Name: Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Naucz się izolować ściany komórkowe bakterii i analizować neuropeptydy metodą UPLC. Ta technika pozwala określić skład peptydoglikanu i charakterystykę strukturalną ściany komórkowej w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Dyrektora NIH dla Nowego Innowatora DP2OD006466 (dla K.C.H.). Autorzy dziękują Russellowi Mondsowi za praktyczne zademonstrowanie metody i za dyskusję naukową.

1. Hoduj kultury bakterii w 2,5 ml pożywki przez noc
Rozcieńcz wstecznie kultury 1:100 do 250 ml świeżej pożywki i osiągnij OD600 0,7-0,8. Przygotować roztwór 6% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie.
UWAGA: Proszek SDS jest niebezpieczny - unikaj wdychania proszku SDS; załóż maskę na nos i usta.
2. Dzień 1 - Liza kultur bakteryjnych jest przeprowadzana w ciągu jednego dnia i przez noc
<ol>
	<li>Podczas gdy rozcieńczone kultury rosną, przygotuj wrzącą kąpiel wodną na gorącej płycie w zlewce o pojemności 1 l. Gdy woda się zagotuje, wlej 6 ml 6% SDS do 50 ml probówek polipropylenowych, dodaj jedną małą mieszadło do każdej probówki, dokręć pokrywki probówek palcami, umieść probówki w łaźni wodnej i włącz mieszanie do 500 obr./min na płycie grzejnej.</li>
	<li>Zebrać 250 ml kultur w temperaturze 5 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulki w 3 ml pożywki lub 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Powoli pipetować zawiesiny komórek do probówek o pojemności 50 ml z 6% wrzącą SDS w celu lizy komórek (końcowe stężenie 4% SDS), podczas gdy probówki są zanurzone we wrzącej łaźni wodnej i ponownie zamknąć pokrywki tak, aby były szczelne palcami. Zawiesiny komórek muszą być szybko przeniesione do wrzącej SDS po ponownym zawieszeniu. Należy unikać nagłych zmian środowiskowych, ponieważ może to spowodować błędną zmianę struktury ściany komórkowej.</li>
	<li>Przykryj wrzącą łaźnię wodną i pozwól komórkom wrzeć przez 3 godziny, okresowo sprawdzając poziom wody i uzupełniając łaźnię wodną w razie potrzeby. Po 3 godzinach wyłącz element grzejny płyty grzejnej i kontynuuj mieszanie przez noc z prędkością 500 obr./min.</li>
</ol>
3. Dzień 2 - Trawienie enzymatyczne odbywa się w ciągu jednego dnia
<ol>
	<li>Jeśli SDS wytrącił się w probówkach o pojemności 50 ml przez noc, należy ustawić łaźnię wodną na wrzenie przez dodatkowe 1-2 godziny. Włączyć blok grzewczy do 60 °C. Przygotować zapas 1 mg/ml Pronazy E w 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl i aktywować Pronazę E w temperaturze 60 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Użyj ultrawirówki o masie 400 000 × g, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia dużych polimerów PG, a tym samym oczyszczenia ich z innych składników komórkowych. Ostrożnie usuń supernatant, a następnie ponownie zawieś każdą granulkę w ultraczystej wodzie o temperaturze pokojowej. UWAGA: Objętość zawiesiny zależy od objętości użytych probówek ultrawirówek; Użyj objętości, która wypełnia probówki co najmniej do połowy, ale nie przekracza maksymalnej objętości rurek. Powtarzać wirowanie/mycie do momentu, gdy woda nie utworzy pęcherzyków podczas ponownego wymieszania, co oznacza, że karta charakterystyki została całkowicie usunięta (zwykle trzy płukania). Przestań myć osad, jeśli utworzy się biały osad, ponieważ oznacza to, że woreczki zbijają się ze sobą. Zbrylanie się nie jest katastrofalne, ale grudki bardzo silnie wiążą się z plastikiem i szkłem, powodując duże straty próbki. W takim przypadku postępuj zgodnie z protokołem, używając zbitej próbki worków.</li>
	<li>Na ostatnim etapie wirowania/przemywania ponownie zawiesić próbki w 900 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl i przenieść do probówek o pojemności 2 ml, uprzednio nakłutych małą igłą z otworami w wierzchołkach. Dodać 100 μl aktywowanej pronazy E o stężeniu 100 mg/ml (stężenie końcowe 100 μg/ml) do każdej próbki i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Ustaw inny blok grzewczy na 100 °C.</li>
	<li>Zatrzymać wytrawianie Pronazy E, dodając 200 μl 6% SDS do każdej próbki i gotować próbki w bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez 30 minut. Ustawić inny blok grzewczy na 37 °C i przygotować zapas 1 mg/ml muramidazy (mutanolizyny) w 50 mM buforze fosforanowym (pH 4,9).</li>
