Name: Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Odkryj syntezę cyklicznych peptydów z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego do tworzenia bibliotek terapeutycznych przeciwpasożytniczych. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskiwanie związków o zróżnicowanej konformacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang i Darii Mochly-Rosen za pomocne dyskusje. Prace były wspierane przez National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) dla N.Q. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Przygotowanie sprzętu i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie sprzętu
	<ol>
		<li>Wszystkie czynności wewnątrz dygestorium należy wykonać, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Chemicznie syntetyzować peptydy na stałym podłożu za pomocą mikrofalowego syntezatora peptydów z dodatkowym modułem Discover wyposażonym w światłowodową sondę temperatury do sterowania dostarczaniem mocy mikrofalowej w teflonowym naczyniu reakcyjnym (30 ml, z frytą szklaną) lub w jednorazowym kartuszu polipropylenowym (12 ml, z gruboziarnistą frytą).</li>
		<li>W celu prawidłowego wymieszania należy podłączyć dopływ azotu do naczynia reakcyjnego lub alternatywnie uszczelnić oba końce wkładu polipropylenowego i umieścić na wytrząsarce obrotowej.</li>
		<li>Aby spuścić mieszaniny reakcyjne lub myjki, podłącz do odkurzacza domowego za pomocą syfonu na odpady.</li>
		<li>Umieść sondę światłowodową w naczyniu reakcyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotować żywicę, ważąc żywicę Rink Amide AM 100-200 mesh (0,204 mg), dodać 5 ml mieszaniny 1:1 N,N-dimetyloformamidu (DMF)/dichlorometanu (DCM) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego, aby zmyć żywicę, wstrząsać przez 2-4 godziny, aby prawidłowo spęczniały i odcedzić.</li>
		<li>Przygotować 0,2 M roztwory aminokwasów 9-fluorenylometoksykarbonylu (Fmoc), rozpuszczając odpowiedni aminokwas Fmoc w DMF i mieszać mieszaninę, aż aminokwasy się rozpuszczą (Tabela 1).</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 0,45 M roztworu aktywatora, rozpuszczając 18,96 g O-(benzotriazol-1-ylo)-N,N,N′,N′-TETRAMETHYLURONIUM HEXAFLUOROPHOSPHATE (HBTU) W 100 ml DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (tabela 1).</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 2 M roztworu bazowego aktywatora, łącząc 34,8 ml N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) z 65,2 ml 1-metylo-2-pirolidynonu (NMP) (Tabela 1).</li>
		<li>Przygotować 0,1 M mieszaninę roztworów deprotekcyjnych, rozpuszczając 3,37 g hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w 250 ml 20% v/v roztworu piperydyny w DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sprzęgło aminokwasowe chronione przez Fmoc
<ol>
	<li>Sprzężenie aminokwasowe
	<ol>
		<li>Dodać aminokwas (2,5 ml)/aktywator (1 ml)/aktywator (0,5 ml) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i pozostawić reakcję na 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.</li>
		<li>Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, RT) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ochrona Fmoc
	<ol>
		<li>Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 30 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).</li>
		<li>Odcedzić mieszaninę reakcyjną.</li>
		<li>Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 180 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).</li>
		<li>Odcedzić mieszaninę reakcyjną.</li>
		<li>Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz pięć razy. 
		Uwaga: Opcjonalnie wstrzymaj procedurę w tym miejscu i wznów ją w późniejszym terminie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po etapie sprzęgania aminokwasów przemyć żywicę DCM i przechowywać przez co najmniej kilka dni w temperaturze 4 °C (przez dłuższy czas przechowywać żywicę w temperaturze -20 °C).
	<ol>
		<li>Przenieść żywicę z naczynia reakcyjnego do wkładu polipropylenowego.</li>
		<li>Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Szczelnie uszczelnij wkład polipropylenowy za pomocą górnej nakrętki i zaworu odcinającego.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem nowej syntezy należy spęczniać żywicę przez 3-4 godziny w DMF (7 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie syntezy
	<ol>
		<li>Użyj testu Kaisera (ninhydryny) lub testu Chloranilu, aby szybko określić postęp syntezy. Opcjonalnie należy przeprowadzić reakcję rozszczepienia na małą skalę, aby określić czystość i masę zsyntetyzowanego peptydu. Patrz punkt 9. 
		Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, patrz Tabela 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1 i 2.2 zgodnie z potrzebami, aby zsyntetyzować ukierunkowany peptyd: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).</li>
</ol>
3. Sprzężenie bezwodnik/kwas
<ol>
	<li>Sprzęgło bezwodnikowe
	<ol>
		<li>Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego bezwodnika w NMP (5 ml), dodać 1 równoważnik 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) i 10 równoważników DIEA do roztworu (Tabela 1).</li>
		<li>Dodać mieszaninę bezwodnika/DMAP/DIEA w stosunku 10:10 do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.</li>
		<li>Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzężenie kwasowe
	<ol>
		<li>Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego kwasu dikarboksylowego w DMF (5 ml). Dodać 1 równoważny DMAP i 10 równoważnych N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) do roztworu (Tabela 1).</li>
		<li>Wstępnie aktywuj mieszaninę, mieszając przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2) i odcedzić roztwór.</li>
		<li>Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz krok trzy razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. N-metylotrytyl (Mtt) Ochrona grupy Deprotection
Uwaga: Łańcuch boczny lizyny był chroniony N-metylotrytylem (Mtt)81, grupą ochronną, która może być selektywnie odbezpieczona w kwaśnych warunkach labilności82,83. Wyłącz ochronę grupy Mtt ręcznie na wytrząsarce bez energii mikrofalowej.
