Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie skoncentrowanej biblioteki cyklicznych peptydomimów szkieletowych o różnorodności konformacyjnej z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego do nowych terapii przeciwpasożytniczych. Metoda ta może pomóc w opracowaniu nowych narzędzi do celowania w interakcje białko-białko. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 2,5 mililitra pożądanego aminokwasu, jeden mililitr aktywatora i 0,5 mililitra bazy aktywatora do wkładu polipropylenowego.

Umieść wkład w automatycznym syntezatorze mikrofalowym i pozwól, aby reakcja sprzężenia postępowała przez 300 sekund przy 25 watach i 75 stopniach Celsjusza. Po zakończeniu reakcji przemyj żywicę siedmioma mililitrami N, N-dimetyloformamidu lub DMF przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. Po pięciokrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, dodaj siedem mililitrów 20% piperydyny w DMF z 0,1-molowym 1-hydroksybenzotriazolem lub HOBt do wkładu polipropylenowego i inkubuj przez 30 sekund przy 45 watach i 75 stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu odcedź mieszaninę reakcyjną. Następnie dodaj siedem mililitrów 20% piperydyny w DMF z 0,1 molowym HOBt do wkładu polipropylenowego i inkubuj przez 180 sekund przy 45 watach i 75 stopniach Celsjusza. Po odsączeniu mieszaniny reakcyjnej przemyj żywicę siedmioma mililitrami DMF przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj żywicę siedmioma mililitrami dichlorometanu lub DCM przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. W przypadku sprzężenia bezwodnika należy przemyć żywicę siedmioma mililitrami 1-metylo-2-pirolidynonu lub NMP przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu odcedź mieszaninę reakcyjną.

Po trzykrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku rozpuść 10 odpowiedników odpowiedniego bezwodnika w pięciu mililitrach NMP w 50-mililitrowej probówce polipropylenowej. Następnie dodaj do roztworu jeden odpowiednik 4-dimetyloaminopirydyny lub DMAP i 10 odpowiedników N, N-diizopropyloetyloaminy lub DIEA. Dodaj tę mieszaninę do żywicy i inkubuj przez 300 sekund w temperaturze 25 watów i 75 stopni Celsjusza.

Po umyciu żywicy NMP myj ją siedmioma mililitrami DMF przez 120 sekund w temperaturze pokojowej. W tym momencie przenieś żywicę do wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający. Po umyciu żywicy DCM dodaj 15 do 25 mililitrów mieszaniny 1% kwasu trifluorooctowego, 5% triizopropylosilianu i 94% DCM do wkładu polipropylenowego na 1 gram żywicy.

Umieść wkład polipropylenowy na shakerze i potrząsaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie spuść roztwór z wkładu polipropylenowego, stosując próżnię. Po trzykrotnym powtórzeniu poprzednich kroków umyj żywicę siedmioma mililitrami DCM przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.

Etapy te są bardzo ważne, ponieważ stwierdzono, że grupy chroniące przed trytylem w kilku żywicach są częściowo rozszczepione w roztworach DCM-kwasu trifluorooctowego. Usuwanie grup metylotrytylowych to powolny proces, który wymaga wielu prań. W 50-mililitrowej probówce polipropylenowej rozpuść pięć równoważników sześciofluorfosforanu benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidynofosfoniowego w pięciu mililitrach dibromometanu.

Następnie dodaj 10 odpowiedników DIEA do roztworu. Dodaj mieszaninę do żywicy płukanej DCM i inkubuj przez 300 sekund w temperaturze 25 watów i 75 stopni Celsjusza. Następnie umyj żywicę siedmioma mililitrami DCM przez 120 sekund w temperaturze pokojowej.

Po dwóch płukaniach DCM przenieś żywicę do wkładu polipropylenowego i przemyj dwukrotnie eterem dietylowym. Suszyć żywicę w eksykatorze próżniowym w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny na wodorotlenku potasu. Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie schłodzonego koktajlu rozszczepiającego kwas trifluorooctowy na każdy gram żywicy.

Umieść wkład polipropylenowy na shakerze i wstrząsaj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie zbierz roztwór do rozszczepienia, filtrując żywicę do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej. Dodaj 35 mililitrów zimnego eteru dietylowego do probówki.

Wirować przez pięć minut w temperaturze 1 207 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zdekantować warstwę eteru. Do testu Kaisera przygotuj roztwór A, rozpuszczając 16,5 miligrama cyjanku potasu w 25 mililitrach wody destylowanej.

Rozcieńczyć jeden mililitr roztworu 49 mililitrami perydyny. Następnie przygotuj roztwór B, rozpuszczając jeden gram ninhydryny w 20 mililitrach etanolu. Przygotować roztwór C, rozpuszczając 40 gramów fenolu w 20 mililitrach etanolu.

Po przygotowaniu roztworów przenieś kilka kulek z żywicy do probówki. Dodaj trzy krople każdego roztworu do probówki i wymieszaj. Na koniec podgrzej probówkę na bloku grzewczym w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego na stałym podłożu zgodnie z protokołem FMOC, t-butylowym. Produkt analizowano metodą spektrometrii mas, a jego stopień czystości określono za pomocą HPLC. Badania biologiczne wykazały, że peptyd pL1 był aktywny przeciwko Leishmania donovani, pasożytowi powodującemu leiszmaniozę trzewną, najcięższą leiszmaniozę u ludzi.

Peptyd pL1 zmniejszył żywotność pasożyta o 75% w porównaniu z leczeniem kontrolnym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z wielu dziedzin do badania peptydów jako regulatorów farmakologicznych w badaniach podstawowych i terapiach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować ukierunkowaną bibliotekę peptydomimetyki o różnorodności konformacyjnej, aby konkretnie celować w interakcje białko-białko. Nie zapominaj, że praca z kwasem trifluorooctowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów, fartucha laboratoryjnego i rękawic podczas pracy w dobrze wentylowanym kapturze.