Name: Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę bioprintingu tkanki chrzęstnej z wykorzystaniem zmodyfikowanej drukarki atramentowej z jednoczesną polimeryzacją UV. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie ludzkich chondrocytów w trójwymiarowej matrycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony New York Capital Region Research Alliance Grant.

1. Założenie platformy biodruku
Modyfikacja drukarki była oparta na termicznej drukarce atramentowej HP Deskjet 500 i czarnym wkładzie atramentowym HP 51626a.
<ol>
	<li>Zdejmij górną plastikową pokrywę drukarki i ostrożnie odłącz panel sterowania od pokrywy.</li>
	<li>Odłącz 3 połączenia kablowe między górną częścią drukarki a podstawą. Zdejmij górną część drukarki z podstawy.</li>
	<li>Z górnej części drukarki wyjmij małe plastikowe i gumowe akcesoria (system czyszczenia głowicy drukującej) po prawej stronie pod pojemnikiem z tuszem.</li>
	<li>Zdejmij podstawę podajnika papieru za pomocą sprężyn.</li>
	<li>Zdejmij metalową płytkę zakrywającą plastikowy pręt podajnika papieru.</li>
	<li>Odetnij plastikową listwę podającą papier w środkowej pozycji koła podającego za pomocą piły ręcznej lub innego narzędzia tnącego.</li>
	<li>Usuń 2 kółka podające papier odsłonięte po poprzednim kroku. Plastikowe koło jest bardzo twarde i pomocna będzie piła elektroniczna.</li>
	<li>Oczyść kurz i zanieczyszczenia za pomocą chusteczek z powietrzem w puszce i etanolu.</li>
	<li>Przymocuj górną część drukarki do podstawy.</li>
	<li>Przed użyciem sterylizuj zmodyfikowaną drukarkę UV przez co najmniej 2 godziny w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Odetnij nakrętkę wkładu atramentowego HP 51626a za pomocą piły ręcznej lub innego narzędzia tnącego.</li>
	<li>Opróżnij tusz i wyjmij filtr, który zakrywa dolny zbiornik studni chrząstki.</li>
	<li>Dokładnie wypłucz wkład pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	<li>Ultradźwiękowo zanurzyć wkład w wodzie dejonizowanej (DI) przez 10 minut, aby usunąć resztki atramentu.</li>
	<li>Sprawdź wkład, aby upewnić się, że cały atrament został usunięty. Dokładnie wypłucz lub spryskaj wkład 70% etanolem do sterylizacji, a następnie wysterylizowaną wodą DI.</li>
	<li>Ustaw lampę ultrafioletową o dużej długości fali nad platformą drukującą, aby zapewnić jednoczesną zdolność fotopolimeryzacji.</li>
	<li>Zmierz intensywność promieniowania UV na platformie drukującej za pomocą miernika światła UV. Dostosuj odległość między lampą UV a platformą drukarki tak, aby intensywność przy drukowanym obiekcie wynosiła od 4 do 8 mW/cm2 (około 25 cm od lampy do platformy drukarki).</li>
</ol>
2. Przygotowanie biotuszu
<ol>
	<li>Jednowarstwowa ekspansja chondrocytów
	<ol>
		<li>Umieść 5 milionów ludzkich chondrocytów w każdej kolbie do hodowli tkankowej T175 w celu ekspansji komórek w pożywce Dulbeccos Modified Eagles (DMEM) uzupełnionej 10% surowicą cielęcą i 1x penicyliną-streptomycyną-glutaminą (PSG). Hodowla komórek w temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem zawierającym 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 3 dni, aż kolba osiągnie 85% zbieżności. Użyj komórek z tego samego fragmentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić PEGDA w PBS do końcowego stężenia 10% w/v. Dodać fotoinicjator I-2959 do końcowego stężenia 0,05% w/v. Filtrować wysterylizować roztwór.</li>
	<li>Zawiesić hodowane ludzkie chondrocyty w przygotowanym roztworze PEGDA w stężeniu 5 x 106 komórek/ml.</li>
</ol>
3. Drukowanie tkanki chrzęstnej
<ol>
	<li>Włącz drukarkę i laptopa.</li>
	<li>Utwórz wzór drukowania pełnego koła o średnicy 4 mm za pomocą programu Microsoft Word lub Adobe Photoshop.