<ol>
	<li>Przenieś żywicę do wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.</li>
	<li>Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
	<li>Dodać 15-25 ml mieszaniny 1% kwasu trifluorooctowego (TFA), 5% triizopropylosilanu (TIS) i 94% DCM do wkładu polipropylenowego na jeden gram żywicy. 
	Uwaga: TFA jest silnym kwasem i oraz jest niezwykle drażniący dla skóry, oczu i tkanki płucnej.
	<ol>
		<li>Stężone roztwory TFA należy zawsze przechowywać w masce.</li>
		<li>Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice) i pracuj w dobrze wentylowanym kapturze. W przypadku kontaktu z TFA należy niezwłocznie zmienić rękawice i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny. Jeśli skóra lub oczy wejdą w kontakt z kwasem, natychmiast spłucz dotknięty obszar wodą i myj przez dodatkowe 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wkład polipropylenowy na wytrząsarce i potrząsaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spuść roztwór z wkładu polipropylenowego, stosując podciśnienie.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.5 trzy razy.</li>
	<li>Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.</li>
</ol>
5. Cyklizacja peptydu liniowego
<ol>
	<li>Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.</li>
	<li>W probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml rozpuścić 5 równoważników heksafluorfosforanu benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidynofosfonii (PyBOP) w dibromometanie (DBM, 5 ml) i dodać do roztworu 10 równoważników DIEA (Tabela 1).</li>
	<li>Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.</li>
	<li>Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.</li>
</ol>
6. Podział i deochrona grup łańcuchów bocznych
<ol>
	<li>Umyj żywicę DCM i eterem dietylowym.
	<ol>
		<li>Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz dwa razy.</li>
		<li>Dodaj eter dietylowy do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W) i odcedź roztwór. Powtórz dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć żywicę w eksykatorze próżniowym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny na wodorotlenku potasu (KOH, 1-10 g).</li>
	<li>Zważ wysuszoną żywicę i przenieś ją do wkładu polipropylenowego.</li>
	<li>Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego koktajlu rozszczepiającego z kwasem trifluorooctowym (TFA) (np. 90% TFA, 2,5% wody, 2,5% TIS i 5% fenolu) do każdego grama żywicy.</li>
	<li>Wstrząsaj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać roztwór do rozszczepienia TFA, filtrując żywicę do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Do filtracji użyj fryty, która znajduje się w 12 ml wkładu polipropylenowym.</li>
	<li>Dodać zimny eter dietylowy (35 ml) do probówki.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 1,207 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować warstwę eteru.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.7-6.9 pięć razy.</li>
</ol>
7. Suszenie cyklicznego peptydu szkieletowego
<ol>
	<li>Trzymaj wytrącony peptyd w tej samej probówce i susz go w kapturze przez 30 minut.</li>
	<li>Rozpuść peptyd w mieszaninie wody i acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:1.</li>
	<li>Zamrozić roztwór produktu końcowego w ciekłym azocie.</li>
	<li>Liofilizacja produktu końcowego.</li>
</ol>
8. Charakterystyka cyklicznego peptydu szkieletowego
<ol>
	<li>Rozpuścić małą próbkę (1 mg) produktu w wodzie (400 μl).</li>
	<li>Wstrzyknąć rozpuszczony peptyd (10–200 μl) do systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) w celu zbadania czystości peptydu 34.</li>
	<li>Sprawdź masę peptydu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą jonizacji (MS-MALDI) 84.
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 μl (100 μM) peptydu w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z 1 μl matrycy (5 mg/ml, kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy) w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z TFA (0,1%).</li>
		<li>Punktowo 1 μl na płytce MS-MALDI.</li>
		<li>Wysuszyć próbkę i umieścić ją w spektrometrze masowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważyć peptyd i obliczyć procentową wydajność.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
9. Monitorowanie syntezy
<ol>
	<li>Test Kaisera (ninhydryny) 85
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory odczynników.
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór A, rozpuszczając 16,5 mg cyjanku potasu (KCN) w 25 ml wody destylowanej. Rozcieńczyć 1 ml powyższego roztworu w 49 ml pirydyny.</li>
			<li>Przygotować roztwór B, rozpuszczając 1 g ninhydryny w 20 ml etanolu.</li>
			<li>Przygotować roztwór C, rozpuszczając 40 g fenolu w 20 ml etanolu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj testu Kaisera, aby sprawdzić zakończenie sprzężenia aminokwasów lub deprotekcję grupy ochronnej.
		<ol>
			<li>Przenieś kilka kulek z żywicy do probówki.</li>
			<li>Dodać trzy krople (~ 100 μl) każdego roztworu (A, B i C) i wymieszać.</li>
			<li>Podgrzej probówkę na bloku grzewczym w temperaturze 110 °C przez 5 min. 
			Uwaga: Niebieskie kulki (wynik pozytywny) wskazują na niepełną reakcję sprzęgania lub deochronę grupy ochronnej Fmoc.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test chloranilu 86
	<ol>
		<li>Do każdego testu należy przygotować świeże następujące odczynniki.
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór 2% chloranilu w DMF, roztwór A.</li>
			<li>Przygotować roztwór 2% aldehydu octowego w DMF, roztwór B.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj test chloranilu, aby sprawdzić, czy sprzężenie aminokwasów zostało zakończone lub czy grupa ochronna została odbezpieczona.
		<ol>
			<li>Zmieszać 100 μl roztworu A ze 100 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Wrzuć koraliki i delikatnie potrząsaj przez 5 min. 
