Name: Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę indukowalnej ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją apoptozy w komórkach HEK293. Technika ta pozwala zlokalizować punkt działania białek bakteryjnych w kaskadzie sygnałowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) poprzez Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) do A.L. i C.B., oraz poprzez ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających interesujące białko
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę, dodając inaktywowany termicznie FCS i 1% penicyliny/streptomycyny do dostępnego na rynku zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego GlutaMAX-I, pirogronianem i 4,5 g/l D-glukozy.</li>
	<li>Hodować komórki HEK293 w pożywce w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Hoduj komórki co trzeci dzień. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 15 ml świeżej pożywki. Odpipetować 1 ml do nowej kolbyhodowlanej o średnicy 75 cm i dodać 14 ml pożywki.</li>
	<li>Przeanalizuj liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wysiewaj komórki HEK293 na 6-dołkowej płytce o gęstości 2 x 105 komórek na dołek i inkubuj przez 24 godziny.</li>
	<li>Do transfekcji należy użyć protokołu dostarczonego przez producenta odczynnika do transfekcji. Komórki transfekcyjne z pEGFP-C2 lub pEGFP-C2-CaeB przy użyciu odczynnika do transfekcji. Przed użyciem rozgrzej odczynnik do transfekcji i pożywkę wymaganą do RT. Użyj odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 do DNA.
	<ol>
		<li>Szczegółowo, odpipetować 1,5 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do 50 μl pożywki DMEM bez surowicy. W celu wytworzenia kompleksu należy pobrać pipetą 0,5 μg DNA kodującego GFP lub GFP-CaeB do mieszaniny zawierającej odczynnik do transfekcji i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Transfekować komórki, dodając mieszaninę reakcyjną kroplami i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 mg/ml genetycyny w celu selekcji klonów GFP dodatnich w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Po 6 dniach wyizolować pojedyncze komórki metodą cytometrii przepływowej, sortując w 96-dołkowej płytce zawierającej pożywkę i supernatant HEK293 w stosunku 1:1. Wygeneruj supernatant HEK293 z hodowanych, zlewających się komórek HEK293, które odwirowywano przez 15 minut przy 4,966 x g.</li>
	<li>Następnego dnia należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą 1,5 mg/ml genetycyny. Zmieniaj media raz w tygodniu. Jeśli komórki tworzą zlewającą się monowarstwę, przenieś je na 24-dołkową płytkę. Hoduj komórki dwa razy w tygodniu w stosunku 1:5 w pożywce zawierającej 1,5 mg/ml genetycyny. Na koniec przeanalizuj procent komórek GFP-dodatnich za pomocą analizy immunoblot i cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
2. Analiza stabilnych linii komórkowych za pomocą analizy immunoblot
<ol>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć przylegające komórki ciepłym PBS. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 2x buforu do próbek Laemmli, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Załaduj około 4 x 104 komórek na próbkę na 12% żel SDS-PAGE. Dodatkowo załaduj 6 μl komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele w systemie elektroforezy żelowej pod stałym napięciem 180 V przez 45-60 minut z 1x buforem roboczym Laemmli.</li>
	<li>Osusz białka na błonach PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut za pomocą półsuchej komórki transferowej Trans-Blot SD.</li>
	<li>Zablokuj błony w 10 ml 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS/0,05% Tween 20 (MPT) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć 4 μl przeciwciała anty-GFP w 4 ml MPT i inkubować błony O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj trzy 10-minutowe kroki mycia za pomocą 10 ml PBS/0,05% Tween 20.</li>
	<li>Inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową w 4 ml MPT.</li>
	<li>Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 2.6) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe.</li>
</ol>
3. Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.
<ol>
	<li>Ponowne zawieszanie komórek w PBS. Użyj komórek HEK293 jako kontroli negatywnej, aby dostosować rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), tak aby komórki były w skali. Narysuj bramę na żywych komórkach, wykluczając dublety komórek, agregaty i szczątki komórek.</li>
	<li>Dostosuj wzmocnienie lampy fotopowielacza (PMT) tak, aby niebarwione komórki znajdowały się po lewej stronie histogramu kanału FL1 (laser argonowy 488 nm).</li>
	<li>Aby przeanalizować intensywność fluorescencji komórek HEK293-GFP i HEK293-GFP-CaeB, otwórz histogram kanału FL1 i uzyskaj 10 000 zdarzeń w populacji bramkowanej.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy FACS.</li>
</ol>
4. Transfekcja stabilnej linii komórkowej za pomocą indukowalnego systemu wektorów ekspresyjnych
<ol>
	<li>Nasiona komórek HEK293 stabilnie eksprymujących GFP lub GFP-CaeB w 12-dołkowej płytce o gęstości 1 x 105 komórek / dołek.</li>
	<li>19 godzin po wysiewie, współtransfekuj komórki plazmidem regulatorowym i plazmidem odpowiedzi kodującym Bax lub aktywowaną kaspazę 3.