	<li>Podobnie jak w kroku 3.2, użyj ultrawirówki o masie 400 000 × g, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej i myć ultraczystą wodą o temperaturze pokojowej, aż SDS zostanie całkowicie usunięty (zwykle trzy płukania). Objętość ponownego zaparcia zależy od objętości użytych probówek do ultrawirówek; Użyj objętości, która wypełnia probówki co najmniej do połowy, ale nie przekracza maksymalnej objętości rurek.</li>
	<li>Na ostatnim etapie wirowania/przemywania ponownie zawiesić próbki w 200 μl 50 mM buforu fosforanu sodu (pH 4,9). Objętość tę można dostosować w zależności od ilości peptydoglikanu w próbce i może ona być zależna od gatunku. Jeżeli istnieją wcześniej opublikowane sprawozdania z analizy HPLC dla gatunków będących przedmiotem zainteresowania, objętość ta może być oszacowana na podstawie tych danych ilościowych (kompilację badań HPLC PG można znaleźć w informacjach uzupełniających w pozycjireferencyjnej 7). W przypadku innych gatunków można przeprowadzić przygotowanie worka do tego etapu, a następnie dodać różne ilości objętości zawiesiny w celu powtórzenia próbek w celu określenia minimalnej objętości, która pozwala PG pozostać w roztworze (patrz Dyskusja w celu uzyskania dalszych szacunków). Jeśli próbka zawiera więcej peptydoglikanu, należy zwiększyć objętość zawiesiny; Jeśli próbka zawiera mało peptydoglikanu, należy zmniejszyć objętość zawiesiny do minimum 50 μl.</li>
	<li>Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i dodać 1 mg/ml muramidazy, aby uzyskać końcowe stężenie 40 μg/ml. Inkubować 6-8 godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Dzień 3 - Przygotowanie próbek do UPLC odbywa się ostatniego dnia
<ol>
	<li>Włączyć blok grzewczy do temperatury 100 °C. Gotować próbki bez SDS przez 5 minut, aby zatrzymać trawienie muramidazy. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 16 000 × g w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść supernatant (muropeptydy są teraz rozpuszczalne) do szklanych probówek o wymiarach 13 mm x 100 mm. Postaraj się odzyskać jak najwięcej supernatantu, zbliżając się bardzo blisko osadu, nie naruszając go.</li>
	<li>Dostosuj pH, dodając do próbki 500 mM buforu boranowego (pH 9), aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM buforu boranowego. Bufor boranowy jest kompatybilny ze środkiem redukującym borowodorkiem sodu. Dodać 1-2 ziarna borowodorku sodu, aby zredukować każdą próbkę i pozostawić reakcję na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Borowodorek sodu jest wysoce reaktywny i niebezpieczny w obsłudze - unikać kontaktu ze skórą (nosić rękawice) i unikać kontaktu z oczami (nosić okulary ochronne).</li>
	<li>Dostosuj próbki do pH 3-4 (punkt izoelektryczny muropeptydu wynosi ~3,5) za pomocą kwasu ortofosforowego o stężeniu 50% v/v, stosując przyrosty co 20 μl do pH 6, mierzone za pomocą papierka wskaźnikowego pH, a następnie z przyrostem 2 μl. UWAGA: Kwas ortofosforowy jest i niebezpieczny w obsłudze - unikać kontaktu ze skórą (nosić rękawice) i unikać kontaktu z oczami (nosić okulary ochronne). Próbka powinna bąbelkować w odpowiedzi na dodanie kwasu ortofosforowego; Kiedy próbka przestaje bulgotać, zwykle oznacza to, że osiągnięto pH 6. Jeżeli w próbce nie występuje bąbelkowanie, może to oznaczać, że ilość dodanego borowodorku sodu była zbyt mała. W takim przypadku należy przerwać obniżanie pH, ostrożnie dodać jedno lub dwa ziarna borowodorku sodu, odczekać 5-10 minut, a następnie wznowić regulację pH.</li>
	<li>Przefiltrować próbkę przez filtr strzykawkowy 0,22 μm bezpośrednio do fiolki UPLC. Jeśli utworzył się osad, podgrzej rurkę z kilkoma przejściami przez płomień przed filtrowaniem. Jeśli próbka nie zostanie wstrzyknięta do instrumentu UPLC w ciągu dnia, należy zamrozić w temperaturze -20 °C przez noc. Próbki mogą być przechowywane przez okres do roku w temperaturze -80 °C. Próbkę można rozmrozić, kilkakrotnie przechodząc przez płomień.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl każdej próbki do przyrządu UPLC wyposażonego w kolumnę C18 1,7 μm z odwróconymi fazami i detektor absorbancji ustawiony do monitorowania 202-208 nm. Próbki są wstrzykiwane sekwencyjnie, ale funkcje automatycznego podajnika próbek pozwalają na przetwarzanie do 96 próbek w partii. Użyć 50 mM fosforanu sodu (pH 4,35) + 0,4% v/v azydku sodu dla rozpuszczalnika A i 75 mM fosforanu sodu (pH 4,95) + 15% v/v metanolu dla rozpuszczalnika B. UWAGA: Azydek sodu dodaje się w celu skompensowania absorpcji metanolu o długości 205 nm, aby uniknąć dryftu linii podstawowej. Ustaw przepływ na 0,25 ml/min i użyj gradientu liniowego przez 25 minut, aby uzyskać 100% rozpuszczalnika B i sekwencyjną elucję muropeptydów w ciągu 30 minut. Jeżeli do scharakteryzowania muropeptydów po UPLC ma być stosowana spektrometria mas, należy zebrać frakcje interesującego piku w kolektorze frakcji i wysuszyć frakcje za pomocą parownika odśrodkowego.</li>