			Uwaga: Ciemnobrązowe kulki (wynik pozytywny) wskazują na brak ochrony grupy ochronnej Fmoc lub niepełną reakcję sprzęgania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja rozszczepienia na małą skalę
	<ol>
		<li>Usuń niewielką ilość żywicy do 3 ml wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.</li>
		<li>Potraktuj 2 ml mieszaniny 95% TFA, 2,5% wody i 2,5% TIS.</li>
		<li>Potrząsaj mieszaniną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć żywicę przez filtrację za pomocą frytki z wkładu polipropylenowego i odparować rozpuszczalniki za pomocą strumienia azotu.</li>
		<li>Rozpuścić pozostałość w wodzie i przeanalizować produkt za pomocą HPLC i/lub MS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Żywotność promastigotu Leishmania donovani w teście hodowlanym
<ol>
	<li>Leishmania donovani (L. donovani) warunki wzrostu i leczenia
	<ol>
		<li>Kultura L. donovani promastigotes w modyfikacji pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu w temperaturze 26 °C.</li>
		<li>Traktuj promastigoty L. donovani cyklicznymi peptydami (100 μM) przez 24 godziny w temperaturze 26 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywotności Leishmania donovani (L. donovani)
	<ol>
		<li>Oceń żywotność pasożyta za pomocą 20 μl alamarBlue zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Określić redukcję alamarBlue, mierząc fluorescencję (przy wzbudzeniu 570 nm i emisji 590 nm). Wyższe wartości fluorescencji wskazują na większą aktywność metaboliczną i zwiększoną żywotność pasożytów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano syntezę skoncentrowanej biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych pochodzących z białka LACK pasożyta Leishmania przy użyciu w pełni zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego. Opracowano skoncentrowaną bibliotekę cyklicznych peptydów z konserwatywnymi farmakoforami i różnymi łącznikami. Dodanie różnych łączników, takich jak bezwodnik glutarowy, bezwodnik bursztynowy, kwas adypinowy, kwas pimelowy, lizyna, ornityna i inne elementy budulcowe, może być stosowane w celu zwiększenia różnorodności przest...

Oddziaływania białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w większości procesów biologicznych, od wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnałów po śmierć komórki1. Dlatego też celowanie w PPI ma fundamentalne znaczenie dla badań podstawowych oraz zastosowań terapeutycznych. Oddziaływania PPI mogą być regulowane za pomocą specyficznych i stabilnych przeciwciał, jednak przeciwciała są kosztowne, trudne w produkcji i wykazują słabą biodostępność. Alternatywnie PPI można celować za pomocą małych cząsteczek. Małe cząsteczki są łatwiejsze w syntezie i tańsze w porównaniu z przeciwciałami; są one jednak stosunkowo mniej elastyczne i lepiej dopasowują się do małych wnęk niż do dużych powierzchni styku białko-białko2,3. Różne badania wykazały, że peptydy, które są prostsze i tańsze od przeciwciał oraz bardziej elastyczne niż małe cząsteczki, mogą wiązać się z powierzchniami białek i regulować PPI4,5. Globalny rynek peptydów terapeutycznych był wyceniany na około piętnaście miliardów dolarów w 2013 roku i rośnie w tempie 10,5% rocznie6. Ponadto istnieje ponad 50 peptydów wprowadzonych na rynek, około 270 peptydów w różnych fazach badań klinicznych oraz około 400 peptydów w zaawansowanych fazach przedklinicznych7. Choć liczne peptydy są stosowane jako leki, wciąż stawiają one kilka wyzwań ograniczających ich powszechne zastosowanie, w tym słabą biodostępność i stabilność, nieefektywność w przenikaniu przez błony komórkowe oraz elastyczność konformacyjną8,9. Jedną z alternatyw pozwalających przezwyciężyć te wady jest zastosowanie różnych modyfikacji, takich jak ograniczenia lokalne (D-aminokwasy i N-alkilacja) oraz globalne (cyklizacja)8,10-12. Modyfikacje te występują również w naturze. Na przykład cyklosporyna A, immunosupresyjny cykliczny peptyd naturalny, zawiera pojedynczy D-aminokwas i ulega modyfikacjom N-alkilacji13,14.
Modyfikacja naturalnych aminokwasów w celu wprowadzenia ograniczeń lokalnych, takich jak alkilacja D- oraz N-, często wpływa na aktywność biologiczną peptydów. Jednak cyklizacja, w której sekwencja docelowa może pozostać niezmieniona, z większym prawdopodobieństwem pozwala na zachowanie aktywności biologicznej. Cyklizacja jest niezwykle atrakcyjną metodą ograniczania przestrzeni konformacyjnej peptydów poprzez redukcję równowagi między różnymi konformacjami. Zazwyczaj zwiększa ona aktywność biologiczną i selektywność, ograniczając peptyd do konformacji aktywnej, która pośredniczy tylko w jednej funkcji. Cyklizacja poprawia również stabilność peptydów, utrzymując je w konformacji, która jest słabiej rozpoznawana przez enzymy degradujące. Rzeczywiście wykazano, że peptydy cykliczne charakteryzują się lepszą stabilnością metaboliczną, biodostępnością i selektywnością w porównaniu do ich liniowych odpowiedników15-17.
Cyklizacja może być jednak obosiecznym mieczem, ponieważ w niektórych przypadkach ograniczenia te mogą uniemożliwić peptydom przyjęcie konformacji bioaktywnej. Aby pokonać tę przeszkodę, można zsyntetyzować ukierunkowaną bibliotekę, w której wszystkie peptydy mają tę samą sekwencję pierwotną, a w konsekwencji stałe farmakofory. Peptydy w bibliotece różnią się parametrami wpływającymi na ich strukturę, takimi jak wielkość i położenie pierścienia, aby w dalszej kolejności wyłonić konformację o najwyższej bioaktywności9,18.
