Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii
10 kwietnia 2020
Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.
Badanie, w jaki sposób mikroorganizmy regulują skład chemiczny poszczególnych dwuwarstw, dostarczy nam wiedzy na temat mechanizmów zabijania antybiotyków, oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i patogenezy chorób. Technika ta dzieli otoczkę komórkową bakterii Gram-ujemnych na dwie zdefiniowane frakcje bez użycia detergentu. Dlatego lipidy, białka i cukry można oceniać w środowisku, które jest półrodzime.
Niektóre kroki są zależne od czasu i wymagają skupienia i koordynacji. Początkowo użyj jednej lub dwóch próbek. Gdy poziom komfortu wzrasta, można dodać więcej próbek.
Nie należy zajmować się jednocześnie więcej niż sześcioma próbkami. Jest to procedura wielodniowa, a wizualne punkty kontrolne są pomocne w ocenie skuteczności i błędów. Przed wykonaniem tego czasami ostatnie kroki.
Przenieś bakterie z zamrożonych zapasów glicerolu na świeże płytki agarowe. Gdy rozwiną się kolonie, przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia pięciomililitrowej probówki wypełnionej pożywką bulionową i hoduj bakterie według potrzeb przez noc.
Ponownie rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną do jednego litra preferowanej pożywki bulionowej i inkubować kolby. Po osiągnięciu pożądanej gęstości optycznej wyjąć kolby z inkubatora i umieścić je na lodzie. Zmierz gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach i oblicz objętość kultury, która odpowiada od sześciu do ośmiu razy 10 jedenastej jednostce tworzącej kolonię bakteryjną.
Dodać tę objętość kultury do probówki wirówkowej i upewnić się, że pozostałe kultury pozostaną na lodzie do czasu, gdy będą miały być użyte. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez 10 minut w wirówce o stałym kącie, o dużej prędkości w temperaturze od 7 000 do 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie zdekantować supernatant i wyrzucić go.
Ponownie zawiesić każdą komórkę w 12,5 mililitra buforu A. Dodaj mieszadło magnetyczne do zawiesiny komórek. Dodaj 180 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr lizozymu do każdego wysiedlenia komórek. Po zebraniu bakterii potraktowanych lizozymem EDTA przez odwirowanie, szybko dodaj inhibitor proteazy, chlorek magnezu i nukleazę do bakterii i szybko ponownie zawieś komórki w buforze B. Mieszaj przez dwie minuty, utrzymując zawiesiny na lodzie.
Następnie dodaj 12,5 mililitra 1,5 milimolowego roztworu EDTA do każdej reprodukcji komórek i kontynuuj mieszanie na lodzie przez dodatkowe siedem minut. Przelej zawiesiny do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować zawiesiny w temperaturze od 9 000 do 11 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wyrzucić supernatanty do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zatrzymać granulki na lodzie. Dodaj 25 mililitrów buforu B do każdej osadki komórki. Następnie dodaj 55 mikrolitrów jednego molowego chlorku magnezu, jeden mikrolitr odczynnika RNAZA/DNAZY/nukleazy i jeden mikrolitr koktajlu inhibitorów proteazy.
Ponownie zawiesić granulki w mieszance. Energicznie pipetować i wirować, aż roztwory staną się jednorodne. Zawiesiny należy przechowywać na lodzie.
Wlać próbkę do cylindra próbki homogenizatora i doprowadzić kuwetę do 20 000 PSI. Aby uniknąć aerozolowania patogenów, należy kondycjonować aparat ciśnieniowy w buforze B i dostosować poziomy ciśnienia przed dodaniem zawiesiny bakteryjnej. Włącz komórkę ciśnieniową i na wszelki wypadek podaj 10 mililitrów buforu B.
Zbierz lizat komórkowy w 50-mililitrowych stożkowych probówkach na lodzie, jednocześnie utrzymując próbki na lodzie. Aby osiągnąć całkowitą lizę, powtórz ten proces trzy do pięciu razy. Aby osadzać pozostały, nienaruszony materiał komórkowy, odwiruj zlizowane próbki bakteryjne w temperaturze 6, 169 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.
Rozprowadzić supernatanty, które teraz zawierają homogenizowane membrany, do butelek z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Ultraodwirować lizaty komórek w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Odrzucić supernatanty i pozostawić granulki membrany na lodzie.
