Name: Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj tomografię krioelektronową zdalnego zbierania danych i uśredniania subtomogramu przy użyciu apoferrytyny. Ta metoda osiąga rozdzielczość 2,86 Å dla badań strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy firmie Diamond Light Source za dostęp i wsparcie urządzeń kriogenicznych w brytyjskim krajowym Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC), finansowanych przez Wellcome Trust, MRC i BBRSC. Chcielibyśmy również podziękować Andrew Howe'owi za nabycie tomogramu Apoferritin (Film 1), Ishika Kumarowi za przygotowanie i nabycie tomogramu neuronowego (Film 2) oraz Craigowi MacGregorowi-Chatwinowi za tomogram blaszkowy Cyanobacteria (Film 3).

<ol><li>Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SerialEM%3A+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+getting+intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166(2018).</li>
<li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li>
<li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tomography+in+EMAN2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li>
<li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li>
<li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((emClarity%3A+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+cryo-electron+microscopy%3A+From+sample+to+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).</li>
<li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li>
<li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li>
<li>Liu, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li>
<li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121(2011).</li>
<li>Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li>
<li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364(2021).</li>
<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+%C3%85+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+A+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((emClarity%5BTitle%5D)+AND+%22GitHub%22%5BJournal%5D)">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li>
<li>Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020).</li>
<li>Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021).</li>
<li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li>
<li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016).</li>
<li>Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022).</li>
<li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086(2022).</li>
<li>Mendonça, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629(2021).</li>
<li>Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019).</li>
<li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Tomo5 powiedział: Opis przepływu pracy oprogramowania do tomografii podkreśla jeden potencjalny i najbardziej usprawniony sposób konfiguracji (zdalnej) sesji tomografii wsadowej. Chociaż oprogramowanie jest łatwe dla początkujących, początkowe doświadczenie w krio-EM i podstawowa wiedza na temat tomografii mogą pomóc w konfiguracji. Krytyczne kroki są wyróżnione w protokole i powinny pomóc w rozwiązywaniu problemów, nawet jeśli zastosowano inne podejście do konfiguracji. Postęp w oprogramowaniu ułatwi (zdalne) gromadzenie danych i sprawi, że cryo-ET będzie bardziej dostępny dla szerokiej bazy użytkowników. Poniżej opisano kilka porad i wskazówek, które mogą pomóc w rozwiązywaniu często spotykanych problemów.
Ważną kwestią do omówienia jest wybór siatek, ponieważ podczas przechylania próbki do ±60°, pręty siatki przy dużych nachyleniach mogą zasłaniać widok (Rysunek 8). W siatce TEM rozmiar siatki odnosi się do liczby kwadratów siatki na jednostkę długości siatki. Większe numery siatek mają więcej kwadratów siatki na jednostkę długości, większą gęstość kwadratów siatki i mniejsze kwadraty siatki, tj. siatka 400 siatek ma mniejsze kwadraty niż siatka 200 oczek. Dobrym wyborem siatek do tomografii są siatki 200 lub 300 siatek. Jak pokazano na rysunku 8, dostępny obszar do zebrania zmniejsza się wraz z nachyleniem siatki. Przy nachyleniu ±60° siatka o oczkach 300 będzie miała małe pole widzenia, na którym będzie można uzyskać pełny tomogram. Zaletą siatek o siatce 200 jest to, że większe kwadraty siatki przyspieszają konfigurację tomografii molekularnej, a przy zwiększonej powierzchni siatki kwadratowej jeden kwadrat prawdopodobnie wystarczy na nocną kolekcję. Wadą jest to, że siatki o oczkach 200 są bardziej delikatne, więc obsługa i przycinanie wymagają większej finezji.
Ponadto, w przypadku stosowania dziurawej folii nośnej (patrz tabela materiałów) na siatkach EM, odstępy między otworami muszą być brane pod uwagę przy ustawianiu obszaru ostrości i śledzenia w stosunku do obszaru ekspozycji. Idealnie, średnica wiązki przy pożądanym powiększeniu powinna być wystarczająco mała, aby pokryć obszar węglowy przylegający do obszaru ekspozycji wzdłuż osi nachylenia w celu optymalnego i szybkiego ustawienia. W ten sposób można uzyskać potencjalne obszary zainteresowania w każdym otworze.
