Name: Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru translokacji efektorów Yersinia do komórek HeLa za pomocą fuzji beta-laktamazy i mikroskopii laserowej. Technika FRET umożliwia ilościową analizę mechanizmów wirulencji bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Antonio Virgilio Failla za dostarczenie algorytmu kwantyfikacji akwizycji FRET oraz Erwinowi Bohnowi za dostarczenie konstrukcji pMK-bla i pMK-ova.

1. Wyznaczanie szczytowej emisji i przesłuchów (zobacz również rysunek 2)
<ol>
	<li>W celu określenia pików emisyjnych i ilości przesłuchów między barwnikami donorowymi (pochodna kumaryny V450) i akceptorowymi (fluoresceina), należy wykonać skany spektralne komórek znakowanych oboma pojedynczymi fluoroforami przy wzbudzeniu 405 nm.</li>
	<li>Określ szerokość pasma 10 nm w szczycie każdego barwnika, który będzie używany dla kanałów donorowych i akceptorowych (tutaj 455-465 nm i 525-535 nm). Wykreślić znormalizowane natężenie na długości fali i obliczyć średni procent przesłuchu barwnika donorowego w kanale akceptorowym i odwrotnie (rysunek 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie szczepów Y. enterocolitica do zakażenia kulturą komórkową
<ol>
	<li>Należy stosować następujące szczepy: WA-314 pMK-ova (WA-314 transformowany odpowiednio plazmidami pMK-bla17 i pMK-ova17) oraz WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformowany plazmidem pMK-bla17)</li>
	<li>Co najmniej dwa dni przed zakażeniem szczepy Y. enterocolitica WA-314 pMK-ova, WA-314 pMK-bla i WA-314ΔE pMK-bla z wywarów kriogenicznych na płytkach LB-agar zawierających wymagane antybiotyki (kanamycyna dla WA-314 pMK-bla i WA-314 pMK-ova; kanamycyna i tetracyklina dla WA-314ΔE pMK-bla) i wyhodować O/N w temperaturze 27 °C. Następnie przechowywać płytki przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na jeden dzień przed zakażeniem zaszczepić 3 ml pożywki LB zawierającej wymagane antybiotyki jedną kolonią odpowiednich szczepów i inkubować O/N w temperaturze 27 °C w wytrząsarce z prędkością 180 obr./min.</li>
	<li>W dniu zakażenia zaszczepić 2 ml kultury O/N w 40 ml świeżej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować przez 90 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 180 obr./min w celu wywołania ekspresji układu sekrecji typu III.</li>
	<li>Przenieść kultury do odpowiedniej probówki i od teraz przechowywać je na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Odwirować kultury przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad bakteryjny w 2-3 ml lodowatego PBS. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do stężenia 8 x 108 jtk/ml za pomocą spektrofotometru. Odpowiednią gęstość optyczną należy określić indywidualnie. Zawiesinę tę należy utrzymywać na lodzie aż do zakażenia komórek HeLa.</li>
</ol>
3. Poszycie komórek HeLa
<ol>
	<li>Na dzień przed zakażeniem wysiewać 1,5 x 104 komórek HeLa w 200 μl DMEM zawierającym 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS) w studzienkach na 96-dołkowej płytce i hodować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wysiać trzy dołki dla każdego szczepu (trzy różne czasy inkubacji).</li>
</ol>
4. Zakażenie komórek HeLa i obciążenie CCF4
<ol>
	<li>Zakażone komórki HeLa należy dodać 3,5 μl zawiesiny bakteryjnej do pożywki i wymieszać, delikatnie pipetując pożywkę dwukrotnie. Pozwól bakteriom osadzać się na komórkach w MOI (ugrupowaniu infekcji) około 100 bakterii na komórkę. Przez pewien czas infekcje należy rozpocząć po -90 minach, -60 minutach i -30 minutach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 do 0 minut, aby osiągnąć wspólny punkt końcowy.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessać pożywkę bez usuwania komórek HeLa i dodać 50 μl PBS zawierającego 20 μg/ml chloramfenikolu w celu zatrzymania ekspresji efektorów i 2,5 mM probenecydu w celu zmniejszenia eksportu CCF4.</li>
