Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu syntezy bibliotek kombinatorycznych zawierających peptydowe jednostki trzeciorzędowych amidów lub PTA. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie submonomeru PTA z naturalnych aminokwasów. Drugim krokiem jest synteza regionu łącznika peptydowego na nośniku stałym.

Następnie syntetyzowana jest biblioteka kombinatoryczna zawierająca podjednostki PTA i peptydowe. Ostatnim krokiem jest charakterystyka zsyntetyzowanej biblioteki w celu zapewnienia jakości syntezy. W rezultacie otrzymywana jest biblioteka kombinatoryczna zawierająca podjednostki PTA o ograniczonej konformacji, która może być wykorzystana do wysokoprzepustowego screeningu w celu uzyskania ligandów białkowych i opracowania nowych leków.

Chemia będąca przedmiotem tego artykułu została opracowana w próbie znalezienia cząsteczek znacznie sztywniejszych niż peptydy i inne związki, z którymi pracowaliśmy wcześniej. Koncepcja polega na tym, że zidentyfikowanie bibliotek sztywniejszych cząsteczek pozwoli na ich wiązanie z białkowymi celami z znacznie wyższym powinowactwem, co uznaliśmy za niezwykle istotne w kontekście dalszego opracowywania leków lub interesujących cząsteczek sond. Wizualna demonstracja tej syntezy PTA jest kluczowa, ponieważ jest ona trudna do opanowania ze względu na fakt, że kontrola temperatury i czasu jest krytyczna dla powodzenia syntezy.

Najpierw do 500 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej z magnetycznym mieszadłem dodaje się 8,9 g dine oraz 11,9 g bromku potasu. Następnie do kolby dodaje się 100 ml wcześniej przygotowanego 30% roztworu bromku wodoru. Po umieszczeniu kolby w kąpieli z glikolu etylenowego i suchego lodu o temperaturze -10 °C, przez 10 minut przepuszcza się argon za pomocą długiej igły z dna kolby.

Mieszano roztwór za pomocą magnetycznego mieszadła z prędkością 300 RPM. Następnie do lejka rozdzielczego z wyrównaniem ciśnienia, przymocowanego do trójszyjnej kolby okrągłodennej, wlano wcześniej przygotowany roztwór azotynu sodu i zamknięto go septem. Powoli otwarto zawór lejka, pozwalając roztworowi azotynu sodu kapać do kolby.

Używając zaworu, należy dostosować tempo kapania do około dwóch kropli na sekundę. Po zakończeniu dodawania azotynu sodu należy kontynuować mieszanie roztworu przez kolejne trzy godziny, pozwalając temperaturze wzrosnąć z -10 °C do temperatury pokojowej. Jeśli roztwór ma zbyt ciemny kolor, należy zastosować próżnię, aby usunąć nadmiar tlenków azotu oraz ewentualny brom powstały podczas reakcji.

Po przeniesieniu roztworu do rozdzielacza, produkt należy wyekstrahować trzykrotnie za pomocą 35 mililitrów eteru etylowego. Po połączeniu fazy organicznej i przemyciu jej nasyconym roztworem soli fizjologicznej, należy zebrać ją do kolby i suszyć nad siarczanem sodu przez sześć godzin. Po odfiltrowaniu siarczanu sodu, rozpuszczalnik odparowuje się w próżni, aż do uzyskania oleju o barwie od bezbarwnej do bladożółtej.

Oczyszczony produkt surowy poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując heksan i octan etylu w stosunku trzy do jednego. W celu znakowania izotopowego 300 mg L-alaniny rozpuszczono w 10 mL wody deuterowanej w 50 ml polietylenowej probówce. Po dodaniu 10 mg alfa-ketoglutaranu jako kosubstratu, probówkę ogrzano do 37 °C. Po zakończeniu procesu pH dostosowano do poziomu 8,5–8,7, używając 1 M roztworu tlenku sodu deuterowanego oraz pasków testowych do pomiaru pH.

