Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów
20 czerwca 2014
Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak zsyntetyzować biblioteki kombinatoryczne zawierające trzeciorzędowe jednostki peptydowe amid lub PTA. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw submonomeru PTA z naturalnych aminokwasów. Drugim krokiem jest synteza regionu łącznika peptydowego na solidnym podłożu.
Następnie syntetyzowana jest biblioteka kombinatoryczna zawierająca podjednostki PTA i peptydowe. Ostatnim krokiem jest scharakteryzowanie zsyntetyzowanej biblioteki w celu zapewnienia jakości syntezy. Ostatecznie syntetyzowana jest biblioteka kombinatoryczna zawierająca potwierdzone podjednostki PTA z ograniczeniami i taka biblioteka może być wykorzystana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu dostarczenia ligandów białkowych i doprowadzenia do odkrycia nowych leków.
Tak więc chemia, która jest tematem tego artykułu, została opracowana w celu znalezienia cząsteczek, które byłyby znacznie sztywniejsze niż niektóre peptydy i inne rzeczy, nad którymi pracowaliśmy wcześniej. Chodzi o to, że jeśli zidentyfikuje się biblioteki sztywniejszych cząsteczek, będą one wiązać się z celami białkowymi o znacznie wyższym powinowactwie, a my pomyśleliśmy, że jest to bardzo, bardzo ważne w próbach opracowania leków posuwających się naprzód, a nawet interesujących cząsteczek sondujących. Wizualna demonstracja tej syntezy podrzędu PTA jest naprawdę krytyczna, ponieważ synteza jest trudna do nauczenia, ponieważ kontrola temperatury i czasu są naprawdę krytyczne dla udanej syntezy.
Najpierw dodaj 8,9 grama obiadu i 11,9 grama bromku potasu do 500-mililitrowej kolby z okrągłym dnem z trzema szyjkami z magnetycznym mieszadłem. Następnie dodać do kolby 100 mililitrów wcześniej przygotowanego 30% roztworu bromowodoru. Po umieszczeniu kolby w ujemnym temperaturze 10 stopni Celsjusza glikolu etylenowego, suchy lód wytacza argon przez długą igłę z dna kolby przez 10 minut.
Wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego przy 300 obr./min. Następnie dodać wcześniej przygotowany roztwór azotynu sodu do lejka do kroplowania wyrównującego ciśnienie przymocowanego do kolby z trzema szyjkami i okrągłym dnem i uszczelnić ją przegrodą. Powoli otworzyć zawór wkraplacza, pozwalając roztworowi azotynu sodu spłynąć do kolby.
Kontroluj zawór, aby dostosować szybkość kapania do około dwóch kropli na sekundę. Po zakończeniu dodawania azotynu sodu mieszaj roztwór jeszcze przez trzy godziny, pozwalając temperaturze rozgrzać się z minus 10 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej. Jeśli kolor roztworu jest zbyt ciemny, należy zastosować próżnię, aby usunąć nadmiar tlenków azotu i ewentualnie bromu powstałych podczas reakcji.
Po przeniesieniu roztworu do lejka ekstrakcyjnego należy trzykrotnie wyekstrahować produkt za pomocą 35 mililitrów eteru datylowego. Po połączeniu fazy organicznej i przemyciu nasyconą solanką zebrać ją do kolby i suszyć nad siarczanem sodu przez sześć godzin. Po przefiltrowaniu siarczanu sodu odparować rozpuszczalnik w próżni, aby uzyskać klarowny lub bladożółty olej.
Oczyść surowy produkt za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym z octanem etylu trzech do jednego heksanu do znakowania izotopowego, rozpuść 300 miligramów L-alaniny w 10 mililitrach deuterowanej wody w 50-mililitrowej probówce polietylenowej. Po dodaniu 10 miligramów alfa ketoglutaranu jako substratu cos, rozgrzej probówkę do 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu dostosuj pH do 8,5 do 8,7 za pomocą jednomolowego roztworu tlenku sodu i pasków testowych pH.
Następnie dodaj 0,1 miligrama aminotransferazy alaninowej do roztworu. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc z łagodnym wstrząsaniem przy 10 do 30 obr./min. W tym momencie spęcznieć jeden gram 90 mikronów, 10 do żelowych kulek z łącznikiem Ram w 10 mililitrach dimetyloformamidu przez trzy godziny w 12-mililitrowym reaktorze strzykawkowym z łagodnym wstrząsaniem, spuścić dimetyloformamid z reaktora i dodać 10 mililitrów roztworu dimetyloformamidu perine o stężeniu 20% pi, aby chronić grupę FOC przed lodowiskiem wśród łącznika.