Używając szklanego homogenizatora Dounce, ponownie zawieś granulki membrany w jednym mililitrze izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś homogenat próbki do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i umieść probówkę na lodzie. Aby przygotować gradient sacharozy, trzymaj polipropylenową lub ultraprzezroczystą rurkę Open-Top w lekko pochylonej pozycji.
Powoli dodawaj dwa mililitry roztworu sacharozy o większej gęstości. Następnie dodaj cztery mililitry roztworu sacharozy o mniejszej gęstości. Przygotowując gradient gęstości, powoli dodawaj roztwór sacharozy, aby uniknąć mieszania warstw.
Warstwy sacharozy powinny być lekko widoczne i wydawać się ogólnie zarysowane. Następnie dodaj całkowitą frakcję membranową, która została wcześniej zawieszona w jednym mililitrze izopiknowego roztworu sacharozy o niskiej gęstości. Na koniec napełnij pozostałą część probówki, dodając około sześciu mililitrów izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości.
Ultrawirować próbki za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o temperaturze 288 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 16 do 23 godzin. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 około pięciu mililitrów od punktu. Po zakończeniu wirowania użyj pipety, aby usunąć górną, brązową warstwę z probówki.
Przenieś tę warstwę, która zawiera wewnętrzną frakcję membrany, do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Pozostaw około dwóch mililitrów roztworu sacharozy powyżej granicy faz między 53% sacharozą a 73% sacharozą, aby upewnić się, że dolna, biała, zewnętrzna frakcja błony nie zanieczyszcza krzyżowo frakcji błony wewnętrznej. Ponownie używając końcówki pipety P1000 z usuniętym końcem, usuń zewnętrzną warstwę membrany i przenieś ją do butelki z poliwęglanu.
Wypełnij pozostałą pustkę butelki z poliwęglanu izolowanym buforem do przechowywania membrany i wymieszaj przez inwersję lub pipetowanie. Próbki należy przechowywać na lodzie. Aby zebrać membrany, należy ultraodwirować butelki z poliwęglanu w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.
Na koniec wyrzuć supernatanty i dodaj 500 do 1 000 mikrolitrów bufora do przechowywania. Ponownie zawiesić membrany przez homogenizację Dounce. Zbierz próbki do dwóch mililitrowych probówek mikrowirówek.
Całkowite granulki membrany zostały zeskrobane, zhomogenizowane i ultraodwirowane przez gradienty gęstości sacharozy w celu oddzielenia membrany wewnętrznej i zewnętrznej. Gradient gęstości sacharozy wynoszący 20%53%73% był wystarczający do podziału niektórych szczepów bakterii. Ale nie do partycjonowania A.baumannii, który został pomyślnie podzielony przy użyciu gradientu 20%45%73%.
Aby ocenić skuteczność separacji, próbki membranowe przetestowano pod kątem dehydrogenazy NADH, enzymu znajdującego się w wewnętrznej błonie bakteryjnej. Spadek gęstości optycznej przy 340 nanometrach wskazywał na obecność enzymu. Gęstość optyczną zmierzono dla 50 mikrogramowych próbek wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych typu dzikiego S.typhimurium, E.coli K12 DH5a i zmutowanego galE S.typhimurium.
Wyższe stężenie białka dodano podczas oznaczania czystości frakcji błonowych A. baumannii, ponieważ wstępny test przy użyciu 50 mikrogramów sugerował, że względne poziomy dehydrogenazy NADH były niższe dla A. baumannii niż dla innych szczepów bakteryjnych. Aby ocenić zanieczyszczenie krzyżowe wewnętrznych frakcji membranowych z zewnętrznymi frakcjami membrany, LPS i LOS zostały wyekstrahowane i zobrazowane. Ekstrakty zostały załadowane na żel poliakrylamidowy i wybarwione Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii jest ludzkim patogenem o najwyższym priorytecie, odpornym na wiele leków. Protokół ten powinien pomóc naukowcom w zrozumieniu roli lipooligosacharydów, fosfolipidów i lipoprotein w mechanizmach oporności i wirulencji tego wyjątkowego i ważnego patogenu. Metoda ta jest idealna do dalszej analizy fosfolipidów, glikolipidów, węglowodanów, białek i małych cząsteczek, które zwykle występują w podwójnych błonach bakterii Gram-ujemnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł omawia strukturalną organizację bakterii Gram-ujemnych, skupiając się na ich podwójnym układzie błon. Zrozumienie składu i funkcji tych błon jest kluczowe dla poznania oporności na antybiotyki i patogenezy drobnoustrojów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad substancjami przeciwdrobnoustrojowymi
Tło
- Bakteria Gram-ujemne mają dwie odrębne błony.
- Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej przez periplazm.
- Ta cecha strukturalna jest istotna dla badań fizjologii bakterii.
- Zrozumienie tych błon pomaga w rozwiązywaniu problemu oporności na antybiotyki.
Cel badania
- Zbadać, jak drobnoustroje regulują skład chemiczny swoich błon.
- Zdobyć informacje na temat mechanizmów działania antybiotyków i oporności na nie.
- Zdobyć wgląd w patogenezę chorób.
Stosowane metody
- Rozdzielenie otoczki komórkowej na określone frakcje bez użycia detergentów.
- Oceny lipidów, białek i cukrów w środowisku półnaturalnym.
- Zastosowanie technik zależnych od czasu wymagających skupienia i koordynacji.
- Rozpoczęcie od jednej lub dwóch próbek dla początkowej praktyki.
Główne wyniki
- Udane odizolowanie składników błony do analizy.
- Wgląd w skład chemiczny bakterii błon.
- Lepsze zrozumienie mechanizmów oporności na antybiotyki.
- Potencjalne implikacje dla opracowywania nowych strategii przeciwdrobnoustrojowych.
Wnioski
- Badanie dostarcza metody do analizy bakterii błon Gram-ujemnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia fizjologii i patogenezy drobnoustrojów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wnioskach w walce z opornością na antybiotyki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables the isolation of inner and outer membrane fractions from Gram-negative bacteria without detergents, preserving a semi-native state for biochemical analysis. It supports target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery by allowing direct assessment of membrane-associated proteins, lipids, and glycolipids. The technique is adaptable to strains with varying glycolipid content, such as Acinetobacter baumannii, enhancing its utility across diverse pathogens in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of membrane protein localization and function, supporting target validation in Gram-negative pathogens.
- Operational Value: Provides detergent-free fractionation that maintains native protein complexes and lipid interactions for accurate functional assays.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking specific membrane components (e.g., LOS, LPS) to resistance or virulence phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified inner and outer membrane fractions suitable for downstream assays targeting membrane-associated drug targets.
- Operational Value: Enables standardized preparation of membrane fractions across bacterial strains, improving assay reproducibility.
- Scalability: The sucrose gradient can be adjusted (e.g., 20%45%73% for A. baumannii) to accommodate organisms with differing membrane densities, supporting platform adaptability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports preclinical evaluation by enabling analysis of membrane composition changes linked to antibiotic resistance mechanisms.
- Biomarker Alignment: Allows detection of glycolipid markers (e.g., LOS vs. LPS) that may correlate with pathogenic potential or resistance profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying whether a compound’s mechanism involves disruption of specific membrane layers.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for antibiotics targeting Gram-negative bacterial membranes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding the role of specific membrane components in pathogen survival and drug susceptibility.
- Screening: Produces membrane fractions ready for use in binding, enzymatic, or permeability assays to evaluate compound activity.
- Analytics: Enables quantitative assessment of membrane purity via marker enzymes (e.g., NADH dehydrogenase) and glycolipid analysis (e.g., LOS/LPS extraction).
- Translational Research: Connects early membrane profiling to preclinical models by identifying resistance-linked membrane alterations.
- Enterprise Reuse: The core fractionation approach is reusable across multiple Gram-negative species with gradient adjustments, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by confirming subcellular localization of drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized, detergent-free membrane isolation applicable to diverse strains.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of membrane-targeting mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on validated membrane interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, membrane fractionation, and ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to high-speed centrifuges, ultracentrifuges with swinging bucket rotors, and sucrose gradient preparation capabilities.
- Necessitates standardization across teams for gradient formulation (e.g., 20%53%73% vs. 20%45%73%) and fraction validation protocols.
- Must account for variations in membrane density due to glycolipid content when adapting the protocol to new organisms.
- Limited by the multi-day duration and need for careful handling to prevent cross-contamination between fractions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Preparation of Bacteria for Membrane Extraction
2:18
Dissociation of the Outer Membrane and Plasmolysis
3:56
Pressurized Homogenization and Lysis
4:35
Total Membrane Fractionation
5:34
Separating the Dual Membranes
8:00
Results: Purity and Quality of Inner and Outer Membrane Fractions
9:36
Conclusion