Ponieważ eucentryczna procedura wysokości oprogramowania nie jest obecnie tak solidna, jak procedura serialEM, poniższe wskazówki mogą obejść ten problem. Jeśli określenie wysokości eucentrycznej nie powiedzie się przy użyciu ustawienia wysokości eucentrycznej, można zamiast tego użyć ustawienia wstępnego przeglądu i ponownie uruchomić "Auto-eucentryczne przez pochylenie stolika"; Może to rozwiązać problemy, jeśli wysokość eucentryczna jest daleko od 0. Jeśli to się powiedzie, można ponownie uruchomić "Auto-eucentryczny przez pochylenie sceny" z ustawieniami wstępnymi "Eucentryczna wysokość", aby poprawić precyzję. Jeśli to się nie powiedzie, można uruchomić "Auto-Eucentryczny przez pochylenie wiązki" z ustawioną wysokością eucentryczną, a następnie ponownie uruchomić "Auto-eucentryczny przez pochylenie sceny" lub ręcznie ustawić wysokość z skonsolidowaną przez "Auto-eucentryczną przez pochylenie wiązki" w interfejsie użytkownika TEM w ustawieniach "Stół montażowy". W przypadku stosowania siatek z powtarzającym się wzorem otworów, mogą one uniemożliwić identyfikację pojedynczego piku korelacji krzyżowej. Można spróbować zmienić ustawienie wysokości eucentrycznej na mniejsze przesunięcie rozmycia, takie jak −25 μm i/lub krótszy czas ekspozycji, aby zmniejszyć korelację krzyżową z układów otworów. Z drugiej strony, użycie siatek koronkowych/lameli może nie dostarczyć wystarczającego sygnału do silnego piku korelacji krzyżowej. Można spróbować zmienić ustawienie wysokości eucentrycznej na większe przesunięcie rozmycia, takie jak −75 μm i/lub wydłużony czas ekspozycji, aby zwiększyć pik korelacji krzyżowej. Inną opcją jest dostosowanie ustawień filtra obrazu; znajdziesz je w zakładce "Przygotowanie". Opcje dostosowywania ustawień filtra można ustawić dla niskiego (Przegląd/Kwadrat siatki), średniego (Wysokość eucentryczna) i dużego powiększenia (Śledzenie/Ostrość), aby znaleźć optymalny szczyt korelacji krzyżowej dla każdego ustawienia wstępnego. Wymagane dane wejściowe to jeden obraz, tj. pod kątem 0° i jeden pod kątem 5°, a następnie kliknięcie przycisku Porównaj , aby porównać oba obrazy. Zalecana wartość początkowa dla najdłuższej długości fali to jedna czwarta podziałki liniowej na obrazie, a dla najkrótszej długości fali to jedna czterdziesta skali paska. Jeśli szczyt nie zostanie solidnie zidentyfikowany, można zoptymalizować ustawienia, aż do znalezienia przekonującego szczytu. Nie ma potrzeby ponownego pozyskiwania obrazów za każdym razem; wystarczy nacisnąć "Porównaj". Jeśli TOMO nadal nie znajdzie automatycznie wysokości eucentrycznej, można użyć ręcznej kalibracji wysokości eucentrycznej. Należy wyśrodkować się na dość dużym kryszku lodu w powiększeniu ogólnym w zakładce "Przygotowanie", a następnie przejść do "Sterowania stolikiem" w interfejsie użytkownika TEM, ustawić alfę na -30° i dostosować wartość z stopnia, aby ponownie wyśrodkować kryształ za pomocą obrazu ekranu fluorescencyjnego. Wybranie ustawień "Wysoka rozdzielczość" i "Wysoki kontrast" w interfejsie użytkownika TEM sprawi, że będzie to proste (przyciski u dołu okna ekranu fluorescencyjnego). Opcjonalnie, jeśli istnieje dostęp do kamery z trybem na żywo, można to wykorzystać do określenia wysokości eucentrycznej; Będzie to łatwiejsze niż na ekranie fluorescencyjnym.
Największymi ograniczeniami w wersjach Tomo5 wcześniejszych niż 5.8 są brakujące montaże średniego powiększenia, brak symetrycznego schematu dawki oraz problemy związane z eucentrycznym znajdowaniem wysokości. Są one dostępne w serialEM, darmowym oprogramowaniu z szybkim rozwojem i wsparciem społeczności, solidną eucentryczną rutyną wysokości i opcją skryptu, tj. niestandardowym schematem symetrycznym dawki. Począwszy od wersji 5.8 w Tomo5, najczęściej spotykany problem ze znalezieniem wysokości eucentrycznej, tj. nieudane zapętlenie wokół docelowej wartości z, został rozwiązany poprzez wprowadzenie opcji ustawienia kryterium akceptacji wysokości eucentrycznej. Jednak przy różnych typach siatki i próbek zdecydowanie zaleca się dostosowanie ustawień filtra obrazu w celu odzwierciedlenia unikalnych warunków obrazowania poszczególnych sesji i uzyskania najlepszego możliwego piku korelacji krzyżowej w celu znalezienia wysokości eucentrycznej oraz aby obszar ostrości i śledzenia działał niezawodnie podczas akwizycji tomogramu.

