Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar translokacji białek efektorowych do komórek gospodarza za pośrednictwem systemu wydzielania vernia typu trzeciego. Osiąga się to poprzez inkubację komórek heela z mutantami jersynii eksprymującymi fuzje efektorowej TEM one beta laktamazy, aby umożliwić translokację fuzji efektorowych do komórek HELOC. W drugim etapie zainfekowane komórki HELOC są ładowane związkiem reporterowym fret permeant hermeant fret, który jest przetwarzany przez estro komórkowy do naładowanego we fluorescencyjnym CCF czterech, a tym samym uwięziony w komórce.

Kolejne rozszczepienie CCF 4 przez beta-laktamazę zlokalizowaną trans powoduje zakłócenie fre, które jest rejestrowane za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w celu analizy intensywności fluorescencji donorowej i akceptorowej. Wyniki wskazują na różne ilości fuzji beta-laktamazy z efektorem trans TEM one w oparciu o różną kinetykę wzrostu fluorescencji donorowej. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że międzykomórkowe przetwarzanie czteroskładnikowego związku CCF zapewnia wysoce specyficzne i czułe narzędzie do pomiaru translokacji.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy bakterii, takie jak to, w jaki sposób translokacja jest precyzyjnie dostrojona podczas interakcji bakterii i komórek gospodarza na jeden dzień przed zakażeniem. Zaszczepić trzy oddzielne fiolki zawierające trzy mililitry pożywki LB i wymagane antybiotyki jedną kolonią z każdego z przekształconych szczepów Y enterocolitica przygotowanych zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Przygotuj również płytki zawierające komórki heela na dzień przed zakażeniem, wysiewając 15 000 komórek w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej do dziewięciu dołków z 96-dołkową płytką, inkubuj komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza w dniu infekcji.

Zaszczep dwa mililitry nocnej kultury w 40 mililitrach świeżej pożywki funtowej bez antybiotyków. Inkubuj bakterie przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce z prędkością 180 obr./min. Spowoduje to ekspresję systemu wydzielania typu trzeciego po 90 minutach, przeniesienie kultur do świeżej probówki i utrzymanie kultur na lodzie.

Od tego momentu do przodu. Odwirowywać kultury przez 10 minut w temperaturze 5 000 G i czterech stopniach Celsjusza, aby otoczkować bakterie. Następnie ponownie zawiesić osad w dwóch do trzech mililitrach lodowatego PBS, rozcieńczyć zawiesinę bakterii do stężenia 800 milionów jednostek tworzących kolonie na mililitr, a następnie umieścić kultury na lodzie.

Następnie określ odpowiednią gęstość optyczną każdej kultury. Dodaj 3,5 mikrolitra zawiesiny bakteryjnej z każdego szczepu do różnych studzienek przygotowanych 96. Dobrze płytkować i mieszać, delikatnie pipetując pożywkę dwukrotnie, pozwól bakteriom osadzać się na komórkach przy ilości infekcji około 100 bakterii na komórkę.

Wykonaj kurs czasowy, rozpoczynając infekcje w 30-minutowych odstępach i utrzymując komórki w komorze 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po każdym zakażeniu, 90 minut po pierwszym zakażeniu, ostrożnie odessać pożywkę, nie usuwając żadnych komórek hela. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS zawierających 20 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 2,5 milimolowego pronika.

Spowoduje to zatrzymanie ekspresji efektorów i ograniczenie wywozu CCF czterech. Aby przygotować mikroskopię, należy zapewnić ciągłe zanurzenie, rozprowadzając pożywkę zanurzeniową na dno studzienek za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza w medium zanurzeniowym.

Następnie przenieś 96-dołkową płytkę na stolik mikroskopu i zlokalizuj odpowiednie miejsca do późniejszej analizy w każdym z nich. Cóż, zakończ ten krok w ciągu 10 minut. Następnie dodaj do każdego 70 mikrolitrów roztworu ładującego CF 4:00 AM.

Dobrze inkubować płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór ładujący i dodać 100 mikrolitrów PBS zawierających 20 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 2,5 milimola pronic. Następnie szybko rozpocznij mikroskopię.

Umieść na miejscu obiektyw zanurzeniowy z 20-krotnym powiększeniem i dużą aperturą numeryczną i otwórz otworek detektora na 2,5 przewiewnej jednostki i przenieś 96-dołkową płytkę do konfokalnego etapu skanowania laserowego. Następnie wybierz detektory fosforanu arsenku galu o wysokiej czułości z jednocześnie aktywnymi kanałami donorowymi i akceptującymi. Uśrednianie ramek o potrójnej głębokości ośmiu bitów i wzbudzanie za pomocą 10% lasera diodowego o długości 405 nanometrów.