Następnie do roztworu należy dodać 0,1 mg alaninaminotransferazy. Probówkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować przez noc z łagodnym wytrząsaniem z prędkością od 10 do 30 RPM. W tym czasie należy napęcznieć 1 g kulek żelowych o rozmiarze 90 µm z łącznikiem Ram w 10 mL dimetyloformamidu przez trzy godziny w reaktorze strzykawkowym o pojemności 12 mL przy łagodnym wytrząsaniu, odlać dimetyloformamid z reaktora i dodać 10 mL 20% roztworu pi-perydyny w dimetyloformamidzie, aby usunąć grupę ochronną Fmoc z łącznika rinkamidowego.

Po wstrząsaniu kulek z 20% roztworem Pepperidyny przez 30 minut, należy przemyć je pięciokrotnie dimetyloformamidem, aby usunąć całą Pepperidynę. Następnie należy wyjąć kilka kulek z strzykawki i poddać je próbie z chloralem. Do kulek należy dodać dwa mililitry dwumolarnego roztworu kwasu bromooctowego w dimetyloformamidzie i delikatnie wstrząsnąć.

Następnie do kulek dodaje się 2 mL 2 M roztworu diop propyl carbo diamine w dimetyloformamidzie. Po zamknięciu strzykawki tłokiem, kulki należy inkubować na wytrząsarce przez 10 minut. Po dokładnym przemyciu kulek dimetyloformamidem, dodaje się do nich 2 mL wcześniej przygotowanego 1 M roztworu methoxy ethyl w dimetyloformamidzie.

Po wstrząśnięciu kulek i ich pięciokrotnym przemyciu dimetyloformamidem, należy sprawdzić kilka kulek za pomocą testu chloralowego. Następnie do wcześniej użytej strzykawki należy dodać 10 ml roztworu dichlorometanu w dimetyloformamidzie w stosunku 1:1. Wszystkie kulki o masie 1 g należy rozdzielić równomiernie do trzech reaktorów strzykawkowych o pojemności 5 ml, używając pipety 1000 µL z przyciętym końcem.

Po trzykrotnym przemyciu trzech strzykawek chlormetanem, przemyj strzykawki oznaczone jako R i S trzykrotnie bezwodnym tetrahydrofuranem, a strzykawkę oznaczoną jako B trzykrotnie dimetyloformamidem. W celu sprzęgnięcia tristyny z kwasem bromo-propan-NOIC, dodaj około 200 mg tristyny do fiolki w dygestorium. Po zamknięciu fiolki zważ ilość znajdującej się w niej tristyny.

Następnie do fiolki należy dodać odpowiednią ilość bezwodnego tetrahydrofuranu, aby przygotować roztwór trifosgenu w tetrahydrofuranie o stężeniu 20 mg/mL. Aby przygotować mieszaninę kwasów bromowych z trifosgenem, do dwóch oddzielnych małych fiolek należy dodać po 89 µL kwasu R-2-bromopropionowego oraz kwasu S-2-bromopropionowego-d4; do każdej z fiolek dodać 5 mL roztworu trifosgenu w tetrahydrofuranie. Po zamknięciu fiolek należy umieścić je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut.

W międzyczasie do strzykawek r i s należy dodać po 1,125 µL roztworu tetrahydrofuranu i diizopropylaminy w stosunku 2:1. Następnie do każdej z fiolek zawierających schłodzone mieszaniny bromoestru z fosgenem, w których powstały białe osady, należy dodać 356 µL 2,4,6-trimetylopuryny. Otrzymaną zawiesinę należy bezzwłocznie nanieść bezpośrednio na zmodyfikowane kuleczki, a następnie umieścić je na wytrząsarce i inkubować przy 120 RPM przez dwie godziny.

W celu sprzężenia bromooctanu z diizopropylokarbodiimidem, do strzykawki B należy dodać 5 ml 2 M roztworu bromooctanu w dimetyloformamidzie. Po wymieszaniu do tej samej strzykawki należy dodać 5 ml 2 M roztworu diizopropylokarbodiimidu w dimetyloformamidzie, delikatnie wymieszać, a następnie umieścić strzykawkę B na tym samym wytrząsarce co strzykawki R i S. Następnie strzykawki należy wytrząsać przez 2 h, po uprzednim dokładnym przemyciu ich dichlorometanem i dimetyloformamidem. Wszystkie kulek ze strzykawek R, S i B należy zebrać do jednego reaktora strzykawkowego o pojemności 12 ml.

