Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest określenie struktury i organizacji białek mitochondrialnych w C dwa. Osiąga się to poprzez wygenerowanie najpierw zamrożonej, uwodnionej siatki mikroskopu elektronowego zawierającej próbkę. Następnie w kriomikroskopie elektronowym rejestruje się serię nachylenia próbki o ograniczonej dawce.

Następnie seria pochylenia jest przetwarzana w celu wygenerowania objętości tomograficznej. Na koniec gęstości białek są uśredniane w celu określenia struktury białek, a błony są segmentowane, aby ujawnić ich strukturę 3D. Poprzez repozycjonowanie średnich białek z powrotem do Toma Grahama, ujawnia się struktura i organizacja białek w błonie.

Robimy więc tomografię krykryzmu elektronowego mitochondriów, ponieważ chcemy zrozumieć, jak działają one na poziomie molekularnym. Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa cienkich skrawków tworzywa sztucznego, jest wyższa rozdzielczość. Materiał nie jest w żaden sposób utrwalony chemicznie, a szczegóły molekularne białek są zachowane.

Opanowanie techniki krytografii elektronowej może zająć trochę czasu, ale doświadczeni użytkownicy mogą zdobyć od pięciu do sześciu dobrej jakości podstaw TOM na sesję. Najtrudniejszą częścią procedury jest wyprodukowanie zamrożonych, uwodnionych siatek o optymalnej grubości lodu Po wyizolowaniu i granulowaniu mitochondriów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 250 milimolowych trioz T w 10-milimolowym buforze HEPA, aby ponownie zawiesić osad do stężenia około pięciu miligramów na mililitr całkowitego wyładowania żarzenia białka. Całkowicie węglowe siatki EM stroną węglową do góry w urządzeniu próżniowym zgodnie z instrukcjami producenta, skroplić kilka mililitrów etanu, kierując strumień etanu na wewnętrzną stronę aluminiowego pojemnika chłodzonego ciekłym azotem.

Użyj pęsety, aby podnieść siatkę DM wyładowania jarzeniowego i umieść ją na białku do mieszania w stole, sprzężonej zawiesinie fiducialnej złota, jeden do jednego z zawiesiną mitochondrialną i natychmiast nałóż trzy mikrolitry roztworu na siatkę. Następnie umieść pęsetę w urządzeniu do witryfikacji, takim jak domowa gilotyna, z klinem bibuły filtracyjnej, zetrzyj nadmiar płynu z siatki i zwolnij spust, aby natychmiast zanurzyć siatkę w ciekłym etanie. Następnie, aby przenieść siatkę z ciekłego etanu do ciekłego azotu.

Usuń nadmiar etanu z siatki, umieszczając końcówkę świeżego klina bibuły filtracyjnej w ciekłym etanie. Gdy ciecz się podnosi, delikatnie przeciągnij siatkę w górę bibuły filtracyjnej, trzymając ją poniżej czoła cieczy, a następnie natychmiast przenieś ją do ciekłego azotu w celu przechowywania do późniejszego wykorzystania. Umieść siatkę w pudełku z siatką i przechowuj w naczyniu wypełnionym ciekłym azotem, aby zarejestrować tomograficzną serię pochylenia.

Zacznij od upewnienia się, że ciekłe azoty są pełne i sprawdź, czy temperatura stolika próbki i urządzenia do przenoszenia siatki są poniżej 100 kelwinów. Upewnij się, że mikroskop elektronowy jest dobrze wyrównany, uzyskując obraz siatki testowej i sprawdzając jakość pierścieni ciernych Pierścienie powinny być okrągłe i rozciągać się do krawędzi obrazu. Następnie włóż siatkę z zamrożonymi uwodnionymi mitochondriami.

Następnie w trybie wyszukiwania wyszukaj obszary o odpowiedniej grubości lodu i jakości próbki. Wykonaj sześciosekundowe wyszukiwanie obrazu obiecujących obszarów, aby określić przydatność do zbierania danych. Po zlokalizowaniu dobrego obszaru próbki przechyl stolik o plus lub minus 60 stopni, aby określić maksymalny zakres nachylenia, który jest dostępny bez zasłaniania ekspozycji lub obszaru ostrości przez paski siatki lub kryształki lodu na pobliskim wypełnionym lodem otworze o podobnym wyglądzie, zmień na tryb ekspozycji i dostosuj intensywność wiązki lub czas akwizycji obrazu.

Tak więc każdy zarejestrowany obraz ma dawkę elektronów od 30 do 50 elektronów na piksel w przypadku CCD lub od sześciu do ośmiu elektronów na piksel na sekundę. W przypadku bezpośrednich detektorów elektronów należy obliczyć stosunek rozkładu dawki lub I zero przez I 60, dzieląc średnią liczbę elektronów dla jednosekundowego obrazu uzyskanego pod kątem zera stopni przez obraz 60 stopni nad pustą. Uzyskaj jednosekundowy obraz w trybie ekspozycji i zanotuj liczbę elektronów na angstrem do kwadratu.

