Name: Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj strukturę i organizację białek mitochondrialnych za pomocą kriotomografii elektronowej. Ta metoda pozwala na wizualizację dimerów syntazy ATP w natywnych błonach mitochondriów z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Max Planck Society (K.M.D., B.D., A.W.M., T.B., T.B.B., D.J.M., i W.K.), Cluster of Excellence Frankfurt "Macromolecular Complexes" ufundowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (W.K.) oraz podoktoranckie stypendium EMBO Long-Term Fellowship (V.A.M.G.).

1. Przygotowanie mitochondriów z komórek lub tkanek przez wirowanie różnicowe
Ta sekcja opisuje ogólną procedurę izolacji nienaruszonych mitochondriów od różnych organizmów eukariotycznych. Precyzyjne składniki buforowe i prędkości wirowania muszą być zoptymalizowane dla każdej badanej tkanki/gatunku.
<ol>
	<li>Rozbij komórki w buforze izotonicznym (np. 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES pH 7,4), używając młynka z kulkami szklanymi (grzybnia)28, enzymatycznego trawienia ściany komórkowej (Saccharomyces cerevisiae)29, homogenizatora z łożyskiem kulkowym (jednokomórkowe eukarionty/komórki hodowlane/nicienie)30 lub mieszalnika (tkanki zwierzęce lub roślinne)31.</li>
	<li>Usunąć resztki komórek przez filtrację przez muślin, a następnie odwirowanie na niskiej prędkości (2 000 x g, 4 °C, 10 min).</li>
	<li>Zebrać mitochondria sklarowanego osadu i osadu przez szybkie wirowanie (9 000 x g, 4 °C, 10 min).</li>
	<li>W razie potrzeby należy zastosować stopniowy gradient gęstości izotonicznej w celu dodatkowego oczyszczenia frakcji mitochondrialnej32.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mitochondriów do kriotomografii elektronowej
Poniższa sekcja opisuje, jak uzyskać zamrożone próbki do cryo-ET. UWAGA: Metoda polega na użyciu bardzo zimnego ciekłego azotu i etanu, które mogą powodować poważne oparzenia skóry. Należy nosić okulary ochronne i rękawice krioochronne. Ciekły etan, który jest również łatwopalny, musi być przenoszony w dygestorium.
<ol>
	<li>Zawiesić granulowane mitochondria w 250 mM trehalozie, 10 mM buforze HEPES o pH 7,4 do stężenia około 5 mg/ml białka całkowitego.</li>
	<li>Żarowo-wyładowcze dziurawe siatki węglowe EM, stroną węglową do góry, w urządzeniu próżniowym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Skroplić kilka mililitrów etanu, kierując strumień gazowego etanu na wewnętrzną stronę aluminiowego pojemnika chłodzonego ciekłym azotem.</li>
	<li>Zmieszaj zawiesinę fiducialną złota sprzężoną z białkiem A w stosunku 1:1 z zawiesiną mitochondrialną i natychmiast nałóż 3 μl na siatkę EM z wyładowaniami jarzeniowymi trzymaną w pęsetie.</li>
	<li>Umieść pęsetę w urządzeniu do witryfikacji, np. domowej gilotynie. Zetrzyj nadmiar cieczy klinem bibuły filtracyjnej (~5 sekund lub do momentu, gdy ciecz przestanie się rozprzestrzeniać) i natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie, zwalniając spust.</li>
	<li>Przenieś siatkę z ciekłego etanu na ciekły azot. Podczas przenoszenia usuń nadmiar etanu z siatki za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieść końcówkę kawałka bibuły filtracyjnej w kształcie klina w ciekłym etanie. Gdy ciekły etan unosi się, delikatnie przeciągnij siatkę w górę bibuły filtracyjnej, ale utrzymuj ją poniżej czoła cieczy. Ciekły etan jest usuwany z siatki przez działanie kapilarne, a po usunięciu całego ciekłego etanu natychmiast przenosi siatkę do ciekłego azotu.</li>
	<li>Umieść zeszkloną siatkę w siatkowym pojemniku do przechowywania i przechowuj w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania, jeśli jest to właściwe.</li>
</ol>
3. Nagrywanie serii tomograficznych pochyleń
Poniższa sekcja opisuje, jak skonfigurować i zebrać serię tomografii mitochondrium za pomocą mikroskopu elektronowego Polara wyposażonego w filtr energetyczny po kolumnie i kamerę CCD. Podobne protokoły są stosowane we wszystkich kriomikroskopach elektronowych wyposażonych w kamery CCD lub bezpośrednie detektory elektronów.