</ol>

<ol><li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li>
<li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).</li>
<li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).</li>
<li>Davis, K. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+peptidoglycan+backbone+help+bacteria+to+establish+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection.</a> Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).</li>
<li>Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vancomycin+resistance+in+enterococci%3A+reprogramming+of+the+D-ala-D-Ala+ligases+in+bacterial+peptidoglycan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis.</a> Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).</li>
<li>Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+at+its+peaks%3A+how+chromatographic+analyses+can+reveal+bacterial+cell+wall+structure+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly.</a> Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).</li>
<li>Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Composition of the murein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).</li>
<li>Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+Escherichia+coli+L+forms+revisited%3A+growth+requires+peptidoglycan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis.</a> J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).</li>
<li>Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHakenbeck%2C+R+%22The+target+of+penicillin%3A+the+murein+sacculus+of+bacterial+cell+walls+architecture+and+growth%22">The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth</a>. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).</li>
<li>Boylen, C. W., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratio+of+teichoic+acid+and+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Bacillus+subtilis+following+spire+germination+and+during+vegetative+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth.</a> J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).</li>
<li>Sutow, A. B., Welker, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+the+cell+walls+of+Bacillus+stearothermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus.</a> J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).</li>
<li>Wang, W. S., Lundgren, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+of+a+chemolithotrophic+bacterium%2C+Ferrobacillus+ferrooxidans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans.</a> J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).</li>
<li>de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penicillin+binding+proteins%3A+role+in+initiation+of+murein+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).</li>
<li>Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Streptococcus+faecalis+Andrewes+and+Horder+and+Streptococcus+faecium+Orla-Jensen+based+on+the+amino+acid+composition+of+their+murein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein.</a> J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li>
<li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC%3A+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Poloniae+Pharmaceutica%22%5BJournal%5D)">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li>
<li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+%26%2334%3Bultra+performance%26%2334%3B+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High resolution &#34;ultra performance&#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li>
<li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+%28mini+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li>
</ol>

Koszty produkcji tego artykułu były sponsorowane przez Waters Corporation.