	<li>W tym momencie przenieś 96-dołkową płytkę do stolika mikroskopowego i określ odpowiednie miejsca do późniejszej analizy w każdym dołku. Zakończ ten krok w ciągu 10 minut (szczegółowe informacje na temat pozyskiwania znajdują się w sekcji 5.1).</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 70 μl roztworu ładującego CCF4/AM (0,24 μl roztworu A, 1,2 μl roztworu B, 18,56 μl roztworu C (roztwór A, B i C dostarczony w zestawie ładującym CCF4/AM) i 50 μl PBS (zawierającego 20 μg/ml chloramfenikolu i 2,5 mM probenecydu) za pomocą pipety wielokrotnej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Od teraz praca bez zakłóceń.</li>
	<li>Odessać roztwór nasycający i dodać 100 μl PBS zawierającego 20 μg/ml chloramfenikolu i 2,5 mM probenecydu za pomocą pipety wielokrotnej. Następnie szybko przenieś 96-dołkową płytkę do stolika mikroskopowego i rozpocznij akwizycję w ciągu 10 minut od aspiracji roztworu ładującego.</li>
</ol>
5. Laserowa mikroskopia skaningowa i analiza danych
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Ustaw warunki obrazowania w taki sposób, aby zmaksymalizować całkowitą liczbę fotonów i zminimalizować fototoksyczność, fotowybielanie i wzbudzenie krzyżowe.
		<ol>
			<li>W nowoczesnym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym użyj obiektywu zanurzeniowego o 20-krotnej aperturze numerycznej, otwórz otworek detektora na 2,5 jednostki Airy (tj. Szeroki przekrój optyczny), wybierz detektory GaAsP o wysokiej czułości z jednocześnie aktywnymi kanałami donorowymi i akceptorowymi, 8 bitową głębią, rozmiarem piksela ~ 750 nm, 3-krotnym uśrednianiem ramek i wzbudzić 10% lasera diodowego 405 nm.</li>
			<li>Aby zapewnić prawidłową kwantyfikację, ustaw wzmocnienie detektora obu kanałów na tę samą wartość i aby uniknąć nasycenia pikseli. 
			Uwaga: W tym przypadku zyski zostały ustawione na 150%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapewnić ciągłe zanurzenie, rozprowadzając podłoże zanurzeniowe na dno studzienek, na przykład za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, i unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Aktywuj przechodzące światło i znajdź reprezentatywne pole widzenia w każdej studni. Użyj prawidłowo skalibrowanego stolika automatycznego i zaznacz pozycję w oprogramowaniu.</li>
		<li>Po wyjęciu płytki do barwienia (patrz punkt 4.3) ponownie włożyć płytkę i dodać obciążnik na wierzchu, aby uniknąć znoszenia ogniskowej. Przejrzyj zapisane pozycje w trybie skanowania laserowego i odpowiednio dostosuj ostrość i pozycję boczną.</li>
		<li>Ustaw upływ czasu na 2 minuty, czas trwania na 2 godziny i rozpocznij akwizycję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja obrazu (przykłady zostaną podane dla oprogramowania Bitplane, takiego jak Imaris)
	<ol>
		<li>Zaimportuj zestaw danych do oprogramowania, które umożliwia obliczenia arytmetyczne macierzy pikseli. W tym celu przeciągnij i upuść plik źródłowy zawierający zarówno kanał dawcy, jak i akceptora na ikonę oprogramowania.</li>
		<li>Odejmij tło w obu kanałach, używając tego samego przesunięcia. Aby to zrobić, kliknij przycisk Menu, a następnie kliknij pozycję Image>Processing>Baseline Subtraction. Wybierz każdy kanał i wprowadź wartość bazową.</li>
		<li>Skorygować przesączenie kanału donorowego (Ch1) do kanału akceptorowego (Ch2) za pomocą wcześniej ustalonego współczynnika korekcyjnego f (patrz 1.1), tworząc nowy kanał: 
		Ch2' = Ch2 – Ch1 * f 
		UWAGA: Przebijanie się akceptora do kanału dawczego nie było wykrywalne przy poziomie szumu.
