Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury i organizacji białek mitochondrialnych w C two. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie mrożonej hydratowanej siatki do mikroskopu elektronowego zawierającej próbkę. Następnie, w kriomikroskopie elektronowym, rejestrowana jest seria nachyleń próbki z ograniczoną dawką elektronów.

Następnie seria przechyłów jest przetwarzana w celu wygenerowania wolumenu tomograficznego. Na koniec uśrednia się gęstości białek, aby określić ich strukturę, a membrany są segmentowane w celu ujawnienia ich struktury 3D. Poprzez ponowne umieszczenie uśrednionych obrazów białek w tomogramach, ujawniona zostaje struktura i organizacja białek w błonie.

Kriotomografię elektronową mitochondriów przeprowadzamy, aby zrozumieć sposób ich funkcjonowania na poziomie molekularnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa cienkich przekrojów w plastiku, jest wyższa rozdzielczość. Materiał nie jest w żaden sposób utrwalany chemicznie, dzięki czemu zachowane zostają szczegóły molekularne białek.

Opanowanie techniki krioelektronowej może zająć trochę czasu, jednak doświadczeni użytkownicy są w stanie uzyskać od pięciu do sześciu wysokiej jakości preparatów do TOM podczas jednej sesji. Najtrudniejszą częścią procedury jest przygotowanie zamrożonych uwodnionych siatek o optymalnej grubości lodu. Po izolacji i wirowaniu mitochondriów zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 250 mM trioz w 10 mM buforze HEPA, aby resuspender osad do stężenia około 5 mg/mL całkowitego białka. Siatki EM z węglem należy poddać rozładowaniu koronowemu stroną węglową do góry w urządzeniu próżniowym zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie skroplić kilka mililitrów etanu, kierując strumień gazowego etanu na wewnętrzną stronę aluminiowego pojemnika chłodzonego ciekłym azotem.

Za pomocą pęsety chwyć siatkę DM poddaną wyładowaniom żarowym i połóż ją na stole laboratoryjnym. Wymieszaj roztwór białka, koniugowaną zawiesinę markerów złota (fiducials) w stosunku jeden do jednego z zawiesiną mitochondriów, a następnie natychmiast nanieś 3 µL roztworu na siatkę. Następnie umieść pęsetę w urządzeniu do witryfikacji, takim jak własnoręcznie wykonana gilotyna z klinem z papieru filtracyjnego, aby odsączyć nadmiar cieczy z siatki, i zwolnij spust, aby natychmiast zanurzyć siatkę w ciekłym etanie. Następnie przenieś siatkę z ciekłego etanu do ciekłego azotu.

Usuń nadmiar etanu z siatki, zanurzając końcówkę nowego klina z papieru filtracyjnego w ciekłym etanie. W miarę podnoszenia się cieczy, delikatnie przeciągnij siatkę w górę papieru filtracyjnego, utrzymując ją poniżej linii cieczy, a następnie niezwłocznie przenieś ją do ciekłego azotu w celu przechowywania do późniejszego użycia. Umieść siatkę w pudełku na siatki i przechowuj w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem, aby zarejestrować tomograficzną serię pochyleń.

Zacznij od upewnienia się, że zbiorniki z ciekłym azotem są pełne, a następnie sprawdź, czy temperatura stolika z próbką i urządzenia do przenoszenia siatek jest niższa niż 100 kelvin. Potwierdź prawidłowe ustawienie mikroskopu elektronowego poprzez wykonanie obrazu siatki testowej i sprawdzenie jakości pierścieni Thona; pierścienie Thona powinny być okrągłe i sięgać krawędzi obrazu. Następnie włóż siatkę z zamrożonymi hydratowanymi mitochondriami.

Następnie w trybie wyszukiwania (search mode) należy zlokalizować obszary o odpowiedniej grubości lodu i wysokiej jakości próbek. Wykonaj sześciosekundowe zdjęcie obszarów rokujących, aby ocenić ich przydatność do gromadzenia danych. Po zlokalizowaniu odpowiedniego obszaru z próbką, przechyl stoлик o plus lub minus 60 stopni, aby określić maksymalny zakres nachylenia dostępny bez zasłaniania obszaru ekspozycji lub ogniskowania przez pręty siatki lub kryształy lodu w pobliskim wypełnionym lodem otworze o podobnym wyglądzie, przełącz urządzenie w tryb ekspozycji (exposure mode) i dostosuj intensywność wiązki lub czas akwizycji obrazu.

Zatem każdy zarejestrowany obraz ma dawkę elektronów od 30 do 50 elektronów na piksel w przypadku detektorów CCD lub od sześciu do ośmiu elektronów na piksel na sekundę. W przypadku bezpośrednich detektorów elektronów oblicz stosunek rozkładu dawki, czyli I zero do I 60, dzieląc średnią liczbę elektronów dla obrazu z ekspozycją jedną sekundę wykonanego przy zero stopni przez liczbę elektronów dla obrazu z ekspozycją jedną sekundę wykonanego przy 60 stopniach nad pustym otworem. Wykonaj obraz z ekspozycją jedną sekundę w trybie ekspozycji i zanotuj liczbę elektronów na angstrom squared.

Biorąc pod uwagę współczynnik rozkładu dawki, oblicz całkowitą liczbę obrazów oraz interwał kąta nachylenia, które można zarejestrować dla określonej całkowitej dawki elektronów, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do automatycznego gromadzenia danych. Skonfiguruj i zarejestruj tomogram z tak ustalonymi parametrami, typowymi dla tomografii. W przypadku tych próbek rozpocznij od plus lub minus 20 stopni i przejdź przez zero stopni, zanim osiągniesz wysokie kąty nachylenia.

Aby stworzyć i segmentować tomogramy, należy przekonwertować serię pochyleń do formatu pliku odpowiedniego dla oprogramowania do rekonstrukcji. Używając programu do rekonstrukcji tomograficznej, takiego jak IMOD, należy wyrównać obrazy poprzez zaznaczenie pozycji złotych markerów fiducjalnych. Po wyrównaniu należy wygenerować tomogram.

Zwiększ kontrast tomogramu, stosując filtr obrazu, taki jak nieliniowy filtr dyfuzji izotropowej dostarczany z programem IMARIO do wizualizacji. Użyj dostępnych komercyjnie programów do ręcznej segmentacji tomogramu. Przypisz woksele odpowiadające błonie wewnętrznej i zewnętrznej do oddzielnych warstw; po przypisaniu utwórz powierzchnię w celu wizualizacji błon.

Korzystając z opcji clicker wtyczki pakietu EM dla programu emira, zaznacz położenie cząsteczek syntazy TP, używając zaznaczonych cząsteczek jako danych wejściowych oraz odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak program do estymacji cząsteczek. Dla programu do tomografii elektronowej oblicz średnią agram w celu oszacowania rozdzielczości. Oblicz korelację powłoki Fourier między dwiema niezależnie wyznaczonymi średnimi subtomogramami, korzystając z bezpłatnego programu do wizualizacji.

Program Chimera dopasował znane struktury rentgenowskie do średniej z subtomogramów najpierw ręcznie, a następnie automatycznie za pomocą polecenia fit, jak pokazano na tej figurze; manualna segmentacja błon w krioelektronowej tomografii mitochondrium ujawnia strukturę grzebieni w mitochondrium. Poprzez obrazowanie mitochondriów z knockoutowych szczepów drożdży, którym brakuje określonych białek, można ocenić wpływ tych białek na morfologię grzebieni.

Przedstawiono tutaj mitochondrium szczepu drożdży pozbawionego podjednostki E syntazy ATP, która jest niezbędna do tworzenia dimerów syntazy ATP. W przeciwieństwie do prawidłowych grzebieni w mitochondriach typu dzikiego, organelle te zawierają szereg struktur błony wewnętrznej, które są albo pozbawione grzebieni, albo zawierają niewielkie, balonowate w wgłębienia błonowe. Na obrazach o dobrym kontraście dimery syntazy ATP są łatwo widoczne, co wskazują tutaj żółte groty strzałek.

Poprzez segmentację błon można zwizualizować lokalizację syntazy ATP, przedstawionej teraz jako żółta sfera, w odniesieniu do morfologii grzebienia Christi. W tym przypadku syntazy ATP tworzą rzędy dimerów wzdłuż silnie zakrzywionych krawędzi Lo Meer Christi Sub tommo averaging, co pozwala na wyznaczenie struktur białek w rozdzielczości czterech nanometrów lub lepszej. Poprzez dopasowanie znanych struktur rentgenowskich do sub tomo Graham można złożyć średnie modele atomowe kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku, tak jak pokazano na rysunku.

W tym przykładzie średnie wolumeny można ponownie wprowadzić do programu Tomo Graham, aby wspomóc organizację poszczególnych kompleksów względem siebie oraz innych kompleksów białkowych w błonie. Nasz protokół demonstruje, w jaki sposób można wykorzystać kriotomografię elektronową do określenia struktury i organizacji kompleksów białkowych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Protokół ten może być również stosowany do określania struktury i organizacji innych białek związanych z błoną w różnych przedziałach komórkowych.

Przygotowanie próbki jest kluczowe dla uzyskania dobrych termogramów. Zamrożona uwodniona siatka musi zawierać idealnie witryfikowane obszary o grubości od 70 do 150 nanometrów. Zazwyczaj przesiewamy od pięciu do sześciu siatek, dopóki nie znajdziemy obszaru o optymalnej grubości lodu i jakości preparatu.

Do zbierania danych najlepszy będzie transmisyjny mikroskop elektronowy o napięciu przyspieszającym 300 kV z dedykowaną platformą kriogeniczną, filtrem energetycznym i kamerą z bezpośrednim detektorem elektronów, choć można również użyć urządzenia o napięciu 200 kV z boczną platformą kriogeniczną i kamerą CCD. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania siatki do kriomikroskopii elektronowej. Należy zebrać serię obrazów pod różnymi kątami nachylenia, zrekonstruować tomogram, a następnie obliczyć średnią subtomogramową.

Są to podstawowe umiejętności niezbędne do zbadania, w jaki sposób organizacja białek w komórce wpływa na zdolność tej komórki do pełnienia funkcji biologicznych, takich jak wydajna synteza ATP. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem i ciekłym etanem może być bardzo niebezpieczna, dlatego przez cały czas należy nosić okulary ochronne i rękawice.