Name: Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę rozdzielania otoczki komórkowej bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej bez detergentów. Technika ta umożliwia analizę lipidów, białek i cukrów w środowisku półnatywnym, wspierając badania nad opornością na antybiotyki i wirulencją Acinetobacter baumannii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez P20GM10344 i R01AI139248 przyznana Z. D. Dalebroux.

<ol><li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+cell+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).</li>
<li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li>
<li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology%2C+genetics%2C+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li>
<li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li>
<li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fortifying+the+barrier%3A+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li>
<li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+envelope%3A+LPS+modifications+and+their+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li>
<li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153(2018).</li>
<li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li>
<li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li>
<li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+the+inner+%28cytoplasmic%29+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li>
<li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA%2FYejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li>
<li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li>
<li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li>
<li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li>
<li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance%2C+Virulence%2C+and+Surface+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li>
<li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda ta będzie nadal pomagać naukowcom w zrozumieniu roli otoczki komórkowej w fizjologii i patogenezie bakterii. Po sekwencyjnych etapach ultrawirowania można uzyskać oczyszczoną frakcję całkowitą, wewnętrzną i OM. Błony te można badać w izolacji w celu przetestowania hipotez związanych z lokalizacją i funkcją białek błonowych, transportem i transportem przez peryplazmę oraz składem poszczególnych dwuwarstw w różnych warunkach środowiskowych. Badania biologiczne badające udział poszczególnych składników OM w patogenez...

