Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Badanie, w jaki sposób mikroorganizmy regulują skład chemiczny poszczególnych dwuwarstw, dostarczy nam wiedzy na temat mechanizmów zabijania antybiotyków, oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i patogenezy chorób. Technika ta dzieli otoczkę komórkową bakterii Gram-ujemnych na dwie zdefiniowane frakcje bez użycia detergentu. Dlatego lipidy, białka i cukry można oceniać w środowisku, które jest półrodzime.

Niektóre kroki są zależne od czasu i wymagają skupienia i koordynacji. Początkowo użyj jednej lub dwóch próbek. Gdy poziom komfortu wzrasta, można dodać więcej próbek.

Nie należy zajmować się jednocześnie więcej niż sześcioma próbkami. Jest to procedura wielodniowa, a wizualne punkty kontrolne są pomocne w ocenie skuteczności i błędów. Przed wykonaniem tego czasami ostatnie kroki.

Przenieś bakterie z zamrożonych zapasów glicerolu na świeże płytki agarowe. Gdy rozwiną się kolonie, przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia pięciomililitrowej probówki wypełnionej pożywką bulionową i hoduj bakterie według potrzeb przez noc.

Ponownie rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną do jednego litra preferowanej pożywki bulionowej i inkubować kolby. Po osiągnięciu pożądanej gęstości optycznej wyjąć kolby z inkubatora i umieścić je na lodzie. Zmierz gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach i oblicz objętość kultury, która odpowiada od sześciu do ośmiu razy 10 jedenastej jednostce tworzącej kolonię bakteryjną.

Dodać tę objętość kultury do probówki wirówkowej i upewnić się, że pozostałe kultury pozostaną na lodzie do czasu, gdy będą miały być użyte. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez 10 minut w wirówce o stałym kącie, o dużej prędkości w temperaturze od 7 000 do 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie zdekantować supernatant i wyrzucić go.

Ponownie zawiesić każdą komórkę w 12,5 mililitra buforu A. Dodaj mieszadło magnetyczne do zawiesiny komórek. Dodaj 180 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr lizozymu do każdego wysiedlenia komórek. Po zebraniu bakterii potraktowanych lizozymem EDTA przez odwirowanie, szybko dodaj inhibitor proteazy, chlorek magnezu i nukleazę do bakterii i szybko ponownie zawieś komórki w buforze B. Mieszaj przez dwie minuty, utrzymując zawiesiny na lodzie.

Następnie dodaj 12,5 mililitra 1,5 milimolowego roztworu EDTA do każdej reprodukcji komórek i kontynuuj mieszanie na lodzie przez dodatkowe siedem minut. Przelej zawiesiny do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować zawiesiny w temperaturze od 9 000 do 11 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzucić supernatanty do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zatrzymać granulki na lodzie. Dodaj 25 mililitrów buforu B do każdej osadki komórki. Następnie dodaj 55 mikrolitrów jednego molowego chlorku magnezu, jeden mikrolitr odczynnika RNAZA/DNAZY/nukleazy i jeden mikrolitr koktajlu inhibitorów proteazy.

Ponownie zawiesić granulki w mieszance. Energicznie pipetować i wirować, aż roztwory staną się jednorodne. Zawiesiny należy przechowywać na lodzie.

Wlać próbkę do cylindra próbki homogenizatora i doprowadzić kuwetę do 20 000 PSI. Aby uniknąć aerozolowania patogenów, należy kondycjonować aparat ciśnieniowy w buforze B i dostosować poziomy ciśnienia przed dodaniem zawiesiny bakteryjnej. Włącz komórkę ciśnieniową i na wszelki wypadek podaj 10 mililitrów buforu B.

Zbierz lizat komórkowy w 50-mililitrowych stożkowych probówkach na lodzie, jednocześnie utrzymując próbki na lodzie. Aby osiągnąć całkowitą lizę, powtórz ten proces trzy do pięciu razy. Aby osadzać pozostały, nienaruszony materiał komórkowy, odwiruj zlizowane próbki bakteryjne w temperaturze 6, 169 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Rozprowadzić supernatanty, które teraz zawierają homogenizowane membrany, do butelek z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Ultraodwirować lizaty komórek w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Odrzucić supernatanty i pozostawić granulki membrany na lodzie.

