Synteza funkcjonalizowanego bispeptydu w fazie stałej przy użyciu metodologii "Safety Catch"

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest synteza funkcjonalizowanego peptydu BSP przy użyciu technik fazy stałej. Osiąga się to poprzez nałożenie chronionego aminokwasu BIS na żywicę kwasu hydroksyetylobenzoesowego. Następnie powtarzane są cykle głębokiego sprzężenia ochronnego w celu przyłączenia funkcjonalizowanych aminokwasów bis, w procesie, który wydłuża peptyd BIS i wykazuje pożądaną funkcjonalność.

Wreszcie, pierwszy aminokwas bis jest modyfikowany aminokwasem alfa w celu rozszczepienia peptydu BIS z żywicy przez tworzenie pirazyny DI Keto. Uzyskano wyniki, które wskazują na udaną syntezę funkcjonalizowanego peptydu BSP o dobrej czystości surowej i stałej izolowanej wydajności około 10% w oparciu o analizę spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku równoległej i bibliotecznej syntezy peptydów bis, ponieważ peptydy BIS są składane na stałej żywicy, którą łatwiej manipulować niż reakcje w roztworze, a produkty uboczne można łatwo usunąć przez filtrację.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele kroków jest trudnych do nauczenia, ponieważ istnieje wiele ważnych szczegółów niezbędnych do zapewnienia, że wszystkie reakcje zbliżają się do zakończenia tak blisko, jak to możliwe. W przypadku syntezy w fazie stałej nie ma możliwości oczyszczenia produktów pośrednich. Tak więc, aby uzyskać czysty produkt końcowy, każda reakcja musi być doprowadzona tak daleko, jak to tylko możliwe.

Zalecamy utworzenie listy kontrolnej procedur eksperymentalnych, aby uniknąć nieporozumień, ponieważ kroki są z natury powtarzalne. Protokół ten rozpoczyna się od załadowania pierwszego peptydu BSP, ochrony pierwszego peptydu BSP i jednoczesnego zasklepienia żywicy. Aby rozpocząć, załaduj pierwszy peptyd BSP, ważąc 114 miligramów żywicy H-M-B-A-A do ośmiomililitrowego naczynia reakcyjnego i dodaj magnetyczny pręt mieszający.

Zakryj górną część naczynia gumową przegrodą i przeczytaj rurkę preparatem Argonne przez co najmniej pięć minut. W międzyczasie należy przygotować aktywowany roztwór aminokwasowy BIS zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Dołączając ten film, przenieś roztwór do naczynia reakcyjnego za pomocą strzykawki i wymieszaj pod Argonne przez noc następnego dnia, usuń przegrodę i odcedź mieszaninę reakcyjną.

Umyj żywicę, dodając do niej około dwóch mililitrów chlorometanu. Mieszaj przez 30 sekund do minuty, a następnie odcedź. Powtórz ten proces cztery razy z DCM, a następnie przemyj żywicę pięć razy dimetyloformamidem.

Aby przeprowadzić głęboką ochronę pierwszego aminokwasu bis i jednoczesne pokrywanie żywicą, powoli dodaj dwa mililitry roztworu 33% bromowodoru w kwasie octowym i DCM do naczynia reakcyjnego. Pozostawić na 15 minut do wymieszania po odsączeniu i pięciokrotnym umyciu żywicy w DCM. Powtórz sekwencję ochrony D jeszcze raz.

Następnie przemyj żywicę pięć razy w DCM, a następnie pięć razy w DMF, zneutralizuj żywicę, przemywając dwukrotnie 5% objętościowo roztworem D-I-P-E-A w DMF. Następnie umyć pięć razy DCM i jeszcze raz pięć razy DMF. Teraz można wykonać sprzężenie chronionego funkcjonalizowanego aminokwasu bis.

Najpierw należy ponownie wprowadzić obojętną atmosferę do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę, przemłukując trzykrotnie bezwodnym DCM. Następnie podłącz przegrodę i linię argonnową i umyj naczynie, dodając od jednego do dwóch mililitrów bezwodnego DCM i mieszając przez 30 sekund. Następnie opróżnij naczynie, aż bełkotka z linii argonne zacznie się podnosić.

Powtórz ten proces co najmniej jeszcze raz. Następnie przygotuj roztwór funkcjonalizowanego aminokwasu bis w wysuszonej płomieniowo probówce w atmosferze argonny. Dodaj 47 mikrolitrów DIC i mieszaj przez 90 minut.

Następnie dodaj 35 mikrolitrów D-I-P-E-A w 666 mikrolitrach i hydrus DMF do żywicy i mieszaj przez dodatkowe pięć minut. Przenieś wstępnie aktywowany roztwór aminokwasu BIS do naczynia za pomocą strzykawki i mieszaj przez noc następnego dnia. Odcedzić mieszaninę reakcyjną i przemyć dwukrotnie bezwodnym DCM pod wpływem argonu.

Krytycznym krokiem w tej procedurze są sprzężenia aminokwasów biz. Aby zapewnić zamknięcia pierścieniowe di keto piperazyny, stosujemy dłuższe czasy reakcji z dodatkowymi środkami aktywującymi. Aby wspomóc zamknięcie pirazyny di keto, dodaj roztwór HOAT i DIC mieszaj pod argonem przez godzinę.

Następnie usuń przegrodę i odcedź mieszaninę reakcyjną. Umyj żywicę pięć razy DCM i pięć razy DMF. W tej sekcji omówiono głęboką ochronę funkcjonalizowanego aminokwasu BIS, głęboką ochronę F moc i acylację pierwszego aminokwasu BIS.

