Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu
July 12th, 2022
Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.
Protokół ten zapewnia łatwy dostęp do coraz bardziej popularnego, ale złożonego świata kriotomografii elektronowej. Można zobrazować sześć próbek komórkowych. Instytut w stanie bliskim ojczystemu.
Mikrocząsteczki mogą być następnie rozpoznawane w wysokiej rozdzielczości w ich naturalnym środowisku komórkowym za pomocą CROW, ET i uśredniania subatomów. Zacznij od uruchomienia oprogramowania Tomo five z komputera serwera TEM. Rozpocznij konfigurację sesji, dostosowując parametry akwizycji obrazu w zakładce przygotowania, w sekcji ustawień wstępnych.
Skopiuj parametry akwizycji obrazu do wszystkich innych ustawień wstępnych dużego powiększenia. Naciśnij Set", aby ustawić ekspozycję na mikroskop i Pobierz", aby uzyskać ustawienia ekspozycji dla wszystkich innych dużych powiększeń po wybraniu ich indywidualnie. Aby odebrać atlas, kliknij przycisk Nowa sesja"w Atlasie"patka.
Ustaw preferencje sesji. Wprowadź ścieżkę przechowywania i format wyjściowy, a następnie naciśnij Zastosuj. Wybierz Screening" i zaznacz wszystkie atlasy, które chcesz zdobyć.
Wybierz Zamknij zawory wywoławcze"Jeśli mikroskop nie jest nadzorowany, spowoduje to zamknięcie zaworów kolumny. Następnie, aby rozpocząć projekcję, naciśnij przycisk start. Sprawdź pojedyncze lub wiele atlasów pod kątem celów, klikając siatkę w lewym panelu w obszarze Ustawienia sesji"Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij myszą, aby poruszać się i przewiń środkiem, aby powiększyć i pomniejszyć.
Wybierz siatkę dla konfiguracji docelowej. Wybierz go i kliknij Załaduj próbkę"z wnętrza oprogramowania. Aby przeprowadzić kalibrację przesunięcia obrazu, w zakładce Funkcje automatyczne ustaw ustawienie wstępne na Wysokość eucentryczna"Przejdź do automatycznej eucentryczności" przez pochylenie stage i naciśnij start.
Jeśli funkcja pozostała wyśrodkowana podczas celowania, pomiń kalibrację przesunięcia obrazu. W przeciwnym razie przejdź do zakładki Przygotowanie, aby skalibrować przesunięcie obrazu, wybierz Kalibruj przesunięcie obrazu" i naciśnij start. Spowoduje to wyrównanie mniejszych powiększeń do funkcji wyśrodkowanej przy powiększeniu ekspozycji.
Aby skonfigurować tomografię, rozpocznij nową sesję w Ustawieniach sesji" dla próbek biologicznych. Wybierz Płyta jak"jako typ próbki i wybierz Partia"i Niska dawka"Następnie wybierz Format wyjściowy i przechowywanie"folder. Opcjonalnie dodaj odbiorcę wiadomości e-mail i naciśnij Zastosuj"Aby ustawić cele, przejdź do strzałki atlasu, znajdź interesujący Cię region i poruszaj się, wybierając opcje, które pojawiają się po kliknięciu prawym przyciskiem myszy.
Zrób zdjęcie poglądowe, aby potwierdzić dobrą pozycję do eucentrycznej regulacji wysokości. Następnie naciśnij autoeucentryczny"aby uruchomić procedurę eucentrycznego pochylenia sceny, ponownie uzyskaj nowy obraz przeglądowy, aby zaktualizować wysokość eucentryczną. Sprawdź przegląd kwadratów lub pobraną mapę wyszukiwania.
Przejdź do interesującego Cię regionu i naciśnij przycisk Uzyskaj wyszukiwanie. Następnie sprawdź obraz wyszukiwania, jeśli obszar zainteresowania nie jest wyśrodkowany, kliknij prawym przyciskiem myszy w żądanej pozycji i powtórz etap Przenieś tutaj" i uzyskaj obraz. Dostosuj obszary ostrości i śledzenia.
Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby przeciągnąć obszary śledzenia i ostrości. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Dodaj pozycję"Aby wykonać funkcje automatyczne, sprawdź ustawienia, aby wykonać wyrównanie za pomocą funkcji automatycznych"zakładka, nawigując atlasem do obszaru węgla. Doprowadź ten obszar do wysokości eucentrycznej i postępuj zgodnie z kolejnością wyrównań opisaną w rękopisie tekstu.
Następnie rozpocznij automatyczną akwizycję zakładki tomografia. Wybierz płytę Akwizycja danych i ustaw żądane parametry. Ustaw parametry akwizycji danych: krok pochylenia, maksymalny kąt dodatni, maksymalny kąt ujemny, schemat śledzenia.
Następnie wybierz Zamknij zawory kolumnowe"dla schematu wysokości eucentrycznej. Zacznij od przygotowania plików wejściowych i katalogów. Utwórz folder projektu w folderze Projekt".