<ol>
	<li>Wyrównaj mikroskop
	<ol>
		<li>Umieść próbkę do badań, np. grafit i złote wyspy na dziurawej folii węglowej.</li>
		<li>Wybierz tryb wyszukiwania w systemie niskiej dawki mikroskopu.</li>
		<li>Doprowadź próbkę na wysokość eucentryczną. Jest to punkt minimalnego ruchu xy podczas przechylania uchwytu próbki. Wyśrodkuj punkt zainteresowania przy nachyleniu 0°, przechyl stół montażowy pod kątem 20° i ponownie wyśrodkuj punkt, zmieniając wysokość z. Wróć do 0° i powtarzaj, aż przesunięcie boczne zostanie zminimalizowane.</li>
		<li>Wybierz tryb ekspozycji. Wybierz żądane powiększenie do pobrania tomogramu (np. 25 000X na detektorze ≈ rozmiar piksela próbki 0,6 nm).</li>
		<li>Wybierz małą aperturę kondensora (50-70 mm) i wybierz rozmiar plamki oraz intensywność wiązki tak, aby wiązka była nieco szersza niż urządzenie do obrazowania i dawała odczyt pikseli na poziomie 60 e-/piksel (CCD) lub 14 e-/piksel/s (bezpośredni detektor elektronów, tryb zliczania).</li>
		<li>Centralna apertura kondensatora.</li>
		<li>Znajdź ostrość gaussowską, np. punkt o minimalnym kontraście. Zresetuj odczyt rozmycia mikroskopu i popraw punkty obrotu oraz środek obrotu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wybierz żądaną koncentrację do nagrywania tomogramu. UWAGA: Wysokie rozmycie (8 μm) zwiększa kontrast, ale zmniejsza rozdzielczość, podczas gdy niskie rozmycie (2-4 μm) zwiększa rozdzielczość kosztem kontrastu.</li>
		<li>Nad pustym otworem wygeneruj nowe odniesienie wzmocnienia i ustaw filtr energii zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Dostosuj tryby wyszukiwania i ekspozycji. W trybie ekspozycji wyśrodkuj punkt zainteresowania i przełącz się w tryb wyszukiwania. Wybierz powiększenie 1,500X (0,033 μm/piksel próbki na detektorze) i rozmycie 100 μm (dla zwiększenia kontrastu). Przenieś punkt zainteresowania z powrotem na środek za pomocą cewek przesunięcia obrazu.</li>
		<li>W trybie wyszukiwania dostosuj rozmiar plamki i intensywność wiązki tak, aby wiązka była nieco szersza niż urządzenie do obrazowania i dawała odczyt pikseli na poziomie ~20 e-/piksel (CCD) lub ~8 e-/piksel/s (bezpośredni detektor elektronów, tryb zliczania).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdowanie dobrego obszaru próbki
	<ol>
		<li>Włóż siatkę z zamrożonymi mitochondriami uwodnionymi do mikroskopu elektronowego w temperaturze ciekłego azotu (patrz instrukcje producenta EM).</li>
		<li>W trybie wyszukiwania przeszukaj siatkę w poszukiwaniu obszarów o odpowiedniej grubości lodu i jakości próbki. Zrób 6-sekundowe wyszukiwanie obrazu obiecujących obszarów, aby określić przydatność do zbierania tomografów. Zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna błona mitochondrialna powinny być widoczne w tym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywanie serii tomograficznych pochyleń
	<ol>
		<li>Po znalezieniu dobrego obszaru próbki przechyl stolik ±60°, aby określić maksymalny zakres nachylenia, który jest dostępny bez żadnych przeszkód w ekspozycji lub obszarze ostrości przez paski siatki lub bryły lodu.</li>
		<li>Na pobliskiej wypełnionej lodem o podobnym wyglądzie zmień tryb ekspozycji na tryb ekspozycji i dostosuj intensywność wiązki lub czas akwizycji obrazu tak, aby każdy zarejestrowany obraz miał dawkę elektronów 30-50 e-/piksel dla CCD lub 6-8 e-/pixel/s bezpośrednich detektorów elektronów, tryb zliczania.</li>
		<li>Obliczyć stosunek rozkładu dawki (I0/I60), dzieląc średnią liczbę elektronów dla obrazu uzyskanego w ciągu 1 sekundy w temperaturze 0° przez liczbę elektronów uzyskanego w obrazie 60°. Współczynnik ten opisuje wydłużenie czasu ekspozycji wymaganego do utrzymania stałej liczby elektronów na obraz wraz ze wzrostem kąta nachylenia (czas ekspozycji = 1/cos(α)n, gdzie (I0/I60)=2n). Stosunek ten służy również jako dobry wskaźnik grubości lodu. Dobre tomogramy mitochondriów są zwykle rejestrowane z I0/I60 = 2,3-2,6.</li>
		<li>Nad pustym otworem uzyskaj obraz z 1 sekundy w trybie ekspozycji i zanotuj liczbę elektronów na A2. Biorąc pod uwagę stosunek rozkładu dawki, należy obliczyć całkowitą liczbę obrazów, które można zarejestrować dla określonej całkowitej dawki elektronów (np. <40 e-/Å2 dla określenia struktury i ~160 e-/Å2 dla morfologii).</li>
		<li>Określić odpowiedni przedział pochylenia dla zbierania tomogramu, dzieląc całkowity zakres pochylenia (np. 120° dla ±60°) przez całkowitą liczbę obrazów obliczoną w ppkt 3.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić i zapisać tomogram o parametrach określonych powyżej za pomocą odpowiedniego oprogramowania do automatycznego zbierania danych33,34. Serie pochylenia są zwykle rozpoczynane pod kątem ±20° i przechodzą przez 0° przed osiągnięciem wysokich pochyleń, aby zmaksymalizować zawartość informacyjną obrazów o niskim nachyleniu, które są niszczone przez zwiększanie dawki elektronów.</li>
</ol>
4. Tworzenie i segmentacja tomograficznych objętości
Ta sekcja opisuje, jak objętości tomograficzne mitochondriów są generowane z serii pochyleń i jak te objętości są obecne do ogólnego oglądania.
<ol>
	<li>Zapisz serię pochyleń tomograficznych w odpowiednim katalogu. Wygeneruj stos obrazów i przekonwertuj go na odpowiedni format pliku za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak dm2mrc lub tif2mrc (pakiet IMOD), które konwertuje pliki .dm3, .dm4 lub .tif na stosy mrc. Do rekonstrukcji tomograficznej za pomocą IMOD35 wymagane są stosy mrc. Inne pakiety wymagają różnych formatów.</li>
	<li>Wyrównaj obrazy i wygeneruj tomogram, wykonując czynności opisane w samouczku IMOD (<a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a>).</li>
	<li>Zwiększ kontrast tomogramu za pomocą nieliniowego anizotropowego filtra dyfuzyjnego rozprowadzanego za pomocą IMOD. Filtr ten działa dobrze w przypadku membran i cząstek związanych z błoną, takich jak syntaza ATP.</li>
	<li>W celu wizualizacji należy ręcznie podzielić tomogram na segmenty za pomocą dostępnych na rynku programów, np. Amira. Przypisz woksele odpowiadające błonie wewnętrznej lub zewnętrznej i wygeneruj powierzchnię. Korzystając z opcji clicker we wtyczce EM-package dla AMIRA36, zaznacz lokalizację cząsteczek syntazy ATP.</li>
</ol>
5. Subtomogram: Uśrednianie dimerów syntazy ATP i dopasowywanie struktur rentgenowskich
Poniższa sekcja opisuje, jak można uzyskać średnie subtomogramowe dimerów syntazy ATP.