		<ol>
			<li>Kliknij Menu>Przetwarzanie obrazu>Arytmetyka kanałów i wprowadź abs(ch2-(ch1*0.33)). Następnie usuń kanał 2, klikając Menu>Edycja>Usuń kanały. Upewnij się, że kanał akceptora z korektą przebijania pozostaje nowym kanałem 2. Opcjonalnie: Zmień kolor kanału z szarego na kolor oryginalny, przechodząc do Menu>Edytuj>Właściwości obrazu. Wybierz Channel 4>Mapped Color (Kolor odwzorowany>Kolor bazowy i zmień go na np. zielony.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz nowy kanał za pomocą następującej operacji, aby określić względny współczynnik FRET: 
		Ch3 = Ch2' / (Ch1 + Ch2')
		<ol>
			<li>Przejdź do Menu>Przetwarzanie obrazu>Arytmetyka kanałów i wprowadź ch2./(ch1+ch2)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby uzyskać poprawną wizualizację kanału FRET na obrazie 8-bitowym, utwórz czwarty kanał: 
		Ch4 = 255 * Ch3
		<ol>
			<li>Przejdź do Menu>Przetwarzanie obrazu>Arytmetyka kanałów i wprowadź 255*ch3. Zmień kolor kanału, przechodząc do Menu>Edit>Image Properties. Wybierz opcję Channel 4>Maped Color>Color Table File>Jet.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zastosuj filtr mediany 3x3 do kanałów Ch3 i Ch4, który zmniejszy szum na obrazach. Aby to zrobić, kliknij Menu>Przetwarzanie obrazu>Wygładzanie>Filtr mediany. Wybierz oba kanały i zastosuj rozmiar filtra "3x3x1".</li>
		<li>Aby określić ilościowo sygnały komórkowe, wykryj komórki w Ch4, odpowiednio ustawiając przesunięcie i przefiltruj struktury według rozmiaru, aby wykluczyć zbyt małe struktury.
		<ol>
			<li>Wybierz widok Surpass View i kliknij ikonę "Dodaj nowe powierzchnie". Zdefiniuj parametry algorytmu wykrywania w oknie Powierzchnia. Aby przyspieszyć przetwarzanie, zaznacz dwa pola wyboru "Podziel na segmenty tylko obszar zainteresowania" i "Na koniec przetwarzaj cały obraz". Zdefiniuj obszar zainteresowania, edytując jego wymiary.</li>
			<li>Wybierz Kanał 4 jako kanał źródłowy i ustaw próg, wybierając opcję Thresholding>Background Subtraction (Local Contrast) (Thresholding)Background Subtraction (Local Contrast) i ustaw średnicę na 10 μm. Ustaw ręcznie minimalny próg intensywności na 0, a maksymalny próg na maksymalną intensywność. Filtruj struktury według obszaru i ustaw minimalną wartość na np. 187 μm². Zakończ wykrywanie powierzchni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyodrębnij średnie wartości intensywności fluorescencji dawcy (Ch1) i względnego współczynnika FRET (Ch3) oraz ich odchyleń standardowych w jednostce komórkowej. Aby to zrobić, przejdź do Właściwości powierzchni. Zmień wygląd struktur, wybierając opcję Styl/Jakość>Powierzchnia. Zaznacz wszystkie struktury, klikając zakładkę filtrów. Ujednolicenie wykrytych struktur należy przejść do pozycji Wybór procesu>Ujednolicić. Eksportuj statystyki powierzchni do MS Excel, klikając w zakładce statystyki>Eksportuj wszystkie statystyki do pliku.</li>
		<li>Wykreśl te wartości w czasie. Zidentyfikuj 10-minutowy interwał maksymalnego nachylenia wzrostu fluorescencji kanału donorowego dla każdego warunku jako rozsądny parametr reprezentujący ilość translokowanego efektora. Obliczyć nachylenie jako m = Δ intensywność fluorescencji donora / Δ czas (min).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Type+III+Secretion+Systems%3A+Specialized+Nanomachines+for+Protein+Delivery+into+Target+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells.</a> Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+functions+of+pathogenic+Yersinia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effector functions of pathogenic Yersinia species.</a> Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).</li>
<li>Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia%27s+stratagem%3A+targeting+innate+and+adaptive+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense.</a> Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).</li>
<li>Viboud, G. I., Bliska, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+outer+proteins%3A+role+in+modulation+of+host+cell+signaling+responses+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis.</a> Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).</li>
<li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system%3A+traffic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).</li>
