Name: Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy lipidów prątków oraz kwasów mykolowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Protokół umożliwia szybką i wszechstronną charakterystykę profili lipidowych różnych gatunków Mycobacterium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (RTI2018-098777-B-I00), Fundusze FEDER oraz Generalitat Katalonii (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido jest laureatką kontraktu doktorskiego (FI) z Generalitat de Catalunya.

1. Ekstrakcja całkowitej ilości niekowalencyjnie połączonych lipidów z prątków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Zeskrob 0,2 g prątków z pożywki stałej i dodaj do szklanej probówki z nakrętkami z wkładki z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dodać roztwór składający się z 5 ml chloroformu i 10 ml metanolu (chloroform: metanol, 1:2). 
	UWAGA: W przypadku stosowania rozpuszczalników organicznych należy używać wyłącznie szklanego pojemnika. Pojemniki plastikowe nie są dozwolone. Ponadto potrzebne są nakrętki z wkładką PTFE do butelek. 
	UWAGA: Chloroform jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Metanol jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków. 
	UWAGA: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.</li>
	<li>Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną, przefiltruj rozpuszczalniki organiczne i zbierz je do szklanej probówki.</li>
	<li>Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnij probówkę azotem gazowym, przykryj i przechowuj w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Podłącz szklaną pipetę Pasteura do strumienia azotu gazowego, aby dokładnie odparować żądaną probówkę. Dodatkowo utrzymuj rurkę w suchym bloku grzejnym dla rur w temperaturze 37 °C. Gdy rozpuszczalnik odparuje, napełnij rurkę gazowym azotem przed jej zamknięciem.</li>
	<li>Dodać 15 ml roztworu chloroformu:metanolu (2:1) do resztek komórkowych. Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków. 
	UWAGA: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.</li>
	<li>Odstaw mieszaninę na 1 godzinę. Za pomocą pipety Pasteura odzyskaj rozpuszczalniki organiczne. Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną i przefiltruj rozpuszczalniki organiczne, a następnie zbierz je w tej samej szklanej probówce, która została poprzednio użyta w kroku 1.3. Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i ponownie przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja kwasu mykolowego metodą kwasowej metalizy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Dodaj 2-5 ml roztworu estryfikującego do hermetycznej szklanej rurki z nakrętką z wkładki PTFE. Dodać 0,2 g biomasy prątków do szklanej probówki. 
	UWAGA: Roztwór estryfikacyjny powstaje przez zmieszanie 30 ml metanolu, 15 ml toluenu i 1 ml kwasu siarkowego. Komórki prątków można pobrać z kultur stałych lub nawet z komórek zdelipidowanych po przeprowadzeniu ekstrakcji całkowitych lipidów niezwiązanych kowalencyjnie z prątków (pozostałe komórki po przefiltrowaniu w kroku 1.6). 
	UWAGA: Toluen jest substancją łatwopalną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Kwas siarkowy jest substancją i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Pozostawić mieszaninę na noc w suchej kąpieli w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Pozwól probówce ostygnąć, aż osiągnie temperaturę pokojową, a następnie dodaj 2 ml n-heksanu do probówki. Mieszaj zawartość przez wirowanie przez 30 s i pozwól probówce osiąść, aż pojawią się dwie klarowne fazy. 
	UWAGA: n-heksan jest substancją potencjalnie łatwopalną, drażniącą, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Odzyskać górną fazę odpowiadającą fazie n-heksanu. Przenieś go do nowej probówki.</li>
	<li>Powtórz krok 2.3. Ponownie odzyskać górną fazę i przenieść ją do tej samej probówki, która została użyta w kroku 2.4.</li>
	<li>Odparować zawartość probówki za pomocą strumienia azotu gazowego. Napełnij probówkę azotem gazowym, zamknij ją i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja kwasu mykolowego metodą zmydlania i metylacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Zdrap 0,2 g prątków z podłoża stałego i dodaj do szklanej rurki z nakrętką z PTFE.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu metanolu i benzenu (80:20) zawierającego 5% wodorotlenku potasu. Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Podgrzewać mieszaninę przez 3 godziny w temperaturze 100 °C. 