	<ol>
		<li>Dostosuj położenie wzoru i upewnij się, że zostanie on wydrukowany dokładnie w plastikowej formie.</li>
		<li>Oblicz liczbę wydruków potrzebnych do osiągnięcia pożądanej grubości rusztowania. W przypadku wysokości 4 mm potrzeba 220 wydruków, aby stworzyć pożądane rusztowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj biotusz do pojemnika z tuszem. Przykryj wkład folią aluminiową, aby chronić go przed bezpośrednim działaniem promieni UV podczas drukowania.</li>
	<li>Wyślij polecenie drukowania do drukarki. Pociągnij czujnik papieru, gdy drukarka rozpocznie drukowanie. Cały proces drukowania powinien zająć mniej niż 4 minuty w przypadku rusztowania o średnicy 4 mm i wysokości 4 mm.</li>
	<li>Przenieść wydrukowaną chrząstkę nowotworową na płytkę 24-dołkową i dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka.</li>
</ol>
4. Ocena żywotności komórek w rusztowaniu 3D
<ol>
	<li>Inkubować wydrukowaną chrząstkę w roztworze roboczym ŻYWY/MARTWYM Żywotność/Cytotoksyczność w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Przetnij hydrożel obciążony komórkami na pół i wykonaj fluorescencyjne zdjęcia obszaru cięcia.</li>
	<li>Policz żywe (zielone) i martwe (czerwone) komórki przez zaślepionego obserwatora na pięciu losowo wykonanych obrazach. Oblicz żywotność komórek, dzieląc liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę żywych i martwych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvasculature+fabrication+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+three-dimensional+bioprinting+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology.</a> Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+fibroblast+growth+factor-2+and+transforming+growth+factor-beta1+enhances+bioprinted+human+neocartilage+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).</li>
<li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+deposition+of+human+microvascular+endothelial+cells+and+biomaterials+for+human+microvasculature+fabrication+using+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22NIP24%2Fdigital+Fabrication+2008%3A+24th+International+Conference+on+Digital+Printing+Technologies%2C+Technical+Program+and+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing.</a> NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).</li>
<li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+evaluation+of+thermal+inkjet+printed+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).</li>
<li>Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+three-dimensional+co-culture+of+mesenchymal+stem+cells+with+meniscus+cells+promotes+meniscal+phenotype+without+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).</li>
<li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocytes+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).</li>
<li>Elisseeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoencapsulation+of+chondrocytes+in+poly%28ethylene+oxide%29-based+semi-interpenetrating+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).</li>
<li>Buskirk, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+A+High-Resolution+Thermal+Inkjet+Printhead%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).</li>
<li>Harmon, J. P., Widder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+Printhead+Into+the+HP+Deskjet+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+cartilage+tissue+engineering+to+regenerate+the+zonal+organization+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+manufacturing+for+in+situ+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects.</a> Biofabrication. 2, (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego w tym badaniu.