Biorąc pod uwagę stosunek rozkładu dawki, należy obliczyć całkowitą liczbę obrazów i interwał pochylenia, które można zarejestrować dla określonej całkowitej dawki elektronów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do automatycznego gromadzenia danych. Ustaw i nagraj Tom Agram z parametrami właśnie określonymi typowe tomosy. W przypadku tych próbek zacznij od plus minus 20 stopni i przejdź przez zero stopni, zanim osiągniesz wysokie nachylenie.

Aby utworzyć i podzielić tomy na segmenty, należy przekonwertować serię pochyleń na format pliku odpowiedni dla oprogramowania do rekonstrukcji. Korzystając z programu do rekonstrukcji Toma Grahama, takiego jak Im mod, wyrównaj obrazy, zaznaczając położenie złotych znaczników odniesienia. Po wyrównaniu wygeneruj Tommo Grahama.

Zwiększ kontrast tommo Grahama, używając filtra obrazu, takiego jak nieliniowy izotropowy filtr dyfuzyjny rozprowadzony za pomocą IM o do wizualizacji. Użyj dostępnych na rynku programów, aby ręcznie podzielić Toma na segmenty. Przypisz woksele odpowiadające błonie wewnętrznej i zewnętrznej do oddzielnych warstw Po przypisaniu utwórz powierzchnię do wizualizacji membran.

Korzystając z opcji klikania we wtyczce pakietu EM dla emira, zaznacz lokalizację cząstek syntazy TP, używając oznaczonych cząstek jako danych wejściowych i odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak estymacja cząstek. W przypadku programu tomografii elektronowej oblicz średnią agramu, aby uzyskać oszacowanie rozdzielczości. Oblicz korelację powłoki foyer między dwiema niezależnie wyznaczonymi średnimi sub tommo za pomocą bezpłatnego programu do wizualizacji.

Chimera dopasowuje znane struktury rentgenowskie do średniej sub Tom Agram najpierw ręcznie, a następnie automatycznie za pomocą polecenia dopasowania, jak pokazano na tym rysunku, ręczna segmentacja błon w mitochondrialnym krzyku elektronowym ujawnia strukturę Christiego w mitochondriach. Poprzez obrazowanie mitochondriów ze szczepów nokautujących drożdży, które nie mają pewnych białek. Można ocenić wpływ tych białek na morfologię Christi.

Pokazano tutaj mitochondria ze szczepu drożdży pozbawionego podjednostki syntezy TP E, która jest wymagana do tworzenia dimerów syntezy TP. W przeciwieństwie do normalnej Lala Christi z mitochondriów typu dzikiego, te organelle zawierają zamiast tego szereg wewnętrznych struktur błonowych, które są albo pozbawione Christi, albo zawierają małe wgłębienia błony w kształcie balonu. W Ingramach z dobrym kontrastem dimery A TP Synthes są łatwo widoczne, jak wskazują tutaj żółte groty strzałek.

Poprzez segmentację błon można zobrazować lokalizację syntezy A TP reprezentowanej obecnie przez żółtą kulę w odniesieniu do morfologii Christiego. W tym przypadku synteza A TP tworzy rzędy dimerów wzdłuż wysoce zakrzywionych krawędzi tommo Lo Meer Christi Sub Uśrednianie pozwala na określenie struktur białek w rozdzielczości czterech nanometrów lub lepszej. Dopasowując znane struktury rentgenowskie do subtomo Grahama, można złożyć przeciętne modele atomowe kompleksów białkowych w ich naturalnym środowisku, jak widać.

W tym przykładzie średnie objętości mogą zostać umieszczone z powrotem w Tomo Grahamie, aby wspomóc organizację poszczególnych kompleksów względem siebie i innych kompleksów białkowych w błonie. Nasz protokół pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać kriotomografię elektronową do określenia struktury i organizacji kompleksów białkowych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Protokół ten może być również wykorzystany do określenia struktury i organizacji innych białek związanych z błoną w różnych przedziałach komórkowych.

Przygotowanie próbki jest kluczem do uzyskania dobrych termogramów. Zamrożona, uwodniona siatka musi zawierać idealnie szkliste oczy o grubości od 70 do 150 nanometrów. Zazwyczaj przesiewamy od pięciu do sześciu siatek, aż znajdziesz obszar o optymalnej grubości lodu i jakości próbki.

Do zbierania gramów najlepszy jest transmisyjny mikroskop elektronowy o napięciu 300 kilowoltów z dedykowanym kriostopniem i filtrem energetycznym oraz kamerą z bezpośrednim detektorem elektronów, ale można również użyć instrumentu o napięciu 200 kilowoltów ze stolikiem kriogenicznym z bocznym wejściem i kamerą CCD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować siatkę płaczu. Zbierz serię pochylenia, zrekonstruuj termogram i oblicz średnią sub tommo.

Są to podstawowe umiejętności wymagane do zbadania, w jaki sposób organizacja białek w komórce wpływa na zdolność tej komórki do wykonywania funkcji biologicznych, takich jak wydajna synteza A TP. Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem i ciekłym Ethanem może być bardzo niebezpieczna, dlatego przez cały czas należy nosić okulary i rękawice ochronne.