Po potrząśnięciu kulkami z 20% roztworem Pepperdine przez 30 minut, umyj je pięć razy mięsem z formy dimetylu, aby usunąć całą Pepperdine. Następnie wyjmij kilka kulek ze strzykawki i przetestuj je za pomocą testu chloralowego. Dodaj dwa mililitry dwumolowego roztworu dimetyloformamidu kwasu bromooctowego do kulek i delikatnie wstrząśnij.
Następnie dodaj dwa mililitry dwumolowego roztworu dimetyloformamidu diop propylo-karbodiaminy do kulek. Po zamknięciu strzykawki tłokiem, potrząsać kulkami na wytrząsarce przez 10 minut. Po dokładnym umyciu kulek dimetyloformamidem dodać do nich dwa mililitry wcześniej przygotowanego jednomolowego roztworu metoksyetylodimetyloformamidu.
Po potrząśnięciu kulkami i pięciokrotnym umyciu ich dimetyloformamidem, sprawdź kilka kulek za pomocą testu chloralowego. Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu dimetyloformamidu di chloral metan jeden do jednego do poprzednio używanej strzykawki. Podziel wszystkie jednogramowe kulki równomiernie na trzy pięciomililitrowe reaktory strzykawkowe za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ze ściętą końcówką pipety.
Po trzykrotnym umyciu trzech strzykawek chlorometanem, strzykawki oznaczone r i s należy trzykrotnie przemyć bezwodną hydrofuryną tet, a strzykawkę znakowaną B trzykrotnie dimetyloformamidem. W celu sprzężenia trystyny z bromopropanem kwasem NOINOWYM, dodać około 200 miligramów tristyny do fiolki pod wyciągiem. Po zamknięciu fiolki należy zważyć ilość trystyny znajdującej się w fiolce.
Następnie dodaj odpowiednią ilość bezwodnego tetra hydro ferranu do fiolki, aby uzyskać 20 miligramów na mililitr roztworu trifosgenu tetra hydro ferran. Aby przygotować mieszaninę trifosgenu bromokwasów, dodać 89 mikrolitrów R, dwóch kwasów NOIC bromo propanów i S dwóch kwasów Bromo propan, kwasu NOIC D cztery w dwóch małych fiolkach oddzielnie do każdej fiolki, dodać pięć mililitrów roztworu tristyny tetra hydrofuranu. Po zamknięciu fiolek umieść je w zamrażarce o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na 20 minut.
W międzyczasie dodać 1 125 mikrolitrów roztworu tetra hydrofuranu i izopropyloaminy dwa do jednego do jednego do strzykawki r i s. Oddzielnie dodać 356 mikrolitrów 2 4 6 trimetylopuryny do każdej z fiolek zawierających schłodzone mieszaniny fosgenów bromokwasów dających białe osady. Natychmiast nałóż odpowiednią zawiesinę bezpośrednio na kulki iryfikacyjne, a następnie umieść je na wytrząsarce, aby wstrząsnąć poniżej 120 obr./min przez dwie godziny.
W przypadku sprzężenia kwasu bromooctowego z diizopropylokarbodiaminą, dodać pięć mililitrów dwumolowego roztworu dimetyloformamidu kwasu bromooctowego do strzykawki B. Po wstrząśnięciu dodać pięć mililitrów dwumolowego roztworu dimetyloformamidu di propylo-karbodiaminy do tej samej strzykawki i delikatnie wstrząsnąć strzykawką B w tym miejscu na tej samej wytrząsarce co strzykawka r i s. Następnie wstrząsać strzykawkami przez dwie godziny po dokładnym umyciu strzykawek di chlorometanem i dimetyloformamidem. Połącz wszystkie kulki ze strzykawek R, S i B w jednym 12-mililitrowym reaktorze strzykawkowym.
Po pięciokrotnym umyciu kulek dimetyloformamidem dodać do strzykawki 10 mililitrów roztworu dimetyloformamidu dimetyloformamidu w proporcji jeden do jednego. Podziel wszystkie kulki równomiernie na siedem pojedynczych dwumililitrowych strzykawek za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ze ściętą końcówką pipety do emanacji, dodaj pięć mililitrów siedmiu wcześniej przygotowanych dwumolowych roztworów amin do odpowiedniej strzykawki. Inkubować wszystkie siedem strzykawek w inkubatorze o temperaturze 60 stopni Celsjusza, wstrząsając przez noc po inkubacji.