Ten system biodruku 3D z jednoczesną zdolnością fotopolimeryzacji zapewnia znacznie większą rozdzielczość drukowania niż najlepsza wcześniej opisana metoda drukowania in situ ubytków kostno-chrzęstnych przy użyciu strzykawki wytłaczanej przez komórkowy hydrożelalginianowy 16. Wyższa rozdzielczość drukowania jest szczególnie istotna dla inżynierii tkanki chrzęstnej w celu przywrócenia anatomicznej organizacji strefowej chrząstki. Jednoczesna fotopolimeryzacja podczas montażu warstwa po warstwie ma kluc...

Bioprinting oparty na termicznym druku atramentowym jest jedną z najbardziej obiecujących technologii wspomagających w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Dzięki cyfrowemu sterowaniu i wysokiej przepustowości głowice drukujące komórki, rusztowania i czynniki wzrostu mogą być precyzyjnie osadzane w żądanych pozycjach dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D). Technologia ta została z powodzeniem zastosowana w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej1-9. W artykule stworzono platformę biodruku ze zmodyfikowaną termiczną drukarką atramentową Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 i systemem jednoczesnej fotopolimeryzacji. Syntetyczne hydrożele sformułowane z poli(glikolu etylenowego) (PEG) wykazały zdolność do utrzymywania żywotności chondrocytów i promowania chondrogennej produkcji ECM10,11. Ponadto fotosieciowalny PEG jest wysoce rozpuszczalny w wodzie o niskiej lepkości, co czyni go idealnym do jednoczesnej polimeryzacji podczas biodruku 3D. W niniejszej pracy ludzkie chondrocyty zawieszone w dikrylanie poli(etylenu) glikolu (PEGDA; MW 3,400) zostały precyzyjnie wydrukowane, aby zbudować chrząstkę nową warstwa po warstwie w rozdzielczości 1400 dpi w rozdzielczości 3D. Zaobserwowano jednorodne rozmieszczenie zdeponowanych komórek w rusztowaniu 3D, co pozwoliło na wytworzenie tkanki chrzęstnej o doskonałych właściwościach mechanicznych i zwiększonej produkcji ECM. W przeciwieństwie do tego, w wytwarzaniu ręcznym, komórki gromadziły się na dnie żelu zamiast w ich początkowo zdeponowanych pozycjach z powodu wolniejszej polimeryzacji rusztowania, co prowadziło do niejednorodnego tworzenia się chrząstki po hodowli2,3.

<table><tbody><tr><td>Termiczna drukarka atramentowa HP Deskjet 500</td><td>Hewlett-Packard</td><td>C2106a</td><td>została wycofana z produkcji. Zakupiony odnowiony od sprzedawcy internetowego.</td></tr><tr><td>wkład atramentowy HP</td><td>Hewlett-Packard</td><td>51626a Lampa</td><td></td></tr><tr><td>ultrafioletowa</td><td>UVP</td><td>B-100AP</td><td></td></tr><tr><td>Światłomierz UV Narzędzia</td><td>ogólne</td><td>UV513AB</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy Zeiss LSM 510</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG)</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Accutazy Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Żywa/martwa żywotność/cytotoksyczność Zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>Diakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDA)</td><td>Glikoza Biosystems</td><td>GS700</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specjalistyczne chemikalia</td><td>I-2959</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie chondrocyty stawowe</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, który opiera się na termicznym druku atramentowym, jest jedną z najbardziej atrakcyjnych technologii wspomagających w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Dzięki cyfrowym komórkom kontrolnym, rusztowania i czynniki wzrostu mogą być precyzyjnie i szybko odkładane w żądanych dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D) lokalizacjach. Dlatego technologia ta jest idealnym podejściem do wytwarzania tkanek naśladujących ich rodzime struktury anatomiczne. Aby zaprojektować chrząstkę z natywną organizacją strefową, składem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i właściwościami mechanicznymi, opracowaliśmy platformę biodruku przy użyciu komercyjnej drukarki atramentowej z jednoczesną fotopolimeryzacją, zdolną do inżynierii tkankowej chrząstki 3D. Ludzkie chondrocyty zawieszone w diakrylanie poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) zostały wydrukowane do budowy 3D chrząstki nowej poprzez montaż warstwa po warstwie. Wydrukowane komórki utrwalono w ich pierwotnych pozycjach zdeponowanych, wspieranych przez otaczające rusztowanie w jednoczesnej fotopolimeryzacji. Właściwości mechaniczne wydrukowanej tkanki były zbliżone do chrząstki rodzimej. W porównaniu z konwencjonalnym wytwarzaniem tkanek, które wymaga dłuższej ekspozycji na promieniowanie UV, żywotność wydrukowanych komórek przy jednoczesnej fotopolimeryzacji była znacznie wyższa. Drukowana chrząstka nowa wykazywała doskonałą produkcję glikozaminoglikanu (GAG) i kolagenu typu II, co było zgodne z ekspresją genów. Dlatego platforma ta jest idealna do dokładnego rozmieszczenia i rozmieszczenia komórek w anatomicznej inżynierii tkankowej.