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie błony, które są oddzielone przestrzenią peryplazmatyczną i ścianą komórkową peptydoglikanu1. Błona wewnętrzna (IM) otacza cytozol i jest symetryczną dwuwarstwą fosfolipidów. Peptydoglikan chroni przed ciśnieniem turgoru i nadaje bakterii kształt komórki, a także jest przyłączony do błony zewnętrznej (OM) przez lipoproteiny2,3. OM otacza peryplazmę i jest w przeważającej mierze asymetryczna. Ulotka wewnętrzna składa się z fosfolipidów, a ulotka zewnętrzna składa się z glikolipidów znanych jako lipooligosacharydy (LOS) lub lipopolisacharydy (LPS)4,5. Asymetria lipidów i biochemia cząsteczek LOS/LPS w ulotce zewnętrznej nadają powierzchni komórki właściwości barierowe, które chronią bakterię przed zagrożeniami w jej środowisku6,7.
Cząsteczki LPS składają się z trzech składników: disacharydu lipidowego A, oligosacharydu rdzeniowego i O-polisacharydu lub antygenu O. Lipid A jest wielokrotnie acylowanym disacharylipidem. Oligosacharydy rdzeniowe składają się z 10-15 cukrów znanych jako szorstki LPS lub R-LPS. Rdzeń jest podzielony na obszar wewnętrzny, składający się z kwasu 2-keto-3-deoksy-D-manno-oktulosonowego (kdo) i jednej lub więcej reszt heptozy, oraz obszar zewnętrzny, który składa się głównie z heksoz (glukozy lub galaktozy) i heptoz, czyli cukrów acetamido5. Zewnętrzny obszar jądra jest bardziej zmienny pod względem składników i struktury niż jądro wewnętrzne. U Salmonella spp. opisano tylko jedną strukturę rdzenia; jednak w Escherichia coli istnieje pięć różnych struktur rdzeniowych (oznaczonych jako K-12, R1, R2, R3 i R4)8. Bakteria E. coli K-12 DH5α, którego używamy w tej procedurze, niesie ze sobą mutację, która skutkuje produkcją R-LPS9. Cząsteczki R-LPS nie mają ugrupowania antygenu O i mają podobną masę cząsteczkową do cząsteczek LOS.
Dodanie antygenu O do R-LPS zamienia tę cząsteczkę w gładki LPS lub S-LPS. Antygeny O są zbudowane z krótkich 3-4 podjednostek węglowodanowych i składają się z wielu modalności o różnej długości łańcucha10. Niektóre bakterie wytwarzające LPS, takie jak Salmonella enterica serowar Typhimurium (S. Typhimurium), wyświetlają trimodalny rozkład cząsteczek LPS na ich powierzchni10,11. Antygeny O o bardzo długich łańcuchach mogą zawierać ponad sto podjednostek i ważyć ponad sto kilodaltonów. Antygeny O zapewniają bakterii właściwości powierzchniowe, które są niezbędne do oparcia się antybiotykom, unikania drapieżnictwa bakteriofagów i wywoływania choroby.
Gatunki Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria i inne generują cząsteczki LOS zamiast cząsteczek LPS na swojej powierzchni12. Cząsteczki LOS składają się z lipidu A i oligosacharydów rdzeniowych, ale nie mają antygenu O. Tego typu bakterie Gram-ujemne modyfikują swoje podstawowe oligosacharydy dodatkowymi cukrami i kombinacjami cukrów, aby zmienić właściwości powierzchniowe12. Zarówno mikroorganizmy wytwarzające LOS, jak i LPS wyprowadzają fosforany na lipid A i cząsteczki rdzeniowe z ugrupowaniami kationowymi7. Dodatki te obejmują podstawienie fosfoetanoloaminy, galaktozaminy i aminoarabinozy, które działają poprzez neutralizację anionowego ładunku powierzchniowego, a tym samym ochronę przed kationowymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi. Bakterie Gram-ujemne modyfikują również podstawową strukturę oligosacharydów za pomocą zmiennych niestechiometrycznych podstawień cukrów lub dodatkowych cząsteczek kdo i zmieniają liczbę łańcuchów acylowych na disacharylipidach lipid-A7.
Zdolność do izolowania IM od OM bakterii Gram-ujemnych była kluczowa dla zrozumienia roli otoczki komórkowej w oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i patogenezie choroby11,12. Wyprowadzenia tego podejścia wykorzystano do wydedukowania mechanizmów składania, utrzymywania i przebudowy składników białkowych, fosfolipidowych i glikolipidowych dla OM.
Nasze laboratorium rutynowo przeprowadza bakteryjne analizy lipidomiczne, aby badać regulację lipidów i funkcję lipidów za pośrednictwem białek u różnych gatunków Gram-ujemnych. Objętości użyte w protokole odzwierciedlają rutynowe stosowanie tej procedury do analizy fosfolipidów nieznakowanych radioaktywnie metodą chromatografii cienkowarstwowej i chromatografii cieczowej tandemowej spektrometrii mas13,14.
Protokół rozpoczyna się od wystawienia schłodzonej zawiesiny bakterii Gram-ujemnych na działanie wysokoosmolarnego roztworu sacharozy i dodania lizozymu w celu oddzielenia OM od leżącej poniżej warstwy peptydoglikanu (Rysunek 1)12. EDTA jest następnie dodawany, aby ułatwić penetrację lizozymu, ponieważ sekwestracja kationów dwuwartościowych zakłóca boczne elektrostatyczne interakcje mostkowe między sąsiednimi cząsteczkami LOS / LPS15. Pierwotny protokół, z którego został zaadaptowany, wymagał utworzenia sferoplastów, Gram-ujemnej formy komórek bakteryjnych, które składają się z błony plazmatycznej i cytozolu, ale brakuje warstwy peptydoglikanu i OM. Możliwe, że sferoplasty są wytwarzane dostosowaną metodą; Jednak technika ta nie opiera się ani nie zamierza polegać na ich formacji w celu osiągnięcia sukcesu. Zamiast tego bakterie traktowane lizozymem-EDTA są szybko zbierane przez wirowanie i ponownie zawieszane w roztworze sacharozy o mniejszym stężeniu przed lizą pod ciśnieniem. OM, które mogły zostać uwolnione przez tworzenie sferoplastów, powinny teoretycznie nadawać się do zebrania z supernatantów leczonych komórek, ale to podejście nie jest szczegółowo opisane w niniejszym dokumencie. Ostatecznie leczone komórki są poddawane konwencjonalnej homogenizacji i lizie, co zwiększa wydajność i odtwarzalność procedury separacji membranowej16.
Po lizie, całkowite membrany są zbierane przez ultrawirowanie i nakładane na nieciągły gradient gęstości sacharozy w celu frakcjonowania IMs i OMs. Podejście klasyczne wykorzystuje bardziej ciągły gradient, który składa się z co najmniej pięciu różnych roztworów sacharozy11,12. Nieciągły gradient w naszym protokole składa się z trzech roztworów sacharozy i dzieli dwie warstwy na dwie odrębne frakcje17. Cząsteczki LOS i LPS w OM bakterii Gram-ujemnych napędzają otoczkę, aby podzielić się na górną brązową frakcję IM o niskiej gęstości i dolną białą frakcję OM o wysokiej gęstości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2).
Acinetobacter baumannii są ważnymi wielolekoopornymi ludzkimi patogenami, które wytwarzają cząsteczki LOS w swoim OM i tworzą otoczkę komórkową, która jest trudna do oddzielenia18,19. Ostatnie prace sugerują, że pochodna protokołu, który tutaj prezentujemy, może być wykorzystana do podziału dwuwarstw tych organizmów20. Dlatego przetestowaliśmy nasz protokół na A. baumannii 17978. Początkowo procedura była niewystarczająca. Jednak zmodyfikowaliśmy stężenie sacharozy w roztworze o średniej gęstości i znacznie poprawiliśmy separację (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Test dehydrogenazy NADH oraz procedura ekstrakcji i wykrywania LOS/LPS zostały wykorzystane w celu potwierdzenia separacji A. baumannii, S. Typhimurium typu dzikiego i dwóch genotypów enterobakterii z niedoborem antygenu O; mianowicie galE-mutant S. Typhimurium i szczep laboratoryjny, E. coli DH5α (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Ryc. 4).
Intencją tej pracy jest dostarczenie uproszczonego podejścia do powtarzalnego izolowania błon bakterii Gram-ujemnych. Protokół może być wykorzystany do badania wielu rodzajów cząsteczek związanych z błoną dla tych drobnoustrojów.