<ol>
	<li>Korzystając z oznaczonych cząstek jako danych wejściowych i odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak program "Szacowanie cząstek dla tomografii elektronowej", oblicz średnią subtomogramową.</li>
	<li>Aby uzyskać oszacowanie rozdzielczości, porównaj dwie niezależnie wyznaczone średnie subtomogramu za pomocą korelacji powłoki Fouriera37.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, zadokuj znane struktury rentgenowskie do średniej subtomogramu za pomocą dopasowania korpusu sztywnego, ręcznie lub przy użyciu automatycznych procedur sekwencyjnego dokowania, takich jak te w programie Chimera38.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tutaj protokół stanowi wprowadzenie do krio-ET i uśredniania mitochondriów metodą subtomogramu, ale zasadniczo tę samą procedurę można zastosować do każdego innego przedziału komórkowego lub błony. Aby uzyskać jak najlepsze dane, krytycznymi etapami procedury są przygotowanie próbki, proces zamrażania wgłębnego i strategia pozyskiwania danych. Jakość próbki, która ma kluczowe znaczenie dla sukcesu, zależy od zoptymalizowanego protokołu zamrażania, aby zapewnić odpowiednią grubość lodu, co ma ogromne znaczenie dla dobrego kontrastu obrazu. Optymalna strategia pozyskiwania danych zależy od urządzenia i próbki. Parametry, które należy zoptymalizować, obejmują dawkę elektronów na obraz, schemat nachylenia i rozmycie. Zaopatrzenie się w dobry tomogram dobrej próbki ułatwia wszystkie dalsze etapy przetwarzania i zapewnia zadowalający efekt końcowy.
Cryo-ET w połączeniu z uśrednianiem subtomogramu i dopasowaniem modelu atomowego dostarcza szczegółowych informacji na temat rozmieszczenia kompleksów białkowych w ich naturalnym środowisku komórkowym. Technika ta nadaje się również do badania struktury dużych błonowych kompleksów białkowych, takich jak superkompleksy łańcuchów oddechowych (1,7 MDa), dimery syntazy ATP (2x500 kDa) lub jądrowy kompleks porowy (~120 MDa)8,9,17. Organizacja dimerów syntazy ATP w rzędy nie może być obserwowana za pomocą technik o wysokiej rozdzielczości, takich jak krystalografia rentgenowska, NMR lub krio-EM z pojedynczą cząstką, ponieważ rzędy dimerów są zakłócane przez ekstrakcję detergentem, co jest niezbędnym krokiem w izolacji i oczyszczaniu kompleksów białek błonowych.
Ułożenie syntazy ATP w rzędach dimerów wzdłuż grzbietów cristae jest uniwersalną zasadą organizującą mitochondria u wszystkich gatunków. Kompleksy pompujące protony w łańcuchu transportu elektronów, w szczególności kompleks I (dehydrogenaza NADH), znajdują się w obszarach błony po obu stronach rzędów 8,9. Ta organizacja łańcucha oddechowego ma głęboki wpływ na bioenergetykę mitochondriów. Jeśli rzędy dimerów nie mogą się tworzyć z powodu braku podjednostek białkowych specyficznych dla dimerów, komórki wykazują dłuższy czas generacji i zmniejszoną sprawność komórkową, jak zaobserwowano w mutancie drożdży pokazanym na rysunku 341. Wraz z rosnącym zainteresowaniem chorobami mitochondrialnymi, szczegółowe zrozumienie molekularnych podstaw rządzącej ultrastrukturą i funkcją mitochondriów ma ogromne znaczenie. Kriotomografia elektronowa zapewnia powiązanie między strukturą białek określaną metodami o wysokiej rozdzielczości, a rozmieszczeniem i rozmieszczeniem tych białek w błonie w skali nanometrów. To sprawia, że cryo-ET jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia struktury i funkcji mitochondriów w zdrowiu i chorobie.
Dalsze postępy techniczne i ulepszenia w cryo-ET obejmują strategie znakowania białek w celu identyfikacji pozycji podjednostek białkowych w kompleksach makromolekularnych lub lokalizacji mniejszych lub mniej odrębnych białek (<0,5 MDa) w komórkach. Ponadto hybrydowe metody przetwarzania EM, które łączą uśrednianie subtomogramowe z analizą pojedynczych cząstek lub rekonstrukcją spiralną, określiły ostatnio struktury białek do ~8 A42,43. Te metody przetwarzania są obecnie ograniczone do oczyszczonych białek, które są dobrze oddzielone w lodzie lub tworzą spiralne zespoły i obecnie nie mają zastosowania w zatłoczonych środowiskach komórkowych, takich jak mitochondria i błony grzebieniowe. Do gromadzenia danych opracowywane są nowe narzędzia obliczeniowe i sprzętowe, które umożliwiają zautomatyzowane pozyskiwanie tomogramów, zwiększają kontrast obrazu i zmniejszają całkowitą wymaganą dawkę elektronów. Jedynym podstawowym ograniczeniem w cryo-ET jest uszkodzenie próbki przez promieniowanie wiązki elektronów. Oznacza to, że tylko bardzo niskie dawki elektronów mogą być używane do rejestrowania każdego obrazu serii nachylenia tomografii, co skutkuje słabym stosunkiem sygnału do szumu, co ostatecznie ogranicza osiągalną rozdzielczość. Nowe bezpośrednie detektory elektronów, wprowadzone na rynek niecały rok temu, rewolucjonizują obecnie dziedzinę krio-EM44,45 pojedynczych cząstek. Te nowe detektory zapewniają wyższy kontrast i lepszą rozdzielczość przy niższych dawkach elektronów. W przypadku kriotomografii elektronowej oznacza to, że serie pochyleń z mniejszymi krokami, a nawet tomogramy dwuosiowe mogą być zbierane bez obaw o nadmierne uszkodzenia promieniowania (jeden obraz CCD odpowiada pod względem dawki elektronów 5 obrazom z bezpośredniego detektora elektronów). Ogromne ilości danych generowanych przez te detektory stwarzają własne wyzwania w zakresie obsługi, przetwarzania i przechowywania danych, którym trzeba będzie sprostać.