Ogólnie rzecz biorąc, wiele obiektów szybko przystosowało się do pracy zdalnej podczas pandemii. Oprogramowanie Tomo5 zapewnia łatwy dostęp i przyjazną dla użytkownika drogę do tomografii, która doskonale nadaje się do zdalnej obsługi. Postępy poczynione w oprogramowaniu bez wątpienia będą nadal sprawiać, że zdalne gromadzenie danych i tomografia w ogóle staną się bardziej powszechne w społeczności.
emPrzejrzystość Ponieważ emClarity wykorzystuje metodę wybierania cząstek opartą na szablonie, potrzebuje szablonu dla obiektu zainteresowania. Zbieranie cząstek (krok 2.6) jest bardzo czułe i ma kluczowe znaczenie dla końcowej struktury. Przed uśrednieniem i wyrównaniem (krok 2.9) należy dokładnie sprawdzić i ręcznie usunąć fałszywe alarmy. Jeśli szablon nie jest dostępny, emClarity może nie być łatwy w użyciu, ale możliwe jest użycie innego oprogramowania, na przykład Dynamo37 i PEET48, w celu utworzenia początkowego modelu.
W przypadku próbek niejednorodnych emClarity jest wyposażony w metodę klasyfikacji, która umożliwia użytkownikom skupienie się na określonych cechach w różnych skalach. Pomocne jest uruchomienie kilku cykli wyrównań przed klasyfikacją i uruchomienie go z wyższym pojemnikiem (takim jak pojemnik 4 lub pojemnik 3).
Aktualna wersja oprogramowania (V1.5.3.11) zawiera znaczące aktualizacje w porównaniu z pierwszą wersją (V1.0)17. Obejmują one między innymi kontrolę ręczności podczas szacowania CTF (krok 2.3); symetria dla wyrównań (CX, I, I2, O); obliczanie funkcji próbkowania 3D dla każdej cząstki (3DSF); przejście na MATLAB 2019a w celu zapewnienia kompatybilności i stabilności; i rekonstrukcja z wykorzystaniem surowych obrazów projekcyjnych (cisTEM). Oprogramowanie będzie nadal ulepszane dla różnych próbek, a najnowsze ogłoszenia można znaleźć w Internecie (patrz tabela materiałów).

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) jest powszechnie znana z okresu renesansu, który przyspieszył, stając się podstawowym i niezwykle użytecznym narzędziem w biologii strukturalnej. Rozwój i wykorzystanie bezpośrednich detektorów elektronów1,2,3, ulepszone mikroskopy i źródła elektronów3,4,5, ulepszenia automatyzacji/przepustowości6,7,8,9, oraz postępy obliczeniowe w analizie pojedynczych cząstek10,11,12,13,14 i tomografia15,16,17 są częściowo odpowiedzialne za niedawny sukces tej techniki. Te czynniki technologiczne rozwinęły zdolność cryo-EM do rozwiązywania biologicznych struktur makromolekularnych w warunkach kriogenicznych i natywnych. Rozdzielczości, które są łatwo osiągalne, są wystarczające do modelowania z atomową dokładnością i wysunęły tę technikę na czoło areny biologii strukturalnej. Redukcjonistyczne podejście do wyrażania i oczyszczania celu biologicznego od dawna okazuje się skuteczne w krystalografii makromolekularnej (MX) w podstawowych badaniach biologicznych, odkrywaniu leków i naukach translacyjnych. W ramach tego samego podejścia cryo-EM może teraz dostarczać wyniki, które są równoległe do badań MX o wysokiej rozdzielczości. Obecny duży sukces w dziedzinie krio-EM biologii strukturalnej nazywa się analizą pojedynczych cząstek (SPA), która polega na pozyskiwaniu obrazów projekcyjnych 2D typowych dla oczyszczonej próbki białka18 w celu uzyskania tysięcy widoków biologicznej makrocząsteczki19. Obrazy te (1) zawierają informacje z szeregu widoków, które w pełni reprezentują orientację celu w przestrzeni 3D oraz (2) uchwycą niejednorodność konformacyjną obiektu, którą można później rozdzielić i zbadać.
Alternatywnym podejściem do pozyskiwania tych obrazów projekcyjnych 2D próbek biologicznych, nawet in situ i bez oczyszczania, jest tomografia krioelektronowa (cryo-ET). Cryo-ET wykonuje serię zdjęć tego samego obiektu pod kątem nachylenia, mechanicznie obracając próbkę. W ten sposób projekcje 2D zebrane w SPA, reprezentujące ułożenie kątowe cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, są z natury zbierane w ramach eksperymentu obrazowania cryo-ET20. Serie nachylenia tomograficznego są następnie rekonstruowane w tomogram, który zawiera reprezentacje 3D obrazowanych kompleksów makromolekularnych. Charakter gromadzenia danych tomograficznych w pewnym stopniu zmniejsza zależność od uśredniania w celu uzyskania pełnej reprezentacji 3D cząsteczki ze zbioru obrazów 2D. Jednak ze względu na obecne projekty etapów, próbka jest zwykle nachylona od -60° do +60°, pozostawiając brakujące informacje w tomograficznej rekonstrukcji 3D wedge21.