	<ol>
		<li>Kotransfekcja stabilnych komórek HEK293 ze 100 ng plazmidu regulatorowego pWHE125-P (ryc. 2) i 100 ng plazmidów odpowiedzi pWHE655-hBax lub pWHE655-revCasp3 (ryc. 3) i 0,4 μl polietylenininy.</li>
		<li>Przygotować odczynnik do transfekcji DNA i polietyleninominy w 75 μl pożywki Opti-MEM i inkubować dokładnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W celu uzyskania złożonego tworzenia należy inkubować obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawać kroplami roztwór polietyleniny/DNA do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Indukcja apoptozy
<ol>
	<li>5 godzin po transfekcji indukować ekspresję białek proapoptotycznych poprzez dodanie 1 μg / ml doksycykliny do pożywki hodowlanej. Inkubować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Analiza apoptozy komórek gospodarza za pomocą analizy immunoblot
<ol>
	<li>Przed pobraniem należy sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy nie doszło do indukcji śmierci komórki. Komórki apoptotyczne są wykrywalne przez obecność ciał apoptotycznych otaczających umierającą komórkę.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć przylegające komórki ciepłym PBS. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 2x buforu do próbek Laemmli, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Załaduj około 4 x 104 komórek na próbkę na 12% żel SDS-PAGE. Dodatkowo załaduj 6 μl komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele w systemie elektroforezy żelowej pod stałym napięciem 180 V przez 45-60 minut z 1x buforem roboczym Laemmli.</li>
	<li>Osusz białka na błonach PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut za pomocą półsuchej komórki transferowej Trans-Blot SD.</li>
	<li>Zablokuj błony w 10 ml 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS/0,05% Tween 20 (MPT) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć 4 μl przeciwciała przeciwko rozszczepieniu polimerazy poli ADP-rybozy (PARP) w 4 ml MPT i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj trzy 10-minutowe kroki mycia za pomocą 10 ml PBS/0,05% Tween 20.</li>
	<li>Inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową rozcieńczonych w 4 ml MPT.</li>
	<li>Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (jak opisano w ppkt 6.7) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe.</li>
	<li>Usunąć związane przeciwciała przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z 7 ml buforu do usuwania Western Blot.</li>
	<li>Po trzech przemyciach PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 6.7), zbadać błony za pomocą 4 μl przeciwciała antyaktynowego w 4 ml MPT O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po trzech etapach przemywania MPT (jak opisano w ppkt 6.7), inkubować błony z 0,8 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową rozcieńczonych w 4 ml MPT.</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć membrany PBS/0,05% Tween 20 (zgodnie z opisem w ppkt 6.7) i wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta. Zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmu, aby uwidocznić prążki białkowe. 
	Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji przeprowadzono na wytrząsarce płytkowej przez wskazany czas i temperaturę.</li>
</ol>

<ol><li>Galán, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
<li>Banga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+inhibits+macrophage+apoptosis+by+targeting+pro-death+members+of+the+Bcl2+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).</li>
<li>Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legionella+pneumophila-translocated+substrate+that+is+required+for+growth+within+macrophages+and+protection+from+host+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).</li>
<li>Schmid, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translocated+bacterial+protein+protects+vascular+endothelial+cells+from+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis.</a> PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).</li>
<li>Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pathogen-induced+apoptosis+by+a+Coxiella+burnetiitype+IV+effector+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).</li>
<li>Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+pathogens+and+mitochondrial+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).</li>
<li>Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+type+IV+secretion+system+substrate+CaeB+inhibits+intrinsic+apoptosis+at+the+mitochondrial+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level.</a> Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).</li>
<li>Raymond, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+trafficking%2C+apoptosis%2C+and+innate+immunity+by+type+III+secretion+system+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors.</a> Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).</li>
<li>Eckart, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiapoptotic+activity+of+Coxiella+burnetii+effector+protein+AnkG+is+controlled+by+p32-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking.</a> Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).</li>
<li>Byrne, G. I., Ojcius, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+and+apoptosis%3A+life+and+death+decisions+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).</li>
<li>Delft, M. F., Huang, D. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Bcl-2+family+of+proteins+interact+to+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis.</a> Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).</li>
<li>Willis, S. N., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+the+balance%3A+how+BH3-only+proteins+induce+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).</li>
<li>Cory, S., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl2+family%3A+regulators+of+the+cellular+life-or-death+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch.</a> Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).</li>
<li>Adams, J. M., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosomes%3A+engines+for+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosomes: engines for caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).</li>
<li>Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xk-related+protein+8+and+CED-8+promote+phosphatidylserine+exposure+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells.</a> Science. 341 (6144), 403-406 (2013).</li>
<li>Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+throes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell death throes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).</li>
<li>Enari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-activated+DNase+that+degrades+DNA+during+apoptosis%2C+and+its+inhibitor+ICAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD.</a> Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).</li>
<li>Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mammalian+gene+regulation+concepts+on+functional+genomic+research%2C+metabolic+engineering%2C+and+advanced+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies.</a> Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).</li>
<li>Felsher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+oncogene-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Reversibility of oncogene-induced cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Kozlova, E. N., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+differentiation+of+stem+cells+in+vivo+by+tetracycline-controlled+expression+of+key+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors.</a> Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).</li>
<li>Reijmers, L., Mayford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+active+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic control of active neural circuits.</a> Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hillen, W., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+expression+of+Tn10+.encoded+tetracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance.</a> Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).</li>
<li>Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-reversible+silencing+of+eukaryotic+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters.</a> Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mouse+strain%2C+position+of+integration+and+tetracycline+analogue+on+the+tetracycline+conditional+system+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice.</a> Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).</li>
<li>Rang, A., Will, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetracycline-responsive+promoter+contains+functional+interferon-inducible+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements.</a> Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).</li>
<li>Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetracycline+controlled+activation%2Frepression+system+with+increased+potential+for+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.</a> J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).</li>
<li>Knott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+conditional+suicide+switch+using+doxycycline-dependent+expression+of+human+tBid%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid.</a> Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).</li>
<li>Danilchanka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+channel+protein+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+exotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).</li>
<li>Danke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjusting+transgene+expression+levels+in+lymphocytes+with+a+set+of+inducible+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters.</a> J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).</li>
<li>Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+rapid+and+slow+induction+of+apoptosis+obtained+by+inducible+expression+of+pro-apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins.</a> Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+constitutively+active+recombinant+caspases-3+and+-6+by+rearrangement+of+their+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).</li>
<li>Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+two+gene+activities+by+tetracycline+via+a+bidirectional+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter.</a> Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).</li>
<li>Anastassiadis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictable+ligand+regulated+expression+strategy+for+stably+integrated+transgenes+in+mammalian+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture.</a> Gene. 298 (2), 159-172 (2002).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneity+and+long-term+stability+of+tetracycline-regulated+gene+expression+with+low+basal+activity+by+using+the+rtTA2S-M2+transactivator+and+insulator-flanked+reporter+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors.</a> Gene. 327 (1), 61-73 (2004).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Agha-Mohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+tetracycline-regulatable+promoter%3A+repositioned+tet+operator+elements+optimize+transactivator+synergy+while+shorter+minimal+promoter+offers+tight+basal+leakiness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness.</a> J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).</li>
<li>Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+transgene+expression+by+lentivirus+vectors+containing+second-generation+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters.</a> J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).</li>
<li>Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetracycline-dependent+expression+vector+with+low+basal+expression+and+potent+regulatory+properties+in+various+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).</li>
<li>Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Tet-responsive+promoters+with+minimized+background+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression.</a> BMC Biotechnol. 10, 81(2010).</li>
<li>Heinz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+and+transposon-based+tet-regulated+all-in-one+vectors+with+reduced+background+expression+and+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).</li>
<li>Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+transcription+regulatory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems.</a> Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).</li>
<li>Ye, H., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+gene+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele bakterii chorobotwórczych posiada systemy wydzielnicze, które wydzielają lub przemieszczają bakteryjne białka efektorowe do komórki gospodarza. Te białka efektorowe mają zdolność modulowania procesów i szlaków w komórce gospodarza, umożliwiając bakteriom przetrwanie i replikację w odpowiedniej niszy wewnątrzkomórkowej. Zrozumienie aktywności biochemicznej i mechanizmów molekularnych białek efektorowych pomoże w lepszym zrozumieniu patogenności i może pomóc w opracowaniu nowych narzędzi terapeutycznych do zwalczania...