<li>Pettersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+virulence+factor+expression+by+pathogen+target+cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact.</a> Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).</li>
<li>Schweer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+necrotizing+factor+of+Yersinia+pseudotuberculosis+%28CNFY%29+enhances+inflammation+and+Yop+delivery+during+infection+by+activation+of+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases.</a> PLoS Pathog. 9 (11), e1003746(2013).</li>
<li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+necrotizing+factor-Y+boosts+Yersinia+effector+translocation+by+activating+Rac+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein.</a> J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).</li>
<li>Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+controls+type+III+effector+delivery+into+host+cells+by+modulating+Rho+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity.</a> PLoS Pathog. 4 (1), e3(2008).</li>
<li>Aili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Yersinia+Yop-effector+delivery+by+translocated+YopE%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE.</a> Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+YopE+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway+fine-tunes+Yop+delivery+into+host+cells+and+facilitates+systemic+spread+of+Yersinia+enterocolitica+in+host+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue.</a> Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).</li>
<li>Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YopB+of+Yersinia+enterocolitica+is+essential+for+YopE+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation.</a> Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).</li>
<li>Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+pathogenic+type+3+secretion+system+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).</li>
<li>Sory, M. P., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+hybrid+YopE-adenylate+cyclase+from+Yersinia+enterocolitica+into+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells.</a> Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).</li>
<li>Schlumberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+type+III+secretion%3A+Salmonella+SipA+injection+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).</li>
<li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif%2C+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).</li>
<li>Koberle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+enterocolitica+targets+cells+of+the+innate+and+adaptive+immune+system+by+injection+of+Yops+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model.</a> PLoS Pathog. 5 (8), e1000551(2009).</li>
<li>Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cells+targeted+by+Salmonella+type+III+secretion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo.</a> PLoS Pathog. 3 (12), e196(2007).</li>
<li>Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plague+bacteria+target+immune+cells+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plague bacteria target immune cells during infection.</a> Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).</li>
<li>Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+type+III+secretion+system+activity+of+enteropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li>
<li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).</li>
<li>Heesemann, J., Laufs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+mobilizable+Yersinia+enterocolitica+virulence+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid.</a> J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).</li>
<li>Zumbihl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxin+YopT+of+Yersinia+enterocolitica+induces+modification+and+cellular+redistribution+of+the+small+GTP-binding+protein+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA.</a> J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj z powodzeniem zastosowaliśmy test reporterowy oparty na beta-laktamazie TEM-1 do ilościowej analizy translokacji efektorowej przez Y. enterocolitica. W literaturze opisano wiele różnych odmian tej wrażliwej, specyficznej i stosunkowo prostej techniki. W pracy przeprowadzono laserową mikroskopię skaningową w celu uzyskania najbardziej czułej i precyzyjnej detekcji sygnałów fluorescencyjnych. W szczególności poprawka na przesłuchy między barwnikami donorowymi i akceptorowymi oraz indywidualnie regulowane pas...