Używając szklanego homogenizatora Dounce, ponownie zawieś granulki membrany w jednym mililitrze izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś homogenat próbki do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i umieść probówkę na lodzie. Aby przygotować gradient sacharozy, trzymaj polipropylenową lub ultraprzezroczystą rurkę Open-Top w lekko pochylonej pozycji.

Powoli dodawaj dwa mililitry roztworu sacharozy o większej gęstości. Następnie dodaj cztery mililitry roztworu sacharozy o mniejszej gęstości. Przygotowując gradient gęstości, powoli dodawaj roztwór sacharozy, aby uniknąć mieszania warstw.

Warstwy sacharozy powinny być lekko widoczne i wydawać się ogólnie zarysowane. Następnie dodaj całkowitą frakcję membranową, która została wcześniej zawieszona w jednym mililitrze izopiknowego roztworu sacharozy o niskiej gęstości. Na koniec napełnij pozostałą część probówki, dodając około sześciu mililitrów izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości.

Ultrawirować próbki za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o temperaturze 288 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 16 do 23 godzin. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 około pięciu mililitrów od punktu. Po zakończeniu wirowania użyj pipety, aby usunąć górną, brązową warstwę z probówki.

Przenieś tę warstwę, która zawiera wewnętrzną frakcję membrany, do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Pozostaw około dwóch mililitrów roztworu sacharozy powyżej granicy faz między 53% sacharozą a 73% sacharozą, aby upewnić się, że dolna, biała, zewnętrzna frakcja błony nie zanieczyszcza krzyżowo frakcji błony wewnętrznej. Ponownie używając końcówki pipety P1000 z usuniętym końcem, usuń zewnętrzną warstwę membrany i przenieś ją do butelki z poliwęglanu.

Wypełnij pozostałą pustkę butelki z poliwęglanu izolowanym buforem do przechowywania membrany i wymieszaj przez inwersję lub pipetowanie. Próbki należy przechowywać na lodzie. Aby zebrać membrany, należy ultraodwirować butelki z poliwęglanu w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.

Na koniec wyrzuć supernatanty i dodaj 500 do 1 000 mikrolitrów bufora do przechowywania. Ponownie zawiesić membrany przez homogenizację Dounce. Zbierz próbki do dwóch mililitrowych probówek mikrowirówek.

Całkowite granulki membrany zostały zeskrobane, zhomogenizowane i ultraodwirowane przez gradienty gęstości sacharozy w celu oddzielenia membrany wewnętrznej i zewnętrznej. Gradient gęstości sacharozy wynoszący 20%53%73% był wystarczający do podziału niektórych szczepów bakterii. Ale nie do partycjonowania A.baumannii, który został pomyślnie podzielony przy użyciu gradientu 20%45%73%.

Aby ocenić skuteczność separacji, próbki membranowe przetestowano pod kątem dehydrogenazy NADH, enzymu znajdującego się w wewnętrznej błonie bakteryjnej. Spadek gęstości optycznej przy 340 nanometrach wskazywał na obecność enzymu. Gęstość optyczną zmierzono dla 50 mikrogramowych próbek wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych typu dzikiego S.typhimurium, E.coli K12 DH5a i zmutowanego galE S.typhimurium.

Wyższe stężenie białka dodano podczas oznaczania czystości frakcji błonowych A. baumannii, ponieważ wstępny test przy użyciu 50 mikrogramów sugerował, że względne poziomy dehydrogenazy NADH były niższe dla A. baumannii niż dla innych szczepów bakteryjnych. Aby ocenić zanieczyszczenie krzyżowe wewnętrznych frakcji membranowych z zewnętrznymi frakcjami membrany, LPS i LOS zostały wyekstrahowane i zobrazowane. Ekstrakty zostały załadowane na żel poliakrylamidowy i wybarwione Pro-Q Emerald 300.

Acinetobacter baumannii jest ludzkim patogenem o najwyższym priorytecie, odpornym na wiele leków. Protokół ten powinien pomóc naukowcom w zrozumieniu roli lipooligosacharydów, fosfolipidów i lipoprotein w mechanizmach oporności i wirulencji tego wyjątkowego i ważnego patogenu. Metoda ta jest idealna do dalszej analizy fosfolipidów, glikolipidów, węglowodanów, białek i małych cząsteczek, które zwykle występują w podwójnych błonach bakterii Gram-ujemnych.