Krytycznym etapem tej procedury jest krok 3.1 drugiego dnia przygotowania próbki. Jeśli karta charakterystyki wytrąciła się w ciągu nocy lub jeśli próbki były przechowywane w 4% karcie charakterystyki przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej, próbki muszą być ponownie gotowane przez co najmniej 1 godzinę w celu ponownego rozpuszczenia karty charakterystyki. Częstą przyczyną wytrącania się SDS jest stosowanie pożywek z solami potasu, dlatego w miarę możliwości należy unikać potasu w pożywkach. Jak wspomniano w sekcji ...

Celem opisanej tutaj metody jest wyizolowanie nienaruszonych ścian komórkowych bakterii (woreczków) i trawienie peptydoglikanu (PG) w taki sposób, że ultra sprawna chromatografia cieczowa (UPLC) może być użyta do dostarczenia informacji takich jak tożsamość składników muropeptydu i ich stężenia, średnia długość nici glikanu oraz frakcja materiału zaangażowanego w wiązania krzyżowe między niciami. Aby uzyskać szczegółowe omówienie biochemii PG i gatunków muropeptydów, istnieje kilka doskonałych recenzji, które opisują strukturę PG i jej rolę w infekcji, odporności, morfogenezie i wzroście1-6. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) do analizy PG została początkowo opracowana przez Glaunera i Schwarza w latach 80., a ostatnio została udoskonalona i szeroko stosowana w laboratoriach Miguela de Pedro i Waldemara Vollmera. Poprzednie metody wykorzystywały analizę aminokwasów lub chromatografię bibułową, czasochłonne i żmudne techniki, które nie dają dokładnej lub pełnej oceny składników ściany komórkowej.
Analiza UPLC może być łatwo zaimplementowana w każdym laboratorium badawczym, które ma dostęp do ultrawirówki i UPLC. Metoda UPLC, którą prezentujemy poniżej, izoluje całe woreczki, dostarczając w ten sposób wyczerpujących, ilościowych informacji na temat wszystkich zawartych w nich związków chemicznych. Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie ilościowe wszystkich muropeptydów w populacji bakterii, a wszystko to w ciągu 20 minut UPLC. Wdrożenie tej metody wymaga jedynie podstawowych umiejętności laboratoryjnych, bez znacznych nakładów finansowych w materiały. Aby wykonać kroki tej metody, naukowcy muszą jedynie posiadać umiejętności w pipetowaniu, przygotowywaniu i enzymów oraz dostosowywaniu pH, dzięki czemu jest ona dostępna dla szerokiego zakresu dyscyplin naukowych. Wybór enzymów stosowanych w tym protokole zależy od gatunku analizowanej bakterii; opisany tutaj protokół jest przydatny w przypadku Escherichia coli i ogólnie stwierdzono, że jest odpowiedni do izolowania woreczków od innych organizmów Gram-ujemnych. W przypadku stosowania tej metody do bakterii Gram-dodatnich zaleca się konsultację z literaturą; U tych gatunków oczyszczanie worka było tradycyjnie trudniejsze. W szczególności może być konieczna zmiana tej metody pod względem wyboru enzymów i długości czasu trawienia, aby dostosować się do grubszych ścianek i polimerów dodatkowych, takich jak kwasy tejchojowe bakterii Gram-dodatnich. Pierwszy enzym w tym protokole rozszczepia lipoproteiny błony zewnętrznej (takie jak lipoproteina Brauna lub Lpp) przyłączone do peptydoglikanu, uwalniając w ten sposób wszystko oprócz C-końcowego di- (lub tri-) peptydu Lpp ze ściany komórkowej. Ten krok jest konieczny podczas badania Enterobacteria, ale wiele innych bakterii Gram-ujemnych nie ma odpowiedników Lpp, dlatego ten krok można pominąć. Drugi enzym specyficznie rozszczepia się po kwasie muraminowym składniku peptydoglikanu, rozpuszczając podjednostkę disacharydową, która tworzy gatunek muropeptydu. Aby zapewnić dokładną ocenę architektury PG, należy zachować ostrożność podczas trawienia woreczków, aby zapobiec rozszczepieniu mostów poprzecznych lub jakiejkolwiek innej części łodygi peptydu.
