Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i strawienie ścian komórkowych bakterii w celu określenia tożsamości i względnych frakcji różnych neuropeptydów. Za pomocą analizy UPLC osiąga się to poprzez pierwszą lizę próbek bakteryjnych przez gotowanie w ekolsiarczanie sodu. Po wypłukaniu SDS drugim krokiem jest trawienie próbek za pomocą pronazy E w celu oczyszczenia zewnętrznej błony z bakterii Gram-ujemnych.

Następnie próbki są trawione z mease w celu rozpuszczenia peptydoglikanu na poszczególne neuropeptydy. Ostatnim krokiem jest redukcja neuropeptydów i dostosowanie pH do punktu izoelektrycznego neuropeptydu. Ostatecznie UPLC służy do rozdzielania neuropeptydów w zależności od wielkości i hydrofobowości, ułatwiając ilościowe określenie ważnych cech ściany komórkowej, takich jak stopień usieciowania i średnia długość nici glikanu.

Metoda ta może pomóc w ujawnieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, takie jak związki między morfogenezą, architekturą ściany komórkowej, aktywacją układu odpornościowego i patogenezą. Chociaż metoda ta została opracowana w celu oczyszczenia Gram-ujemnego glikanu peptydylu, może być również stosowana do bakterii Gram-dodatnich z dodatkiem kilku enzymów i zabiegów chemicznych Aby ponownie wyhodować kultury bakteryjne, rozcieńcz kultury przez noc od jednego do 100 do 250 mililitrów świeżej pożywki i osiągnij pożądaną gęstość optyczną przy 600 nanometrach, podczas gdy rozcieńczone kultury rosną. Ustaw wrzącą łaźnię wodną na gorącej płycie w litrowej zlewce.

Gdy woda się zagotuje, podlej sześć mililitrów 6% siarczanu sodu dylu lub SDS do 50-mililitrowych probówek polipropylenowych. Dodaj jedną małą mieszadło do każdej probówki i mocno dokręć palcami pokrywki tubki. Umieść rurki we wrzącej łaźni wodnej i mieszaj z prędkością 500 obr./min na płycie grzejnej.

Zbierz 250 mililitrowych kultur, wirując z prędkością 5 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w trzech mililitrach pożywki lub jednym x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej. Powoli pipetować zawiesiny komórek do 50-mililitrowych probówek z 6% wrzącym SDS, aby unieruchomić komórki, podczas gdy probówki są zanurzone we wrzącej kąpieli wodnej i ponownie zamknij pokrywki, aby dokręcić palce.

Przykryj wrzącą łaźnię wodną i pozwól komórkom wrzeć przez trzy godziny, okresowo sprawdzając poziom wody i uzupełniając łaźnię wodną w razie potrzeby. Po trzech godzinach wyłącz ogień na gorącej płycie i kontynuuj mieszanie przez noc z prędkością 500 obr./min. Jeśli SDS wytrącił się w 50-mililitrowych probówkach przez noc, ustaw łaźnię wodną na wrzenie przez dodatkową jedną do dwóch godzin.

Pokazano tutaj, jak powinna wyglądać normalna kultura po nocnej lizie. W SDS zwróć uwagę na przezroczystość, a nie nieprzezroczystość, która koreluje z opadami. Przygotuj bufor leżący e i aktywuj leżący E w temperaturze 60 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez co najmniej 30 minut.

Użyj ultrawirówki ustawionej na 400 000 razy G, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia dużych glikanów peptolowych lub makrocząsteczek PG, a tym samym oczyszczenia ich z innych składników komórkowych. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, a następnie ponownie zawiesić każdą osadkę w temperaturze pokojowej. Objętość zawiesiny resusowej wody ultraczystej zależy od objętości użytych probówek ultrawirówek.

Użyj objętości, która wypełnia probówki co najmniej do połowy, ale nie przekracza maksymalnej objętości rurek. Powtarzaj wirowanie i mycie, aż woda nie utworzy pęcherzyków podczas zawiesiny Resus, co oznacza, że SDS został w tym momencie całkowicie usunięty. Resus zawiesić próbki w 900 mikrolitrach buforu tris HCL i przenieść do dwóch mililitrowych probówek uprzednio przebitych otworami w górach.

Za pomocą małej igły dodaj 100 mikrolitrów aktywowanej pronazy E do każdej próbki przed inkubacją w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Zatrzymaj podatną niestrawność, dodając 200 mikrolitrów 6% SDS do każdej próbki i gotuj próbki w bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut. Tak jak poprzednio, użyj ultrawirówki ustawionej na 400 000 razy G, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przemyć ultraczystą wodą o temperaturze pokojowej, aż SDS zostanie całkowicie usunięty na ostatnim etapie mycia wirowania, ponownie zawiesić próbki w 200 mikrolitrach 50-milimolowego buforu fosforanu sodu.