Ponadto płytki fazowe, które działają na podobnych zasadach, jak te rutynowo stosowane w mikroskopii świetlnej w celu zwiększenia kontrastu fazowego, są obecnie opracowywane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej46,47. Powinno to umożliwić gromadzenie tomogramów bliżej punktu widzenia, a zatem w wyższej rozdzielczości, przy jednoczesnym zachowaniu cech o niskiej rozdzielczości niezbędnych do wyrównania i interpretacji objętości tomograficznych. Podsumowując, ten postęp technologiczny znacznie rozszerzy zakres zagadnień biologicznych, na które można odpowiedzieć za pomocą cryo-ET.

Mitochondria to elektrownie komórki. Przekształcając elektrochemiczny gradient protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną w energię wiązania chemicznego, mitochondrialna syntaza ATP wytwarza większość ATP, która napędza procesy komórkowe. Aby zrozumieć mechanizmy stojące za konwersją energii mitochondrialnej, musimy określić strukturę syntazy ATP in situ oraz dowiedzieć się, w jaki sposób jest ona ułożona i rozprowadzona w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Chociaż dostępne są struktury o wysokiej rozdzielczości większości mitochondrialnych składników syntazy ATP1-3 i mapy o niskiej rozdzielczości całego kompleksu4, ważne jest ustalenie struktury i konformacji enzymu roboczego w błonie. Powszechnie zakłada się, że rozkład syntazy ATP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest losowy, ale wczesneodkrycie5 i nasze własne wstępnewyniki6 wskazują, że tak nie jest. Późniejsze badania naszej grupy i innych7 potwierdziły, że syntaza ATP jest ułożona w długich rzędach dimerów wzdłuż ciasno zakrzywionych grzbietów wewnętrznej błony mitochondrialnej cristae8, podczas gdy pompy protonowe łańcucha transportu elektronów wydają się znajdować po obu stronach rzędów9. Taki układ ma ważne implikacje dla mechanizmów mitochondrialnej konwersji energii.
Techniką, której użyliśmy do określenia tego układu, jest kriotomografia elektronowa (cryo-ET). Cryo-ET jest obecnie jedyną metodą, która zapewnia dokładne trójwymiarowe (3D) objętości komórek, przedziałów komórkowych lub organelli w rozdzielczości molekularnej. Cryo-ET jest szczególnie przydatny do badania dużych kompleksów w błonach biologicznych, ponieważ błony pojawiają się z dobrym kontrastem i są łatwe do prześledzenia w objętościach tomograficznych 3D.
Inne metody badania struktury 3D komórek lub organelli nie dostarczają szczegółów molekularnych. Mikroskopia świetlna o wysokiej rozdzielczości10,11 doskonale ujawnia położenie lub odległości między znacznikami emitującymi światło przyczepionymi do interesujących białek z dokładnością do dziesiątek nm, ale nie ujawnia struktury samego białka, nawet w niskiej rozdzielczości. Transmisyjna mikroskopia elektronowa odcinków szeregowych12 lub obrazowanie blokowe za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej13 próbek biologicznych osadzonych w tworzywach sztucznych zapewnia widoki objętości komórkowych o niskiej rozdzielczości, ale również nie ujawnia szczegółów molekularnych. Mikroskopia sił atomowych14 może w zasadzie zapewnić rozdzielczość molekularną, a nawet atomową, ale tylko na powierzchni obiektów na atomowo płaskim, stałym podłożu. Wreszcie, tomografiarentgenowska15 lub rozpraszanie intensywnych impulsów promieniowania rentgenowskiego z laserów na swobodnychelektronach16 prawdopodobnie nie ujawni struktury dużych, złożonych, aperiodycznych obiektów, takich jak całe komórki lub organelle w rozdzielczości molekularnej w dającej się przewidzieć przyszłości. W związku z tym obecnie nie ma alternatywy dla cryo-ET do badań struktury 3D komórek lub organelli w rozdzielczości nanometrowej.
Cryo-ET to metoda z wyboru do badania struktury i konformacji zespołów białek związanych z błoną, w tym kompleksu porów jądrowych17, kompleksów kolców grypy18 i białek motorycznych wici22,23, ale także organizacji całych komórek bakteryjnych19 i wnikania wirusów chorobotwórczych, takich jak HIV, do komórek20-23. Cryo-ET jest nieoceniony w wizualizacji białek nitkowatych i ich interakcji w komórce, w tym filamentów aktynowych24 lub aksonemów25. Rozdzielczość można zwiększyć do 2 nm lub lepiej przez subtomogram o średniej26, przy czym podobjętości powtarzających się, regularnych cech są wycinane z objętości tomograficznej i uśredniane za pomocą technik przetwarzania obrazu pojedynczej cząstki.
Cryo-ET polega na pozyskiwaniu serii obrazów projekcyjnych cienkiej próbki (<250nm) wykonanych pod różnymi kątami nachylenia w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM). Próbka musi być cienka, aby elektrony, które silnie oddziałują z materią, były rozpraszane nie więcej niż raz. Wielokrotne rozpraszanie sprawia, że powstałe obrazy są trudne do interpretacji i zmniejsza kontrast. Obrazy wybranego obszaru próbki są wyrównywane względem siebie i rzutowane w przestrzeń 3D przez odpowiedni program komputerowy, generując objętość 3D próbki. Wyrównanie obrazów jest wspomagane przez złote znaczniki referencyjne, które są mieszane z próbką przed zamrożeniem. Idealnie byłoby, gdyby na każdym obrazie znajdowało się 10 lub więcej równomiernie rozmieszczonych znaczników odniesienia, aby uzyskać dobre wyrównanie.
Aby obserwować szczegóły molekularne, próbki są zamrażane w ciekłym etanie, który zachowuje ich naturalny stan uwodnienia. Zamrażanie w ciekłym etanie jest tak szybkie (~105 °C/s)27, że woda nie krystalizuje, ale pozostaje w stanie zeszklonym, podobnym do szklistego. Tworzenie się kryształków lodu uszkadza wrażliwe struktury biologiczne. Ponieważ próbki biologiczne cierpią z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, istnieje ograniczenie całkowitej liczby zdarzeń rozpraszania, które próbka może tolerować. Obrazy są zatem pozyskiwane w trybie niskiej dawki: obszar zainteresowania jest identyfikowany przy małym powiększeniu (1 500X) z dawką elektronów poniżej 1 e-/nm2 (tryb wyszukiwania). Obraz jest następnie ustawiany pod kątem większego powiększenia, poza obszarem zainteresowania (tryb ostrości). Dopiero po uzyskaniu obrazu obszar zainteresowania jest naświetlany wyższą dawką elektronów (tryb ekspozycji).
