Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Lipidy prątków są ważną cechą rodzaju i mają kluczowe znaczenie w interakcjach prątków gospodarza. Szybkość i wszechstronność to główne zalety tej procedury. Metodę tę można wykorzystać do zrozumienia roli lipidów i patogenności prątków oraz ich działania immunostymulującego.

W celu ekstrakcji lipidów niekowalencyjnie połączonych, dodaj 15 mililitrów jednego do dwóch roztworów chloroformu do roztworu metanolu do szklanej rurki z nakrętką z wkładką PTFE pod okapem z przepływem laminarnym. Następnie zeskrob 200 miligramów prątków ze stałego podłoża i dodaj prątki do szklanej probówki. Inkubować probówkę przez noc, ciągle mieszając.

Następnego dnia przefiltruj rozpuszczalniki organiczne przez szklany lejek wyłożony bibułą filtracyjną do szklanej probówki. Po użyciu strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w probówce, napełnij rurkę gazowym azotem, aby przechowywać probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj 15 mililitrów roztworu chloroformu dwa do jednego do jednego do roztworu metanolu do szczątków komórkowych i inkubuj probówkę przez noc, ciągle mieszając.

Następnego ranka pozostaw mieszaninę na godzinę do odpoczynku, a następnie użyj pipety Pasteura do przeniesienia rozpuszczalników organicznych do szklanego lejka wyłożonego bibułą filtracyjną do tej samej szklanej probówki zbiorczej. Następnie odparuj fazę ciekłą, jak pokazano, przed ponownym napełnieniem probówki gazowym azotem w celu przechowywania w czterech stopniach Celsjusza. W celu ekstrakcji kwasu mykolowego dodaj od dwóch do pięciu mililitrów roztworu mieszającego i 200 miligramów biomasy prątków do hermetycznej szklanej rurki z nakrętką z wkładką PTFE i wymieszaj zawartość przez wirowanie.

Inkubować mieszaninę w suchej kąpieli w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, gdy probówka ostygnie w temperaturze pokojowej, dodaj dwa mililitry Heksanu N i mieszaj zawartość przez 30 sekund przez wirowanie. Pozwól probówce osiąść, aż pojawią się dwie klarowne fazy i przenieś górną fazę N heksanu do nowej probówki.

Wymieszaj dwa dodatkowe mililitry N-heksanu z zawartością probówki i ponownie zbierz górną warstwę. Następnie odparować zawartość probówki przez przepływ azotu i przechowywać próbkę pokrytą azotem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak pokazano. Aby przeanalizować próbki za pomocą TLC, przykryj jedną ścianę komory TLC kawałkiem bibuły filtracyjnej, dodaj wazelinę na rogi komory, aby uszczelnić komorę, aby mieszaninę rozpuszczalników można było nałożyć na bibułę filtracyjną i dodać pozostałą objętość rozpuszczalnika na dno komory TLC.

Zamknij komorę TLC na co najmniej 20 minut do nasycenia. W międzyczasie rozpuść lipidy w szklanej probówce w 200 do 1000 mikrolitrach chloroformu i użyj szklanej rurki kapilarnej, aby nałożyć 10 mikrolitrów zawiesiny chloroformu lipidowego bezpośrednio na płytkę TLC. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia przez pięć minut, włożyć płytkę do nasyconej komory TLC i pozwolić, aby faza ruchoma przepłynęła przez TLC.

Gdy rozpuszczalnik osiągnie jeden centymetr od górnego końca płytki, umieść płytkę pod strumieniem laminarnym, aż krzemionka całkowicie wyschnie. Następnie spryskaj wysuszoną płytkę 15 do 20 mililitrami 10% molowego hydratu kwasu fosforowego w etanolu, aż płytka stanie się jasnożółta, i podgrzewaj płytkę przez dwie do pięciu minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. W tej reprezentatywnej analizie kwas mykolowy wyekstrahowany z różnych gatunków prątków analizowano za pomocą jednowymiarowej TLC przy użyciu dwóch różnych systemów elucji i dwuwymiarowej TLC.

Wykonano również dwa rodzaje procedur metylacji w celu potwierdzenia obecności kwasu mykolowego typu piątego. W obu systemach elucyjnych kwasy mykolowe znajdowały się mniej więcej w środku płytki, chociaż miejsce odpowiadające kwasowi mykolowemu typu piątego obserwowano dopiero po zmydleniu. Dwuwymiarowa TLC pozwala również na identyfikację poszczególnych typów kwasu mykolowego.

Na przykład Mycobacterium brumae wyraża tylko kwasy mykolowe typu pierwszego, Mycobacterium bovis BCG wyraża typ pierwszy i czwarty, Mycobacterium fortuitum wyraża typ pierwszy i piąty, a Mycobacterium abcessus wyraża profile kwasu mykolowego typu pierwszego i drugiego. Całkowite ekstrakty lipidowe z różnych gatunków prątków analizowano w funkcji ich polarności i wielkości. Okazuje się, że większość lipidów polarnych A, takich jak PDIM, jest obecna w Mycobacterium bovis BCG, ale nie w Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium brumae i gładkim morfotypie M abcessus.

Glikolipidy fenolowe są obecne tylko w Mycobacterium bovis BCG, podczas gdy GlycoPeptidoLipids obserwuje się tylko w próbkach z Mycobacterium abcessus. Podobnie jak kwasy mykolowe, acyloglicerole i PDIM, PIM można również łatwo wizualizować za pomocą jednowymiarowej analizy TLC lub TLC 2D. Do odsłonięcia PIM-ów w jednowymiarowej TLC użyto dwóch rodzajów barwień.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próbowania tego protokołu, jest to, aby nie używać żadnych plastikowych narzędzi podczas całej procedury.