	UWAGA: Benzen jest substancją łatwopalną, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Pozwól probówce ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 20% kwasu siarkowego w celu zakwaszenia próbek, aby osiągnąć pH = 1.</li>
	<li>Dodać 3 ml eteru dietylowego. Delikatnie wymieszaj zawartość przez wirowanie.</li>
	<li>Niech uformują się dwie fazy przez osiadanie. Odzyskaj fazę eteru dietylowego i przenieś do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.</li>
	<li>Przemyć ekstrakt eteru dietylowego 2 ml wody destylowanej i przenieść górną część odpowiadającą eterowi dietylowemu do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.</li>
	<li>Dodać 2 g bezwodnego siarczanu sodu do ekstraktu z eteru dietylowego, aby go wysuszyć.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę. Odparować zawartość za pomocą strumienia gazowego azotu.</li>
	<li>Aby przeprowadzić etap metylacji, rozpuść 3 g N-nitrozo-N-metylomocznika we wstępnie schłodzonym roztworze utworzonym przez 45 ml eteru dietylowego i 9 ml 40% KOH w wodzie destylowanej. 
	UWAGA: N-nitrozo-N-metylomocznik jest substancją toksyczną, drażniącą, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Przenieść supernatant (diazometan) do nowej kolby schłodzonej w lodzie zawierającej granulki wodorotlenku potasu (około 30 g). 
	UWAGA: Jeśli supernatant nie zostanie natychmiast użyty, można go przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 1 godzinę 
	UWAGA: Granulki wodorotlenku potasu są substancją drażniącą i. Materiał ten musi być używany w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Diazometan jest wysoce toksyczny i potencjalnie wybuchowy. Należy go używać w okapie z przepływem laminarnym ze szkłem bezpiecznym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu eteru zawierającego diazometan, otrzymanego w kroku 3.10, do wysuszonego ekstraktu eteru dietylowego, który zawiera kwasy mykolowe, otrzymanego w kroku 3.8. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odparować zawiesinę w temperaturze 40 °C. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i przechowywać metylowane lipidy w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Odparować diazometan z roztworu eteru pod okapem z przepływem laminarnym, aż eter straci żółty kolor.</li>
</ol>
4. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
<ol>
	<li>Nasącz szklaną komorę TLC. W tym celu przykryj jedną ze ścian komory TLC kawałkiem bibuły filtracyjnej i pozwól jej zetknąć się z fazą ruchomą utworzoną przez mieszaninę rozpuszczalników. Umieść pozostałą objętość rozpuszczalnika na dnie komory TLC. 
	UWAGA: Dno komory TLC musi być przykryte co najmniej 1 cm fazą ruchomą. W obecnych eksperymentach wykorzystano różne fazy ruchome do opracowania TLC. Składały się one z 85 ml n-heksanu i 15 ml eteru dietylowego; 100 ml dichlorometanu; 90 ml chloroformu, 10 ml metanolu i 1 ml wody; 30 ml chloroformu, 8 ml metanolu i 1 ml wody; 60 ml chloroformu, plus 35 ml metanolu i 8 ml wody; 95 ml chloroformu plus 5 ml metanolu; i 90 ml eteru naftowego (60–80 °C) plus 10 ml eteru dietylowego. 
	UWAGA: W dwuwymiarowym TLC użyj n-heksanu:acetonu (95:5) w pierwszym kierunku trzy razy i użyj pojedynczego wywołania z toluenem:acetonem (97:3) w drugim kierunku, aby przeanalizować skład kwasu mykolowego. Aby przeanalizować PIM, użyj chloroformu:metanolu:wody (60:30:6) w pierwszym kierunku raz i użyj chloroformu:kwasu octowego:metanolu:wody (40:25:3:6) w drugim kierunku. Do analizy PDIM i AG należy trzykrotnie użyć eteru naftowego (60-80 °C): octanu etylu (98:2) w pierwszym kierunku i użyć pojedynczego wywołania z eterem naftowym (60-80 °C):acetonu (98:2) w drugim kierunku. 
	UWAGA: Eter dietylowy jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Dichlorometan jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Eter naftowy jest substancją potencjalnie łatwopalną, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Kwas octowy jest substancją potencjalnie łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Octan etylu jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Aceton jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
	<li>Zamknij komorę TLC, aby nasycić ją przez co najmniej 20 minut. W międzyczasie rozpuść lipidy obecne w szklanej probówce w 0,2-1 ml chloroformu. 