Tutaj prezentujemy przegląd sposobu zbierania i przetwarzania kriotomogram elektronowych, używając jako przykładu dimerów syntazy ATP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Poniższy protokół opisuje, jak przygotować mitochondria do krio-ET, jak skonfigurować i zebrać serię pochylenia z określoną całkowitą dawką elektronów oraz jak przetworzyć serię przechyłu w celu uzyskania objętości 3D obszaru zainteresowania. Przegląd procedury przedstawiono na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zymola</td><td>biomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości średni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 lub P1644</td><td></td></tr><tr><td>Białko A złoto</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Ethane</td><td>Air Liquide</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>Azot</td><td>Air Liquide</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>Niemagnetyczna, wzór #5</td></tr><tr><td>Siatka testowa kombinowana EM</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>Grapitowe i złote wyspy na dziurawej folii węglowej</td></tr><tr><td>Holey Siatki węglowe</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH lub C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu mesh</td></tr><tr><td>Cryo</td> grid boxes <td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>Alternatywne domowe pudełka metalowe</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do koralików szklanych - ubijak do koralików</td><td>Produkty BioSpec</td><td>1107900-105</td><td>Z kulkami 0,5 mm</td></tr><tr><td>Homogenizator z łożyskiem kulkowym (Balch)</td><td>Wirówka isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>Aparat wyładowczy</td><td>Bal-Tec AG</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do witryfikacji siatki</td><td>FEI, Gatan lub Leica</td><td></td><td>Alternatywny domowy tłok</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI lub Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Bezpośredni detektor elektronów</td><td>Szczyt Gatan</td><td>K2</td><td>4k x 4k pikseli, tryb zliczany</td></tr><tr><td>Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k pikseli (alternatywa dla bezpośredniego detektora elektronów)</td></tr><tr><td>Filtr energii</td><td>Gatan lub Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji Tomogramów</td><td>Alternatywy Gatan, FEI, USCF lub UC-Boulder</td><td></td><td>4</td></tr><tr>Oprogramowanie<td>do przetwarzania Tomogramów</td><td>Alternatywy</td><td></td> FEI, UCSF lub UC-Boulder <td></td> 3</tr><tr><td>Oprogramowanie do uśredniania subtomogramu</td><td>Alternatywy UC-Boulder lub University of Basel</td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do wizualizacji Tomogram</td><td>UC-Boulder, FEI lub University of Utah</td><td></td><td>3 alternatywy</td></tr><tr><td>Wtyczka oprogramowania do wizualizacji</td><td>Uniwersytet</td><td></td> Goethego <td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do wizualizacji konstrukcji</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do obliczeń numerycznych</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

wizualizacja dimerów syntazy atp w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Kriotomografia elektronowa to potężne narzędzie w biologii strukturalnej, zdolne do wizualizacji trójwymiarowej struktury próbek biologicznych, takich jak komórki, organelle, pęcherzyki błonowe czy wirusy na szczegółach molekularnych. Aby to osiągnąć, wodna próbka jest szybko zeszklona w ciekłym ETANIE, który zachowuje ją w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego. W mikroskopie elektronowym rejestrowane są serie nachylenia w temperaturze ciekłego azotu, na podstawie których rekonstruowane są tomogramy 3D. Stosunek sygnału do szumu objętości tomograficznej jest z natury niski. Rozpoznawalne, powtarzające się cechy są wzmacniane przez uśrednianie subtomogramowe, za pomocą którego poszczególne podobjętości są wycinane, wyrównywane i uśredniane w celu zmniejszenia szumu. W ten sposób można uzyskać mapy 3D o rozdzielczości 2 nm lub lepszej. Dopasowanie dostępnych struktur o wysokiej rozdzielczości do objętości 3D tworzy następnie modele atomowe kompleksów białkowych w ich naturalnym środowisku. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystujemy kriotomografię elektronową do badania organizacji in situ dużych kompleksów białek błonowych w mitochondriach. Odkrywamy, że syntazy ATP są zorganizowane w rzędy dimerów wzdłuż silnie zakrzywionych wierzchołków błony wewnętrznej, podczas gdy kompleks I jest losowo rozmieszczony w regionach błony po obu stronach rzędów. Poprzez uśrednianie subtomogramu uzyskano strukturę mitochondrialnego dimeru syntazy ATP w błonie grzebieniowej.

Kriotomogramy elektronowe mitochondriów wyraźnie ukazują morfologię 3D tego organellum (Rysunek 2). Ręczna segmentacja błon w wolumenie tomograficznym ilustruje strukturę grzebieni w mitochondrium. Poprzez obrazowanie mitochondriów z różnych szczepów drożdży z nokautem, którym brakuje określonych komponentów białkowych, można ocenić wpływ tych białek na morfologię grzebieni. Rysunek 3 przedstawia mitochondrium ze szczepu drożdży pozbawionego podjednostki e syntazy ATP. Ten komponent kompleksu syntazy ATP jest niezbędny do dimeryzacji mitochondrialnej syntazy ATP. Mitochondria z tego szczepu nie posiadają typowych blaszkowatych grzebieni charakterystycznych dla mitochondriów typu dzikiego (Rysunek 2), lecz zamiast tego zawierają szereg przedziałów błony wewnętrznej. Przedziały te są albo pozbawione grzebieni, albo zawierają niewielkie, balonowate inwaginacje błony (Rysunek 3).
W tomogramach o dobrym kontraście duże kompleksy białek mitochondrialnych, w tym przypadku dimery syntazy ATP, są łatwo widoczne (Rycina 4; Film 1). Struktury tych kompleksów można wyznaczyć z rozdzielczością 2-3 nm za pomocą uśredniania subtomogramów (Rycina 5; Film 2). Średnie wolumeny można ponownie umieścić w tomogramie, aby ocenić organizację poszczególnych kompleksów względem siebie oraz innych kompleksów białkowych w błonie (Rycina 6; Film 3).