Systemy wydzielania typu III to wyspecjalizowane maszyny do eksportu białek, wykorzystywane przez różne rodzaje bakterii Gram-ujemnych do bezpośredniego dostarczania bakterii kodowanych przez bakterie białek efektorowych do eukariotycznych komórek docelowych. Podczas gdy sama maszyneria wydzielania jest wysoce konserwatywna, wyspecjalizowane zestawy białek efektorowych wyewoluowały wśród różnych gatunków bakterii, aby manipulować komórkowymi szlakami sygnałowymi i ułatwiać określone strategie wirulencji bakterii1. W przypadku Yersinia do siedmiu białek efektorowych, tak zwanych Yops (Yersinia outer proteins), ulega translokacji w kontakcie z komórką gospodarza i działa razem, aby obalić odpowiedzi komórek odpornościowych, takie jak fagocytoza i produkcja cytokin, tj. aby umożliwić zewnątrzkomórkowe przeżycie bakterii2-4. Proces translokacji jest ściśle kontrolowany na różnych etapach5. Ustalono, że pierwotna aktywacja T3SS jest wyzwalana przez jego kontakt z komórką docelową6. Jednak dokładny mechanizm tej inicjacji nie został jeszcze wyjaśniony. W Yersinia drugi poziom tzw. dostrajania translokacji osiąga się poprzez regulację w górę lub w dół komórkowych białek wiążących Rho GTP, Rac1 lub RhoA. Aktywacja Rac1 np. przez inwazynę lub cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący Y (CNF-Y) prowadzi do zwiększonej translokacji7-9, podczas gdy funkcja GAP (białko aktywujące GTPazę) translokowanego YopE reguluje w dół aktywność Rac1 i odpowiednio zmniejsza translokację przez mechanizm typu ujemnego sprzężenia zwrotnego10,11.
Prawidłowe i precyzyjne metody są warunkiem koniecznym do zbadania, w jaki sposób translokacja jest regulowana podczas interakcji z komórkami gospodarza Yersinia. W tym celu wykorzystano wiele różnych systemów, z których każdy ma określone zalety i wady. Niektóre podejścia opierają się na lizie zakażonych komórek, ale nie na bakteriach za pomocą różnych detergentów, a następnie na analizie western blot. Powszechną wadą tych metod jest to, że niewielka, ale nieunikniona liza bakteryjna potencjalnie zanieczyszcza lizat komórkowy białkami efektorowymi związanymi z bakteriami. Jednak leczenie komórek proteinazą K w celu degradacji zewnątrzkomórkowych białek efektorowych, a następnie zastosowanie digitoniny do selektywnej lizy komórek eukariotycznych zostało zaproponowane w celu zminimalizowania tego problemu12. Co ważne, testy te w dużej mierze zależą od wysokiej jakości przeciwciał antyefektorowych, które w większości nie są dostępne na rynku. Próby wykorzystania translacyjnych fuzji białek efektorowych i białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, do monitorowania translokacji nie powiodły się, prawdopodobnie ze względu na globularną trzeciorzędową strukturę białek fluorescencyjnych i niezdolność aparatu wydzielniczego do rozwinięcia ich przed wydzielaniem13. Jednak kilka różnych znaczników reporterowych, takich jak domena cyi (cyklaza adenylanowa zależna od kalmoduliny) cyklolizynytoksyny krztuścowej Bordetella 14 lub znacznik Flash, zostało z powodzeniem wykorzystanych do analizy translokacji. W pierwszym teście aktywność enzymatyczna cyi jest wykorzystywana do wzmacniania sygnału wewnątrzkomórkowego białka fuzyjnego, podczas gdy znacznik Flash, bardzo krótki znacznik motywu tetracysteiny (4Cys), pozwala na znakowanie barwnikiem biarsenowym Flash bez zakłócania procesu wydzielania15.