Peptydy można syntetyzować zarówno w roztworze, jak i metodą syntezy peptydów na fazie stałej (SPPS), która jest obecnie bardziej rozpowszechnionym podejściem i zostanie omówiona szczegółowo. SPPS to proces, w którym transformacje chemiczne są przeprowadzane na nośniku stałym za pomocą łącznika w celu przygotowania szerokiego zakresu związków syntetycznych19. SPPS umożliwia składanie peptydów poprzez kolejne sprzęganie aminokwasów w sposób etapowy od końca C, który jest przyłączony do nośnika stałego, do końca N. Łańcuchy boczne N-α-aminokwasów muszą być maskowane grupami ochronnymi, które są stabilne w warunkach reakcji stosowanych podczas elongacji peptydów, aby zapewnić przyłączenie jednego aminokwasu w każdym kroku. W końcowym etapie peptyd jest uwalniany z żywicy, a grupy ochronne łańcuchów bocznych są jednocześnie usuwane. Podczas syntezy peptydów wszystkie rozpuszczalne odczynniki mogą być usuwane z matrycy peptyd-nośnik stały poprzez filtrację i wypłukiwane na koniec każdego etapu sprzęgania. Dzięki takiemu systemowi duża nadwyżka odczynników o wysokim stężeniu może doprowadzić reakcje sprzęgania do końca, a wszystkie etapy syntezy mogą być przeprowadzone w tym samym naczyniu bez konieczności przenoszenia materiału20 .
Mimo że SPPS posiada pewne ograniczenia, takie jak powstawanie niepełnych produktów reakcji, reakcje uboczne, zanieczyszczenia odczynników oraz trudności w monitorowaniu przebiegu syntezy21, zalety SPPS sprawiły, że metoda ta stała się „złotym standardem” w syntezie peptydów. Do zalet tych należą: możliwość wprowadzenia aminokwasów nienaturalnych, automatyzacja, łatwe oczyszczanie, zminimalizowane straty materiału oraz możliwość stosowania nadmiaru odczynników, co przekłada się na wysoką wydajność. Wykazano, że SPPS jest niezwykle użyteczna w syntezie trudnych sekwencji21,22, modyfikacji fluorescencyjnych23 oraz bibliotek peptydowych24,25. SPPS znajduje również zastosowanie w syntezie innych struktur polimerowych, takich jak oligonukleotydy26,27, oligosacharydy28,29 oraz kwasowe nukleidy peptydowe30,31. Co ciekawe, w niektórych przypadkach wykazano, że SPPS jest korzystniejsza przy syntezie małych cząsteczek, które tradycyjnie otrzymuje się w roztworze32,33. SPPS jest stosowana zarówno w małej skali do celów badawczych i dydaktycznych34,35, jak i w dużej skali w przemyśle36-38.
Dwiema strategiami syntezy najczęściej stosowanymi w metodologii SPPS do syntezy peptydów są strategia butylooksykarbonylowa (Boc) oraz 9-fluorenylometoksikarbonylowa (Fmoc). Pierwotną strategią wprowadzoną do SPPS była strategia Boc, która wymaga silnie kwasowych warunków w celu usunięcia grup ochronnych łańcuchów bocznych i odszczepienia peptydu od żywicy. Synteza peptydów oparta na Fmoc wykorzystuje natomiast umiarkowane warunki zasadowe i stanowi łagodniejszą alternatywę dla protokołu Boc wrażliwego na działanie kwasów39. Strategia Fmoc wykorzystuje ortogonalną ochronę łańcuchów bocznych za pomocą grup t-butylowych (tBu), które są usuwane w ostatnim etapie syntezy podczas odszczepiania peptydu od żywicy w warunkach kwasowych.
Ogólna zasada syntezy peptydów na nośniku stałym została przedstawiona na Rysunku 1. Pierwszy aminokwas, z maskującą tymczasową grupą ochronną na terminalu N-α, jest wiązany z żywicą od strony terminalu C. W razie potrzeby stosuje się również półtrwałą grupę ochronną do maskowania łańcucha bocznego (Rysunek 1, Krok 1). Synteza docelowego peptydu odbywa się od terminalu C do terminalu N poprzez powtarzalne cykle usuwania tymczasowej grupy ochronnej N-α (Rysunek 1, Krok 2) oraz sprzęgania kolejnego chronionego aminokwasu (Rysunek 1, Krok 3). Po przyłączeniu ostatniego aminokwasu (Rysunek 1, Krok 4), peptyd jest odcinany od nośnika w postaci żywicy, a półtrwałe grupy ochronne są usuwane (Rysunek 1, Krok 5).
<img alt="Synteza peptydów w fazie stałej; schemat procesu chemicznego; etapy TPG, SPG, sprzęgania aminokwasów." src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat syntezy peptydów w fazie stałej. Aminokwas z chronioną grupą N-α zostaje przytwierdzony do żywicy za pomocą grupy karboksylowej poprzez łącznik (Krok 1). Pożądany peptyd jest budowany liniowo od końca C do końca N poprzez powtarzalne cykle usuwania tymczasowej grupy ochronnej (TPG) z pozycji N-α (Krok 2) i sprzęgania aminokwasów (Krok 3). Po zakończeniu syntezy (Krok 4), półtrwałe grupy ochronne (SPG) są usuwane podczas odcinania peptydów (Krok 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po zmontowaniu pełnego łańcucha peptydowego cyklizację można przeprowadzić na kilka sposobów: (A) cyklizacja „głowa-ogon” — jest to wygodna metoda, ale ograniczona, ponieważ oferuje tylko jedną opcję cyklizacji (Rysunek 2A), (B) cyklizacja z wykorzystaniem aminokwasów z badanej sekwencji, które zawierają bioaktywne grupy funkcyjne — jednak zastosowanie tych aminokwasów może wpływać na aktywność biologiczną (Rysunek 2B), oraz (C) cyklizacja poprzez dodanie aminokwasów (lub innych bloków budulcowych) bez zakłócania bioaktywnej sekwencji. Wprowadzanie tych cząsteczek jest powszechnie stosowane, ponieważ pozwala na tworzenie ukierunkowanych bibliotek bez modyfikowania badanej sekwencji (Rysunek 2C).