Zjadliwość wielu patogenów bakteryjnych Gram-ujemnych zależy od wyspecjalizowanych systemów wydzielania, które przejmują kontrolę nad eukariotycznymi komórkami gospodarza. Bakterie wykorzystują te systemy wydzielania do wstrzykiwania bakteryjnych białek wirulencji (efektorów) do komórki gospodarza w celu modulowania różnych aktywności komórkowych i biochemicznych. Badania nad białkami efektorowymi dostarczyły nie tylko niezwykłego wglądu w fundamentalne aspekty interakcji gospodarz/patogen, ale także w podstawową biologię komórek eukariotycznych1. Wykazano, że modulacja apoptozy komórek gospodarza jest ważnym mechanizmem wirulencji dla wielu patogenów wewnątrzkomórkowych, a szereg białek efektorowych modulujących apoptozę zidentyfikowano2-9. Jednak w wielu przypadkach ich dokładne molekularne mechanizmy działania pozostają nieuchwytne.
Apoptoza, forma zaprogramowanej śmierci komórki, odgrywa ważną rolę w odpowiedziach immunologicznych na infekcję10. Zidentyfikowano dwie główne ścieżki prowadzące do apoptozy: celowanie w mitochondria (apoptoza wewnętrzna) lub bezpośrednia transdukcja sygnału przez receptory śmierci komórki na błonie komórkowej (apoptoza zewnętrzna). Wewnętrzny lub zależny od mitochondriów szlak śmierci komórki jest wyzwalany przez sygnały wewnątrzkomórkowe i obejmuje aktywację Bax i Bak, dwóch proapoptotycznych członków rodziny Bcl-2. Rodzina ta składa się z pro- i antyapoptotycznych białek regulatorowych, które kontrolują śmierć komórki11-14. Aktywacja apoptozy prowadzi do oligomeryzacji Bax i Bak, a następnie do permeabilizacji zewnętrznej błony mitochondrialnej, co powoduje uwolnienie cytochromu C do cytoplazmy. Uwalnianie cytochromu C inicjuje aktywację kaspaz efektorowych 3 i 7 poprzez aktywację kaspazy 9 w apoptosomie15. Prowadzi to do proteolizy wybranych substratów, która między innymi powoduje ekspozycję fosfatydyloseryny na powierzchniękomórki16 i uwalnia dedykowaną DNazę, która fragmentuje chromatynę17,18.
W celu określenia, gdzie w kaskadzie apoptozy interferuje pojedyncze białko efektorowe, zastosowano indukowalny system ekspresji19. Systemy regulacyjne do warunkowej ekspresji transgenów są nieocenionym narzędziem w analizie funkcji białka w komórce lub jego znaczenia dla rozwoju tkanek, narządów i organizmów, a także podczas inicjacji, progresji i utrzymywania choroby20-23. Zazwyczaj indukowane systemy sterowania, takie jak zastosowany tutaj system Tet24, tworzą sztuczną jednostkę transkrypcyjną (patrz rysunek 1). Jednym ze składników jest sztucznie zmodyfikowany czynnik transkrypcyjny zwany tTA (aktywator transkrypcji zależny od tetracykliny), utworzony przez fuzję bakteryjnego represora transkrypcji TetR25 z domeną białka ssaków, która pośredniczy w aktywacji transkrypcji lub wyciszaniu 24,26. Drugi składnik to promotor hybrydowy, określany jako TRE (element reagujący na tetracyklinę), składający się z eukariotycznego minimalnego promotora, zawierającego co najmniej pudełko TATA i miejsce inicjacji transkrypcji, połączone z wieloma powtórzeniami pokrewnego miejsca wiązania DNA dla TetR, tetO24,25. Trzecim składnikiem jest naturalny ligand TetR, tetracyklina lub jedna z jej pochodnych, taka jak anhydrotetracyklina lub doksycyklina25. Po dodaniu liganda do pożywki hodowlanej, TetR traci swoje powinowactwo do tetO i dysocjuje od TRE. W rezultacie transkrypcja genu docelowego zostaje zniesiona. Ekspresja transgenu może być zatem ściśle kontrolowana w sposób zależny od czasu i dawki, zarówno w hodowli komórkowej, jak i u zwierząt20,23,24. W przypadku tTA ekspresja transgenu zachodzi konstytutywnie, z wyjątkiem obecności tetracykliny. Może to być niekorzystne w badaniach białek cytotoksycznych lub onkogennych, ponieważ tetracyklina musi najpierw zostać usunięta z systemu, zanim nastąpi ekspresja transgenu i będzie można monitorować wpływ białka docelowego na komórkę. Może to być czasochłonne i nie zawsze jest kompletne, zwłaszcza u zwierząt transgenicznych27. Aby rozwiązać to ograniczenie, mutant