<table><tbody><tr><td>Butelki wirówkowe 1 l, PC/PPCO, super speed, z nakrętką uszczelniającą, Nalgene</td><td>VWR</td><td>525-0466</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do przechowywania 1 l Pyrex z nakrętką wysokotemperaturową</td><td>VWR</td><td>10416-312</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera 2 000 mL, wąska szyjka</td><td>VWR</td><td>10545-844</td><td></td></tr><tr><td>4-20% mini prefabrykowane żele białkowe PROTEAN, 12-dołkowe</td><td>4561095</td><td></td><td>BIORAD</td></tr><tr><td>4x próbka Laemmli Bufor 10 ml</td><td>BIORAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu</td><td>VWR</td><td>89049-174</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkanek 7 ml z dwoma szklanymi tłuczkami</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr><tr><td>Zespół butelki z poliwęglanu o pojemności 70 ml</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>VWR</td><td>A10752</td><td></td></tr><tr><td>B10P pH-metr z sondą pH</td><td>VWR</td><td>89231-664</td><td></td></tr><tr><td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (wersja stołowa)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50136146</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa dwuwodna 99,0-101,0%, kryształy, ultraczysty Klasa bioodczynnika Klasa biologii molekularnej, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>4040-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F13-14 x 50cy Rotor o stałym kącie</td><td>nachylenia ThermoFisher Scientific</td><td>75006526</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 6,0 N</td><td>VWR</td><td>BDH7204</td><td></td></tr><tr><td>IBI Scientific Wytrząsarka orbitalna</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>LB Młynek do bulionu</td><td>VWR</td><td>214906</td><td></td></tr><tr><td>lizozym, białko jaja, ultra czysty gatunek</td><td>VWR</td><td>VWRV0063</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 - IVD</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products&nbsp; CZYSTY ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CS&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1624582</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór fenolu, zrównoważony 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagent, do biologii molekularnej</td><td>Sigma - Millipore</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Zestaw testowy</td><td>Thermofisher</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q emerald 300 Lipopolisacharyd Żel Bejgdy</td><td>Thermofisher</td><td>P20495</td><td></td></tr><tr><td>Proteacease -50, bez EDTA</td><td>G Biosciences</td><td>786-334</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, klasa biologii molekularnej</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu &ge; 99,99%</td><td>Wirówka VWR</td><td>AA45780-22</td><td></td></tr><tr><td>Sorval RC 6 Plus</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MiliporeSigma</td><td>SX1075-3</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Wirnik wahadłowy</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan (TRIS, Trometamol) &ge; 99,9% (sucha masa), ultraczysty bioodczynnik klasy biologii molekularnej, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>JT4109-6</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącie</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr></tbody></table>

rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla acinetobacter baumannii

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Ta metoda polega na podziale otoczki bakterii Gram-ujemnych na frakcje całkowite, wewnętrzne i zewnętrzne błony (OM) i kończy się testami oceniającymi czystość dwuwarstw. OM ma zwiększoną gęstość ogólną w porównaniu z błoną wewnętrzną, głównie ze względu na obecność lipooligosacharydów (LOS) i lipopolisacharydów (LPS) w płaszczu zewnętrznym. Cząsteczki LOS i LPS to glikolipidy amfipatyczne, które mają podobną strukturę, która składa się z disacharylipidu lipid-A i podstawnika rdzeniowo-oligosacharydowego. Jednak tylko cząsteczki LPS są ozdobione trzecią podjednostką znaną jako polisacharyd O lub antygen O. Rodzaj i ilość obecnych glikolipidów będzie miała wpływ na gęstość OM organizmu. W związku z tym sprawdziliśmy, czy błony bakterii o zróżnicowanej zawartości glikolipidów można podobnie wyizolować za pomocą naszej techniki. W przypadku organizmów wytwarzających LPS, Salmonella enterica, serowar Typhimurium i Escherichia coli, błony były łatwe do wyizolowania, a ugrupowanie antygenu O LPS nie wpływało na partycjonowanie dwuwarstwowe. Acinetobacter baumannii wytwarza cząsteczki LOS, które mają podobną masę do cząsteczek LPS z niedoborem antygenu O; Jednak błony tych drobnoustrojów początkowo nie mogły zostać rozdzielone. Doszliśmy do wniosku, że OM A. baumannii był mniej gęsty niż u Enterobacteriaceae, więc gradient sacharozy został dostosowany, a błony wyizolowane. Technika ta może być zatem dostosowywana i modyfikowana do stosowania w przypadku innych organizmów.

Technika ta zapewnia skuteczną metodę izolacji błon wewnętrznych (IM) i zewnętrznych (OM) bakterii Gram-ujemnych. Schemat całej procedury przedstawiono na Rysunku 1. Generalnie, normalizacja kultur do OD600 na poziomie 0,6-0,8 w 1 L pożywki lub zebranie od 6,0 do 8,0 x 1011 komórek bakteryjnych zapewni zgromadzenie odpowiedniej ilości materiału błonowego do późniejszej separacji.
Po lizie bakterii i ultrawirowaniu lizatu, na dnie probówki do ...