<img alt="Schemat struktury chemicznej łańcuchów peptydowych pokazujący mostki dwusiarczkowe i sekwencje aminokwasowe." src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Alternatywne strategie cyklizacji peptydów. (A) cyklizacja od końca N do końca C poprzez wiązanie peptydowe między C-końcem a N-końcem; (B) cyklizacja między grupami funkcyjnymi, takimi jak mostek dwusiarczkowy między resztami cysteiny (1), lub wiązanie amidowe między łańcuchami bocznymi lizyny a kwasem asparaginowym/glutaminowym (2), lub łańcuchem bocznym a N- lub C-końcem (3-4); (C) cyklizacja poprzez dodanie dodatkowych aminokwasów, pochodnych aminokwasów lub małych cząsteczek, na przykład przed (R0) i po (R7) sekwencji bioaktywnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Synteza wspomagana mikrofalowo wykorzystuje promieniowanie mikrofalowe do ogrzewania reakcji, co przyspiesza organiczne przemiany chemiczne40,41. Chemia mikrofalowa opiera się na zdolności odczynnika/rozpuszczalnika do pochłaniania energii mikrofal i przekształcania jej w ciepło42. Przed upowszechnieniem się tej technologii należało pokonać główne przeszkody, w tym kwestie sterowalności i powtarzalności protokołów syntezy oraz brak dostępnych systemów do odpowiedniej kontroli temperatury i ciśnienia43,44. Pierwszy raport dotyczący syntezy peptydów wspomaganej mikrofalowo opisany był z wykorzystaniem kuchennej mikrofalówki do syntezy kilku krótkich peptydów (7-10 aminokwasów), co przyniosło znaczną poprawę wydajności sprzęgania i czystości 45. Ponadto wykazano, że energia mikrofal zmniejsza agregację łańcuchów, ogranicza reakcje uboczne, ogranicza racemizację oraz zwiększa szybkość sprzęgania, co ma krytyczne znaczenie w przypadku sekwencji długich i trudnych46-53.
Obecnie promieniowanie mikrofalowe jest szeroko stosowane w syntezie peptydów lub związków pokrewnych na nośniku stałym, w tym w przypadku (A) syntezy w wodzie zamiast w rozpuszczalniku organicznym54; (B) syntezy peptydów z powszechnymi modyfikacjami potranslacyjnymi, takimi jak glikopeptydy55-58 lub fosfopeptydy59-61, których synteza jest zazwyczaj trudna ze względu na niską wydajność sprzęgania sterycznie utrudnionych pochodnych aminokwasów; (C) syntezy peptydów z modyfikacją szkieletu, takich jak azapeptydy, które mogą być tworzone poprzez zastąpienie C(α) reszty aminokwasu atomem azotu62, lub peptoidy, których łańcuch boczny jest połączony z azotem amidowym, a nie z atomem Cα63,64; (D) syntezy peptydów cyklicznych65-71; oraz (E) syntezy bibliotek kombinatorycznych51,72. W wielu przypadkach autorzy zgłaszali wyższą wydajność i skrócony czas syntezy przy użyciu promieniowania mikrofalowego w porównaniu z protokołem konwencjonalnym.
Stosując projektowanie racjonalne73-75, opracowaliśmy peptydy przeciwpasożytnicze pochodne z białka rusztowaniowego receptora aktywowanej kinazy C u Leishmania (LACK). LACK odgrywa istotną rolę w wczesnej fazie zakażenia Leishmania76. Pasożyty wykazujące niższy poziom LACK nie są w stanie zainfekować nawet myszy z niedoborami odporności77, ponieważ LACK uczestniczy w kluczowych procesach sygnalizacji i syntezy białek pasożyta78. W związku z tym LACK jest kluczowym białkiem rusztowaniowym79 i wartościowym celem terapeutycznym. Koncentrując się na sekwencjach w LACK, które są konserwatywne u pasożytów, ale nie u ssaczego homologu gospodarza RACK, zidentyfikowaliśmy 8-aminokwasowy peptyd (RNGQCQRK), który obniżył żywotność Leishmania sp. w hodowli.
W niniejszej pracy opisujemy protokół syntezy cyklicznych peptydów o szkieletowych wiązaniach, pochodnych sekwencji białka LACK opisanej powyżej. Peptydy syntetyzowano na podłożu stałym z wykorzystaniem ogrzewania mikrofalowego metodą SPPS zgodnie z protokołem Fmoc/tBu. W ramach procesu SPPS peptydy sprzęgano z peptydem nośnikowym TAT47-57 (YGRKKRRQRRR) poprzez wiązanie amidowe. Transport różnych ładunków do wnętrza komórek oparty na TAT jest stosowany od ponad 15 lat, a dostarczanie ładunku do organelli podkomórkowych zostało potwierdzone80. Do przeprowadzenia cyklizacji w celu wytworzenia łączników kwasowych o długości od dwóch do pięciu atomów węgla wykorzystano cztery różne łączniki: bezwodnik bursztynowy i glutarowy oraz kwas adypinowy i pimelowy. Cyklizację przeprowadzono z wykorzystaniem energii mikrofalowej, natomiast końcowe etapy odszczepiania i deprotekcji łańcuchów bocznych wykonano manualnie, bez użycia mikrofal. Zastosowanie zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego poprawiło czystość produktu, zwiększyło jego wydajność oraz skróciło czas syntezy. Ten ogólny protokół może zostać zastosowany w innych badaniach wykorzystujących peptydy do zrozumienia istotnych mechanizmów molekularnych in vitro oraz in vivo i dalszego opracowywania potencjalnych leków na choroby ludzkie.

