Test bakteriobójczy surowicy na działanie bakteriobójcze przeciwciał za pośrednictwem dopełniacza

Weź seryjnie rozcieńczoną próbkę surowicy zawierającą przeciwciała monoklonalne przeciwko lipopolisacharydom lub LPS - składnikowi błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych.

Wprowadź bakterie Gram-ujemne. Przeciwciała w surowicy wiążą się z bakteryjnym LPS.

Dodaj białka dopełniacza. Kompleks C1 wiąże się z przeciwciałami związanymi z LPS, tworząc enzymatycznie aktywny C1.

Aktywowany C1 rozszczepia C4 i C2, tworząc konwertazę C3, która z kolei rozszczepia C3, tworząc konwertazę C5. Konwertaza rozszczepia C5, aby wytworzyć C5b, który rekrutuje C6 i C7. Powstały kompleks wstawia się do błony zewnętrznej i wiąże się z C8 i wieloma C9, tworząc pory.

Uszkodzenie błony zewnętrznej destabilizuje błonę wewnętrzną, powodując lizę komórek.

Umieść mieszaninę na talerzu agarowym i rozprowadź. Inkubuj w celu wzrostu bakterii. Na płytkę nałożyć agar zawierający chlorek trifenylotetrazolu lub TTC, który ulega redukcji przez dehydrogenazy mikrobiologiczne, nadając koloniom bakteryjnym czerwony kolor.

Liczba kolonii wzrasta wraz z rozcieńczeniem próbki, co wskazuje na zmniejszoną aktywność bakteriobójczą przy niższym stężeniu przeciwciał.

Na początek należy inkubować próbki w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby inaktywować próbki testowe pod wpływem ciepła. Uzyskać płytkę do oznaczania i 20 mikrolitrów buforu do oznaczania w kolumnach od 1 do 12 w wierszach od A do G. Dodać 20 mikrolitrów buforu do oznaczania do kolumn 1 i 2 wiersza H. Załadować 30 mikrolitrów każdej próbki testowej w dwóch egzemplarzach do rzędu H płytki do oznaczania.

Aby rozpocząć wykonywanie trzykrotnych seryjnych rozcieńczeń badanych próbek, należy użyć pipety wielokanałowej, aby usunąć 10 mikrolitrów z dołków od 3H do 12H. Przenieś próbki do odpowiednich dołków w rzędzie G i pipetuj w górę iw dół 8 do 10 razy, aby dobrze wymieszać próbkę. Następnie wyjmij 10 mikrolitrów z tych studzienek, przenieś do odpowiednich studzienek w rzędzie F i pipetuj w górę iw dół 8 do 10 razy, aby wymieszać. Kontynuować ten proces seryjnego rozcieńczania w wierszu A. Po wymieszaniu studzienek w rzędzie A wyjąć i wyrzucić 10 mikrolitrów z dołków od 3A do 12A, tak aby końcowa objętość we wszystkich studzienkach wynosiła 20 mikrolitrów.

Pobrać jedną fiolkę z zamrożonym docelowym bulionem bakteryjnym i rozmrozić ją w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć bakterie w 20 ml buforu do oznaczania zgodnie z wcześniej ustalonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych bakterii do każdej studzienki płytki testowej.

Pobrać jedną fiolkę z zamrożonym dopełniaczem dla młodego królika i jedną fiolkę z mrożonym, inaktywowanym termicznie BRC. Użyj zimnej bieżącej wody, aby rozmrozić fiolki do temperatury pokojowej. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów ciepła i inaktywowanego termicznie BRC z 400 mikrolitrami buforu testowego. Dodaj 50 mikrolitrów tego 20% inaktywowanego termicznie roztworu BRC do wszystkich studzienek w kolumnie 1. Wymieszaj 1 mililitr natywnego BRC z 4 mililitrami buforu testowego. Dodaj 50 mikrolitrów tej 20% mieszaniny do wszystkich studzienek w kolumnach od 2 do 12. Umieścić płytkę na wytrząsarce na 10 do 15 sekund, aby delikatnie wymieszać płytkę testową.

Inkubować płytkę testową w inkubatorze mikrobiologicznym przez dwie godziny. W międzyczasie zdejmij pokrywki z dwóch płytek agarowych LB i umieść płytki stroną zadrukowaną do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40 do 60 minut do wyschnięcia. Po zakończeniu inkubacji przenieść płytkę testową na mokry lód i inkubować przez 10 do 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Za pomocą 12-kanałowej pipety wymieszać studzienki w rzędzie H i umieścić punktowo 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na dnie płytki LBA. Natychmiast przechyl płytkę i pozwól plamom biegać przez około 1,5 do 2 centymetrów.

Powtórz tę procedurę dla rzędów G, F i E, dostrzegając je powyżej poprzedniego rzędu. Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej, aż roztwór zostanie wchłonięty przez płytki LBA. Następnie połóż pokrywki na płytkach i przenieś je do góry nogami do inkubatora mikrobiologicznego w celu inkubacji przez noc.

Następnego dnia dodaj 25 ml agaru nakładkowego w temperaturze 55 stopni Celsjusza zawierającego 100 mikrogramów na mililitr TTC i 0,1% azydku sodu do każdej płytki LBA. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby bakterie, które przeżyły, mogły rozwinąć czerwony kolor. Następnie użyj aparatu cyfrowego, aby sfotografować płyty. Prześlij obrazy do komputera i użyj zintegrowanego oprogramowania do liczenia kolonii NIST, aby przeanalizować obrazy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.