Umyj koraliki, które należy pięciokrotnie rozszczepić, metanem di chloral. Po potrząśnięciu kulkami przez 15 minut i ponownym umyciu ich di chlorometanem, odcedź di chloro metan ze strzykawki. Następnie przenieś każdy pojedynczy koralik do płytki 96-dołkowej.
Za pomocą mikroskopu świetlnego i pipety ze ściętą końcówką przykryj 96-dołkową płytkę szkiełkiem nakrywkowym i umieść ją w zamrażarce o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na 15 minut. Po wyjęciu płytki z zamrażarki dodaj 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego schłodzonego roztworu chlorometanu TFA DI jeden do jednego do jednego do każdej ze studzienek zawierających kulkę. Załóż szkiełko nakrywkowe i umieść płytę ścienną 96 na wytrząsarce z powrotem w zamrażarce o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.
Po wstrząśnięciu przez 20 minut wyjmij płytkę ścienną 96 z zamrażarki i zdejmij szkiełko nakrywkowe. Wysuszyć di chlorometan z każdej studzienki, wdmuchując na nią powietrze. Po rozszczepieniu w temperaturze pokojowej przy użyciu 50% roztworu TFA DI CHLORO metanu obserwuje się znaczną degradację.
Piki 593 i 484 odpowiadają odpowiednio łącznikowi i trimerowi PTA, co pokazuje, że cała cząsteczka została z powodzeniem zsyntetyzowana na koraliku, ale uległa degradacji podczas rozszczepienia. Po rozszczepieniu w warunkach niskiej temperatury, jak opisano powyżej, ilość degradacji wywołanej przez TFA jest znacznie stłumiona. Mechanizm rozszczepienia został opisany w poprzedniej literaturze i uważa się, że przechodzi przez pośrednie cząsteczki PTA olainy mogą być sekwencjonowane przez Ms.MS, a wzór fragmentacji jest podobny do peptydów i peptydów.
Cząsteczki PTA syntetyzowane z S dwoma kwasami bromo-propolowymi D cztery na ogół dają szersze piki w MS i msm. Ms.Spectra ze względu na obecność produktów o niepełnym czasie trwania, takich jak S dwa bromo propan, kwas NOIC D trzy, może to być wykorzystane jako wskazanie obecności centrum R Chiral podczas procedury sekwencjonowania, cząsteczki PTA mają również tendencję do tworzenia bardziej ated addduct niż peptyd peptydowy. Dlatego preferowana jest woda o niskiej zawartości sodu i aparatura z tworzywa sztucznego.
Innym potencjalnym produktem ubocznym jest akryloamid powstały w wyniku eliminacji bromu podczas aminacji. Po utworzeniu akrylamidu sekwencja zostaje zakończona. Można to rozwiązać, obniżając stężenie amin pierwszorzędowych do jednego mola w celu zmniejszenia roztworu.
Podstawowość Po opanowaniu biblioteki o dobrym rozmiarze, można ją przygotować w dwa dni, jeśli zostanie wykonana poprawnie. Teraz, gdy ta chemia została w pełni rozwinięta, a synteza jest dość skuteczna, mam nadzieję, że inni badacze przyjmą tę potężną technologię do tworzenia konformacyjnie ograniczonych mimetyki peptydów do opracowywania leków i opracowywania sond.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje syntetyczną metodę tworzenia peptydowych amidów trzeciorzędowych (PTA), klasy peptydomimetyków. Metoda łączy strategie split-and-pool i sub-monomerowych w celu wygenerowania biblioteki PTA o jednej perle - jedno związku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Synteza peptydów
- Chemia kombinatorialna
- Odkrywanie leków
Tło
- Peptydowe amidy trzeciorzędowe są zróżnicowaną superrodziną związków.
- Obejmują peptydy, peptoidy i N-metylowane peptydy.
- Biblioteki kombinatorialne są cenne dla wysoko przepustowego przesiewania.
- PTA mogą dostarczać nowych ligandów białkowych dla odkrywania leków.
Cel badania
- Syntetyzacja bibliotek kombinatorialnych zawierających jednostki PTA.