<table><tbody><tr><td>REAGENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid support, żywica Rink Amide AM ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>Ładowanie: 0,49 mmol/</td></tr><tr><td>g Fmoc-Ala-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asn(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asp(OBut)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(But)-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-metylo-2-pirolidynon (NMP)</td><td>Sigma</td><td>328634</td><td><silny>Uwaga</silny> Toksyczny/Wysoce łatwopalny/drażniący.</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid (DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43465</td><td>Uwaga Toxic. 
Używaj wysokiej jakości DMF, aby wyeliminować reakcje uboczne, takie jak usunięcie Fmoc w wyniku śladów dimetyloaminy z rozkładu DMF.</td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Sigma</td><td>D65100</td><td><silny>Uwaga</silny> Szkodliwy</td></tr><tr><td>dibromometan (DBM)</td><td>Sigma</td><td>D41868</td><td><silny>Ostrożny</silny> Szkodliwy</td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma</td><td>T62200</td><td>Uwaga</silny>/toksyczny</td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy, klasa HPLC (TFA)</td><td>Sigma</td><td>91707</td><td><silny>Ostrożny</silny>/toksyczny</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma</td><td>31690</td><td><silny>Uwaga</silny> Wysoce łatwopalny/szkodliwy</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan (TIS)</td><td>Sigma</td><td>233781</td><td><silny>Ostrożny</silny> Woda drażniąca/łatwopalna</td></tr><tr><td>, klasa HPLC</td><td>Sigma</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitroile, Klasa HPLC (ACN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td><silny>Ostrożny</silny> Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy</td></tr><tr><td>N,N-Diizopropyloetyloamina (DIEA)</td><td>Sigma</td><td>3440</td><td><silny>Uwaga</silny>/wysoce łatwopalny</td></tr><tr><td>Piperydyna</td><td>Sigma</td><td>W290807</td><td><silny>Ostrożny</silny> Toksyczny/Wysoce łatwopalny</td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma</td><td>270970</td><td><silny>Uwaga</silny> Wysoce łatwopalny/Szkodliwy</td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td><silny>Uwaga</silny> Wysoce łatwopalny/drażniący</td></tr><tr><td>Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt)</td><td>Sigma</td><td>157260</td><td><silny>Uwaga</silny> Wysoce łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy</td></tr><tr><td>O-(Benzotriazol-1-ylo)-N,N,N&prime;,N&prime; -tetrametylofluorofosforan (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td>Uwaga Drażniący/szkodliwy</td></tr><tr><td>Heksafluorfosforan benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidinofosphonium (PyBOP)</td><td>Zaawansowany Chemtech</td><td>RC8602</td><td><silny>Uwaga</silny> Drażniący</td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Sigma</td><td>454044</td><td><silny>Uwaga</silny> Szkodliwy</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P3653</td><td>Caution/toksyczny</td></tr><tr><td>cyjanek potasu (KCN)</td><td>Sigma</td><td>11813</td><td>Ostrożnie Bardzo toksyczny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td>Uwaga Toksyczny</td></tr><tr><td>N,N' -diizopropylokarbodimidymid (DIC)</td><td>Sigma</td><td>38370</td><td>Uwaga Łatwopalny/ Toksyczny</td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna (DMAP)</td><td>Sigma</td><td>522805</td><td><silny>Uwaga</silny> Toksyczny/drażniący</td></tr><tr><td>Bezwodnik glutarowy</td><td>Sigma</td><td>G3806</td><td><silny>Uwaga</silny> Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy</td></tr><tr><td>Bezwodnik bursztynowy</td><td>Sigma</td><td>239690</td><td><silny>Uwaga</silny> Drażniący/Szkodliwy</td></tr><tr><td>Kwas adypinowy</td><td>Sigma</td><td>A26357</td><td><silny>Uwaga</silny> Toksyczny/Drażniący</td></tr><tr><td>Kwas pimelowy</td><td>Sigma</td><td>P45001</td><td><silny>Ostrożny</silny> Toksyczny/drażniący</td></tr><tr><td>Chloranil</td><td>Sigma</td><td>23290</td><td>Ostrożnie</silny> Toksyczny/Drażniący</td></tr><tr><td>Aldehyd octowy</td><td>Sigma</td><td>402788</td><td><silny>Uwaga</silny> Łatwopalny/</td></tr> <tr><td>Toksyczny<SILNY>SPRZĘT</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>freezone 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Franklin Electric</td><td>model 1101101416 z 3/4 HP</td><td>Alcatel pompa z silnikiem Franklin&nbsp;</td></tr><tr><td>Wkład polipropylenowy 12 ml</td><td>Zastosowana separacja</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczka do wkładu polipropylenowego 12 ml</td><td>Zastosowana separacja</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>Wkład polipropylenowy 3 ml</td><td>Zastosowana separacja</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczka do wkładu polipropylenowego 3 ml</td><td>Zastosowana separacja</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>Kurki odcinające PTFE</td><td>Zastosowane separacje</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>Probówki płaskie, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor ekstrakcyjny, 20 póz, rurki 16 x 100 mm</td><td>Woda</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Shaker, BD Mikser nutatorowy Adams</td><td>Fisher scientific</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Butelki Nalgene HDPE z wąską szyjką IP2, 125&nbsp; ml</td><td>Fisher scientific</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-501, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Thermolyne</td><td>1760 dri bath</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe rurki ze szkła borokrzemianowego z gładkim końcem</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety i końcówki Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&ndash; 200 oraz 100&ndash; 1,000 &mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki HPLC - micro vl pp 400 i micro; l PK100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka HPLC - niebieska nasadka typu Snap-It VWR</td><td></td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>Analityczna kolumna HPLC</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 &micro; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC do przygotowania, XBridge&nbsp;</td><td>Wody</td><td>OBD C18 5 i mikro; m kolumna</td><td>19 mm & razy; 150 mm</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager DE-RP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>butli</td><td></td><td></td><td></td>z azotem</tr><tr><td>Analityczny system RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-20AD, autosampler SIL-20AC, odgazowywacz DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).</td></tr><tr><td>Preparatywny system RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-6AD oraz kolektor frakcji FRC-10A (Shimadzu, MD, USA).</td></tr></tbody></table>

opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Interakcje białko-białko (PPI) są ściśle związane z prawie wszystkimi procesami biologicznymi i są powiązane z wieloma chorobami ludzkimi. W związku z tym podejmowane są znaczne wysiłki na rzecz ukierunkowania IPP na badania podstawowe i w przemyśle farmaceutycznym. Interfejsy białko-białko są zwykle duże, płaskie i często pozbawione kieszeni, co komplikuje odkrycie małych cząsteczek, które celują w takie miejsca. Alternatywne podejścia do celowania z wykorzystaniem przeciwciał mają ograniczenia ze względu na słabą biodostępność po podaniu doustnym, niską przepuszczalność komórek i nieefektywność produkcji.