Utwórz kolejny nowy folder ze stałymi stosami i przygotuj pliki wejściowe. Seria uchylna jedna stała seria uchyłu 1. XF i uchylne serii 1.tlt.
Aby obliczyć rozmycie, zaktualizuj plik parametrów o parametry mikroskopu i obrazowania. Skopiuj plik parametrów do folderu projektu. Zmień jego nazwę na param_CTF.
M i uruchom wskazane polecenie. Następnie sprawdź wyniki estymacji CTF. Dla każdego stosu sprawdź wyrównane stosy za pomocą moda 3D i upewnij się, że koraliki odniesienia zostały poprawnie usunięte.
Upewnij się, że ręczność jest poprawna, uruchamiając wskazane polecenie. Następnie sprawdź wartość rozmycia i upewnij się, że jest zgodna z teoretycznym oszacowaniem CTF. Aby zdefiniować podregiony, wygeneruj tomogram zgięcia.
W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Określ granice, wybierając sześć punktów Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin i Zmax, aby utworzyć jeden podregion w folderze bin10, uruchom wskazane polecenie. Następnie uruchom wybieranie cząstek dla każdego podregionu.
W przypadku zestawu danych apoferrytyny przeprowadź wyszukiwanie w szablonie w pojemniku szóstym. Zmodyfikuj kąt podkreślenia szablonu. Parametry wyszukiwania, aby określić kąt, zakres i interwały dla wyszukiwania w płaszczyźnie lub poza płaszczyzną w stopniach.
W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Usuń niewłaściwe cząsteczki za pomocą moda 3D w folderze. Convmap_wedge_Type2_bin6. Uruchom wskazane polecenie.
Następnie zainicjuj projekt. W folderze projektu uruchom wskazane polecenie, aby utworzyć bazę danych dla przejrzystości EM, AppoF.mat. Wykonaj rekonstrukcję tomogramu przed uśrednieniem i wyrównaniem sub tomo, aby wygenerować tomogramy subregionów skorygowane przez CTF w bin4, uruchom wskazane polecenie.
Następnie, aby przeprowadzić uśrednianie i wyrównanie sub tomo, przeprowadź uśrednianie za pomocą poprawionych podtelegramów CTF, zaczynając od bin4. W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Kontynuuj wyrównywanie i uruchom polecenie.
Wyczyść nakładające się na siebie cząstki, uruchamiając wskazane polecenie. Wykonaj ostateczną rekonstrukcję, łącząc dwie połówki zestawów danych. W folderze projektu uruchom wskazane polecenia.
Przegląd przebiegu tomografii dla tomografii komórkowej i molekularnej przedstawiono tutaj dla próbek komórkowych i blaszkowych, strategia zbierania danych w dużej mierze zależy od próbki i celu badania obrazowego. Parametry pobierania dla kilku badań krio-ET są pokazane tutaj. Pokazano tutaj reprezentatywne tomogramy próbek molekularnych, takich jak apoferrytyna, cienkie procesy komórkowe i zmielona wiązką jonów blaszka grubej próbki komórkowej.
Analiza strukturalna o wysokiej rozdzielczości może pomóc w ujawnieniu miejsc wiązania celów lekowych, a tomografia i uśrednianie subtomogralne również pomagają w opracowywaniu szczepionek przeciwko SARS-CoV-2.
Przegląd
Ten protokół opisuje szczegółowe kroki zdalnego pozyskiwania i przetwarzania danych w wysokiej rozdzielczości dla tomografii krioelektronowej (cryo-ET), przy użyciu apoferytyny jako systemu modelowego. Przepływ pracy osiąga rozdzielczość struktury cryo-ET na poziomie 2,86 Å, prezentując wydajne metody od zbierania danych do średniej subtomografu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Tomografia krioelektronowa
- Biologia strukturalna
- Wizualizacja komórkowa
Tło
- Wprowadzenie do technik tomografii krioelektronowej.
- Znaczenie obrazowania próbek komórkowych w ich stanie naturalnym.
- Wykorzystanie apoferytyny do ilustracji metodologicznej.
Zastosowane metody
- Zdalne pozyskiwanie danych z oprogramowaniem Tomo5.
- Metody przetwarzania przy użyciu emClarity do średniej subtomografu.
- Wysokiej rozdzielczości obrazowanie w systemach biologicznych.
Główne wyniki
- Sukcesywnie wykazane zbieranie i przetwarzanie danych w wysokiej rozdzielczości.
- Uzyskano szczegółowe obrazowanie apoferytyny z znaczącą rozdzielczością.
- Walidacji metod dla przyszłych badań cryo-ET.
Wnioski
- To badanie dostarcza systematycznego podejścia do obrazowania w wysokiej rozdzielczości w biologii strukturalnej.
- Przedstawione metodologie są istotne dla rozwoju badań nad tomografią krioelektronową.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