<img alt="Izolacja, mrożenie i krio-EM mitochondriów; schemat; proces: rozbicie komórek, tomografia." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający etapy krio-tomografii elektronowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Struktura mitochondrium, tomografia i model 3D, błony wewnętrzna i zewnętrzna, grzebienie, macierz z opisami." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Morfologia mitochondrium z dzikiego typu S. cerevisiae. Przekrój centralny przez wolumen tomograficzny mitochondrium dzikiego typu S. cerevisiae (lewo) oraz odpowiadający mu wolumen z renderowaniem powierzchni (prawo). Segmentowany wolumen błony zewnętrznej przedstawiono w kolorze szarym, a wolumeny błony wewnętrznej i grzebieni w kolorze jasnoniebieskim. Adaptacja z Davies et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Schemat budowy mitochondrium, z zaznaczonymi błonami, grzebieniami i macierzą; porównanie z mikroskopią elektronową." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Mitochondrium z szczepu S. cerevisiae pozbawionego podjednostki niezbędnej do dimeryzacji syntazy ATP. Przekrój przez objętość tomograficzną (po lewej) oraz towarzysząca rekonstrukcja powierzchniowa objętości (po prawej) mitochondrium ze szczepu S. cerevisiae pozbawionego podjednostki białkowej e niezbędnej do dimeryzacji syntazy ATP. W porównaniu z Rycina 2, mitochondrium ze szczepu mutanty nie posiada prawidłowych lamelarnych grzebieni charakterystycznych dla mitochondriów typu dzikiego. Zamiast tego, mitochondrium posiada wiele przedziałów błony wewnętrznej, które nie mają grzebieni lub posiadają grzebienie w kształcie balonów. W ten sposób kriotomografia elektronowa uwydatnia zmiany w morfologii błon wynikające z delecji genów. Adaptacja z Davies et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa chloroplastu z lokalizacjami syntazy ATP, schemat wskazujący miejsca syntezy energii." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Mitochondrium grzyba P. anserina. Przekrój przez wolumen tomograficzny (lewo) oraz towarzysząca renderowana powierzchnia wolumenu (prawo) mitochondrium nitkowatego grzyba P. anserina. W tym tomogramie rzędy cząsteczek o rozmiarze 10 nm (żółte groty strzałek) znajdują się nad silnie zakrzywionymi grzbietami błony w grzebieniach błony wewnętrznej (patrz Film 1). Cząsteczki te zostały zidentyfikowane jako dimery syntazy ATP za pomocą uśredniania subtomogramów. Z Davies et al9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Schemat struktury białka przedstawiający konfigurację molekularną, miejsca wiązania i oddziaływania." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Struktura i organizacja mitochondrialnej syntazy ATP. Widok z boku i z góry przedstawiający gęstość elektronową dimeru syntazy ATP z S. cerevisiae wyznaczoną metodą uśredniania subtomogramów z dopasowanymi modelami atomowymi (po lewej). Pęcherzyk wewnętrznej błony mitochondrialnej pokazujący organizację dimerów syntazy ATP w rzędach (po prawej). Rycina została wygenerowana poprzez umieszczenie średniej z subtomogramów dimeru syntazy ATP w segmentowanej objętości pęcherzyka błonowego, przy użyciu współrzędnych obliczonych podczas uśredniania. Adaptacja z Davies et al8. Modele atomowe: F1/pierścień rotora [PDB:2WPD]39 (niebieski i fioletowy); białko OSCP wrażliwe na oligomycynę [PDB:2BO5]40 (zielone); fragment bocznego ramienia [PDB:2CLY]1 z resztami N-końcowymi z [PDB:2WSS]2 (żółty i czerwony) (patrz Film 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Schemat Cryo-EM układu mikrotubul; analiza strukturalna 3D ujawniająca oddziaływania białkowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Izolowany pęcherzyk grzebieniowy z mitochondrium P. anserina. Przekroje z wolumenu tomograficznego (po lewej) oraz towarzyszący wolumen z renderowaniem powierzchni (po prawej) pęcherzyka grzebieniowego z P. anserina. Wyraźnie widoczne są gęstości białkowe wystające z błony. Gęstości wskazane żółtymi grotami strzał to dimery syntazy ATP, zidentyfikowane metodą uśredniania subtomogramów. Zielone groty strzał wskazują gęstości zidentyfikowane za pomocą znakowania przeciwciałami jako dehydrogenaza NADH (kompleks 1; szczegóły w9). Segmentacja gęstości białkowych ujawnia ich organizację w grzebieniach, gdzie dimery syntazy ATP (czerwone i żółte) tworzą rzędy wzdłuż silnie zakrzywionych krawędzi grzebieni, a kompleksy dehydrogenazy NADH (zielone) znajdują się w obszarach błony po obu stronach tych rzędów (patrz Film 3). Z Davies et al9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
Film 1. Kriotomogram elektronowy mitochondrium P. anserina .Film przedstawia kolejne przekroje przez objętość tomograficzną mitochondrium grzyba nitkowatego P. anserina. Rzędy syntazy ATP zostały zaznaczone żółtymi grotami strzałek. Renderowana powierzchniowo, segmentowana objętość pokazuje rozmieszczenie syntazy ATP (żółte sfery) w odniesieniu do trójwymiarowej struktury grzebieni. Błona zewnętrzna – szara; wewnętrzna błona graniczna – przezroczysta niebieska; błony grzebieni – nieprzezroczyste niebieskie. Według Davies et al9. Patrz również Rysunek 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Film 2. Średnia subtomogramowa dimeru syntazy ATP mitochondrialnej z S. cerevisiae z dopasowanymi modelami atomowymi. Średnia została obliczona z 121 subwolumenów. Gęstość jest wyświetlana na trzech poziomach konturowych: 1s - siatka, 2s - jasnoszary i 3s - ciemnoszary. Modele atomowe zostały dopasowane do gęstości przy użyciu procedury sekwencyjnego dopasowania w programie Chimera. Modele atomowe: F1/pierścień rotora [PDB:2WPD]39 (niebieski i fioletowy); białko OSCP nadające wrażliwość na oligomycynę [PDB:2BO5]40 (zielony); fragment trzonu peryferyjnego [PDB:2CLY]1 z resztami N-końcowymi z [PDB:2WSS]2 (żółty i czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.</a>
Zaadaptowano z Davies et al8. Patrz również Rysunek 5.