W celu wykonania głębokiej ochrony chronionego funkcjonalizowanego aminokwasu bis, należy powoli dodać dwa mililitry roztworu TFA i TIPS do naczynia reakcyjnego i mieszać przez godzinę po odsączeniu, przemyć żywicę DCM przez około 30 sekund, a następnie odcedzić powtórzyć płukanie DCM pięć razy. Następnie powtórz całą sekwencję płukania żywicą głęboko ochronną po praniu A-D-C-M-D-M-F. Zneutralizować żywicę, przemywając ją dwukrotnie 5% objętościowym roztworem D-I-P-E-A w DMF.

Następnie wykonaj kolejne pranie D-C-M-D-M-F. Stąd peptyd BIS może być wydłużany innymi funkcjonalizowanymi aminokwasami bis lub funkcjonalizowany na wiodącym kwasie karboksylowym azotu lub jednym i drugim. Aby zabezpieczyć grupę FM, dodaj dwumililitrowy roztwór 20% parydyny rurowej do DMF i mieszaj reakcję przez 20 minut.

Odcedź i umyj żywicę pięć razy w DMF. Powtórz ten proces jeszcze raz po dodatkowym przepłukaniu żywicy. A wyizoluj pierwszy aminokwas bis, dodając przygotowany roztwór aminokwasu do naczynia reakcyjnego i mieszaj przez sześć godzin jako ostatni krok.

Umyj żywicę pięć razy DCM i pięć razy DMF. Ostatnia część tego protokołu obejmuje usunięcie grupy Bacha z aminokwasu związanego z żywicą i rozszczepienie z żywicy. Najpierw dodaj dwa mililitry roztworu jeden do jednego T-F-A-D-C-M do naczynia reakcyjnego i mieszaj przez 30 minut.

Odcedź i umyj żywicę pięć razy w DCM. Następnie powtórz ten proces jeszcze raz. Umyj i odcedź żywicę przez 30 sekund, pięć razy za pomocą DCM i pięć razy za pomocą DMF.

Następnie dodaj dwa mililitry roztworu 10% D-I-P-E-A w bezwodnym DMF i mieszaj przez 24 do 48 godzin. Na koniec zebrać mieszaninę reakcyjną do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej. Przenieś 30 mikrolitrów tego roztworu do 450 mikrolitrów Tetra Hydro FU w pliku lc MS i prześlij go do analizy.

Przemyć żywicę dodatkowymi porcjami DMF i zebrać do kolby okrągłodennej. Następujące metody mogą być stosowane do monitorowania przemian chemicznych żywicy w trakcie syntezy. Aby wykryć wolne grupy hydroksylowe, należy wykonać test czerwieni metylowej, usuwając najpierw około jednego miligrama suchej żywicy za pomocą jednorazowej pipety.

Przepłukać do czteromililitrowego naczynia reakcyjnego. Dodać roztwór czerwieni metylowej przygotowany zgodnie z opisem w tekście i mieszać przez pięć do 10 minut. Odcedź i umyj żywicę pięć razy pomarańczowymi lub czerwonymi kulkami żywicy DCM, które wskazują na obecność wolnych grup hydroksylowych.

Test ten można wykorzystać do oceny obciążenia pierwszych etapów zakrywania aminokwasów i żywicy bis. Aby wykryć środki wtórne, należy wykonać test chloralowy, przenosząc około jednego miligrama suchej żywicy do małej fiolki za pomocą jednorazowej pipety. Dodaj trzy krople zarówno 0,8 milimolowego chloralu w roztworze DMF, jak i 2% kwaśnego aldehydu w roztworze DMF.

I usiądźmy w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. W tym przypadku niebieskie lub fioletowe kulki żywicy wskazują, że na związku związanym z żywicą znajdują się wolne środki wtórne. Aby potwierdzić skuteczność aktywacji, należy przeprowadzić test pułapki aktywacyjnej, aktywowany związek podczas syntezy można ocenić, przenosząc od pięciu do 10 mikrolitrów aktywowanego roztworu do fiolki ze spektrometrią mas do chromatografii cieczowej zawierającej 50 mikrolitrów olainy zmieszanej ręcznie.

Przez kilka sekund roztwór powinien zmienić kolor na żółty, następnie rozcieńczyć 450 mikrolitrami tetra hydro uran i poddać analizie lc MS. Produkt końcowy i aktywowane produkty pośrednie można ocenić za pomocą systemu LCM S wyposażonego w kolumnę z odwróconymi fazami C 18 i układ rozpuszczalnikowy z wodą, acetylo-nitrylem z 0,1% kwasem mrówkowym. Ten ślad L-C-M-S-U-V stanowi przykład dobrej czystości produktu surowego.

Stwierdzono, że główny pik w widmie stwierdzony po 21,3 minutach ma maskę zgodną z oczekiwaną masą produktu. Można to zobrazować w widmie masowym produktu naftowego, przy czym pik ujawnia główne piki odpowiadające masie plus masa jonu sodu, a także masa pomniejszona o masę grupy ochronnej IV DDE. Pokazany tutaj jest ślad LCMS UV oczyszczonych widm ujawniający bardzo czysty produkt po 21,3 minutach oraz widmo masowe potwierdzające tożsamość tego oczyszczonego piku Trewiru.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technik solid face do syntezy funkcjonalizowanych peptydów bis po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się peptydami biz do zbadania zastosowań w interakcjach białko-białko i katalizie, gdy już zostanie opanowana. Ta technika może prowadzić do syntezy funkcjonalizowanego trimera peptydowego biz w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby kulki były zanurzone w roztworach reakcyjnych i myjących Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak synteza równoległa lub biblioteczna, mogą być wykonywane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ stereochemii lub alternatywnych funkcji na wiązanie białek lub aktywność katalityczną. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami organicznymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i okapu wyciągowego.