Zmodyfikowana drukarka termiczna do druku atramentowego umożliwiła wysokoprzepustowe nanoszenie komórek i rusztowań przy zachowaniu doskonałej żywotności komórek. Dzięki połączeniu z jednoczesną fotopolimeryzacją i zastosowaniu biomateriałów światłoczułych, technologia ta pozwala na utrwalenie komórek oraz innych wydrukowanych substancji w miejscach ich pierwotnego naniesienia. Biorąc pod uwagę właściwości zmodyfikowanej drukarki termicznej, rozdzielczość druku 2D wynosiła 300 dpi, przy objętości pojedynczej kropli tuszu...

Metody opisane w tym artykule pokazują, jak przekształcić komercyjną drukarkę atramentową w biodrukarkę z jednoczesną polimeryzacją UV. Drukarka jest w stanie konstruować strukturę tkankową 3D z komórek i biomateriałów. Badanie, które wykazało, że tutaj skonstruowano chrząstkę nową 3D.

Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie trójwymiarowej tkanki chrząstki ludzkiej w celu przetestowania wykonalności druku tkankowego 3D, przy użyciu zmodyfikowanej termicznej drukarki atramentowej z jednoczesną fotopolimeryzacją. Osiąga się to najpierw poprzez przekształcenie komercyjnie dostępnej termicznej drukarki atramentowej Hewlett Packard DeskJet 500 oraz jednobarwnego wkładu atramentowego w biodrukarkę. Drugim krokiem jest połączenie prostego stołu do druku 3D z lampą UV o długiej fali, aby zapewnić natychmiastową polimeryzację wstrzykiwanego bioatramentu podczas procesu wytwarzania.Następnie przygotowuje się biotusz poprzez zawieszenie namnożonych ludzkich chondrocytów stawowych w 10% roztworze glikolu polietylenowego w stężeniu 5 milionów komórek na mililitr. Ostatnim krokiem jest wydruk tkanki chrzęstnej warstwa po warstwie z jednoczesną fotopolimeryzacją. W końcowym etapie wykonuje się mikroskopię konfokalną oraz badania histologiczne.Barwienie stosuje się w celu wykazania równomiernego rozkładu wydrukowanych chondrocytów w hydrożelu 3D oraz doskonałej produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki w jednorodnej neochrząstce podczas hodowli. Główną zaletą tej technologii w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak polimeryzacja po ręcznym wytwarzaniu lub osadzanie komórek po skanowaniu w celu fabrykacji, jest precyzyjne dostarczanie wydrukowanych komórek do określonego miejsca i ich utrzymywanie w pozycji w macierzy. Zapobiega to opadaniu komórek na dno rusztowania pod wpływem grawitacji, dzięki czemu powstaje jednorodna chrząstka.Modyfikacja drukarki zaprezentowana w tym filmie opiera się na termicznym drukarce atramentowej Hewlett Packard desk jet 500 oraz czarnym kartridżu 5 1 6 2 6 a. Rozpocznij od zdjęcia górnej plastikowej obudowy drukarki i ostrożnego odłączenia panelu sterowania od pokrywy. Odłącz trzy połączenia kablowe pomiędzy górną częścią a podstawą drukarki.Następnie zdejmij górną część drukarki z podstawy. W kolejnym kroku z górnej części drukarki usuwa się małe plastikowe i gumowe akcesoria wchodzące w skład systemu czyszczenia głowicy drukującej. Zdejmij podstawę tacy papieru wraz ze sprężynami.Należy również zdjąć metalową płytkę zakrywającą plastikowy element podawania papieru. Ponadto plastikowy element podawania papieru musi zostać odcięty na wysokości środkowego koła podającego, a oba koła podające usunięte. Na potrzeby tego filmu komponenty te zostały już usunięte.Po usunięciu kurzu i zanieczyszczeń za pomocą sprężonego powietrza w sprayu oraz chusteczek nasączonych etanolem, przymocuj górną część drukarki do podstawy przed użyciem promieniowania UV. Sterylizuj zmodyfikowaną drukarkę przez co najmniej dwie godziny w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Aby zmodyfikować wkład z tuszem, najpierw odetnij jego nasadkę.Za pomocą piłki ręcznej opróżnij wkład z tuszu i usuń filtr zakrywający dolny zbiornik wkładu. Dokładnie wypłucz wkład pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć pozostałości tuszu. Poddaj wkład obróbce sonicznej w wodzie dejonizowanej przez 10 minut.Sprawdzić wkład, aby upewnić się, że cały tusz został usunięty. Spryskać dokładnie wkład 70% etanolem w celu sterylizacji, a następnie sterylną wodą dejonizowaną. Na koniec ustawić lampę UV o długiej fali nad platformą drukującą, aby zapewnić możliwość jednoczesnej fotopolimeryzacji.Zmierz natężenie promieniowania UV na platformie drukującej za pomocą miernika natężenia światła UV. Dostosuj odległość między lampą UV a platformą drukarki tak, aby natężenie