Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. Osiąga się to poprzez ustanowienie stabilnych linii komórkowych, wyrażających białko będące przedmiotem zainteresowania Aby w drugiej kolejności zbadać jego aktywność na poziomie komórek masowych, tworzony jest indukowalny system wektorów ekspresji, który umożliwia aktywację kaskady sygnalizacyjnej komórki gospodarza w określonym kroku. Następnie zostanie przeanalizowane, czy białko będące przedmiotem zainteresowania może zakłócać aktywację kaskady sygnalizacji komórki gospodarza w celu zawężenia punktu aktywności białka będącego przedmiotem zainteresowania, wyniki pokazują, że przytulny żółty czynnik wirulencji Burnetta KA B zakłóca kaskadę apoptotyczną za plecami i przed aktywacją kaskady trzeciej w oparciu o analizę western blot.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii zakaźnej, takie jak identyfikacja kluczowego kroku w kaskadzie transdukcji sygnału, w którym interferuje dane bakteryjne białko efektorowe. Pomoże nam to nie tylko lepiej zrozumieć, w jaki sposób mikroorganizmy chorobotwórcze manipulują swoimi gospodarzami, ale także jak funkcjonują te podstawowe procesy komórkowe. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strategie bakteryjne zapobiegające apoptozie śmierci komórki, może być również stosowana do innych systemów transdukcji sygnału w polu śmierci komórki, takich jak on lub pyro ptoza, a także do sieci sygnalizacyjnych, które są zaangażowane w proliferację komórek, regulację genów lub reakcje układu odpornościowego.

Procedurę tę zademonstruje Stephanie Besler, doktorantka z laboratorium Manna. Rozpocznij tę procedurę od wysiewu komórek HEK 2 93 stabilnie eksprymujących GFP lub GFP, powiedzmy B w a 12. Płytka studzienkowa o gęstości 100 000 komórek na studzienkę.

Następnie należy oddzielnie przygotować odczynnik do transfekcji DNA i polietylenu w 75 mikrolitrach pożywki opt i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksu. Inkubować obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj kroplami roztwór DNA polietylenu do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Pięć godzin po transfekcji indukować ekspresję białek proapoptotycznych poprzez dodanie jednego mikrograma na mililitr doksycykliny do pożywki hodowlanej. Następnie inkubuj komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla pod mikroskopem świetlnym. Przed zbiorem należy sprawdzić komórki pod kątem indukcji śmierci komórkowej.

Zbadaj indukowane komórki apoptotyczne, które są wykrywalne przez obecność ciał apoptotycznych. Następnie usuń supernatant i umyj przylegające komórki. Raz z ciepłym PBS ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach dwóch x lamby buforu próbki.

Następnie podgrzewaj przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie załaduj sześć mikrolitrów komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Następnie załaduj około 40 000 komórek na próbkę do 12% żelu stronicowego SDS.

Uruchom żele w systemie elektroforezy żelowej pod stałym napięciem 180 woltów przez 45 do 60 minut z jednym buforem roboczym x laly. Następnie BLO białka umieszcza się na membranach PVDF przy stałym napięciu 16 woltów przez 60 minut. Używając półsuchej komórki transferowej trans blot SD, zablokuj błony w 10 mililitrach MPT na godzinę w temperaturze pokojowej.

Rozcieńczyć siedem mikrolitrów przeciw rozszczepieniu przeciwciała PARP w siedmiu mililitrach MPT. Inkubować membranę PVDF z roztworem przeciwciała przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć roztwór przeciwciała i wykonać trzy 10-minutowe płukania PBS 0,05% Tween 20, inkubować błony z 1,4 mikrolitra sprzężonych z peroksydazą chrzanową przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w siedmiu mililitrach MPT przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Umyj membrany trzykrotnie PBS 0,05%Tween 20, wykryj aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. I zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe. Następnie usuń związane przeciwciała, inkubując błony z siedmioma mililitrami buforu do usuwania western blot przez 30 minut w temperaturze pokojowej po trzech płukaniach PBS 0,05%Tween 20, sonduj błony czterema mikrolitrami przeciwciała antyaktynowego w czterech mililitrach MPT przez noc w czterech stopniach Celsjusza.

Następnego dnia wykonaj trzy 10-minutowe etapy mycia membran około 10 mililitrami PBS 0,05% Tween 20, a następnie inkubuj błony z 1,4 mikrolitra sprzężonych z peroksydazą chrzanową przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w siedmiu mililitrach MPT Po godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej. Umyj membrany trzykrotnie za pomocą PBS 0,05%Tween 20, wykryj aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą zestawu komercyjnego i zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić zakazy białka. W tym eksperymencie lizaty całych komórek komórek sabe HEK 2 93 GFP i HEK 2 93 GFP zostały poddane immunokrwi pod kątem GFP, aby wykazywały stabilną ekspresję.

Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej komórek sabe HEK 2 93 GFP i HEK 2 93 GFP pokazuje intensywność ekspresji GFP. Komórki szablaste HEK 2 93 GFP i HEK 2 93 GFP traktowano czterema mikromolowymi sporynami przez sześć godzin w celu wywołania wewnętrznej apoptozy. Apoptozę analizowano za pomocą rozszczepionej analizy immuno blot PARP, w której stwierdzono, że rozszczepienie PARP zmniejsza się w komórkach B HK 2 9 3 GFP SA w porównaniu z komórkami HK 2 93 GFP.

CB chroni przed apoptozą indukowaną przez bax, ale nie przed apoptozą indukowaną kaspazą trzy. Podczas wdrażania tej procedury ważne jest, aby zbadać jak najwięcej składników szlaku sygnałowego, aby pomóc w identyfikacji etapu interakcji. Dobrze jest również przetestować białka, które są aktywowane zarówno w stanie podstawowym, jak i aktywowanym, aby określić, czy wybrane białko efektorowe zakłóca sam szlak, czy raczej etap aktywacji następujący po tej procedurze.

Inne metody, takie jak knockdown, knockout, drożdże, dwie hybrydowe modyfikacje potranslacyjne pull down lub testy stabilności proteolitycznej, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są dokładne mechanizmy molekularne, które te efektory mikrobiologiczne wykorzystują do manipulowania normalną fizjologią komórki gospodarza? I w jaki sposób wpływa to korzystnie na przetrwanie i rozprzestrzenianie się patogenów.