celowanie w wiele różnych białek i procesów sygnalizacyjnych.

immunostaining-based-detection-dynamic-alterations-red-blood-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Poznaj metodę immunologicznego wykrywania dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych. Technika umożliwia badanie mechanosygnałowania i modyfikacji białkowych w erytrocytach.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Przeglądaj więcej filmów