w miejscu druku wynosiło od 4 do 8 mW/cm². Odległość ta między lampą a platformą drukarki powinna wynosić około 25 cm.Bioatrament przygotowuje się z ludzkich chondrocytów poprzez ich namnażanie w warstwie monowarstwie. W celu ekspansji komórek do każdej kolby hodowlanej T 1 75 wprowadza się 5 milionów ludzkich chondrocytów. Komórki hoduje się w DMEM uzupełnionym o 10% surowicy cielęcej oraz 1x penicylinę, streptomycynę i glutaminę w temperaturze 37 °C w atmosferze zwilżonego powietrza zawierającego 5% dwutlenku węgla. Pożywkę hodowlaną wymienia się co trzy dni, aż komórki osiągną 85% konfluencji.Należy użyć komórek z tego samego pasażu. Przygotować roztwór glikolu polietylenowego DL lub peda. Rozpuścić peda w PBS do końcowego stężenia 10% w/v.Dodać fotoinicjator I 2 9 5 9 do stężenia końcowego 0.05% w/v. Przesączyć roztwór przez filtr sterylizujący, gdy hodowane ludzkie chondrocyty osiągną 85% konfluencji. Zebrać komórki po obliczeniu ich stężenia.Przenieś objętość zawiesiny komórkowej niezbędną do przygotowania biotuszu o stężeniu 5 milionów komórek na mililitr do probówki stożkowej i wiruj przy 1200 RPM przez pięć minut. Aby odwirować komórki, odessaj nadsącz i zawieś komórki w przygotowanym roztworze Pega, tworząc biotusz. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz drukarkę oraz laptop, a następnie w programie Microsoft Word utwórz wzór druku w postaci pełnego koła o średnicy czterech milimetrów.Umieść plastikową formę w drukarce. Dostosuj pozycję wzoru i upewnij się, że zostanie on wydrukowany dokładnie wewnątrz plastikowej formy. Oblicz liczbę wydruków niezbędnych do uzyskania pożądanej grubości rusztowania.Dla wysokości czterech milimetrów wymagane jest wykonanie 220 warstw druku w celu stworzenia pożądanego rusztowania. Należy wprowadzić bioatrament do wkładu z atramentem. Wkład należy owinąć folią aluminiową, aby chronić go przed bezpośrednią ekspozycją na promieniowanie UV.Podczas drukowania wyślij polecenie drukowania do drukarki. Gdy drukarka rozpocznie pracę, pociągnij czujnik papieru, aby kontynuować drukowanie. W przypadku braku papieru przechodzącego przez drukarkę, cały proces drukowania rusztowania o średnicy 4 mm i wysokości 4 mm powinien zająć mniej niż cztery minuty.Przenieś wydrukowaną neo-chrząstkę do płytki 24-dołkowej i dodaj 1,5 milliliters pożywki hodowlanej do każdego dołka. Aby ocenić żywotność komórek, inkubuj wydrukowaną neo-chrząstkę w roztworze roboczym do testu żywotności Live/Dead w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności, a następnie przetnij hydrożel z komórkami na pół. Po wykonaniu obrazów fluorescencyjnych obszaru cięcia, poproś zaślepionego obserwatora o przeliczenie żywych i martwych komórek na pięciu randomly wybranych obrazach w celu obliczenia żywotności komórek.Na tym zdjęciu przedstawiono reprezentatywną wydrukowaną tkankę neochrząstki o średnicy 4 mm i wysokości 4 mm, wykonaną przy użyciu zmodyfikowanej drukarki termicznej atramentowej. W przypadku konstrukcji o takim rozmiarze, objętość i grubość każdej warstwy nanoszonej podczas druku warstwa po warstwie wynosiły odpowiednio 0,23 µL i 18 µm. Cały proces drukowania w celu wytworzenia tkanki neochrząstki trwał mniej niż cztery minuty.Na tych obrazach przedstawiono chondrocyty znakowane zielonym i pomarańczowym barwnikiem fluorescencyjnym. Panel A pokazuje równomierny rozkład wydrukowanych chondrocytów w rusztowaniu 3D. Dzięki jednoczesnej fotopolimeryzacji otaczającego rusztowania podczas osadzania komórek, proces drukowania i fotopolimeryzacji zakończył się w ciągu czterech minut przy żywotności komórek na poziomie 90%. W przeciwieństwie do tego, panel B pokazuje, że bez jednoczesnej fotopolimeryzacji komórki, zamiast pozostać w miejscach ich początkowego osadzenia, opadły pod wpływem grawitacji na dolny interfejs poziomy.Żelowanie trwało 10 minut ekspozycji na promieniowanie UV; konstrukcja o rozmiarze takim samym jak A wykazała żywotność komórek na poziomie 63%. Barwienie szafranem O wydrukowanych chondrocytów w hydrożelu PEG wykazuje stopniowo zwiększoną produkcję proteoglikanów w trakcie hodowli, co wskazuje na zachowanie fenotypu chondrocytów w 3D oraz tworzenie się jednorodnej neochrząstki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania zmodyfikowanej termicznej drukarki atramentowej do tworzenia trójwymiarowej tkanki chrzestnej z równomiernym rozkładem komórek w rusztowaniu 3D.