	UWAGA: Objętość użyta do rozpuszczenia lipidów może być modyfikowana w zależności od pożądanego lub oczekiwanego stężenia próbki.</li>
	<li>Nanieść 10 μl każdej zawiesiny za pomocą szklanej rurki kapilarnej bezpośrednio na płytkę TLC i pozostawić próbkę do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Próbki należy nakładać w dolnej części płytki, pozostawiając 1 cm z każdej strony. Próbki muszą być oddalone od siebie o co najmniej 0,5 cm. Po nałożeniu próbki na płytkę, probówki można ponownie odparować za pomocą azotu gazowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.</li>
	<li>Włożyć płytkę do nasyconej komory TLC zawierającej fazę ruchomą. Pozwól, aby faza ruchoma przebiegała przez TLC. 
	UWAGA: Każdy ruch zastosowany w komorze TLC wpływa na płyn płynący rozpuszczalnik na płytce i wpływa na ruchliwość lipidów. W przypadku wykonywania dwuwymiarowej TLC, wymagane są dwie komory TLC, które muszą zawierać oba systemy elucji.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z komory TLC, gdy rozpuszczalnik osiągnie odległość 1 cm od górnego końca płytki. Pozostawić płytkę pod strumieniem laminarnym do całkowitego wyschnięcia krzemionki. 
	UWAGA: W przypadku analizy składu kwasu mykolowego przy użyciu n-heksanu i eteru dietylowego (85:15), powtórz kroki 4.4 i 4.5 jeszcze dwa razy, aż do trzykrotnego przeprowadzenia fazy ruchomej na płytce TLC.</li>
	<li>Odsłoń płytkę z wymaganą plamą; w razie potrzeby podgrzej płytę. 
	UWAGA: W niniejszym eksperymencie do rozpylania płytek TLC użyto 15-20 ml następujących roztworów: 10% hydrat kwasu molibdatofosforowego w etanolu, aż płytka stanie się jasnożółta, a następnie podgrzanie płytki w temperaturze 120 °C; 5% w etanolu 20% α-naftolu w kwasie siarkowym, a następnie podgrzanie płytki do 120 °C; Odczynnik Molibden Blue (1,3% tlenek molibdenu w 4,2 M kwasie siarkowym) do momentu pojawienia się pasm fosforanowych lub 1% antronu w kwasie siarkowym. 
	UWAGA: Hydrat kwasu molibdatofosforowego jest substancją łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Etanol jest substancją potencjalnie łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: 1-Naftol jest substancją łatwopalną, i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe). 
	UWAGA: Odczynnik w sprayu Molibdenum Blue jest substancją, toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).</li>
</ol>

<ol><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains%3B+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li>
<li>Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO%22">WHO</a>. , (2019).</li>
<li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li>
<li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).</li>
<li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li>
<li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+virulence+factors%3A+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).</li>
<li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li>
<li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185(2016).</li>
<li>Guallar-Garrido, S., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+Calmette-Gu%C3%A9rin+%28BCG%29+therapy+for+bladder+cancer%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li>
<li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li>
<li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology+Focus%22%5BJournal%5D)">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li>
<li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232(2016).</li>
<li>Rodríguez-Güell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li>
<li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li>
<li>Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734(2020).</li>
<li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li>
<li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li>
<li>Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMinnikin%2C+DE+%22Topics+in+Lipid+Research%3A+From+Structural+Elucidation+to+Biological+Function%22">Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function</a>. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).</li>
<li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li>
<li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Bacteriology+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li>
<li>Muñoz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li>
<li>Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphthienoyl+trehalose%2C+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li>
<li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li>
<li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li>
<li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354%5BTitle%5D)+AND+%22Microbios%22%5BJournal%5D)">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li>
<li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Chest+Diseases+%26+Allied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li>
<li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management%5BTitle%5D)+AND+%22NanoBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Current+Microbiology+and+Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li>
<li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mycobacterium+tuberculosis+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li>
<li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li>
<li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li>
<li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+polyphleates%2C+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus%2C+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology%2C+which+have+been+associated+with+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).</li>
<li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+%22Mtb+LipidDB%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li>
<li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li>
<li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+%28TLC-FID%29+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono prosty protokół uznawany za złoty standard metody ekstrakcji niekowalencyjnie połączonych związków lipidowych ze ściany komórkowej prątków. Pokazano dalszą wizualizację za pomocą jedno- i dwuwymiarowych TLC z wyekstrahowanych lipidów czterech różnych prątków.