Używanie peptydów do atakowania interfejsów PPI ma kilka zalet. Peptydy mają wyższą elastyczność konformacyjną, zwiększoną selektywność i są na ogół niedrogie. Jednak peptydy mają swoje ograniczenia, w tym słabą stabilność i nieefektywność przenikania przez błony komórkowe. Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, można przeprowadzić cyklizację peptydów. Wykazano, że cyklizacja poprawia selektywność peptydów, stabilność metaboliczną i biodostępność. Jednak przewidywanie bioaktywnej konformacji cyklicznego peptydu nie jest trywialne. Aby sprostać temu wyzwaniu, jednym z atrakcyjnych podejść jest badanie przesiewowe ukierunkowanej biblioteki do badań przesiewowych, w której wszystkie cykliczne peptydy szkieletowe mają tę samą sekwencję pierwotną, ale różnią się parametrami wpływającymi na ich budowę, takimi jak rozmiar pierścienia i położenie.
Opisujemy szczegółowy protokół syntezy biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych ukierunkowanych na określone pasożytnicze PPI. Stosując racjonalne podejście projektowe, opracowaliśmy peptydy pochodzące z białka rusztowania receptora Leishmania dla aktywowanej kinazy C (LACK). Postawiliśmy hipotezę, że sekwencje w LACK, które są konserwatywne u pasożytów, ale nie w homologu gospodarza ssaków, mogą reprezentować miejsca interakcji dla białek, które są krytyczne dla żywotności pasożytów. Cykliczne peptydy zsyntetyzowano przy użyciu promieniowania mikrofalowego w celu skrócenia czasu reakcji i zwiększenia wydajności. Opracowanie biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych o różnych rozmiarach pierścieni ułatwia systematyczne badanie przesiewowe w celu uzyskania najbardziej aktywnej biologicznie konformacji. Ta metoda zapewnia ogólny, szybki i łatwy sposób syntezy cyklicznych peptydów.

W niniejszej pracy opisujemy opracowanie ukierunkowanej, niewielkiej biblioteki peptydów cyklicznych w szkielecie (backbone cyclic peptides), które specyficznie celują w kluczowe PPI pasożyta Leishmania i działają jako środki przeciwpasożytnicze (przegląd peptydów celujących w PPI jako środków przeciwpasożytniczych znajduje się w pozycji87). Poprzez syntezę nowych peptydów cyklicznych w szkielecie, farmakofory zostają zachowane w rusztowaniu o rozszerzalnym rozmiarze. Atut proponowanej tutaj ukierunko...

