Name: Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę ilościowej proteomiki wykorzystującą redukcyjną dimetylację do znakowania stabilnych izotopów w badaniach białek. Technika ta umożliwia szybką, ekonomiczną i precyzyjną analizę złożonych mieszanin białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy SP Gygi i GM Church za pomoc i wskazówki. Prace te były wspierane przez przewodniczącego doskonałości CNRS przy ACT.

UWAGA: Ta metoda została wcześniej opisana12.
1. Izolacja białka
Przygotuj 1 mg białka komórkowego przez lizę komórek, najlepiej metodami fizycznymi, takimi jak prasa francuska, ubijanie koralików lub sonikacja. Unikaj lizy komórek za pośrednictwem lizozymu, ponieważ enzym zakłóci pomiary spektrometrii mas.
2. Wytrącanie białek TCA
Dodaj 1 objętość kwasu trichlorooctowego (TCA) do 4 objętości białka i schładzaj na lodzie przez 10 minut, aby wytrącić białka. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego acetonu i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i odwrócić probówkę na stole, aby wysuszyć osad przez 15 minut. Przechowywać granulki białka w temperaturze -80 °C.
3. Denaturyzacja białek i redukcja wiązań dwusiarczkowych
Zawieś białka do ~2 mg/ml w 500 μl buforu denaturacyjnego i redukcyjnego (albo 4 M mocznik lub 3% SDS w 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Opcjonalnie należy włączyć inhibitor proteazy do buforu. Inkubować białka przez 30 minut w temperaturze 56 °C, a następnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Aklylate Free Sulfhydryl Groups Nieodwracalnie Zakłócają Tworzenie Wiązań Dwusiarczkowych
Przygotuj świeży 0,3 M jodoacetamid w wodzie. OSTROŻNOŚĆ! Jodoacetamid jest wysoce toksyczny. Dodać 25 μl 0,3 M jodoacetamidu (15 mM stężenie końcowe) do 500 μl białka i inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Ugasić jodoacetamid, dodając 10 μl 300 mM DTT (5 mM końcowe stężenie DTT). Białka alkilowane należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Trawienie białek
TCA wytrącić białka (jak opisano w kroku 2) i ponownie zawiesić w 1 ml 50 mM HEPES (pH 8.2), 1 M mocznik. Przygotować roztwór podstawowy endoproteinazy lizylowej (Lys-C) w wodzie o stężeniu 2 μg/μl i dodać 5 μl do roztworu białkowego. Inkubować mieszaninę przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że końcowe stężenie Lys-C wynosi 10 ng/μl, a stosunek białka do LysC (w/w) wynosi 1/50 do 1/200. Zawiesić 20 μg trypsyny do sekwencjonowania w 40 μl 50 mM kwasu octowego, dodać 5 μl (10 μg trypsyny) do roztworu Lys-C i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Dla Lys-C należy stosować takie same stężenie proteazy i proporcje proteazy do białka, jak w przypadku trypsyny.
6. Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie
<ol>
	<li>Zakwaszać peptydy przez dodanie kwasu trifluorooctowego (TFA) do końcowego stężenia 0,5% (pH≈2). Podłącz kolumnę C18 do kolektora wyciągowego. Stosować najwyższe możliwe natężenie przepływu na wszystkich etapach z wyjątkiem ładowania i elucji peptydów.</li>
	<li>Mokra kolumna z 6 ml acetonitrylu (ACN). Przemyć kolumnę 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, a następnie zrównoważyć 6 ml 0,1% TFA. Nie pozwól, aby kolumna wyschła między stopniami.</li>
	<li>Zatrzymać podciśnienie i załadować 500 μg peptydów do kolumny o natężeniu przepływu około 1 ml/min. Gdy peptydy zwiążą się z kolumną, ponownie odkurzyć i przemyć 6 ml 0,1% TFA, a następnie 3 ml buforu kwasu cytrynowego (0,09 M kwasu cytrynowego, 0,23 M Na2HPO4, pH 5,5). 
	Uwaga: Większe ilości peptydów można oznaczyć, ale zdolność wiązania kolumny C18 powinna być co najmniej dwukrotnie wyższa niż ilość peptydu, aby uniknąć utraty próbki.</li>
</ol>
7. Etykietowanie peptydów na kolumnie metodą redukcyjnej dimetylacji (etykietowanie ReDi)
Wykonaj ten krok pod chemicznym kapturem, ponieważ cyjanowodór jest uwalniany w niskim stężeniu podczas procesu etykietowania.