Objętość tę można dostosować w zależności od ilości glikanu pepto w próbce i może ona być zależna od gatunku. Jeśli próbka zawiera więcej glikanu pep, należy zwiększyć objętość zawiesiny. Jeśli próbka zawiera mało glikanu peptydowego.

Zmniejsz objętość zawiesiny resus do minimum 50 mikrolitrów. Przenieś próbki do probówek o pojemności 1,5 mililitra i dodaj jeden miligram na mililitr mąki, aby uzyskać końcowe stężenie 40 mikrogramów na mililitr. Inkubuj przez sześć do ośmiu godzin lub przez noc w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby przygotować próbki do UPLC, włącz blok grzewczy do 100 stopni Celsjusza. Gotować próbki bez SDS przez pięć minut, aby zatrzymać próbki z wirówki fermentacyjnej na 10 minut po 16 000 razy. G w temperaturze pokojowej.

Neuropeptydy znajdują się teraz w supernatancie. Przenieść supernatant do szklanych probówek o wymiarach 13 na 100 milimetrów. Postaraj się odzyskać jak najwięcej supernatantu, zbliżając się bardzo do podniebienia, nie naruszając go.

Dostosuj pH, dodając 500-milimolowy bufor boranowy do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 100-milimolowego buforu boranowego, otwór 8 bufor jest zgodny ze środkiem redukującym. Wodorek boro sodu dodać kilka ziaren wodorku boro sodu, aby zredukować każdą próbkę i pozostawić reakcję na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dostosuj próbki do pH szóstego, mierzonego za pomocą papieru wskaźnikowego pH z kwasem ortofosforowym, z dokładnością do 20 mikrolitrów, próbka powinna bąbelkować w odpowiedzi na dodanie kwasu ortofosforowego.

Próbka zazwyczaj przestaje bulgotać, gdy zostanie osiągnięte pH sześć. Następnie kontynuuj dostosowywanie próbek do pH od trzeciego do czwartego za pomocą kwasu ortofosforowego, stosując przyrosty co dwa mikrolitry. Przefiltrować próbkę przez strzykawkę o średnicy 0,22 mikrona.

Przefiltrować bezpośrednio do fiolki A-U-P-L-C. Jeżeli osad przekształcił się w próbkach po przeniesieniu do fiolek z UPLC, należy podgrzać fiolki, kilkakrotnie przechodząc przez płomień. Umieść fiolkę UPLC w próbniku automatycznym i wstrzyknij 10 mikrolitrów każdej próbki na instrument A-U-P-L-C.

Wyposażony w kolumnę UPLC z odwróconymi fazami C 18 i detektor absorbancji ustawiony do monitorowania. Próbki o długości od 202 do 208 nanometrów są wstrzykiwane sekwencyjnie. Ustaw przepływ na 0,25 mililitra na minutę i użyj gradientu liniowego przez 25 minut, aby uzyskać 100% rozpuszczalnika B i sekwencyjne E neuropeptydów w ciągu 30 minut.

Jeśli spektrometria mas będzie stosowana do charakteryzowania neuropeptydów po UPLC, należy zebrać frakcje interesującego piku w kolektorze frakcji, przenieść frakcje do rurki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie wysuszyć frakcje za pomocą parownika odśrodkowego, frakcje muszą zostać odsolone przed analizą MS. W tym typowym wyniku UPLC. Detekcja za pomocą absorbancji UV przy 202 do 208 nanometrach w funkcji czasu ustala określony czas retencji neuropeptydów.

Obserwuje się wyraźną rozdzielczość między większością gatunków neuropeptydów i silną siłę sygnału w całym spektrum, co umożliwia analizę stopnia usieciowania średniej długości nici glikanów oraz tożsamości neuropeptydów i ich stężeń. Przykładowy chromatogram odzwierciedlający wytrącanie się C neuropeptydów jest pokazany tutaj. Nie wspomniano o pikach, co skutkuje brakiem jakichkolwiek danych na temat składu PG.

Brak dostrzegalnych pików z analizy UPLC może wystąpić w wyniku nadmiernego zagęszczenia próbki lub mis dostosowania pH do poziomu znacznie poniżej punktu izoelektrycznego neuropeptydów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, choć gorączkowych wykonała poprawnie Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak spektrometria mas, mogą być stosowane do pozytywnej identyfikacji gatunków neuropeptydów na podstawie masy po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do zbadania biochemicznej funkcji kluczowych enzymów ściany komórkowej oraz sposobu działania inhibitorów chemicznych u wielu różnych gatunków i mutantów.