- Wykorzystanie naturalnych aminokwasów do tworzenia sub monomerów PTA.
- Możliwość wysoko przepustowego przesiewania w celu odkrywania leków.
Zastosowane metody
- Przygotowanie sub monomerów PTA z naturalnych aminokwasów.
- Synteza regionu łącznika peptydowego na podłożu stałym.
- Stworzenie biblioteki kombinatorialnej z podjednostkami PTA i peptydami.
- Charakteryzacja zsyntetyzowanej biblioteki dla zapewnienia jakości.
Główne wyniki
- Udało się zsyntetyzować kombinatorialną bibliotekę zawierającą ograniczane konformacyjnie podjednostki PTA.
- Biblioteka może być wykorzystywana do wysoko przepustowego przesiewania.
- Potencjalne zastosowania obejmują odkrywanie nowych ligandów białkowych.
- Metoda wykazuje skuteczne techniki syntezy i charakteryzacji.
Wnioski
- Syntetyczna metoda zapewnia solidne podejście do tworzenia bibliotek PTA.
- Takie biblioteki są niezbędne dla postępu w dziedzinie odkrywania leków.
- To dzieło wspomaga dziedzinę peptydomimetyków i chemii kombinatorialnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Conformationally constrained peptide mimetics such as peptide tertiary amides (PTAs) address a key challenge in early drug discovery: identifying high-affinity protein ligands from combinatorial libraries. By introducing steric and stereochemical constraints through side chains on both α-carbon and backbone nitrogen, PTAs enhance structural preorganization, improving the likelihood of target engagement. This approach supports mechanistic de-risking in lead generation by expanding chemical space beyond traditional peptides and peptoids, offering improved predictive confidence in ligand discovery campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through structurally constrained peptidomimetics that reduce conformational entropy upon binding.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating ligands with increased proteolytic stability and cell permeability, as demonstrated in prior peptoid studies.
- Predictive Value: Enhances target validation confidence by increasing the probability of identifying high-affinity binders from screened libraries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces one-bead one-compound (OBOC) libraries suitable for high-throughput screening against protein targets.
- Reproducibility: Employs split-and-pool synthesis with sub-monomer chemistry to ensure uniform bead-based compound presentation.
- Scalability: Enables generation of diverse PTA-peptide chimeric libraries amenable to automation and parallel synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a pathway from discovery-stage ligand identification to preclinical validation using MS/MS-sequenceable PTA scaffolds.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk by delivering ligands with defined conformation and reduced flexibility, improving target specificity predictions.
- Biomarker Alignment: Supports screening campaigns where conformational constraint correlates with functional activity in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling the synthesis of conformationally diverse PTA libraries that bridge peptidomimetic design and functional screening, supporting progression from target validation to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening by generating ligands with restricted conformation, improving hit-to-lead progression potential.
- Screening: Delivers OBOC libraries compatible with bead-based assays, enabling standardized, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables library characterization via MS/MS sequencing, with fragmentation patterns comparable to peptides, supporting identity confirmation and purity assessment.
- Translational Research: Supports advancement to preclinical studies by yielding proteolysis-resistant and cell-permeable scaffolds suitable for further optimization.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, platform-capable approach for generating diverse PTA libraries across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in ligand discovery by accessing chemically diverse, conformationally constrained peptidomimetic space.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible synthesis of OBOC libraries using split-and-pool and sub-monomer strategies on solid support.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by increasing the likelihood of identifying high-affinity binders, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through enhanced ligand quality and structural definition in early screening stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic synthesis, solid-phase chemistry, and sub-monomer techniques for PTA precursor preparation.
- Depends on anhydrous conditions, low-temperature reaction control, and inert atmosphere handling during key coupling steps.
- Necessitates access to microfluidic splitting tools, syringe reactors, and purification systems such as silica gel column chromatography.
- Involves optimization of cleavage conditions to minimize TFA-induced degradation, with low-temperature protocols recommended.
- Demands careful monitoring of side products such as acrylamide from amine overconcentration, which can terminate chain elongation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Acid Bromide from Natural Amino Acids and Isotopic Labeling of Alanine Using Transaminase
4:39
Synthesis of Peptoid Linker Region
6:15
Split-and-pool Synthesis of PTA Library with (R)- and (S)-2-bromopropionic Acids
11:10
Results: Characterization of a One-Bead-One-Compound Peptide Tertiary Amine Library
13:00
Conclusion