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie ukierunkowanej biblioteki cyklicznych peptydomimetyków z szkieletem zapisanym w strukturze cyklicznej o zróżnicowanej konformacji z wykorzystaniem napromieniowania mikrofalowego w celu stworzenia nowych środków terapeutycznych przeciwpasożytniczych. Metoda ta może pomóc w opracowaniu nowych narzędzi do specyficznego celowania w oddziaływania białko-białko. Aby rozpocząć procedurę, należy dodać 2,5 ml pożądanego aminokwasu, 1 ml aktywatora oraz 0,5 ml zasady aktywującej do kartridża z polipropylenu.Umieść kartridż w automatycznym syntezatorze mikrofalowym i pozwól reakcji sprzęgania przebiegać przez 300 sekund przy mocy 25 W i temperaturze 75 °C. Po zakończeniu reakcji przemyj żywicę siedmioma mililitrami N, N-dimetyloformamidu (DMF) przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. Po pięciokrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, dodaj do polipropylenowego kartridża siedem mililitrów 20% piperydyny w DMF z 0,1 M 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) i inkubuj przez 30 sekund przy mocy 45 W i temperaturze 75 °C.Po zakończeniu procesu odlać mieszaninę reakcyjną. Następnie do kartridża polipropylenowego dodać siedem mililitrów 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt i inkubować przez 180 sekund przy mocy 45 W i temperaturze 75 °C. Po odlaniu mieszaniny reakcyjnej przemyć żywicę siedmioma mililitrami DMF przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.Następnie przemyj żywicę siedmioma mililitrami dichlorometanu, czyli DCM, przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. W przypadku sprzęgania z bezwodnikiem przemyj żywicę siedmioma mililitrami 1-metylo-2-pirolidynonu, czyli NMP, przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu odlej mieszaninę reakcyjną.Po trzykrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, rozpuść 10 równoważników odpowiedniego bezwodnika w pięciu mililitrach NMP w 50-mililitrowej probówce polipropylenowej. Następnie do roztworu dodaj jeden równoważnik 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) oraz 10 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA). Dodaj tę mieszaninę do żywicy i inkubuj przez 300 sekund przy mocy 25 W i temperaturze 75 °C.Po przemyciu żywicy NMP, przemyj ją siedmioma mililitrami DMF przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś żywicę do polipropylenowego wkładu wyposażonego w zatyczkę i kranik. Po przemyciu żywicy DCM, dodaj do polipropylenowego wkładu od 15 do 25 mililitrów mieszaniny 1% kwasu trifluorooctowego, 5% triizopropylosilanu i 94% DCM na każdy 1 gram żywicy.Umieść wkład polipropylenowy na wytrząsarce i wytrząsaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessaj roztwór z wkładu polipropylenowego za pomocą pompy próżniowej. Po powtórzeniu powyższych kroków trzykrotnie, przemyj żywicę siedmioma mililitrami DCM przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.Kroki te są niezwykle istotne, ponieważ stwierdzono, że grupy ochronne tritylowe w kilku żywicach ulegają częściowemu odszczepieniu w roztworach DCM i kwasu trifluorooctowego. Usuwanie grup metylotrytlowych jest procesem powolnym, wymagającym wielokrotnego przemywania. W probówce z polipropylenu o pojemności 50 ml rozpuścić pięć równoważników Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate w pięciu ml dibromomethane.Następnie do roztworu należy dodać 10 ekwiwalentów DIEA. Mieszaninę dodaje się do żywicy wypłukanej DCM i inkubuje przez 300 sekund przy mocy 25 W i temperaturze 75 °C. Następnie żywicę przemywa się siedmioma mililitrami DCM przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.Po dwukrotnym przemyciu DCM przenieś żywicę do polipropylenowego wkładu i przemyj ją dwukrotnie eterem dietylowym. Susz żywicę w deskryptorze próżniowym w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny nad wodorotlenkiem potasu. Następnie dodaj 10 ml schłodzonego wcześniej koktajlu do odszczepiania na bazie kwasu trifluorooctowego na każdy gram żywicy.Umieść wkład polipropylenowy na wytrząsarce i wytrząsaj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie zbierz roztwór z odszczepianiem, filtrując żywicę do 50 mililitrowej probówki polipropylenowej. Do probówki dodaj 35 mililitrów zimnego eteru dietylowego.Wiruj przez pięć minut przy 1 207 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odlej warstwę eteru. W celu przeprowadzenia testu Kaisera przygotuj roztwór A, rozpuszczając 16,5 mg cyjanku potasu w 25 mL wody destylowanej.Rozcieńczyć jeden mililitr roztworu w 49 mililitrach perydyny. Następnie przygotować roztwór B, rozpuszczając jeden gram ninhydryny w 20 mililitrach etanolu. Przygotować roztwór C, rozpuszczając 40 gramów fenolu w 20 mililitrach etanolu.Po przygotowaniu roztworów przenieś kilka kuleczek żywicy do probówki. Do probówki dodaj po trzy krople każdego z roztworów i wymieszaj. Na koniec ogrzewaj probówkę w bloku grzejnym w temperaturze 110 °C przez pięć minut.Syntezę szkieletowych peptydów cyklicznych przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego na nośniku stałym, zgodnie z protokołem FMOC, t-butyl. Produkt poddano analizie spektrometrią mas, a jego stopień czystości określono za pomocą HPLC. Przesiew biologiczny wykazał, że peptyd pL1 był aktywny przeciwko Leishmania donovani, pasożytowi wywołującemu leiszmaniozę trzewną, najcięższą postać leiszmaniozy u ludzi.Peptyd pL1 zmniejszył żywotność pasożytów o 75% w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w ciągu trzech do pięciu dni, pod warunkiem właściwego wykonania. Po opracowaniu metoda ta otworzyła badaczom z wielu dziedzin możliwość eksploracji peptydów jako regulatorów farmakologicznych w badaniach podstawowych oraz terapeutykach.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować ukierunkowaną bibliotekę peptydomimetyków o różnorodności konformacyjnej w celu specyficznego celowania w oddziaływania białko-białko. Należy pamiętać, że praca z kwasem trifluorooctowym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie ochrony oczu, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek oraz praca w dobrze wentylowanym dygestorium.

development-backbone-cyclic-peptide-library-as-potential

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Ten protokół przedstawia syntezę cyklicznych peptydów poprzez bissalkilację między cysteiną a metioniną oraz łatwą reakcję tiol-yne wywołaną przez centrum propargylu sulfonium.

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

Ten protokół opisuje syntezę cyklicznych peptydów penetrujących komórki z aromatycznymi wiązaniami krzyżowymi oraz ocenę ich przepuszczalności przez bariery biologiczne.

Budowa cyklicznych peptydów penetrujących komórki w celu zwiększenia penetracji barier biologicznych

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Prezentowano prosty, niedrogi i nowatorski aparat do syntezy peptydów w fazie stałej w komercyjnym reaktorze mikrofalowym.

Niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Odkryj syntezę cyklicznych peptydów z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego do tworzenia bibliotek terapeutycznych przeciwpasożytniczych. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskiwanie związków o zróżnicowanej konformacji.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Przeglądaj więcej filmów