Chociaż skład chemiczny peptydoglikanu z ponad 100 szczepów ~40 gatunków bakterii był analizowany przez HPLC, nie przeprowadzono żadnych analiz za pomocą technologii UPLC. Ponadto wcześniejsze prace scharakteryzowały peptydoglikan tylko na podstawie niewielkiej części domeny bakteryjnej, częściowo ograniczonej przepustowością HPLC. W związku z tym rozpowszechnienie tej metody wśród jak największej liczby badaczy i wdrożenie jej na platformach UPLC będzie miało kluczowe znaczenie dla prowadzenia badań fizjologicznych dużej części gatunków bakterii, których peptydoglikan nie został jeszcze sklasyfikowany.

<table><tbody><tr><td>Pronase E</td><td>Amresco</td><td>E629</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolizyna ze Streptomyces</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu (NaBH4)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Borowodorek sodu jest wysoce reaktywny i niebezpieczny w obsłudze</td></tr><tr><td>Kwas ortofosforowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79607</td><td>Kwas ortofosforowy jest i niebezpieczny w obsłudze</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31146</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Azydek sodu jest trucizną</td></tr><tr><td>Tetraboran sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Millex 0,22 &mu; m filtry strzykawkowe</td><td>Paski pH Fisher</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>(zakres pH 0-6)</td><td>Fisher</td><td>M95863</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe probówki Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Rurki szklane 13 mm x 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>60CM13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 32 mm szklana fiolka do odzyskiwania z szyjką śrubową</td><td>Wody</td><td>186000327C</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Ambion</td><td>Proszek SDS AM9820</td><td>jest niebezpieczny</td></tr><tr><td></td> System Instrumentation <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC H-Class, w tym:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC H-Class Quadternary Solvent Manager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 i mikro; m kolumna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC PDA Detektor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda Frakcja Zbieracz</td><td></td><td></td><td></td>III</tr><tr><td>Acquity UPLC 30 cm Kolumna Grzejnik/Chłodnica</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Bakteryjna ściana komórkowa jest kluczowa dla określenia kształtu komórki podczas wzrostu i podziału, a także utrzymuje mechaniczną integralność komórek w obliczu ciśnienia turgoru o sile kilku atmosfer. W różnych kształtach i rozmiarach królestwa bakterii, ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych krótkimi peptydami. Kluczowe znaczenie peptydoglikanu dla fizjologii bakterii leży u podstaw jego stosowania jako celu antybiotykowego i zmotywowało do badań genetycznych, strukturalnych i biologicznych komórek dotyczących tego, w jaki sposób jest on solidnie składany podczas wzrostu i podziału. Niemniej jednak nadal potrzebne są szeroko zakrojone badania, aby w pełni scharakteryzować kluczowe działania enzymatyczne w syntezie peptydoglikanu i skład chemiczny ścian komórkowych bakterii. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest potężną metodą analityczną służącą do ilościowego określania różnic w składzie chemicznym ścian bakterii hodowanych w różnych warunkach środowiskowych i genetycznych, ale jej przepustowość jest często ograniczona. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę izolacji i przygotowania ścian komórkowych bakterii do analiz biologicznych peptydoglikanu za pomocą HPLC i ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), rozszerzenia HPLC, które wykorzystuje pompy do dostarczania ultrawysokich ciśnień do 15 000 psi, w porównaniu z 6 000 psi w przypadku HPLC. W połączeniu z przedstawionym tutaj przygotowaniem bakteryjnych ścian komórkowych, iniektory do próbek o małej objętości, detektory o wysokiej częstotliwości próbkowania, mniejszych objętościach próbek i krótszych czasach pracy UPLC umożliwią wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu i podstawowej biologii komórek bakteryjnych w większości laboratoriów biologicznych z dostępem do ultrawirówki i UPLC.