Dwie kolejne połączone mieszaniny chloroformu i metanolu w celu odzyskania zawartości lipidów w komórkach prątków są najczęściej stosowaną mieszaniną rozpuszczalników 23,24,25,26,27,28,29.<...

Mycobacterium to rodzaj obejmujący gatunki chorobotwórcze i niepatogenne, charakteryzujący się wysoce hydrofobową i nieprzepuszczalną ścianą komórkową utworzoną przez ich specyficzne lipidy. W szczególności ściana komórkowa prątków zawiera kwasy mykolowe, które są α-alkilowymi i β-hydroksykwasami tłuszczowymi, w których gałąź α jest stała we wszystkich kwasach mykolowych (z wyjątkiem długości), a łańcuch β, zwany łańcuchem meromykolanowym, jest długim łańcuchem alifatycznym, który może zawierać różne funkcjonalne grupy chemiczne opisane wraz z literaturą (α-, α'-, metoksy-, κ-, epoksydowo-, karboksylowe i ω-1-metoksy-mykołany), wytwarzając w ten sposób siedem rodzajów kwasów mykolowych (I-VII)1. Co więcej, inne lipidy o niekwestionowanym znaczeniu są również obecne w ścianie komórkowej gatunków prątków. Gatunki chorobotwórcze, takie jak Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę2 wytwarzają specyficzne czynniki wirulencji na bazie lipidów, takie jak dimykocerozy ftiocerolu (PDIM), glikolipidy fenolowe (PGL), di-, tri- i penta-acylotrehalozy (DAT, TAT i PAT) lub sulfolipidy, między innymi3. Ich obecność na powierzchni prątków wiąże się ze zdolnością do modyfikowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza, a tym samym z ewolucją i trwałością prątków wewnątrz gospodarza4. Na przykład obecność triacylogliceroli (TAG) została związana z hiperwirulentnym fenotypem podlinii M. tuberculosis linii 2-Pekin, prawdopodobnie ze względu na jej zdolność do tłumienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza5,6. Innymi istotnymi lipidami są lipooligosacharydy (LOS) obecne w prątkach gruźliczych i niegruźliczych. W przypadku Mycobacterium marinum obecność LOS w jego ścianie komórkowej jest związana z ruchliwością ślizgową i zdolnością do tworzenia biofilmów oraz zakłóca rozpoznawanie przez receptory rozpoznające wzorce makrofagów, wpływając na wychwyt i eliminację bakterii przez fagocyty gospodarza7,8. Ponadto brak lub obecność niektórych lipidów pozwala na klasyfikację członków tego samego gatunku do różnych morfotypów o profilach zjadliwych lub osłabionych podczas interakcji z komórkami gospodarza. Na przykład, brak glikopeptydolipidów (GPL) w przybliżonym morfotypie Mycobacterium abscessus jest związany ze zdolnością do indukowania zakwaszenia śródfagosomalnego, a w konsekwencji apoptozy komórek9, w przeciwieństwie do gładkiego morfotypu, który posiada GPL na swojej powierzchni. Ponadto zawartość lipidów w ścianie komórkowej prątków jest związana ze zdolnością do modyfikowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jest to istotne w kontekście wykorzystania niektórych prątków do uruchomienia ochronnego profilu immunologicznego przeciwko różnym patologiom10,11,12,13. Wykazano na przykład, że Mycolicibacterium vaccae, saprofityczne prątki, które są obecnie w fazie III badań klinicznych jako szczepionka immunoterapeutyczna przeciwko gruźlicy, wykazują dwa morfotypy kolonialne. Podczas gdy gładki fenotyp, który zawiera poliester na swojej powierzchni, wyzwala odpowiedź Th2, szorstki fenotyp pozbawiony poliestru może indukować profil Th1, gdy wchodzi w interakcję z komórkami odpornościowymi gospodarza14. Repertuar lipidów obecnych w komórce prątkowej zależy nie tylko od gatunku prątków, ale także od warunków kultur prątków: czas inkubacji15,16 lub skład podłoża hodowlanego17,18. W rzeczywistości zmiany w składzie pożywki wpływają na działanie przeciwnowotworowe i immunostymulujące M. bovis BCG i Mycolicibacterium brumae in vitro17. Co więcej, ochronny profil immunologiczny wywołany przez M. bovis BCG przeciwko prowokacji M. tuberculosis w modelach mysich zależy również od pożywki hodowlanej, w której rośnie M. bovis BCG17. Można je następnie powiązać ze składem lipidowym prątków w każdym stanie hodowli. Z tych wszystkich powodów istotne jest badanie zawartości lipidów w prątkach. Przedstawiono wizualną procedurę ekstrakcji i analizy składu lipidowego ściany komórkowej prątków.