Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wpływu bakteryjnych czynników wirulencji na sygnalizację wewnątrzkomórkową. Osiąga się to poprzez stworzenie stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję badanego białka. Aby w drugim kroku zbadać jego aktywność na poziomie całej populacji komórek, tworzony jest indukowalny system wektorów ekspresyjnych, który pozwala na aktywację kaskady sygnalizacyjnej komórki gospodarza na określonym etapie. Następnie analizowane jest, czy badane białko może zakłócać aktywację kaskady sygnalizacyjnej komórki gospodarza, aby zawęzić zakres punktu aktywności badanego białka. Wyniki analizy western blotting wykazują, że czynnik wirulencji KA B z bakterii cozy yellow Burnett zakłóca kaskadę apoptotyczną poniżej poziomu backs i powyżej aktywacji cascade three.

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii infekcji, takie jak zidentyfikowanie kluczowego etapu w kaskadzie transdukcji sygnału, na którym oddziałuje dane białko efektorowe bakterii. Pozwoli to nie tylko lepiej zrozumieć, w jaki sposób mikroorganizmy patogenne manipulują swoimi gospodarzami, ale także jak funkcjonują te podstawowe procesy komórkowe. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat strategii bakteryjnych zapobiegających wystąpieniu apoptotycznej śmierci komórki, może być ona również zastosowana do innych systemów transdukcji sygnału w obszarze śmierci komórki, takich jak nekroptoza lub piroptoza, a także do sieci sygnalizacyjnych zaangażowanych w proliferację komórek, regulację genów lub reakcje układu odpornościowego.

Procedurę tę zademonstruje Stephanie Besler, doktorantka z laboratorium Manna. Rozpocznij procedurę od wysiania komórek HEK 2 93 stabilnie exprimujących GFP lub GFP, say B w płytce 12-dołkowej z gęstością 100 000 komórek na dołek.

Następnie przygotuj osobno DNA oraz polietylenowy odczyn do transfekcji w 75 µL opt medium i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksów. Inkubuj obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodaj kroplowo roztwór DNA z polietylenem do komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C w 5% CO2.

Pięć godzin po transfekcji indukuje się ekspresję białek proapoptotycznych poprzez dodanie 1 µg/mL doksycykliny do pożywki hodowlanej. Następnie komórki inkubuje się przez 18 h w temperaturze 37 °C w 5% CO₂. Przed zebraniem komórek należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym, czy doszło do indukcji śmierci komórkowej.

Zbadaj komórki z indukowaną apoptozą, które można zidentyfikować po obecności ciał apoptotycznych. Następnie usuń naddatek i wypłucz przytwierdzone komórki. Po jednym razie ciepłym PBS zawiesić komórki w 100 µL dwukrotnego buforu do próbek Laemmli.

Następnie podgrzewaj przez pięć minut w temperaturze 95°C, a po tym czasie przechowuj w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Po tym nałóż 6 µL komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Następnie nałóż około 40 000 komórek na próbkę na żel SDS-PAGE o stężeniu 12%.

Przeprowadź elektroforezę żeli w systemie do elektroforezy żelowej przy stałym napięciu 180 V przez 45 do 60 minut, stosując jednokrotny bufor do elektroforezy laly. Następnie przenieś białka na membrany PVDF przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut, korzystając z komory do transferu półsuchego trans blot SD. Po tym czasie zablokuj membrany w 10 ml MPT przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Rozcieńczyć 7 µL przeciwciała przeciwko rozszczepionej białku PARP w 7 mL MPT. Inkubować membranę PVDF w roztworze przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciał i przeprowadzić trzy 10-minutowe płukania w PBS z 0,05% Tween 20, a następnie inkubować membrany z 1,4 µL przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych w 7 mL MPT, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Membrany należy przemyć trzykrotnie roztworem PBS z 0,05% Tween 20, a następnie wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Do wizualizacji prążków białkowych należy użyć standardowego sprzętu do wywoływania filmów. Następnie, po trzech przemyciach roztworem PBS z 0,05% Tween 20, należy usunąć związane przeciwciała, inkubując membrany w 7 mL buforu do strippingu western blot przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować membrany przez noc w temperaturze 4 °C z 4 µL przeciwciała anty-aktynowego w 4 mL MPT.

Następnego dnia przeprowadź trzy 10-minutowe etapy płukania membran przy użyciu około 10 mililitrów PBS 0,05%Tween 20, następnie inkubuj membrany z 1,4 mikrolitrami przeciwciał wtórnych koniugowanych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych w siedmiu mililitrach MPT. Po godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej przemyj membrany trzykrotnie za pomocą PBS 0,05%Tween 20, wykryj aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą komercyjnego zestawu i zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmów w celu wizualizacji prążków białkowych. W tym eksperymencie lizaty całych komórek HEK 2 93 GFP oraz HEK 2 93 GFP sabe poddano analizie immunoblotting pod kątem GFP, aby wykazać stabilną ekspresję.

Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej komórek HEK 2 93 GFP oraz HEK 2 93 GFP sabe wykazuje intensywność ekspresji GFP. Komórki HEK 2 93 GFP i HEK 2 93 GFP sabe poddano działaniu 4 µM sporiny przez sześć godzin w celu wywołania apoptozy wewnątrzpochodnej. Apoptozę przeanalizowano za pomocą immunoblottingu na obecność rozszczepionego PARP, wykazując, że rozszczepienie PARP uległo zmniejszeniu w komórkach HK 2 9 3 GFP SA B w porównaniu z komórkami HK 2 93 GFP.

CB chroni przed apoptozą indukowaną przez bax, ale nie przed apoptozą indukowaną przez kaspazę 3. Podczas wdrażania tej procedury ważne jest zbadanie jak największej liczby komponentów szlaku sygnałowego, aby pomóc w zidentyfikowaniu etapu interakcji. Warto również testować białka w ich stanach podstawowym i aktywowanym, aby ustalić, czy wybrane białko efektorowe zakłóca sam szlak, czy raczej etap aktywacji następujący po tej procedurze.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są dokładne mechanizmy molekularne wykorzystywane przez te efektory mikrobiologiczne do manipulowania prawidłową fizjologią komórek gospodarza oraz w jaki sposób przynosi to korzyść w zakresie przetrwania i rozprzestrzeniania się patogenu, można przeprowadzić inne metody, takie jak knockdown, knockout, dwuhybrydowy system drożdżowy, pull-down, analizy modyfikacji posttranslacyjnych lub testy stabilności proteolitycznej.