Stosując procedurę opisaną na Rysunku 1, końcowa próbka powinna składać się z co najmniej 200 µl przejrzystego roztworu, który został przefiltrowany bezpośrednio do fiolki UPLC (krok 4.4). Rozdział UPLC różnych muropeptydów w próbce bakteryjnej opiera się na ich względnej rozpuszczalności między ciekłą fazą ruchomą a fazą stacjonarną kolumny. Kolumny C18 w odwróconej fazie zapewniają silnie hydrofobową macierz do rozdzielania gatunków muropeptydów na podstawie hydrofobowości i rozmiaru8; polar...

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja i trawienie ścian komórkowych bakterii w celu określenia tożsamości i względnych frakcji różnych neuropeptydów. Przy użyciu analizy UPLC osiąga się to poprzez wstępną lizę próbek bakteryjnych poprzez gotowanie w siarczanie sodu (SDS). Po wypłukanie SDS drugim krokiem jest trawienie próbek za pomocą pronazy E w celu usunięcia błony zewnętrznej bakterii gram-ujemnych.Następnie próbki poddaje się trawieniu za pomocą mureinazy, aby rozpuścić peptydoglikan do pojedynczych neuropeptydów. Ostatnim krokiem jest redukcja neuropeptydów i dostosowanie pH do punktu izoelektrycznego neuropeptydów. Ostatecznie wykorzystuje się UPLC do rozdzielenia neuropeptydów według wielkości i hydrofobowości, co umożliwia ilościowe określenie istotnych cech ściany komórkowej, takich jak stopień sieciowania i średnia długość nici glikanowych.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, takie jak zależności między morfogenezą, architekturą ściany komórkowej, aktywacją układu odpornościowego a patogenezą. Chociaż metoda ta została opracowana w celu oczyszczania peptydoglikanu bakterii gram-ujemnych, można ją zastosować również do bakterii gram-dodatnich po dodaniu kilku enzymów i zastosowaniu obróbki chemicznej. Aby ponownie wyhodować kultury bakteryjne, należy rozcieńczyć kultury nocne w stosunku 1:100 w 250 mililitrach świeżej pożywki i hodować je do pożądanej gęstości optycznej przy 600 nanometrach. Podczas wzrostu rozcieńczonych kultur należy przygotować kąpiel w wrzącej wodzie na płycie grzewczej w zlewce o pojemności jednego litra.Gdy woda zawrze, odmierz sześć mililitrów 6% dodecylu siarczanu sodu (SDS) do probówek polipropylenowych o pojemności 50 mililitrów. Do każdej probówki włóż jeden mały mieszadełko magnetyczne i mocno zakręć ręką nakrętki. Umieść probówki w kąpieli wodnej z wrzącą wodą i mieszaj z prędkością 500 RPM na płycie grzejnej.Zbiór 250 ml kultur przeprowadzić poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Osady zawiesić w trzech ml pożywki lub 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Powoli przenieść zawiesiny komórkowe pipetą do probówek o pojemności 50 ml zawierających 6% wrzący SDS w celu lizy komórek, podczas gdy probówki są zanurzone w łaźni wodnej z wrzącą wodą, a następnie zakręcić szczelnie pokrywki.Przykryj łaźnię wodną i gotuj komórki przez trzy godziny, okresowo sprawdzając poziom wody i uzupełniając ją w razie potrzeby. Po trzech godzinach wyłącz grzanie na płycie grzejnej i kontynuuj mieszanie przez noc przy 500 RPM. Jeśli w probówkach 50 milliliter SDS wytrącił się w ciągu nocy, ustaw łaźnię wodną na gotowanie przez dodatkowe jedną