Film 3. Izolowany pęcherzyk grzebieniowy z mitochondrium P. anserina. Przedstawiono kolejne przekroje przez objętość tomograficzną, a następnie segmentowaną objętość z renderowaniem powierzchni. Wyraźnie widoczne są gęstości białek wystające z błony. Czerwone i żółte gęstości to dimery syntazy ATP. Zielone gęstości to dehydrogenaza NADH (kompleks I), zidentyfikowana za pomocą znakowania przeciwciałami. Z Davies et al9. Zobacz również Rysunek 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury i organizacji białek mitochondrialnych w C two. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie mrożonej hydratowanej siatki do mikroskopu elektronowego zawierającej próbkę. Następnie, w kriomikroskopie elektronowym, rejestrowana jest seria nachyleń próbki z ograniczoną dawką elektronów.Następnie seria przechyłów jest przetwarzana w celu wygenerowania wolumenu tomograficznego. Na koniec uśrednia się gęstości białek, aby określić ich strukturę, a membrany są segmentowane w celu ujawnienia ich struktury 3D. Poprzez ponowne umieszczenie uśrednionych obrazów białek w tomogramach, ujawniona zostaje struktura i organizacja białek w błonie.Kriotomografię elektronową mitochondriów przeprowadzamy, aby zrozumieć sposób ich funkcjonowania na poziomie molekularnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa cienkich przekrojów w plastiku, jest wyższa rozdzielczość. Materiał nie jest w żaden sposób utrwalany chemicznie, dzięki czemu zachowane zostają szczegóły molekularne białek.Opanowanie techniki krioelektronowej może zająć trochę czasu, jednak doświadczeni użytkownicy są w stanie uzyskać od pięciu do sześciu wysokiej jakości preparatów do TOM podczas jednej sesji. Najtrudniejszą częścią procedury jest przygotowanie zamrożonych uwodnionych siatek o optymalnej grubości lodu. Po izolacji i wirowaniu mitochondriów zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 250 mM trioz w 10 mM buforze HEPA, aby resuspender osad do stężenia około 5 mg/mL całkowitego białka. Siatki EM z węglem należy poddać rozładowaniu koronowemu stroną węglową do góry w urządzeniu próżniowym zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie skroplić kilka mililitrów etanu, kierując strumień gazowego etanu na wewnętrzną stronę aluminiowego pojemnika chłodzonego ciekłym azotem.Za pomocą pęsety chwyć siatkę DM poddaną wyładowaniom żarowym i połóż ją na stole laboratoryjnym. Wymieszaj roztwór białka, koniugowaną zawiesinę markerów złota (fiducials) w stosunku jeden do jednego z zawiesiną mitochondriów, a następnie natychmiast nanieś 3 µL roztworu na siatkę. Następnie umieść pęsetę w urządzeniu do witryfikacji, takim jak własnoręcznie wykonana gilotyna z klinem z papieru filtracyjnego, aby odsączyć nadmiar cieczy z siatki, i zwolnij spust, aby natychmiast zanurzyć siatkę w ciekłym etanie. Następnie przenieś siatkę z ciekłego etanu do ciekłego azotu.Usuń nadmiar etanu z siatki, zanurzając końcówkę nowego klina z papieru filtracyjnego w ciekłym etanie. W miarę podnoszenia się cieczy, delikatnie przeciągnij siatkę w górę papieru filtracyjnego, utrzymując ją poniżej linii cieczy, a następnie niezwłocznie przenieś ją do ciekłego azotu w celu przechowywania do późniejszego użycia. Umieść siatkę w pudełku na siatki i przechowuj w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem, aby zarejestrować tomograficzną serię pochyleń.Zacznij od upewnienia się, że zbiorniki z ciekłym azotem są pełne, a następnie sprawdź, czy temperatura stolika z próbką i urządzenia do przenoszenia siatek jest niższa niż 100 kelvin. Potwierdź prawidłowe ustawienie mikroskopu elektronowego poprzez wykonanie obrazu siatki testowej i sprawdzenie jakości pierścieni Thona; pierścienie Thona powinny być okrągłe i sięgać krawędzi obrazu. Następnie włóż siatkę z zamrożonymi hydratowanymi mitochondriami.Następnie w trybie wyszukiwania (search mode) należy zlokalizować obszary o odpowiedniej grubości lodu i wysokiej jakości próbek. Wykonaj sześciosekundowe zdjęcie obszarów rokujących, aby ocenić ich przydatność do gromadzenia danych. Po zlokalizowaniu odpowiedniego obszaru z próbką, przechyl stoлик o plus lub minus 60 stopni, aby określić maksymalny zakres nachylenia dostępny bez zasłaniania obszaru ekspozycji lub ogniskowania przez pręty siatki lub kryształy lodu w pobliskim wypełnionym lodem otworze o podobnym wyglądzie, przełącz urządzenie w tryb ekspozycji (exposure mode) i dostosuj intensywność wiązki lub czas akwizycji obrazu.Zatem każdy zarejestrowany obraz ma dawkę elektronów od 30 do 50 elektronów na piksel w przypadku detektorów CCD lub od sześciu do ośmiu elektronów na piksel na sekundę. W przypadku bezpośrednich detektorów elektronów oblicz stosunek rozkładu dawki, czyli I zero do I 60, dzieląc średnią liczbę elektronów dla obrazu z ekspozycją jedną sekundę wykonanego przy zero stopni przez liczbę elektronów dla obrazu z ekspozycją jedną sekundę wykonanego przy 60 stopniach nad pustym otworem. Wykonaj obraz z ekspozycją jedną sekundę w trybie ekspozycji i zanotuj liczbę elektronów na angstrom squared.Biorąc pod uwagę współczynnik rozkładu dawki, oblicz całkowitą liczbę obrazów oraz interwał kąta nachylenia, które można zarejestrować dla określonej całkowitej dawki elektronów, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do automatycznego gromadzenia danych. Skonfiguruj i zarejestruj tomogram z tak ustalonymi parametrami, typowymi dla tomografii. W przypadku tych próbek rozpocznij od plus lub minus 20 stopni