Podejście zastosowane tutaj zostało po raz pierwszy opisane przez Charpentiera i wsp. i opiera się na wewnątrzkomórkowej konwersji barwnika rezonansowego rezonansu Förstera (FRET) CCF4 przez translokowane fuzje beta-laktamazy efektorowej TEM-116 (Rysunek 1A). CCF4/AM jest związkiem przenikającym komórkę, w którym pochodna kumaryny (donor) i ugrupowanie fluoresceiny (akceptor) są połączone rdzeniem cefalosporyny. Po biernym wejściu do komórki eukariotycznej niefluorescencyjny estryfikowany związek CCF4 / AM jest przetwarzany przez esterazy komórkowe do naładowanego i fluorescencyjnego CCF4, a tym samym uwięziony w komórce. Wzbudzenie ugrupowania kumaryny przy długości fali 405 nm powoduje powstanie FRET do ugrupowania fluoresceinowego, które emituje zielony sygnał fluorescencyjny przy długości fali 530 nm. Po rozszczepieniu rdzenia cefalosporyny przez beta-laktamazę FRET zostaje zakłócony, a wzbudzenie ugrupowania kumaryny prowadzi do emisji niebieskiej fluorescencji przy długości fali 460 nm. W literaturze opisano różne zastosowania tej metody, podkreślając jej wszechstronność. Metoda pozwala na analizę translokacji in vitro, a także in vivo, np. technika została wykorzystana w modelu infekcji myszy w celu identyfikacji populacji leukocytów docelowych do translokacji in vivo17-19. Odczyt sygnałów może odbywać się za pomocą czytników płytek, analizy FACS lub mikroskopii fluorescencyjnej. Warto zauważyć, że metoda ta daje również możliwość monitorowania translokacji w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii żywych komórek podczas procesu infekcji20,21. W tym przypadku do odczytu sygnałów fluorescencyjnych zastosowano laserową skaningową mikroskopię fluorescencyjną, ponieważ zapewnia ona najwyższą czułość i dokładność. W szczególności możliwość regulacji okna emisyjnego z nanometrową precyzją w połączeniu z detektorami o wysokiej czułości ułatwia zoptymalizowane wykrywanie fluorescencji i zminimalizowanie przesłuchów. Ponadto ta konfiguracja mikroskopowa może być dostosowana do monitorowania translokacji w czasie rzeczywistym i potencjalnie pozwala na jednoczesną analizę interakcji gospodarz-patogen na poziomie komórkowym.
W tym badaniu wzorowo przeanalizowano wskaźniki translokacji dzikiego szczepu Y. enterocolitica i mutanta delecji YopE wykazującego fenotyp hipertranslokatora10,11.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Średni</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka (, przezroczyste dno)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, suplement o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX, pirogronian</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ładujący LiveBLAzer FRET-B/G z technologiami CCF4-AM</td><td>Life</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lektyna z Triticum vulgaris (pszenica) Koniugat FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Używany do oznaczania emisji szczytowej i przesłuchów</td></tr><tr><td>V450 Szczur anty-mysi CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Służy do wyznaczania emisji szczytowej i przesłuchów</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny W&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Współczynnik załamania światła = 1,3339 @ 23 &deg; C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x detektory GaAsP-Hybrid, 4-kanałowy spektrometr, rozdzielacz wiązki optycznej acusto, zmotoryzowany stolik XY, regulowany otwór trzpieniowy, obiektyw 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&#160; Laser diodowy nm 50&#160; </td></tr><tr><td>Oprogramowanie mW Imaris 7.6</td> Wtyczki <td>Bitplane</td><td></td><td>w zestawie: kompilator ImarisXT i MeasurementPro</td></tr>, <tr><td>środowisko uruchomieniowe</td>, oprogramowanie <td></td> MathWorks <td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza translokacji efektorowej yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Wiele bakterii Gram-ujemnych, w tym patogenne Yersinia spp., wykorzystuje systemy sekrecji typu III do translokacji białek