Po pięciokrotnym przemyciu kulek dimetyloformamidem, do strzykawki należy dodać 10 ml roztworu dichlorometanu i dimetyloformamidu w stosunku jeden do jednego. Wszystkie kulki należy równomiernie rozdzielić do siedmiu oddzielnych strzykawek o pojemności 2 ml, używając do tego pipety 1000 µL z uciętą końcówką do ułatwienia wydostawania materiału, a następnie do odpowiednich strzykawek dodać po 5 ml z siedmiu wcześniej przygotowanych 2 M roztworów amin. Po inkubacji wszystkie siedem strzykawek należy inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 60 °C z wytrząsaniem.

Kuleczki przeznaczone do odszczepienia przemyć pięciokrotnie dichlorometanem. Po wstrząsaniu kuleczkami przez 15 minut i ponownym przemyciu ich dichlorometanem, odprowadzić dichlorometan ze strzykawki. Następnie przenieść każdą kuleczkę do płytki 96-dołkowej.

Używając mikroskopu świetlnego oraz pipety z uciętą końcówką, przykryj płytkę 96-dołkową szkiełkiem podstawowym i umieść ją w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 15 minut. Po wyjęciu płytki z zamrażarki, dodaj 20 µL uprzednio przygotowanego, schłodzonego roztworu TFA w dichlorometanie (DI) w stosunku 1:1 do każdego dołka zawierającego kuleczkę. Ponownie przykryj płytkę szkiełkiem i umieść ją na wytrząsarce w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

Po 20 minutach wytrząsania wyjmij płytkę 96-dołkową z zamrażarki i zdejmij pokrywkę. Odparuj dichlorometan z każdego dołka, przedmuchując je powietrzem. W przypadku odszczepiania w temperaturze pokojowej przy użyciu 50% roztworu TFA w dichlorometanie obserwuje się znaczną degradację.

Piki 593 i 484 odpowiadają odpowiednio linkerowi i trimerowi PTA, co wskazuje, że cała cząsteczka została pomyślnie zsyntetyzowana na ziarnie, lecz uległa degradacji podczas odszczepiania. W przypadku odszczepiania w niskich temperaturach, zgodnie z powyższym opisem, ilość degradacji indukowanej przez TFA jest znacznie ograniczona. Mechanizm odszczepiania został opisany w literaturze przedmiotu i uważa się, że przebiega on z udziałem pośrednika olainowego. Cząsteczki PTA można sekwencjonować metodą Ms.MS, a wzór fragmentacji jest podobny do wzorców dla peptydów i pseudopeptydów.

Cząsteczki PTA syntetyzowane za pomocą kwasu 2-bromopropionowego zazwyczaj dają szersze piki w widmach MS i MS/MS. Widma MS wynikają z obecności produktów niepełnej reakcji, takich jak 2-bromopropan i kwas propionowy, co może służyć jako wskaźnik obecności centrum chiralnego R podczas procedury sekwencjonowania. Cząsteczki PTA mają również tendencję do tworzenia większej liczby adduktów sodowych niż peptydy. Dlatego preferowane jest stosowanie wody o niskiej zawartości sodu oraz aparatury plastikowej.

Kolejnym potencjalnym produktem ubocznym jest akrylamid powstający w wyniku eliminacji bromu podczas aminowania. Po utworzeniu się akrylamidu sekwencja zostaje przerwana. Problem ten można rozwiązać poprzez obniżenie stężenia aminy pierwszorzędowej do 1 M w celu rozcieńczenia roztworu.

Po opanowaniu tej metody, odpowiednio dużą bibliotekę można przygotować w dwa dni, jeśli proces zostanie przeprowadzony prawidłowo. Skoro ta chemia została w pełni opracowana, a synteza jest bardzo efektywna, mam nadzieję, że inni badacze zaadoptują tę potężną technologię do tworzenia konformacyjnie ograniczonych mimetyków peptydów na potrzeby opracowywania leków oraz sond biologicznych.