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>UWAGA. Bezwodny do analizy EMSURE&reg; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carlo Erba</td><td>400971N</td><td>UWAGA. ACETON RPE-ACS-ISO DO ANALIZ ml 1000</td></tr><tr><td>Anthrone</td><td>Merck</td><td>8014610010</td><td>Anthrone do syntezy.</td></tr><tr><td>Benzen</td><td>Carlo Erba</td><td>426113</td><td>UWAGA. Benzen RPE - Do analizy - ACS 2,5 l</td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna</td><td>Merck</td><td>BR708709</td><td>MARKA&reg; &nbsp; jednorazowe BLAUBRAND&reg; &nbsp; mikropipety, intraMark</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carlo Erba</td><td>412653</td><td>UWAGA. Chloroform RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Stabilizowany etanolem 2,5 L</td></tr><tr><td>Suchy blok</td><td>grzewczy J.P. Selecta</td><td>7471200</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Carlo Erba</td><td>412622</td><td>UWAGA. Dichlorometan RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Stabilizowany amylenem 2,5 L</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Carlo Erba</td><td>412672</td><td>UWAGA. Eter dietylowy RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Niestabilizowany 2,5 L</td></tr><tr><td>octanu etylu</td><td>Panreac</td><td>1313181211</td><td>UWAGA. Octan etylu (Reag. USP, Ph. Eur.) do analizy, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy Absolute</td><td>Carlo Erba</td><td>4146072</td><td>UWAGA. Etanol absolutny bezwodny RPE - Do analizy - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td></tr><tr><td>Lejek szklany</td><td>VidraFOC</td><td>DURA.2133148 1217/1</td><td></td></tr><tr><td>Rurka szklana</td><td>VidraFOC</td><td>VFOC.45066A-16125</td><td>Rurka szklana z nakrętką z odzysku PTFE</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>412722</td><td>UWAGA. Metanol RS - Do HPLC - ZŁOTO - Ultragradientowy stopień 2,5 L</td></tr><tr><td>Hydrat kwasu molibdetofosforowego</td><td>Merck</td><td>51429-74-4</td><td>UWAGA.</td></tr><tr><td>Odczynnik w sprayu Molibdenum Blue, 1,3%</td> <td>Sigma</td><td>M1942-100ML</td><td>UWAGA.</td></tr><tr><td>n-heksan</td><td>Carlo Erba</td><td>446903</td><td>UWAGA. n-Heksan 99% RS - ATRASOL - Do analizy śladów 2,5 L</td></tr><tr><td>n-nitrozo-n-metylomocznika</td><td>Sigma</td><td>N4766</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Orbitalna platforma wibratorska</td><td>DDBiolab</td><td>995018</td><td>NB-205L Inkubator laboratoryjny</td></tr><tr><td>Eter naftowy (60-80&ordm; C)</td> <td>Carlo Erba</td><td>427003</td><td>UWAGA. Eter naftowy 60 - 80&deg; C RPE - Do analizy 2,5 L</td></tr><tr><td>Opryskiwacz</td><td>VidraFOC</td><td>712/1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu bezwodny</td><td>Merck</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311000</td><td>UWAGA. Kwas siarkowy 95-97%</td></tr> <tr><td>komora TLC</td><td>Merck</td><td>Z204226-1EA</td><td>Prostokątne zbiorniki do wywoływania TLC, kompletne L i razy; H i czasy; szer. 22 cm i razy; 22 cm i razy; Płytka TLC 10 cm</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>1057210001</td><td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td></tr><tr><td>Grzejnik płytowy</td><td>TLC CAMAG</td><td>223306</td><td>CAMAG TLC Plat Heater III</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Carlo Erba</td><td>488551</td><td>UWAGA. Toluen RPE - Do analizy - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>10132562</td><td>IKA&nbsp; Agitador IKA v&oacute; rtex 3</td></tr><tr><td>1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102269427</td><td>UWAGA.</td></tr></tbody></table>

analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Gatunki prątków mogą różnić się od siebie szybkością wzrostu, obecnością pigmentacji, morfologią kolonii wyświetlaną na pożywkach stałych, a także innymi cechami fenotypowymi. Jednak wszystkie mają wspólną cechę najistotniejszą cechę prątków: unikalną i wysoce hydrofobową ścianę komórkową. Gatunki prątków zawierają kompleks połączony z błoną kowalencyjną, który obejmuje arabinogalaktan, peptydoglikan i długie łańcuchy kwasów mykolowych o typach różniących się między gatunkami prątków. Ponadto prątki mogą również wytwarzać lipidy, które znajdują się, niekowalencyjnie połączone, na powierzchni swoich komórek, takie jak między innymi dimykocerozyany ftiocerolu (PDIM), glikolipidy fenolowe (PGL), glikopeptydolipidy (GPL), acylotrehalozy (AT) lub mannozydy fosfatydylo-inozytolu (PIM). Niektóre z nich są uważane za czynniki wirulencji w chorobotwórczych prątkach lub krytyczne lipidy antygenowe w interakcji gospodarz-prątki. Z tych powodów istnieje duże zainteresowanie badaniem lipidów prątków ze względu na ich zastosowanie w kilku dziedzinach, od zrozumienia ich roli w patogenności zakażeń prątkami, po możliwe implikacje jako środki immunomodulujące w leczeniu chorób zakaźnych i innych patologii, takich jak rak. W tym miejscu przedstawiono proste podejście do ekstrakcji i analizy całkowitej zawartości lipidów i składu kwasu mykolowego w komórkach prątków hodowanych w pożywce stałej przy użyciu mieszanin rozpuszczalników organicznych. Po uzyskaniu ekstraktów lipidowych przeprowadza się chromatografię cienkowarstwową (TLC) w celu monitorowania wyekstrahowanych związków. Przykładowy eksperyment przeprowadza się na czterech różnych prątkach: szybko rosnących w środowisku Mycolicibacterium brumae i Mycolicibacterium fortuitum, atenuowanym, wolno rosnącym Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) oraz oportunistycznym patogenie szybko rosnącym Mycobacterium abscessus, co pokazuje, że metody przedstawione w niniejszym protokole mogą być stosowane do szerokiego zakresu prątków.

W celu wykazania szerokiego spektrum lipidów występujących u różnych gatunków prątków, *M. bovis* Wybrano BCG, ponieważ są to prętkowce o morfologii szorstkiej i wolnym wzroście. Szorstkie i szybko rosnące M. fortuitum i *M. brumae* dodano w ramach procedury, a na koniec gładki morfotyp *M. abscessus* zostały również uwzględnione. Te cztery gatunki pozwalają nam na wizualizację szerokiego spektrum lipidów pochodzenia prątkowego, takich jak acyltrehalozy (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, TDM i...

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Lipidy prątków są ważną cechą rodzaju i mają kluczowe znaczenie w interakcjach prątków gospodarza. Szybkość i wszechstronność to główne zalety tej procedury. Metodę tę można wykorzystać do zrozumienia roli lipidów i patogenności prątków oraz ich działania immunostymulującego.W celu ekstrakcji lipidów niekowalencyjnie połączonych, dodaj 15 mililitrów jednego do dwóch roztworów chloroformu do roztworu metanolu do szklanej rurki z nakrętką z wkładką PTFE pod okapem z przepływem laminarnym. Następnie zeskrob 200 miligramów prątków ze stałego podłoża i dodaj prątki do szklanej probówki. Inkubować probówkę przez noc, ciągle mieszając.Następnego dnia przefiltruj rozpuszczalniki organiczne przez szklany lejek wyłożony bibułą filtracyjną do szklanej probówki. Po użyciu strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w probówce, napełnij rurkę gazowym azotem, aby przechowywać probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj 15 mililitrów roztworu chloroformu dwa do jednego do jednego do roztworu metanolu do szczątków komórkowych i inkubuj probówkę przez noc, ciągle mieszając.Następnego ranka pozostaw mieszaninę na godzinę do odpoczynku, a następnie użyj pipety Pasteura do przeniesienia rozpuszczalników organicznych do szklanego lejka wyłożonego bibułą filtracyjną do tej samej szklanej probówki zbiorczej. Następnie odparuj fazę ciekłą, jak pokazano, przed ponownym napełnieniem probówki gazowym azotem w celu przechowywania w czterech stopniach Celsjusza. W