human-cartilage-tissue-fabrication-using-three-dimensional-inkjet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja tkanki chrząstki ludzkiej za pomocą trójwymiarowej technologii drukowania atramentowego

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Trójwymiarowe (3D) mikrostrukturalne wiązki kompozytowe są wytwarzane poprzez ukierunkowaną i zlokalizowaną infiltrację nanokompozytów do porowatych sieci mikroprzepływowych 3D. Elastyczność tej metody produkcji umożliwia wykorzystanie różnych materiałów termoutwardzalnych i nanowypełniaczy w celu uzyskania różnorodnych funkcjonalnych makroskopowych produktów nanokompozytowych wzmocnionych 3D.

Wytwarzanie trójwymiarowych mikrostrukturalnych nanokompozytów metodą infiltracji mikroprzepływowej

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Trzy kluczowe kroki tego protokołu to: i) opracowanie właściwego składu i konsystencji tuszu hydrożelowego celulozy, ii) drukowanie 3D rusztowań w różnych strukturach porów z dobrą wiernością kształtu i wymiarów oraz iii) demonstracja właściwości mechanicznych w symulowanych warunkach ciała do regeneracji chrząstki.

Drukowane w 3D porowate rusztowania hydrożelowe z celulozy nanokompozytowej

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Poznaj metodę bioprintingu tkanki chrzęstnej z wykorzystaniem zmodyfikowanej drukarki atramentowej z jednoczesną polimeryzacją UV. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie ludzkich chondrocytów w trójwymiarowej matrycy.

Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

Przeglądaj więcej filmów