TetR z odwrotną reakcją na obecność doksycykliny został wykorzystany do wygenerowania nowego czynnika transkrypcyjnego, rtTA (reverse tTA)28. Wiąże się tylko z TRE i jednocześnie aktywuje transkrypcję w obecności doksycykliny. Szczątkowa nieszczelność systemu, tj. ekspresja transgenu przy braku czynnika transkrypcyjnego związanego z TRE, pochodząca albo (i) z efektów położenia w miejscu integracji genomowej, (ii) z samego TRE29, albo (iii) z niespecyficznego wiązania tTA/rtTA28, została rozwiązana poprzez wprowadzenie dodatkowego tłumika transkrypcyjnego, określanego jako tTS (tłumik transkrypcyjny zależny od tetracykliny)30 do systemu. Tworzy on podwójną sieć regulatorów wraz z rtTA (patrz rysunek 1). W przypadku braku doksycykliny, tTS wiąże się z TRE i aktywnie wyłącza pozostałą transkrypcję. W obecności doksycykliny tTS dysocjuje od TRE i rtTA wiąże się jednocześnie, indukując ekspresję docelowego genu. Ta dodatkowa warstwa surowości jest często niezbędna do ekspresji wysoce aktywnych białek cytotoksycznych31-34.
Korzystając z tego ściśle kontrolowanego systemu podwójnego regulatora, kaskada apoptozy może być zainicjowana w określonym kroku, co pozwala na analizę, czy dane białko efektorowe może zakłócać indukcję apoptozy. Metoda ta może być stosowana nie tylko do badania aktywności antyapoptotycznej bakteryjnych białek efektorowych, ale także do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

<table><tbody><tr><td>Technologie życia</td> <td>DMEM</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>pióra/paciorkowca</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>OptiMEM</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleniny</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowa</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFMillipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>przeciw rozszczepieniu PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>antyaktyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do blottingu ECL</td><td>Western Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do usuwania Western Blot Restore Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Przedstawiona tutaj technika pozwala przeanalizować, na którym etapie docelowe białko, lub alternatywnie mała cząsteczka, oddziałuje ze składnikami szlaku sygnałowego. Metoda opiera się z jednej strony na indukowalnej ekspresji określonego białka w celu zainicjowania zdarzenia sygnalizacyjnego na określonym i z góry określonym kroku w wybranej kaskadzie sygnałowej. Z drugiej strony, jednoczesna ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania pozwala badaczowi ocenić, czy aktywność wyrażonego białka docelowego znajduje się przed czy za zainicjowanym zdarzeniem sygnalizacyjnym, w zależności od odczytu uzyskanego szlaku sygnałowego. W tym przypadku kaskada apoptotyczna została wybrana jako zdefiniowana ścieżka sygnałowa w celu zademonstrowania funkcjonalności protokołu. Bakterie chorobotwórcze, takie jak Coxiella burnetii, przemieszczają białka efektorowe, które zakłócają indukcję śmierci komórki gospodarza w komórce gospodarza, aby zapewnić przetrwanie bakterii w komórce i sprzyjać ich rozprzestrzenianiu się w organizmie. Białko efektorowe CaeB C. burnetii skutecznie hamuje śmierć komórek gospodarza po indukcji apoptozy światłem UV lub staurosporyną. Aby zawęzić, na którym etapie CaeB zakłóca propagację sygnału apoptotycznego, wybrane białka o dobrze scharakteryzowanej aktywności proapoptotycznej uległy ekspresji przejściowej w sposób indukowany doksycykliną. Jeśli CaeB działa przed tymi białkami, apoptoza będzie przebiegać bez przeszkód. Jeśli CaeB działa w dół, śmierć komórki zostanie zahamowana. Wybrano białka testowe: Bax, który działa na poziomie mitochondriów, oraz kaspazę 3, która jest główną proteazą egzekucyjną. CaeB zakłóca śmierć komórki indukowaną przez ekspresję Bax, ale nie przez ekspresję kaspazy 3. W ten sposób CaeB oddziałuje z kaskadą apoptotyczną między tymi dwoma białkami.