Rekonstrukcje 3D w jednym tomogramie mają wtedy brakujący klin informacji i niski poziom sygnału do szumu. Poszczególne makrocząsteczki można ekstrahować jako subtomogramy i uśredniać razem, aby rozwiązać ten problem. Tam, gdzie każda makrocząsteczka w subtomogramie znajduje się w innej orientacji, brakujący klin jest zorientowany inaczej w każdym subtomogramie obiektu docelowego, więc uśrednianie na wielu kopiach uzupełnia informacje z powodu brakującego klina. Ostatnie osiągnięcia w przetwarzaniu obrazów podjęły również próbę wytrenowania sieci neuronowych sztucznej inteligencji, aby wypełniły brakujący klin znaczącymi danymi22. Ten proces uśredniania zwiększa również stosunek sygnału do szumu, podobnie jak w przypadku uśredniania w analizie pojedynczych cząstek, dzięki czemu poprawia się jakość i rozdzielczość rekonstrukcji. Jeśli cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania posiada symetrię, to również można ją zdefiniować i wykorzystać podczas uśredniania, co jeszcze bardziej poprawia rozdzielczość rekonstrukcji. Ekstrakcja objętości 3D makrocząsteczki z tomogramu do zestawu subtomogramów i ich późniejsze przetwarzanie jest znane jako uśrednianie subtomogramu (STA)23. W przypadku, gdy każdy subtomogram reprezentuje unikalną kopię badanej cząsteczki, każda niejednorodność strukturalna może być badana za pomocą przepływu pracy STA. Techniki klasyfikacyjne, powszechnie stosowane w przepływie pracy SPA, mogą być stosowane podczas STA w celu przeanalizowania stanów konformacyjnych kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Oprócz tego, że STA umożliwia rekonstrukcję w wysokiej rozdzielczości w cryo-ET, podejście to sprawia, że technika ta jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów strukturalnych makrocząsteczek w ich naturalnym środowisku komórkowym lub celów, które często nie są podatne na SPA24,25,26.
Tomografia elektronowa ma długą historię określania ultrastruktury 3D próbek komórkowych w temperaturze pokojowej27. Akwizycja widoków poprzez fizyczne przechylenie próbki dostarcza wystarczających informacji do rekonstrukcji 3D obiektu w skalach długości komórkowej i jest szczególnie ważna, gdy strukturom komórkowym brakuje regularności uśredniania. Komórki mogą być również zamrażane na podłożach do obrazowania krio-ET na krawędziach komórek, gdzie próbka jest wystarczająco cienka, aby była przezroczysta dla elektronów. W tych warunkach STA może być wykorzystany do określenia struktur makromolekularnych w środowisku komórkowym, aczkolwiek gdy próbka jest wystarczająco cienka, aby była przezroczysta dla elektronów28. Jednak w połączeniu z dodatkowymi technikami preparatywnymi, w tym kriokorelacyjną mikroskopią świetlną i elektronową (cryo-CLEM) oraz mieleniem skupionej wiązki jonów (cryo-FIB), cryo-ET może być używany do obrazowania wnętrza całych komórek w warunkach kriogenicznych29. Łączy to moc cryo-ET do badania ultrastruktury komórkowej z mocą STA do określania struktur kompleksów makromolekularnych in situ, jednocześnie identyfikując ich lokalizację komórkową30 i dostarczając migawki kompleksów zaangażowanych w procesy dynamiczne31. Zdolność tej techniki do obrazowania próbek komórkowych i wykorzystania STA w kilku badaniach podkreśliła moc tej techniki w rozwiązywaniu struktur makromolekularnych in situ, nawet w rozdzielczościach porównywalnych do SPA32. Kolejną korzyścią jest wiedza o pierwotnej lokalizacji makrocząsteczki, reprezentowanej przez ostateczną sklasyfikowaną rekonstrukcję 3D w tomogram30. Dlatego struktura makromolekularna może być skorelowana z ultrastrukturą komórkową. Te obserwacje w różnych skalach długości prawdopodobnie doprowadzą do ważnych odkryć, w których mechanizmy strukturalne mogą być skorelowane ze zmianami komórkowymi w kontekście badań funkcjonalnych.
Cryo-ET i STA umożliwiają zbieranie danych w trzech głównych przepływach pracy: tomografii molekularnej, komórkowej i lamello. Struktury oczyszczonych kompleksów makromolekularnych można określić za pomocą krio-ET za pomocą tomografii molekularnej. Określenie struktur białek w ich środowisku komórkowym, w którym komórka jest wystarczająco cienka, można określić jako tomografię komórkową. Niedawno, wraz z rozwojem celowania i mielenia kriogenicznego, te same techniki mogą być stosowane w przepływach pracy tomografii lamelowej w celu określenia struktur białkowych głęboko w komórce w ich naturalnym środowisku, ujawniając jednocześnie kontekst komórkowy, w którym te białka są obserwowane. W zależności od dostępnych pakietów oprogramowania i, co najważniejsze, w zależności od wymagań dotyczących próbki, można stosować różne strategie gromadzenia danych. Próbki molekularne lub nieprzylegające na miedzianej siatce TEM oczyszczonego białka zazwyczaj wymagają mniej obsługi, a zatem w idealnych przypadkach pozostają płaskie i nieuszkodzone. Tomogramy elektronowe można łatwo ustawić szeregowo na dziurawej siatce węglowej, aby szybko i systematycznie uzyskiwać dziesiątki do setek tomogramów. Najprostszym sposobem, w jaki użytkownicy mogą skonfigurować próbki tomografii molekularnej, w których białka są obficie obecne na siatce, byłoby użycie Tomo5 (oprogramowanie do tomografii elektronowej 3D użyte w niniejszym badaniu, patrz Tabela materiałów). Dostępne są również inne programy tomograficzne, takie jak Leginon9 i serialEM6; Oferują one więcej opcji konfiguracji dla bardziej spersonalizowanych podejść do zbierania danych, ale są bardziej złożone i w związku z tym mogą być trudniejsze w nawigacji, szczególnie dla użytkowników nowych w tomografii i użytkowników uzyskujących zdalny dostęp do sesji. W przypadku obiektu z dużą i zróżnicowaną bazą użytkowników, Tomo5 jest łatwy w obsłudze w środowisku zdalnym i do szkolenia użytkowników. W przypadku ogniw przylegających siatki zazwyczaj wymagają większej liczby etapów obsługi, a konieczność stosowania delikatnych siatek złotych zwiększa potrzebę lepszej staranności w strategiach obsługi i gromadzenia danych. Aby ułatwić znalezienie interesującego obszaru komórkowego i uniknąć okluzji od samej siatki przy dużych kątach nachylenia, korzystne jest również stosowanie większych rozmiarów oczek, ale kosztem tego, że są one z natury bardziej kruche. W przypadku próbek lameli kruchość próbki zależy od jakości blaszki, która może być zmienna. Czynniki te wydłużają czas konfiguracji i rozważania, ale zwiększona zdolność adaptacji i solidność ponownie sprawiają, że Tomo5 nadaje się do tego typu gromadzenia danych. Jednak dla każdego przepływu pracy istnieją wyspecjalizowane scenariusze zbierania danych. BISECT i PACE-tomo (oba działają w SerialEM) wprowadzają możliwość skryptowego przesuwania obrazu wiązki podczas akwizycji tomografii w celu zwiększenia szybkości pobierania tomogramu28, szczególnie w tomografii molekularnej. Montaże ze średnim powiększeniem (MMM) w SerialEM6,7,33 może lepiej identyfikować i precyzyjnie celować w cechy molekularne we wszystkich przepływach pracy, chociaż w chwili pisania tego tekstu funkcje te zaczynają być implementowane w Tomo5.
Podobnie jak SPA, cryo-ET i STA stają się coraz bardziej dostępne dzięki ulepszeniom oprogramowania do akwizycji i bogactwu dostępnych pakietów do uśredniania subtomogramów16,17,32,34,35,36,37,38. Ponadto, podczas pandemii, umożliwienie zdalnego dostępu do oprzyrządowania krio-EM stało się niezbędne do dalszego działania krajowych obiektów, takich jak Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC) w Diamond Light Source (DLS) w Wielkiej Brytanii. Osiągnięcia te sprawiły, że cryo-ET stał się bardziej dostępny i solidny dla badaczy, którzy chcą wykorzystać tę technikę. Po uzyskaniu danych STA jest niezbędnym narzędziem do analizy powtarzających się obiektów w celu uzyskania rekonstrukcji w maksymalnej rozdzielczości i umożliwienia klasyfikacji heterogeniczności makromolekularnej. Obecny protokół ma na celu zapewnienie szczegółowego przewodnika po przygotowaniu mikroskopu krio-TEM do zbierania danych krio-ET oraz sposobu przeprowadzania uśredniania subtomogramowego przy użyciu emClarity na przykładzie zestawu danych tomografii molekularnej apoferrytyny. Korzystanie z emClarity (oprogramowanie do wysokorozdzielczej tomografii krioelektronowej i uśredniania subtomogramu, patrz Tabela materiałów) wymaga uruchamiania skryptów z wiersza poleceń, więc zakłada się poziom znajomości systemów Linux/UNIX.
Zdalne połączenie zależy od środowiska sieciowego w każdym instytucie/placówce. W eBIC zdalny system korzysta z programów, które umożliwiają zdalne zbieranie danych na temat określonej konfiguracji sieci używanej w Diamond. Zdalne połączenie z mikroskopem ułatwiają dwie platformy: NoMachine i TeamViewer (patrz tabela materiałów). Za pomocą programu NoMachine użytkownik może zalogować się do zdalnego pulpitu systemu Windows. Zdalny pulpit systemu Windows dostarczony przez NoMachine znajduje się w tej samej sieci co mikroskop, a zatem działa jako wirtualny komputer pomocniczy dla mikroskopu. Z wirtualnego komputera pomocniczego użytkownik łączy się z mikroskopem za pośrednictwem TeamViewer, zapewniając bezpośredni dostęp i kontrolę nad komputerem mikroskopu z uruchomionymi TUI i Tomo.
Obecny protokół składa się z dwóch części (krok 1 i krok 2). Krok 1 koncentruje się na zdalnym pozyskiwaniu danych cryo-ET za pomocą Tomo5 (oprogramowanie do tomografii elektronowej 3D). Przewodnik po (zdalnej) sesji rejestruje obrazy w coraz większych powiększeniach, aby ostatecznie umożliwić użytkownikowi skierowanie oprogramowania tomograficznego do docelowych obszarów próbek w celu zebrania danych tomograficznych. Rysunek 1 podsumowuje ten proces. Krok 2 zawiera szczegółowe informacje na temat przetwarzania danych cryo-ET STA za pomocą emClarity (oprogramowanie do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości i uśredniania subtomogramu). Rysunek 9 podsumowuje ten proces.
Protokół jest przeznaczony dla odbiorców zdalnych. Zakłada się, że osoba fizycznie stojąca przy mikroskopie i ładująca próbki dokonała bezpośredniego wyrównania i zajęła się strojeniem kamery oraz pozyskiwaniem danych referencyjnych. W przypadku tego protokołu zakłada się system soczewek z trzema kondensorami i automatycznym ładowaczem. Aby uzyskać bardziej szczegółowe wskazówki dotyczące oprogramowania do tomografii, szczegółowa instrukcja producenta jest dostępna w przycisku Start systemu Windows, z którego oprogramowanie zostało załadowane.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tomography</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5.9.0</td><td>Terminologia wewnętrzna: Tomo5 w dokumencie</td></tr><tr><td>TEM serwer Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>7.10.1</td><td></td></tr><tr><td>TIA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5.10.1</td><td></td></tr><tr><td>DigitalMicrograph</td><td>Gatan</td><td>3.44</td><td></td></tr><tr><td>emClarity</td><td>Oprogramowanie Open-Source</td><td>1.5.3.11</td><td>Oprogramowanie do wysokorozdzielczej tomografii krioelektronowej i uśredniania subtomogramu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie IMOD</td><td>Open-Source</td><td>4.11</td><td>Programy do modelowania, wyświetlania i przetwarzania obrazów wykorzystywane do rekonstrukcji 3D i modelowania obrazów mikroskopowych ze szczególnym uwzględnieniem danych z mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>MotionCor2</td><td>Free do użytku akademickiego</td><td>1.1.0</td><td>Program multi-GPU, który koryguje wywołany wiązką ruch próbki zarejestrowany na stosach filmowych frakcjonowanych dawką</td></tr><tr><td>ETomo</td><td>Open-Source software</td><td>4.11</td><td>ETomo to interfejs do uruchamiania podzbioru poleceń IMOD i PEET.&nbsp;</td></tr><tr><td>NoMachine</td><td>NoMachine, freeware</td><td>7.9.2</td><td>Oprogramowanie do zdalnego pulpitu</td></tr><tr><td>TeamViewer</td><td>TeamViewer AG</td> <td>-</td> <td>Oprogramowanie komputerowe do zdalnego dostępu i zdalnego sterowania</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil (dziurawa folia nośna) Siatki EM</td><td>Quantifoil-Płaska</td><td></td> <td>folia węglowa z predefiniowanym rozmiarem, kształtem i układem</td></tr> <tr><td>otworówInstrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>mikroskop Thermo Fisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr><tr><td>K3 i filtr energetyczny GIB</td> Kamera <td>Gatan-Falcon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4 i filtr energii Selectris X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Website</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Witryna 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td> <td>-</td><td>-</td><td>Link do pobrania pakietu oprogramowania emClarity</td></tr><tr><td>Witryna 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td>-</td><td>-</td><td>Łącze do pobrania IMOD</td></tr><tr><td>Witryna 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td><td>-</td><td>-Link</td> <td>do samouczka online emClarity</td></tr><tr><td>Witryna 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td>-</td><td>-Link</td><td> aby pobrać MotionCor2</td></tr><tr><td>Witryna 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki-</td><td></td><td>-Link</td> <td>do najnowszych ogłoszeń, w tym aktualizacji i poprawek błędów dla emClarity</td></tr></tbody></table>

tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) nabiera rozpędu w ostatnich latach, szczególnie od czasu wprowadzenia bezpośrednich detektorów elektronów, ulepszonych strategii automatycznej akwizycji, technik przygotowawczych, które rozszerzają możliwości tego, co mikroskop elektronowy może zobrazować w wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-ET i nowego oprogramowania do uśredniania subtomogramu. Ponadto pozyskiwanie danych staje się coraz bardziej usprawnione, dzięki czemu jest bardziej dostępne dla wielu użytkowników. Pandemia SARS-CoV-2 jeszcze bardziej przyspieszyła gromadzenie danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), zwłaszcza w przypadku krio-EMU pojedynczych cząstek, w wielu obiektach na całym świecie, zapewniając użytkownikom nieprzerwany dostęp do najnowocześniejszych instrumentów podczas pandemii. Dzięki niedawnym postępom w Tomo5 (oprogramowaniu do tomografii elektronowej 3D), zdalne gromadzenie danych cryo-ET stało się solidne i łatwe w obsłudze z dowolnego miejsca na świecie. Ten artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowego przewodnika, zaczynając od konfiguracji zbierania danych w oprogramowaniu tomograficznym dla procesu (zdalnej) sesji zbierania danych cryo-ET ze szczegółowym rozwiązywaniem problemów. Protokół (zdalnego) gromadzenia danych jest dodatkowo uzupełniony o proces określania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej poprzez uśrednianie subtomogramu za pomocą emClarity, na przykładzie apoferrytyny.

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Protokół ten zapewnia łatwy dostęp do coraz bardziej popularnego, ale złożonego świata kriotomografii elektronowej. Można zobrazować sześć próbek komórkowych. Instytut w stanie bliskim ojczystemu.Mikrocząsteczki mogą być następnie rozpoznawane w wysokiej rozdzielczości w ich naturalnym środowisku komórkowym za pomocą CROW, ET i uśredniania subatomów. Zacznij od uruchomienia oprogramowania Tomo five z komputera serwera TEM. Rozpocznij konfigurację sesji, dostosowując parametry akwizycji obrazu w zakładce przygotowania, w sekcji ustawień wstępnych.Skopiuj parametry akwizycji obrazu do wszystkich innych ustawień wstępnych dużego powiększenia. Naciśnij Set", aby ustawić ekspozycję na mikroskop i Pobierz", aby uzyskać ustawienia ekspozycji dla wszystkich innych dużych powiększeń po wybraniu ich indywidualnie. Aby odebrać atlas, kliknij przycisk Nowa sesja"w Atlasie"patka.Ustaw preferencje sesji. Wprowadź ścieżkę przechowywania i format wyjściowy, a następnie naciśnij Zastosuj. Wybierz Screening" i zaznacz wszystkie atlasy, które chcesz zdobyć.Wybierz Zamknij zawory wywoławcze"Jeśli mikroskop nie jest nadzorowany, spowoduje to zamknięcie zaworów kolumny. Następnie, aby rozpocząć projekcję, naciśnij przycisk start. Sprawdź pojedyncze lub wiele atlasów pod kątem celów, klikając siatkę w lewym panelu w obszarze Ustawienia sesji"Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij myszą, aby poruszać się i przewiń środkiem, aby powiększyć i pomniejszyć.Wybierz siatkę dla konfiguracji docelowej. Wybierz go i kliknij Załaduj próbkę"z wnętrza oprogramowania. Aby przeprowadzić kalibrację przesunięcia obrazu, w zakładce Funkcje automatyczne ustaw ustawienie wstępne na Wysokość eucentryczna"Przejdź do automatycznej eucentryczności" przez pochylenie stage i naciśnij start.Jeśli funkcja pozostała wyśrodkowana podczas celowania, pomiń kalibrację przesunięcia obrazu. W przeciwnym razie przejdź do zakładki Przygotowanie, aby skalibrować przesunięcie obrazu, wybierz Kalibruj przesunięcie obrazu" i naciśnij start. Spowoduje to wyrównanie mniejszych powiększeń do funkcji wyśrodkowanej przy powiększeniu ekspozycji.Aby skonfigurować tomografię, rozpocznij nową sesję w Ustawieniach sesji" dla próbek biologicznych. Wybierz Płyta jak"jako typ próbki i wybierz Partia"i Niska dawka"Następnie wybierz Format wyjściowy i przechowywanie"folder. Opcjonalnie dodaj odbiorcę wiadomości e-mail i naciśnij Zastosuj"Aby ustawić cele, przejdź do strzałki atlasu, znajdź interesujący Cię region i poruszaj się, wybierając opcje, które pojawiają się po kliknięciu prawym przyciskiem myszy.Zrób zdjęcie poglądowe, aby potwierdzić dobrą pozycję do eucentrycznej regulacji wysokości. Następnie naciśnij autoeucentryczny"aby uruchomić procedurę eucentrycznego pochylenia sceny, ponownie uzyskaj nowy obraz przeglądowy, aby zaktualizować wysokość eucentryczną. Sprawdź przegląd kwadratów lub pobraną mapę wyszukiwania.Przejdź do interesującego Cię regionu i naciśnij przycisk Uzyskaj wyszukiwanie. Następnie sprawdź obraz wyszukiwania, jeśli obszar zainteresowania nie jest wyśrodkowany, kliknij prawym przyciskiem myszy w żądanej pozycji i powtórz etap Przenieś tutaj" i uzyskaj obraz. Dostosuj obszary ostrości i śledzenia.Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby przeciągnąć obszary śledzenia i ostrości. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Dodaj pozycję"Aby wykonać funkcje automatyczne, sprawdź ustawienia, aby wykonać wyrównanie za pomocą funkcji automatycznych"zakładka, nawigując atlasem do obszaru węgla. Doprowadź ten obszar do wysokości eucentrycznej i postępuj zgodnie z kolejnością wyrównań opisaną w rękopisie tekstu.Następnie rozpocznij automatyczną akwizycję zakładki tomografia. Wybierz płytę Akwizycja danych i ustaw żądane parametry. Ustaw parametry akwizycji danych: krok pochylenia, maksymalny kąt dodatni, maksymalny kąt ujemny, schemat śledzenia.Następnie wybierz Zamknij zawory kolumnowe"dla schematu wysokości eucentrycznej. Zacznij od przygotowania plików wejściowych i katalogów. Utwórz folder projektu w folderze Projekt".Utwórz kolejny nowy folder ze stałymi stosami i przygotuj pliki wejściowe. Seria uchylna jedna stała seria uchyłu 1. XF i uchylne serii 1.tlt.Aby obliczyć rozmycie, zaktualizuj plik parametrów o parametry mikroskopu i obrazowania. Skopiuj plik parametrów do folderu projektu. Zmień jego nazwę na param_CTF.M i uruchom wskazane polecenie. Następnie sprawdź wyniki estymacji CTF. Dla każdego stosu sprawdź wyrównane stosy za pomocą moda 3D i upewnij się, że koraliki odniesienia zostały poprawnie usunięte.Upewnij się, że ręczność jest poprawna, uruchamiając wskazane polecenie. Następnie sprawdź wartość rozmycia i upewnij się, że jest zgodna z teoretycznym oszacowaniem CTF. Aby zdefiniować podregiony, wygeneruj tomogram zgięcia.W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Określ granice, wybierając sześć punktów Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin i Zmax, aby utworzyć jeden podregion w folderze bin10, uruchom wskazane polecenie. Następnie uruchom wybieranie cząstek dla każdego podregionu.W przypadku zestawu danych apoferrytyny przeprowadź wyszukiwanie w szablonie w pojemniku szóstym. Zmodyfikuj kąt podkreślenia szablonu. Parametry wyszukiwania, aby określić kąt, zakres i interwały dla wyszukiwania w płaszczyźnie lub poza płaszczyzną w stopniach.W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Usuń niewłaściwe cząsteczki za pomocą moda 3D w folderze. Convmap_wedge_Type2_bin6. Uruchom wskazane polecenie.Następnie zainicjuj projekt. W folderze projektu uruchom wskazane polecenie, aby utworzyć bazę danych dla przejrzystości EM, AppoF.mat. Wykonaj rekonstrukcję tomogramu przed uśrednieniem i wyrównaniem sub tomo, aby wygenerować tomogramy subregionów skorygowane przez CTF w bin4, uruchom wskazane polecenie.Następnie, aby przeprowadzić uśrednianie i wyrównanie sub tomo, przeprowadź uśrednianie za pomocą poprawionych podtelegramów CTF, zaczynając od bin4. W folderze projektu uruchom wskazane polecenie. Kontynuuj wyrównywanie i uruchom polecenie.Wyczyść nakładające się na siebie cząstki, uruchamiając wskazane polecenie. Wykonaj ostateczną rekonstrukcję, łącząc dwie połówki zestawów danych. W folderze projektu uruchom wskazane polecenia.Przegląd przebiegu tomografii dla tomografii komórkowej i molekularnej przedstawiono tutaj dla próbek komórkowych i blaszkowych, strategia zbierania danych w dużej mierze zależy od próbki i celu badania obrazowego. Parametry pobierania dla kilku badań krio-ET są pokazane tutaj. Pokazano tutaj reprezentatywne tomogramy próbek molekularnych, takich jak apoferrytyna, cienkie procesy komórkowe i zmielona wiązką jonów blaszka grubej próbki komórkowej.Analiza strukturalna o wysokiej rozdzielczości może pomóc w ujawnieniu miejsc wiązania celów lekowych, a tomografia i uśrednianie subtomogralne również pomagają w opracowywaniu szczepionek przeciwko SARS-CoV-2.

cryo-electron-tomography-remote-data-collection-subtomogram

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiono podejście do określania struktur kompleksów glikoprotein błony wirusowej za pomocą kombinacji kriotomografii elektronowej i uśredniania sub-tomogramu za pomocą pakietu obliczeniowego Jsubtomomo.

Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

To jest metoda trenowania wielowarstwowego U-Net do wieloklasowej segmentacji tomogramów krioelektronowych przy użyciu części jednego tomogramu jako danych wejściowych do treningu. Opisujemy, jak wywnioskować tę sieć z innymi tomogramami i jak wyodrębnić segmentacje do dalszych analiz, takich jak uśrednianie subtomogramu i śledzenie włókien.

Segmentacja tomogramów krioelektronowych oparta na głębokim uczeniu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj tomografię krioelektronową zdalnego zbierania danych i uśredniania subtomogramu przy użyciu apoferrytyny. Ta metoda osiąga rozdzielczość 2,86 Å dla badań strukturalnych.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Przeglądaj więcej filmów