Aby zapewnić prawidłową kwantyfikację, ustaw wzmocnienie detektora obu kanałów na tę samą wartość i unikaj nasyconych pikseli. Następnie aktywuj światło przechodzące i ponownie sprawdź reprezentatywne pola widzenia w każdym z nich, dobrze wyreguluj i ponownie zapisz pozycje w razie potrzeby za pomocą skalibrowanego automatycznego stolika. Na koniec ustaw upływ czasu na dwie minuty, czas trwania na dwie godziny i rozpocznij pobieranie obrazów.

Po pobraniu obrazu zaimportuj zestaw danych do oprogramowania, które umożliwia obliczenia arytmetyczne macierzy pikseli. Odejmij tło w obu kanałach za pomocą tego samego przesunięcia, klikając najpierw menu, a następnie przejdź do przetwarzania obrazu i wybierz odejmowanie linii bazowej. Następnie wybierz każdy kanał i wprowadź wartość bazową.

Skoryguj przeciek kanału dawcy, skieruj pierwszy kanał do kanału akceptorowego kanału drugiego z wcześniej ustalonym współczynnikiem korekcji, tworząc w tym celu nowy kanał drugi kanał główny. Kliknij menu, a następnie wybierz przetwarzanie obrazu, a następnie arytmetykę kanałów i wprowadź wartość bezwzględną kanału drugiego odjętą przez punkt 33 razy. Następnie należy usunąć kanał drugi i upewnić się, że przeciek przez poprawiony kanał akceptujący pozostaje nowym kanałem drugim.

Następnie utwórz nowy kanał za pomocą operacji pokazanej tutaj, aby określić względny współczynnik progu. Następnie wróć do menu arytmetyki kanałów i wprowadź kanał drugi podzielony przez kanał pierwszy i kanał drugi, aby uzyskać prawidłową wizualizację kanału progowego. Na obrazie ośmiobitowym utwórz czwarty kanał kanałowy, który jest równy 255 razy kanał trzeci.

Zmień kolor kanału, przechodząc do menu właściwości obrazu, wybierz kanał czwarty, następnie zmapowany kolor, a następnie plik tabeli kolorów i wybierz jet. Następnie zastosuj filtr mediany trzy na trzy do kanałów trzeciego i czwartego. Spowoduje to zmniejszenie szumów na obrazach, wchodząc do menu przetwarzania obrazu i wybierając wygładzanie.

Następnie filtr mediany, wybierz oba kanały i zastosuj rozmiar filtra trzy na trzy po jednym do kwantyfikacji sygnałów komórkowych. Wykryj komórki w kanale czwartym, wybierając widok przewyższający i klikając ikonę. Dodaj nowe powierzchnie.

Zdefiniuj parametry algorytmu wykrywania w oknie powierzchni i aktywuj dwa pola wyboru. Segmentuj tylko obszar zainteresowania i przetwarzaj cały obraz. Na koniec zdefiniuj obszar zainteresowania, edytując jego wymiary.

Wybierz kanał czwarty jako kanał źródłowy i ustaw próg, przechodząc do menu progowego i wybierając odejmowanie tła. Ustaw średnicę na 10 mikrometrów, minimalny próg intensywności ręcznie na zero, a maksymalny próg na maksymalną intensywność. Przefiltruj struktury według obszaru i ustaw minimalną wartość na 187 mikrometrów kwadratowych.

Następnie zakończ wykrywanie powierzchni. Na koniec wyodrębnij średnie wartości intensywności fluorescencji dawcy w kanale pierwszym i względnego współczynnika fretu w kanale trzecim, wraz z ich odchyleniami standardowymi w jednostce komórkowej. Aby wykazać zdolność tej metody do ilościowej analizy translokacji efektorowej do komórek docelowych, zbadano dwa szczepy yersinia o różnej kinetyce translokacji przy użyciu zarówno fluorescencji donorowej, jak i względnych współczynników fret.

Zakażone komórki typu dzikiego wykazują wzrost intensywności fluorescencji w czasie. Zgodnie z oczekiwaniami, maksymalne nachylenie intensywności fluorescencji jest dodatnio skorelowane z długością infekcji, co wskazuje, że można rozróżnić różne stężenia translowanej beta-laktamazy zgodnie z wcześniejszymi badaniami. Komórki zakażone mutantem delecji yersinia YOPE wykazują szybszy wzrost intensywności fluorescencji w porównaniu ze szczepem typu dzikiego.

Co ciekawe, wydłużenie infekcji do 90 minut nie przyspieszyło jeszcze bardziej wzrostu fluorescencji dawcy w porównaniu z 60 minutami infekcji Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, że przetwarzanie związku CCR four rozpoczyna się natychmiast po jego dodaniu. Dlatego ważne jest, aby na czas rozpocząć pozyskiwanie obrazu.