W pierwszej kolejności utworzono linie komórkowe HEK293 stabilnie ekspresyjne białko docelowe (CaeB) w formie białka fuzyjnego z GFP. Jako kontrolę wygenerowano również linie komórkowe HEK293 stabilnie ekspresyjne GFP. Ekspresję GFP oraz GFP-CaeB zweryfikowano za pomocą analizy immunoblotowej. Reprezentacyjny immunoblot (Rycina 4A) wykazuje stabilną i wyraźnie wykrywalną ekspresję GFP oraz GFP-CaeB. Jednakże badanie to nie pozwala określić, czy wszystkie komórki ekspresjonują GFP lub GFP-CaeB. Dlatego st...

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wpływu bakteryjnych czynników wirulencji na sygnalizację wewnątrzkomórkową. Osiąga się to poprzez stworzenie stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję badanego białka. Aby w drugim kroku zbadać jego aktywność na poziomie całej populacji komórek, tworzony jest indukowalny system wektorów ekspresyjnych, który pozwala na aktywację kaskady sygnalizacyjnej komórki gospodarza na określonym etapie. Następnie analizowane jest, czy badane białko może zakłócać aktywację kaskady sygnalizacyjnej komórki gospodarza, aby zawęzić zakres punktu aktywności badanego białka. Wyniki analizy western blotting wykazują, że czynnik wirulencji KA B z bakterii cozy yellow Burnett zakłóca kaskadę apoptotyczną poniżej poziomu backs i powyżej aktywacji cascade three.Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii infekcji, takie jak zidentyfikowanie kluczowego etapu w kaskadzie transdukcji sygnału, na którym oddziałuje dane białko efektorowe bakterii. Pozwoli to nie tylko lepiej zrozumieć, w jaki sposób mikroorganizmy patogenne manipulują swoimi gospodarzami, ale także jak funkcjonują te podstawowe procesy komórkowe. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat strategii bakteryjnych zapobiegających wystąpieniu apoptotycznej śmierci komórki, może być ona również zastosowana do innych systemów transdukcji sygnału w obszarze śmierci komórki, takich jak nekroptoza lub piroptoza, a także do sieci sygnalizacyjnych zaangażowanych w proliferację komórek, regulację genów lub reakcje układu odpornościowego.Procedurę tę zademonstruje Stephanie Besler, doktorantka z laboratorium Manna. Rozpocznij procedurę od wysiania komórek HEK 2 93 stabilnie exprimujących GFP lub GFP, say B w płytce 12-dołkowej z gęstością 100 000 komórek na dołek.Następnie przygotuj osobno DNA oraz polietylenowy odczyn do transfekcji w 75 µL opt medium i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksów. Inkubuj obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodaj kroplowo roztwór DNA z polietylenem do komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C w 5% CO2.Pięć godzin po transfekcji indukuje się ekspresję białek proapoptotycznych poprzez dodanie 1 µg/mL doksycykliny do pożywki hodowlanej. Następnie komórki inkubuje się przez 18 h w temperaturze 37 °C w 5% CO₂. Przed zebraniem komórek należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym, czy doszło do indukcji śmierci komórkowej.Zbadaj komórki z indukowaną apoptozą, które można zidentyfikować po obecności ciał apoptotycznych. Następnie usuń naddatek i wypłucz przytwierdzone komórki. Po jednym razie ciepłym PBS zawiesić komórki w 100 µL dwukrotnego buforu do próbek Laemmli.Następnie podgrzewaj przez pięć minut w temperaturze 95°C, a po tym czasie przechowuj w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Po tym nałóż 6 µL komercyjnej drabinki białkowej jako marker masy cząsteczkowej. Następnie nałóż około 40 000 komórek na próbkę na żel SDS-PAGE o stężeniu 12%.Przeprowadź elektroforezę żeli w systemie do elektroforezy żelowej przy stałym napięciu 180 V przez 45 do 60 minut, stosując jednokrotny bufor do elektroforezy laly. Następnie przenieś białka na membrany PVDF przy stałym napięciu 16 V przez 60 minut, korzystając z komory do transferu półsuchego trans blot SD. Po tym czasie zablokuj membrany w 10 ml MPT przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Rozcieńczyć 7 µL przeciwciała przeciwko rozszczepionej białku PARP w 7 mL MPT. Inkubować membranę PVDF w roztworze przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciał i przeprowadzić trzy 10-minutowe płukania w PBS z 0,05% Tween 20, a następnie inkubować membrany z 1,4 µL przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych w 7 mL MPT, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji.Membrany należy przemyć trzykrotnie roztworem PBS z 0,05% Tween 20, a następnie wykryć aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Do wizualizacji prążków białkowych należy użyć standardowego sprzętu do wywoływania filmów. Następnie, po trzech przemyciach roztworem PBS z 0,05% Tween 20, należy usunąć związane przeciwciała, inkubując membrany w 7 mL buforu do strippingu western blot przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować membrany przez noc w temperaturze 4 °C z 4 µL przeciwciała anty-aktynowego w 4 mL MPT.Następnego dnia przeprowadź trzy 10-minutowe etapy płukania membran przy użyciu około 10 mililitrów PBS 0,05%Tween 20, następnie inkubuj membrany z 1,4 mikrolitrami przeciwciał wtórnych koniugowanych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych w siedmiu mililitrach MPT. Po godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej przemyj membrany trzykrotnie za pomocą PBS 0,05%Tween 20, wykryj aktywność peroksydazy chrzanowej za pomocą komercyjnego zestawu i zastosuj standardowy sprzęt do wywoływania filmów w celu wizualizacji prążków białkowych. W tym eksperymencie lizaty całych komórek HEK 2 93 GFP oraz HEK 2 93 GFP sabe poddano analizie immunoblotting pod kątem GFP, aby wykazać stabilną ekspresję.Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej komórek HEK 2 93 GFP oraz HEK 2 93 GFP sabe wykazuje intensywność ekspresji GFP. Komórki HEK 2 93 GFP i HEK 2 93 GFP sabe poddano działaniu 4 µM sporiny przez sześć godzin w celu wywołania apoptozy wewnątrzpochodnej. Apoptozę przeanalizowano za pomocą immunoblottingu na obecność rozszczepionego PARP, wykazując, że rozszczepienie PARP uległo zmniejszeniu w komórkach HK 2 9 3 GFP SA B w porównaniu z komórkami HK 2 93 GFP.CB chroni przed apoptozą indukowaną przez bax, ale nie przed apoptozą indukowaną przez kaspazę 3. Podczas wdrażania tej procedury ważne jest zbadanie jak największej liczby komponentów szlaku sygnałowego, aby pomóc w zidentyfikowaniu etapu interakcji. Warto również testować białka w ich stanach podstawowym i aktywowanym, aby ustalić, czy wybrane białko efektorowe zakłóca sam szlak, czy raczej etap aktywacji następujący po tej procedurze.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są dokładne mechanizmy molekularne wykorzystywane przez te efektory mikrobiologiczne do manipulowania prawidłową fizjologią komórek gospodarza oraz w jaki sposób przynosi to korzyść w zakresie przetrwania i rozprzestrzeniania się patogenu, można przeprowadzić inne metody, takie jak knockdown, knockout, dwuhybrydowy system drożdżowy, pull-down, analizy modyfikacji posttranslacyjnych lub testy stabilności proteolitycznej.

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w...

Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Ten film opisuje metodę regulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach poprzez transfekcję plazmidem zawierającym interesujący nas gen i plazmid regulatorowy. Ekspresja tego plazmidu może być kontrolowana przez tetracyklinę lub jej syntetyczne analogi, co czyni ten system użytecznym modelem do badania regulowanej ekspresji genów.

Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Poznaj metodę indukowalnej ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją apoptozy w komórkach HEK293. Technika ta pozwala zlokalizować punkt działania białek bakteryjnych w kaskadzie sygnałowej.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Przeglądaj więcej filmów