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Badanie, w jaki sposób mikroorganizmy regulują skład chemiczny poszczególnych dwuwarstw, dostarczy nam wiedzy na temat mechanizmów zabijania antybiotyków, oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i patogenezy chorób. Technika ta dzieli otoczkę komórkową bakterii Gram-ujemnych na dwie zdefiniowane frakcje bez użycia detergentu. Dlatego lipidy, białka i cukry można oceniać w środowisku, które jest półrodzime.Niektóre kroki są zależne od czasu i wymagają skupienia i koordynacji. Początkowo użyj jednej lub dwóch próbek. Gdy poziom komfortu wzrasta, można dodać więcej próbek.Nie należy zajmować się jednocześnie więcej niż sześcioma próbkami. Jest to procedura wielodniowa, a wizualne punkty kontrolne są pomocne w ocenie skuteczności i błędów. Przed wykonaniem tego czasami ostatnie kroki.Przenieś bakterie z zamrożonych zapasów glicerolu na świeże płytki agarowe. Gdy rozwiną się kolonie, przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia pięciomililitrowej probówki wypełnionej pożywką bulionową i hoduj bakterie według potrzeb przez noc.Ponownie rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną do jednego litra preferowanej pożywki bulionowej i inkubować kolby. Po osiągnięciu pożądanej gęstości optycznej wyjąć kolby z inkubatora i umieścić je na lodzie. Zmierz gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach i oblicz objętość kultury, która odpowiada od sześciu do ośmiu razy 10 jedenastej jednostce tworzącej kolonię bakteryjną.Dodać tę objętość kultury do probówki wirówkowej i upewnić się, że pozostałe kultury pozostaną na lodzie do czasu, gdy będą miały być użyte. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez 10 minut w wirówce o stałym kącie, o dużej prędkości w temperaturze od 7 000 do 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie zdekantować supernatant i wyrzucić go.Ponownie zawiesić każdą komórkę w 12,5 mililitra buforu A. Dodaj mieszadło magnetyczne do zawiesiny komórek. Dodaj 180 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr lizozymu do każdego wysiedlenia komórek. Po zebraniu bakterii potraktowanych lizozymem EDTA przez odwirowanie, szybko dodaj inhibitor proteazy, chlorek magnezu i nukleazę do bakterii i szybko ponownie zawieś komórki w buforze B. Mieszaj przez dwie minuty, utrzymując zawiesiny na lodzie.Następnie dodaj 12,5 mililitra 1,5 milimolowego roztworu EDTA do każdej reprodukcji komórek i kontynuuj mieszanie na lodzie przez dodatkowe siedem minut. Przelej zawiesiny do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować zawiesiny w temperaturze od 9 000 do 11 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzucić supernatanty do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zatrzymać granulki na lodzie. Dodaj 25 mililitrów buforu B do każdej osadki komórki. Następnie dodaj 55 mikrolitrów jednego molowego chlorku magnezu, jeden mikrolitr odczynnika RNAZA/DNAZY/nukleazy i jeden mikrolitr koktajlu inhibitorów proteazy.Ponownie zawiesić granulki w mieszance. Energicznie pipetować i wirować, aż roztwory staną się jednorodne. Zawiesiny należy przechowywać na lodzie.Wlać próbkę do cylindra próbki homogenizatora i doprowadzić kuwetę do 20 000 PSI. Aby uniknąć aerozolowania patogenów, należy kondycjonować aparat ciśnieniowy w buforze B i dostosować poziomy ciśnienia przed dodaniem zawiesiny bakteryjnej. Włącz komórkę ciśnieniową i na wszelki wypadek podaj 10 mililitrów buforu B.Zbierz lizat komórkowy w 50-mililitrowych stożkowych probówkach na lodzie, jednocześnie utrzymując próbki na lodzie. Aby osiągnąć całkowitą lizę, powtórz ten proces trzy do pięciu razy. Aby osadzać pozostały, nienaruszony materiał komórkowy, odwiruj zlizowane próbki bakteryjne w temperaturze 6, 169 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Rozprowadzić supernatanty, które teraz zawierają homogenizowane membrany, do butelek z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Ultraodwirować lizaty komórek w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Odrzucić supernatanty i pozostawić granulki membrany na lodzie.Używając szklanego homogenizatora Dounce, ponownie zawieś granulki membrany w jednym mililitrze izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś homogenat próbki do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i umieść probówkę na lodzie. Aby przygotować gradient sacharozy, trzymaj polipropylenową lub ultraprzezroczystą rurkę Open-Top w lekko pochylonej pozycji.Powoli dodawaj dwa mililitry roztworu sacharozy o większej gęstości. Następnie dodaj cztery mililitry roztworu sacharozy o mniejszej gęstości. Przygotowując gradient gęstości, powoli dodawaj roztwór sacharozy, aby uniknąć mieszania warstw.Warstwy sacharozy powinny być lekko widoczne i wydawać się ogólnie zarysowane. Następnie dodaj całkowitą frakcję membranową, która została wcześniej zawieszona w jednym mililitrze izopiknowego roztworu sacharozy o niskiej gęstości. Na koniec napełnij pozostałą część probówki, dodając około sześciu mililitrów izopiknowego roztworu gradientu sacharozy o niskiej gęstości.Ultrawirować próbki za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o temperaturze 288 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 16 do 23 godzin. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 około pięciu mililitrów od punktu. Po zakończeniu wirowania użyj pipety, aby usunąć górną, brązową warstwę z probówki.Przenieś tę warstwę, która zawiera wewnętrzną frakcję membrany, do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania. Pozostaw około dwóch mililitrów roztworu sacharozy powyżej granicy faz między 53% sacharozą a 73% sacharozą, aby upewnić się, że dolna, biała, zewnętrzna frakcja błony nie zanieczyszcza krzyżowo frakcji błony wewnętrznej. Ponownie używając końcówki pipety P1000 z usuniętym końcem, usuń zewnętrzną warstwę membrany i przenieś ją do butelki z poliwęglanu.Wypełnij pozostałą pustkę butelki z poliwęglanu izolowanym buforem do przechowywania membrany i wymieszaj przez inwersję lub pipetowanie. Próbki należy przechowywać na lodzie. Aby zebrać membrany, należy ultraodwirować butelki z poliwęglanu w temperaturze 184, 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.Na koniec wyrzuć supernatanty i dodaj 500 do 1 000 mikrolitrów bufora do przechowywania. Ponownie zawiesić membrany przez homogenizację Dounce. Zbierz próbki do dwóch mililitrowych probówek mikrowirówek.Całkowite granulki membrany zostały zeskrobane, zhomogenizowane i ultraodwirowane przez gradienty gęstości sacharozy w celu oddzielenia membrany wewnętrznej i zewnętrznej. Gradient gęstości sacharozy wynoszący 20%53%73% był wystarczający do podziału niektórych szczepów bakterii. Ale nie do partycjonowania A.baumannii, który został pomyślnie podzielony przy użyciu gradientu 20%45%73%.Aby ocenić skuteczność separacji, próbki membranowe przetestowano pod kątem dehydrogenazy NADH, enzymu znajdującego się w wewnętrznej błonie bakteryjnej. Spadek gęstości optycznej przy 340 nanometrach wskazywał na obecność enzymu. Gęstość optyczną zmierzono dla 50 mikrogramowych próbek wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych typu dzikiego S.typhimurium, E.coli K12 DH5a i zmutowanego galE S.typhimurium.Wyższe stężenie białka dodano podczas oznaczania czystości frakcji błonowych A. baumannii, ponieważ wstępny test przy użyciu 50 mikrogramów sugerował, że względne poziomy dehydrogenazy NADH były niższe dla A. baumannii niż dla innych szczepów bakteryjnych. Aby ocenić zanieczyszczenie krzyżowe wewnętrznych frakcji membranowych z zewnętrznymi frakcjami membrany, LPS i LOS zostały wyekstrahowane i zobrazowane. Ekstrakty zostały załadowane na żel poliakrylamidowy i wybarwione Pro-Q Emerald 300.Acinetobacter baumannii jest ludzkim patogenem o najwyższym priorytecie, odpornym na wiele leków. Protokół ten powinien pomóc naukowcom w zrozumieniu roli lipooligosacharydów, fosfolipidów i lipoprotein w mechanizmach oporności i wirulencji tego wyjątkowego i ważnego patogenu. Metoda ta jest idealna do dalszej analizy fosfolipidów, glikolipidów, węglowodanów, białek i małych cząsteczek, które zwykle występują w podwójnych błonach bakterii Gram-ujemnych.

separation-cell-envelope-for-gram-negative-bacteria-into-inner-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokół oddzielania błon wewnętrznych i zewnętrznych Francisella tularensis poprzez sferoplastykę, lizę osmotyczną i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy.

Metoda izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Figueroa, D. i in. Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu charakteryzacji lokalizacji antybakteryjnych peptydów. J. Vis. Exp. (2018).Ten film pokazuje przygotowanie sferoplastów z pręcikowatych, gram-ujemnych bakterii. Bakterie są hodowane w obecności antybiotyku, tworząc wydłużone włókna. Są one myte roztworem hipertonicznym i traktowane buforem lizowym, aby usunąć zewnętrzną ścianę komórkową. Leczenie hipotoniczne tworzy sferoplasty, które są...

Generowanie sferoplastów z bakterii Gram-ujemnych

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Poznaj metodę rozdzielania otoczki komórkowej bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej bez detergentów. Technika ta umożliwia analizę lipidów, białek i cukrów w środowisku półnatywnym, wspierając badania nad opornością na antybiotyki i wirulencją Acinetobacter baumannii.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii (Wideo) | JoVE Journal

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Przeglądaj więcej filmów