do dwóch godzin.Przedstawiono tutaj wygląd prawidłowej hodowli po całonocnej lizie. W przypadku SDS należy zwrócić uwagę na przejrzystość, w przeciwieństwie do mętności, która koreluje z wytrącaniem osadu. Przygotować bufor Proteinase K i aktywować Proteinase K w temperaturze 60 °C w bloku grzewczym przez co najmniej 30 minut.Próbki należy wirować w ultrawirówce przy 400 000 $\times$g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby doprowadzić do sedymentacji dużych makrocząsteczek peptydoglikanu (PG) i w ten sposób oczyścić je z pozostałych składników komórkowych. Należy ostrożnie usunąć nadosad, a następnie zawiesić każdy osad w wodzie ultrapurej w temperaturze pokojowej. Objętość zawiesiny zależy od objętości zastosowanych probówek do ultrawirówki.Należy użyć objętości wypełniającej probówki co najmniej do połowy, lecz nieprzekraczającej ich maksymalnej pojemności. Powtarzać wirowanie i przemywanie do momentu, gdy podczas resuspensji woda nie będzie tworzyć pęcherzyków, co wskaże całkowite usunięcie SDS. Resuspender próbki w 900 µL buforu Tris-HCl i przenieść do probówek o pojemności 2 mL, w których wcześniej wykonano otwory w pokrywkach.Za pomocą małej igły dodaj 100 µL aktywnej pronazy E do każdej próbki, a następnie inkubuj w temperaturze 60 °C przez dwie godziny. Przerwij trawienie pronazą, dodając 200 µL 6% SDS do każdej próbki, i gotuj próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 30 minut. Podobnie jak poprzednio, użyj ultrawirówki ustawionej na 400 000 ×g, aby wirować próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej, i przemywaj je ultrazczystą wodą o temperaturze pokojowej aż do całkowitego usunięcia SDS; w ostatnim etapie przemywania po wirowaniu resuspenderuj próbki w 200 µL 50 mM buforu fosforanowego sodu.Objętość tę można dostosować do ilości peptydoglikanu w próbce, co może zależeć od gatunku. Jeśli próbka zawiera więcej peptydoglikanu, należy zwiększyć objętość zawiesiny. Jeśli próbka zawiera mało peptydoglikanu.Zredukuj objętość zawiesiny po reanimacji do minimum 50 µL. Przenieś próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i dodaj mease w stężeniu 1 mg/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 40 µg/ml. Inkubuj przez sześć do ośmiu godzin lub przez noc w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C.Aby przygotować próbki do analizy UPLC, należy rozgrzać blok grzejny do 100 °C. Próbki bez SDS gotować przez pięć minut w celu zatrzymania trawienia przez mease, a następnie wirować próbki przez 10 minut przy 16 000 ×g w temperaturze pokojowej.Neuropeptydy znajdują się teraz w nadsączu. Przenieś nadsącz do szklanych probówek o wymiarach 13 by 100 milimetrów. Staraj się odzyskać jak najwięcej nadsącza, zbliżając się maksymalnie do osadu, aby go nie naruszyć.Dostosuj pH, dodając do próbki 500 milimolarny bufor boratowy, aby uzyskać końcowe stężenie 100 milimolarnego buforu boratowego; bufor boratowy jest zgodny z reduktorem. Boro-wodorek sodu: dodaj kilka ziaren boro-wodorku sodu, aby zredukować każdą próbkę, i pozostaw reakcję na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, za pomocą papierka wskaźnika pH, dostosuj pH próbek do wartości 