i przejdź przez zero stopni, zanim osiągniesz wysokie kąty nachylenia.Aby stworzyć i segmentować tomogramy, należy przekonwertować serię pochyleń do formatu pliku odpowiedniego dla oprogramowania do rekonstrukcji. Używając programu do rekonstrukcji tomograficznej, takiego jak IMOD, należy wyrównać obrazy poprzez zaznaczenie pozycji złotych markerów fiducjalnych. Po wyrównaniu należy wygenerować tomogram.Zwiększ kontrast tomogramu, stosując filtr obrazu, taki jak nieliniowy filtr dyfuzji izotropowej dostarczany z programem IMARIO do wizualizacji. Użyj dostępnych komercyjnie programów do ręcznej segmentacji tomogramu. Przypisz woksele odpowiadające błonie wewnętrznej i zewnętrznej do oddzielnych warstw; po przypisaniu utwórz powierzchnię w celu wizualizacji błon.Korzystając z opcji clicker wtyczki pakietu EM dla programu emira, zaznacz położenie cząsteczek syntazy TP, używając zaznaczonych cząsteczek jako danych wejściowych oraz odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak program do estymacji cząsteczek. Dla programu do tomografii elektronowej oblicz średnią agram w celu oszacowania rozdzielczości. Oblicz korelację powłoki Fourier między dwiema niezależnie wyznaczonymi średnimi subtomogramami, korzystając z bezpłatnego programu do wizualizacji.Program Chimera dopasował znane struktury rentgenowskie do średniej z subtomogramów najpierw ręcznie, a następnie automatycznie za pomocą polecenia fit, jak pokazano na tej figurze; manualna segmentacja błon w krioelektronowej tomografii mitochondrium ujawnia strukturę grzebieni w mitochondrium. Poprzez obrazowanie mitochondriów z knockoutowych szczepów drożdży, którym brakuje określonych białek, można ocenić wpływ tych białek na morfologię grzebieni.Przedstawiono tutaj mitochondrium szczepu drożdży pozbawionego podjednostki E syntazy ATP, która jest niezbędna do tworzenia dimerów syntazy ATP. W przeciwieństwie do prawidłowych grzebieni w mitochondriach typu dzikiego, organelle te zawierają szereg struktur błony wewnętrznej, które są albo pozbawione grzebieni, albo zawierają niewielkie, balonowate w wgłębienia błonowe. Na obrazach o dobrym kontraście dimery syntazy ATP są łatwo widoczne, co wskazują tutaj żółte groty strzałek.Poprzez segmentację błon można zwizualizować lokalizację syntazy ATP, przedstawionej teraz jako żółta sfera, w odniesieniu do morfologii grzebienia Christi. W tym przypadku syntazy ATP tworzą rzędy dimerów wzdłuż silnie zakrzywionych krawędzi Lo Meer Christi Sub tommo averaging, co pozwala na wyznaczenie struktur białek w rozdzielczości czterech nanometrów lub lepszej. Poprzez dopasowanie znanych struktur rentgenowskich do sub tomo Graham można złożyć średnie modele atomowe kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku, tak jak pokazano na rysunku.W tym przykładzie średnie wolumeny można ponownie wprowadzić do programu Tomo Graham, aby wspomóc organizację poszczególnych kompleksów względem siebie oraz innych kompleksów białkowych w błonie. Nasz protokół demonstruje, w jaki sposób można wykorzystać kriotomografię elektronową do określenia struktury i organizacji kompleksów białkowych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Protokół ten może być również stosowany do określania struktury i organizacji innych białek związanych z błoną w różnych przedziałach komórkowych.Przygotowanie próbki jest kluczowe dla uzyskania dobrych termogramów. Zamrożona uwodniona siatka musi zawierać idealnie witryfikowane obszary o grubości od 70 do 150 nanometrów. Zazwyczaj przesiewamy od pięciu do sześciu siatek, dopóki nie znajdziemy obszaru o optymalnej grubości lodu i jakości preparatu.Do zbierania danych najlepszy będzie transmisyjny mikroskop elektronowy o napięciu przyspieszającym 300 kV z dedykowaną platformą kriogeniczną, filtrem energetycznym i kamerą z bezpośrednim detektorem elektronów, choć można również użyć urządzenia o napięciu 200 kV z boczną platformą kriogeniczną i kamerą CCD. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania siatki do kriomikroskopii elektronowej. Należy zebrać serię obrazów pod różnymi kątami nachylenia, zrekonstruować tomogram, a następnie obliczyć średnią subtomogramową.Są to podstawowe umiejętności niezbędne do zbadania, w jaki sposób organizacja białek w komórce wpływa na zdolność tej komórki do pełnienia funkcji biologicznych, takich jak wydajna synteza ATP. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem i ciekłym etanem może być bardzo niebezpieczna, dlatego przez cały czas należy nosić okulary ochronne i rękawice.

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizację dimeru syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kryo-tomografii elektronowej

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) umożliwia wizualizację 3D ultrastruktury komórkowej w rozdzielczości nanometrów, ale ręczna segmentacja pozostaje czasochłonna i skomplikowana. Przedstawiamy nowatorski przepływ pracy, który integruje zaawansowane oprogramowanie rzeczywistości wirtualnej do segmentacji tomogramów krio-ET, pokazując jego skuteczność poprzez segmentację mitochondriów w komórkach ssaków.

Wykorzystanie rzeczywistości wirtualnej do immersyjnej segmentacji i analizy danych z tomografii krioelektronowej

Poznaj strukturę i organizację białek mitochondrialnych za pomocą kriotomografii elektronowej. Ta metoda pozwala na wizualizację dimerów syntazy ATP w natywnych błonach mitochondriów z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów