Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie trójwymiarowej tkanki chrzęstnej człowieka w celu przetestowania wykonalności drukowania tkanek 3D przy użyciu zmodyfikowanej termicznej drukarki atramentowej z jednoczesną polimeryzacją fotograficzną. Osiąga się to poprzez modyfikację dostępnej na rynku termicznej drukarki atramentowej Hewlett Packard Desk jet 500 oraz 5 1 16 2 6, monochromatycznego kolorowego wkładu atramentowego do drukarki biologicznej. Drugim krokiem jest połączenie prostego etapu drukowania 3D i lampy UV o długiej długości fali, aby zapewnić natychmiastową polimeryzację wstrzykiwanego biotuszu podczas procesu produkcyjnego.

Następnie biotusz przygotowuje się przez zawieszenie rozszerzonych chondrocytów stawowych człowieka w 10% roztworze glikolu polietylenowego w ilości 5 milionów komórek na mililitr. Ostatnim krokiem jest wydrukowanie tkanki chrzęstnej warstwa po warstwie z jednoczesną fotopolimeryzacją. Ostatecznie mikroskopia konfokalna i histologia.

Barwienie służy do pokazania równomiernego rozmieszczenia wydrukowanych chondrocytów w hydrożelu 3D i doskonałej produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki w jednorodnej chrząstce neo podczas hodowli. Główną przewagą tej technologii nad istniejącymi środkami, takimi jak polimeryzacja po ręcznym wytwarzaniu lub siedzące komórki po zeskanowaniu w celu wytworzenia, jest to, że wydrukowane komórki są precyzyjnie dostarczane do miejsca dotykowego i pozostają na swoim miejscu w matrycy. Zamiast myśleć do dna rusztowania z powodu grawitacji, tworzy on jednorodny wkład.

Modyfikacja drukarki pokazana w tym filmie jest oparta na termicznej drukarce atramentowej Hewlett Packard Desk jet 500 i czarnym wkładzie atramentowym 5 1 6 2 6 a. Zacznij od zdjęcia górnej plastikowej pokrywy drukarki i ostrożnego odłączenia panelu sterowania od pokrywy. Odłącz trzy połączenia kablowe między górną częścią drukarki a podstawą.

Następnie zdejmij górną część drukarki z podstawy. Następnie małe plastikowe i gumowe akcesoria, które składają się na system czyszczenia głowicy drukującej, są usuwane z górnej części drukarki. Zdejmij podstawę podajnika papieru za pomocą sprężyn.

Należy również usunąć metalową płytkę zakrywającą plastikową listwę podającą papier. Ponadto pręt podający papier z tworzywa sztucznego musi zostać odcięty w środkowym położeniu koła podającego, a dwa koła podające papier należy wyjąć. Na potrzeby tego filmu te komponenty zostały już usunięte.

Po oczyszczeniu z kurzu i zanieczyszczeń za pomocą chusteczek z powietrzem w puszce i etanolem, przed użyciem uv przymocuj górną część drukarki do podstawy. Zmodyfikowaną drukarkę sterylizowano przez co najmniej dwie godziny w okapie z przepływem laminarnym. Aby zmodyfikować pojemnik z tuszem, najpierw odetnij jego nakrętkę.

Za pomocą piły ręcznej opróżnij atrament i wyjmij filtr zakrywający dolny zbiornik studni wkładu. Dokładnie wypłucz wkład pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć resztki atramentu. Sonikować wkład w wodzie dejonizowanej przez 10 minut.

Sprawdź wkład, aby upewnić się, że cały atrament został usunięty. Dokładnie spryskaj wkład 70% etanolem w celu sterylizacji, a następnie wysterylizowaną wodą dejonizowaną. Na koniec ustaw lampę UV o długiej długości fali nad platformą drukującą, aby zapewnić jednoczesną zdolność fotopolimeryzacji.

Zmierz intensywność promieniowania UV na platformie drukującej za pomocą miernika światła UV. Dostosuj odległość między lampą UV a platformą drukarki tak, aby intensywność drukowanego obiektu wynosiła od czterech do ośmiu miliwatów na centymetr kwadratowy. Ta odległość między lampą a platformą drukarki powinna wynosić około 25 centymetrów.

Atrament biologiczny jest przygotowywany z ludzkich chondrocytów w celu namnażania chondrocytów na płytce jednowarstwowej. 5 milionów ludzkich chondrocytów do każdej kolby do hodowli tkankowej T 1 75 w celu ekspansji komórek W DMEM uzupełniony 10% surowicą cielęcą i jednym x penicyliną streptomycyny komórek hodowli glutaminy w temperaturze 37 stopni Celsjusza z nawilżonym powietrzem zawierającym 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż komórki zlewają się w 85%.

Użyj komórek z tego samego fragmentu. Przygotować roztwór glikolu polietylenowego DL lub peda. Rozpuść pedę w PBS do końcowego stężenia 10% wagowo na objętość.

Dodaj inicjator fotograficzny I 2 9 5 9 do końcowego stężenia 0,05% wagowo na objętość filtra. Wysterylizuj roztwór, gdy hodowane ludzkie chondrocyty są w 85% zlewne. Zbierz komórki po obliczeniu stężenia komórek.

Przenieś objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do przygotowania bio w ilości 5 milionów komórek na mililitr do stożkowej wirówki probówkowej z prędkością 1200 obr./min na pięć minut. Aby osadzać komórki, odessać supernatant i zawiesić komórki w przygotowanym roztworze Pega, aby utworzyć biotusz. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz drukarkę i laptopa za pomocą programu Microsoft Word, utwórz wzór drukowania pełnego koła o średnicy czterech milimetrów.

Umieść plastikową formę w drukarce. Dostosuj położenie wzoru i upewnij się, że zostanie on wydrukowany dokładnie w plastikowej formie. Oblicz liczbę wydruków potrzebnych do osiągnięcia pożądanej grubości rusztowania.

Dla wysokości czterech milimetrów do stworzenia pożądanego rusztowania potrzeba 220 wydruków. Załaduj atrament biologiczny do pojemnika z tuszem. Przykryj wkład folią aluminiową, aby chronić go przed bezpośrednim narażeniem na promieniowanie UV.

Podczas drukowania wyślij polecenie drukowania do drukarki. Gdy drukarka zacznie drukować, pociągnij czujnik papieru, aby kontynuować drukowanie. W przypadku braku papieru przechodzącego przez drukarkę, cały proces drukowania powinien zająć mniej niż cztery minuty w przypadku rusztowania o średnicy czterech milimetrów i wysokości czterech milimetrów.

Przenieś wydrukowaną chrząstkę neo na płytkę 24-dołkową i dodaj 1,5 mililitra pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Aby ocenić żywotność komórek, inkubuj wydrukowaną chrząstkę neo w żywej martwej żywotności. Roztwór roboczy cytotoksyczności w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności, przeciąć hydrożel obciążony komórkami na pół Po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych obszaru cięcia, niech zaślepiony obserwator policzy żywe i martwe komórki na pięciu losowo wykonanych obrazach, aby obliczyć żywotność komórek.

Reprezentatywna wydrukowana tkanka chrząstki neo o średnicy czterech milimetrów i wysokości czterech milimetrów jest pokazana na tym zdjęciu w oparciu o właściwości zmodyfikowanej termicznej drukarki atramentowej. W przypadku konstrukcji tej wielkości objętość i grubość każdej drukowanej warstwy podczas budowy warstwa po warstwie wynosiła odpowiednio 0,23 mikrolitra i 18 mikronów. Cały proces drukowania w celu skonstruowania tkanki chrzęstnej neo trwał mniej niż cztery minuty.

Obrazy te przedstawiają chondrocyty oznaczone zielonymi i pomarańczowymi barwnikami fluorescencyjnymi. Panel A pokazuje równomierny rozkład komórek wydrukowanych chondrocytów w rusztowaniu 3D. Ze względu na jednoczesną fotopolimeryzację otaczającego rusztowania podczas osadzania komórek, proces drukowania i fotopolimeryzacji został zakończony w ciągu czterech minut z żywotnością komórki na poziomie 90%Natomiast panel B pokazuje, że bez jednoczesnej fotopolimeryzacji, zamiast pozostać w początkowo osadzonych miejscach, komórka opadła na dolną granicę poziomą z powodu grawitacji.

Zajęło to 10 minut ekspozycji na promieniowanie UV żelu, konstruktu o tej samej wielkości co A o żywotności komórek 63% Szafran i o barwienie wydrukowanych chondrocytów w hydrożelu PEG pokazuje stopniowo zwiększoną produkcję glikanów prot podczas hodowli, co wskazuje na kongeniczny fenotyp drukowanych chondrocytów w 3D i tworzenie jednorodnej chrząstki neo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać zmodyfikowaną termiczną drukarkę atramentową do tworzenia trójwymiarowej obliczonej tkanki z równomiernym rozmieszczeniem komórek w rusztowaniu 3D.