6, stosując kwas ortofosforowy w przyrostach 20 µL; po dodaniu kwasu ortofosforowego próbka powinna pienić się.Próbka zazwyczaj przestaje bąbelkować po osiągnięciu pH wynoszącego sześć. Następnie należy kontynuować dopasowywanie próbek do poziomu pH od trzech do czterech, stosując kwas ortofosforowy w przyrostach 2 µL. Próbkę należy przefiltrować przez strzykawkę z filtrem 0,22 µm.Przefiltruj roztwór bezpośrednio do fiolki do UPLC. Jeśli po przeniesieniu próbek do fiolek do UPLC ponownie pojawił się osad, podgrzej fiolki, kilkakrotnie przepuszczając je przez płomień. Umieść fiolkę do UPLC w automatycznym próbniku i wstrzyknij 10 µL każdej próbki do urządzenia UPLC.Urządzenie wyposażono w kolumnę UPLC C 18 w fazie odwróconej oraz detektor absorbancji ustawiony na monitorowanie zakresu od 202 do 208 nanometrów; próbki wstrzykuje się sekwencyjnie. Przepływ ustawiono na 0,25 milliliters per minute, stosując gradient liniowy przez 25 minut w celu osiągnięcia 100% rozpuszczalnika B i następującej po tym elucji neuropeptydów w ciągu 30 minut.Jeśli do charakterystyki neuropeptydów po UPLC zostanie zastosowana spektrometria mas, należy zebrać frakcje interesującego piku w kolektorze frakcji, przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wysuszyć frakcje za pomocą ewaporatora odśrodkowego; przed analizą MS frakcje muszą zostać odsolone. Na tym typowym wyniku UPLC detekcja poprzez absorbancję UV przy 202 do 208 nm w funkcji czasu pozwala określić czas retencji konkretnego neuropeptydu.Zaobserwowano wyraźną rozdzielczość między większością gatunków neuropeptydów oraz silną intensywność sygnału w całym spektrum, co umożliwia analizę stopnia sieciowania, średniej długości łańcuchów glikanów oraz tożsamości i stężeń neuropeptydów. Przedstawiono tutaj przykładowy chromatogram odzwierciedlający wytrącanie C neuropeptydów. Nie odnotowano żadnych pików, co skutkuje brakiem danych na temat składu PG.Brak wyraźnych pików w analizie UPLC może wystąpić w wyniku nadmiernego zagęszczenia próbki lub błędnego dostrojenia pH do wartości znacznie poniżej punktu izoelektrycznego neuropeptydów. Po opanowaniu techniki proces ten można przeprowadzić w ciągu trzech dni, choć będą one intensywne, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Do jednoznacznej identyfikacji gatunków neuropeptydów na podstawie masy, po opracowaniu metody, można wykorzystać inne techniki, takie jak spektrometria mas.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mikrobiologii do zgłębiania funkcji biochemicznych kluczowych enzymów ściany komórkowej oraz mechanizmu działania inhibitorów chemicznych u szerokiej gamy gatunków i mutantów.

isolation-preparation-bacterial-cell-walls-for-compositional-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu przy użyciu chromatografii cieczowej ultrawysokiej efektywności

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Naucz się izolować ściany komórkowe bakterii i analizować neuropeptydy metodą UPLC. Ta technika pozwala określić skład peptydoglikanu i charakterystykę strukturalną ściany komórkowej w badaniach mikrobiologicznych.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Przeglądaj więcej filmów