efektorowych do eukariotycznych komórek docelowych. Wewnątrz komórki gospodarza białka efektorowe manipulują funkcjami komórkowymi z korzyścią dla bakterii. Aby lepiej zrozumieć kontrolę wydzielania typu III podczas interakcji z komórkami gospodarza, wymagane są czułe i dokładne testy do pomiaru translokacji. Opisujemy tutaj zastosowanie testu opartego na fuzji fragmentu białka efektorowego Yersinia enterocolitica (białko zewnętrzne Yersinia; YopE) z beta-laktamazą TEM-1 do ilościowej analizy translokacji. Test opiera się na rozszczepieniu barwnika FRET przenikającego komórkę (CCF4 / AM) przez translokowaną fuzję beta-laktamazy. Po rozszczepieniu rdzenia cefalosporyny CCF4 przez beta-laktamazę, FRET od kumaryny do fluoresceiny zostaje zakłócony, a wzbudzenie ugrupowania kumaryny prowadzi do emisji niebieskiej fluorescencji. W literaturze opisano różne zastosowania tej metody, podkreślając jej wszechstronność. Metoda pozwala na analizę translokacji in vitro, a także in vivo, np. w modelu mysim. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych może być realizowana za pomocą czytników płytek, analizy FACS lub mikroskopii fluorescencyjnej. W opisanej tutaj konfiguracji, translokacja in vitro fuzji efektorowych do komórek HeLa przez różne mutanty Yersinia jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej. Rejestrowanie wewnątrzkomórkowej konwersji reportera FRET przez fuzję efektora beta-laktamazy w czasie rzeczywistym zapewnia wiarygodne wyniki ilościowe. Przedstawiamy tutaj przykładowe dane, wykazujące zwiększoną translokację przez mutanta Y. enterocolitica YopE w porównaniu ze szczepem typu dzikiego.

Aby zademonstrować zdolność opisanej metody do ilościowej analizy translokacji efektorów do komórek docelowych, zbadano dwa szczepy Yersinia o różnej kinetyce translokacji: szczep dziki Y. enterocolitica WA-314 (serogrupa O8, posiadający plazmid wirulencji pYVO822) oraz jego pochodną WA-314ΔYopE (WA-314 posiadający pYVO8ΔYopE23). Wcześniejsze prace wykazały, że mutanty Y. enterocolitica pozbawione funkcjonalnego białka YopE wykazują znacznie wyższy stopień translokacji Yop...

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar translokacji białek efektorowych do komórek gospodarza za pośrednictwem systemu sekrecji typu III bakterii Yersinia. Osiąga się to poprzez inkubację komórek HeLa z mutantami Yersinia wykazującymi fuzje efektora z beta-laktamazą TEM-1, co umożliwia translokację fuzji efektorowych do komórek HeLa. W drugim kroku zainfekowane komórki HeLa są obciążone przenikalnym przez błony komórkowe związkiem raportującym FRET, który jest przetwarzany przez esterazy komórkowe do naładowanego fluorescencyjnie CCF4, a tym samym zostaje uwięziony wewnątrz komórki.Kolejne rozszczepienie związku CCF4 przez przetransportowaną beta-laktamazę prowadzi do przerwania wiązania, co jest rejestrowane za pomocą mikroskopii skaningowej laserowej w celu analizy intensywności fluorescencji donora i akceptora. Wyniki wskazują na różne ilości przetransportowanego efektora TEM1 w fuzji z beta-laktamazą, co opiera się na różnej kinetyce wzrostu fluorescencji donora. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że wewnątrzkomórkowe przetwarzanie związku CCF4 stanowi wysoce specyficzne i czułe narzędzie do pomiaru translokacji.Metod

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Modyfikacja genów za pośrednictwem PCR może być wykorzystana do generowania fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida, co ułatwia wizualizację i ocenę ilościową komórek i białek drożdży. W niniejszym artykule przedstawiono strategię konstruowania fuzji białek fluorescencyjnych (Eno1-FP) w parapsilosie Candida.

Generowanie fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Poznaj metodę pomiaru translokacji efektorów Yersinia do komórek HeLa za pomocą fuzji beta-laktamazy i mikroskopii laserowej. Technika FRET umożliwia ilościową analizę mechanizmów wirulencji bakteryjnej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Przeglądaj więcej filmów