celu ekstrakcji kwasu mykolowego dodaj od dwóch do pięciu mililitrów roztworu mieszającego i 200 miligramów biomasy prątków do hermetycznej szklanej rurki z nakrętką z wkładką PTFE i wymieszaj zawartość przez wirowanie.Inkubować mieszaninę w suchej kąpieli w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, gdy probówka ostygnie w temperaturze pokojowej, dodaj dwa mililitry Heksanu N i mieszaj zawartość przez 30 sekund przez wirowanie. Pozwól probówce osiąść, aż pojawią się dwie klarowne fazy i przenieś górną fazę N heksanu do nowej probówki.Wymieszaj dwa dodatkowe mililitry N-heksanu z zawartością probówki i ponownie zbierz górną warstwę. Następnie odparować zawartość probówki przez przepływ azotu i przechowywać próbkę pokrytą azotem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak pokazano. Aby przeanalizować próbki za pomocą TLC, przykryj jedną ścianę komory TLC kawałkiem bibuły filtracyjnej, dodaj wazelinę na rogi komory, aby uszczelnić komorę, aby mieszaninę rozpuszczalników można było nałożyć na bibułę filtracyjną i dodać pozostałą objętość rozpuszczalnika na dno komory TLC.Zamknij komorę TLC na co najmniej 20 minut do nasycenia. W międzyczasie rozpuść lipidy w szklanej probówce w 200 do 1000 mikrolitrach chloroformu i użyj szklanej rurki kapilarnej, aby nałożyć 10 mikrolitrów zawiesiny chloroformu lipidowego bezpośrednio na płytkę TLC. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia przez pięć minut, włożyć płytkę do nasyconej komory TLC i pozwolić, aby faza ruchoma przepłynęła przez TLC.Gdy rozpuszczalnik osiągnie jeden centymetr od górnego końca płytki, umieść płytkę pod strumieniem laminarnym, aż krzemionka całkowicie wyschnie. Następnie spryskaj wysuszoną płytkę 15 do 20 mililitrami 10% molowego hydratu kwasu fosforowego w etanolu, aż płytka stanie się jasnożółta, i podgrzewaj płytkę przez dwie do pięciu minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. W tej reprezentatywnej analizie kwas mykolowy wyekstrahowany z różnych gatunków prątków analizowano za pomocą jednowymiarowej TLC przy użyciu dwóch różnych systemów elucji i dwuwymiarowej TLC.Wykonano również dwa rodzaje procedur metylacji w celu potwierdzenia obecności kwasu mykolowego typu piątego. W obu systemach elucyjnych kwasy mykolowe znajdowały się mniej więcej w środku płytki, chociaż miejsce odpowiadające kwasowi mykolowemu typu piątego obserwowano dopiero po zmydleniu. Dwuwymiarowa TLC pozwala również na identyfikację poszczególnych typów kwasu mykolowego.Na przykład Mycobacterium brumae wyraża tylko kwasy mykolowe typu pierwszego, Mycobacterium bovis BCG wyraża typ pierwszy i czwarty, Mycobacterium fortuitum wyraża typ pierwszy i piąty, a Mycobacterium abcessus wyraża profile kwasu mykolowego typu pierwszego i drugiego. Całkowite ekstrakty lipidowe z różnych gatunków prątków analizowano w funkcji ich polarności i wielkości. Okazuje się, że większość lipidów polarnych A, takich jak PDIM, jest obecna w Mycobacterium bovis BCG, ale nie w Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium brumae i gładkim morfotypie M abcessus.Glikolipidy fenolowe są obecne tylko w Mycobacterium bovis BCG, podczas gdy GlycoPeptidoLipids obserwuje się tylko w próbkach z Mycobacterium abcessus. Podobnie jak kwasy mykolowe, acyloglicerole i PDIM, PIM można również łatwo wizualizować za pomocą jednowymiarowej analizy TLC lub TLC 2D. Do odsłonięcia PIM-ów w jednowymiarowej TLC użyto dwóch rodzajów barwień.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próbowania tego protokołu, jest to, aby nie używać żadnych plastikowych narzędzi podczas całej procedury.

analysis-lipid-composition-mycobacteria-thin-layer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy lipidów prątków oraz kwasów mykolowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Protokół umożliwia szybką i wszechstronną charakterystykę profili lipidowych różnych gatunków Mycobacterium.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Przeglądaj więcej filmów