<ol>
	<li>Przygotuj 12 ml "lekkich" i "ciężkich" ReDi do metylacji amin wolnych od peptydów. Lekki bufor ReDi składa się z 0,8% formaldehydu i 0,12 M cyjanoborowodorku sodu przenoszącego wodór w ich naturalnym rozkładzie izotopowym w buforze kwasu cytrynowego. Ciężki bufor ReDi składa się z 0,8% deuterowanego formaldehydu i 0,12 M deuterowanego cyjanoborowodorku sodu w buforze kwasu cytrynowego.</li>
	<li>Inkubować kolumnę zawierającą peptydy, dodając 10 ml lekkiego lub ciężkiego buforu ReDi do kolumn zawierających peptydy z szybkością przepływu 1 ml/min i powtórzyć czynność w celu zapewnienia pełnego oznakowania. Przepłukać kolumnę 6 ml 0,1% TFA, a następnie 1 ml 0,5% kwasu octowego.</li>
	<li>Zatrzymaj próżnię i wymyj znakowane peptydy najpierw 1 ml 40% ACN, 0,5% kwasu octowego, a następnie 1 ml 80% ACN, 0,5% kwasu octowego, stosując natężenie przepływu około 0,5 ml/min. W razie potrzeby należy zmierzyć skuteczność etykietowania poszczególnych próbek za pomocą spektrometrii mas przed zmieszaniem ciężkich i lekkich próbek (patrz "Reprezentatywne wyniki"). Zmieszać ciężkie i znakowane światłem próbki peptydów w stosunku 1:1 w celu ilościowego określenia za pomocą spektrometrii mas.</li>
</ol>
8. Oddzielna mieszanina peptydów metodą chromatografii podstawowej fazy odwróconej pH (BPRP)
Podstawowa chromatografia odwróconej fazy pH (BPRP) w celu rozdzielenia mieszaniny peptydów na wiele frakcji, które są niezależnie analizowane przez LC-MS/MS w celu zwiększenia pokrycia proteomu.
<ol>
	<li>Frakcjonować mieszaninę peptydów na kolumnie C18-HPLC, stosując gradient rosnącego stężenia ACN w 10 mM wodorowęglanie amonu (pH 8). Zacznij od 5% (v/v) ACN przez 5 minut, zwiększ do 35% ACN w 60 minut, a następnie do 90% ACN w 1 minutę. Utrzymuj 90% ACN przez 4 minuty, a następnie zmniejsz ACN do 5%, aby ponownie wyrównać kolumnę przez 9 minut. Zbierz 96 frakcji o równej objętości na 96-dołkowej płytce (od A1 do H12). Monitoruj frakcjonowanie za pomocą detektora UV przy 220 nm, podczas gdy peptydy uwalniają się z kolumny (10-70 minut dla opisanych tutaj warunków).</li>
	<li>Połącz frakcje z dołków A1, C1, E1 i G1 (frakcja A1), z dołków B1, D1, F1 i H1 (frakcja B1), z dołków A2, C2, E2 i G2 (frakcja A2) i odpowiednio dla pozostałych frakcji. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wirówki próżniowej. Ponownie zawiesić peptydy z frakcji A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 i B12 w 130 μl 1 M mocznika/0,5% TFA i oczyścić za pomocą StageTips zgodnie z opisem w kroku 9. Przechowuj frakcje B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 i A12 w temperaturze -20 ºC.</li>
</ol>
9. Oczyszczanie peptydów metodą ekstrakcji STop i Go (StageTips)
Przygotuj mikrokolumny C18-StageTip7, pakując 200 μl końcówek do pipet z dwoma krążkami C18 o średnicy wewnętrznej (ID) 1,07 mm. Umieść końcówki Stage w probówkach Eppendorf. Za pomocą mikrowirówki umyj końcówki 130 μl metanolu, a następnie 130 ul 80% ACN, 0,5% kwasu octowego. Zrównoważ StageTips za pomocą 130 μl 0,1% TFA. Przenieś mieszaninę peptydów do StageTips i przemyj 130 μl 0,1% TFA, następnie 40 μl 0,1% TFA, a następnie 40 μl 0,5% kwasu octowego. Peptydy elute najpierw zawierają 20 μl 40% ACN, 0,5% kwasu octowego, a następnie 20 μl 80% ACN, 0,5% kwasu octowego. Połączyć eluaty i wysuszyć przez filtrację próżniową.
10. Mikrokapilar LC-MS/MS
<ol>
	<li>Rozpuścić peptydy w 1-5 μl 5% kwasu mrówkowego, 5% ACN do stężenia około 1 μg/μl. Rozpuścić peptydy ~1 μg na kolumnie HPLC o odwróconej fazie 100 μm × 20 cm z gradientem 6-22% ACN w 0,125% kwasie mrówkowym podawanym przez 75 lub 100 minut przy natężeniu przepływu ~300 nl/min.</li>
	<li>Identyfikuj peptydy za pomocą LTQ Orbitrap Velos12 lub podobnej platformy do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas ze spektrometrem masowym zapewniającym wysoką rozdzielczość i dokładność masy. Eksploatuj spektrometr masowy w trybie zależnym od danych z pełnym skanem MS (rozdzielczość 60 000) uzyskanym w analizatorze Orbitrap. Wygeneruj liniowe widma pułapek jonowych MS/MS dla 20 najliczniej występujących jonów wykrytych w pełnym spektrum MS. Ustaw cele automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 1 x 106 dla pełnego MS i 2,000 dla MS/MS. Ustaw maksymalne czasy akumulacji jonów na 1,000 ms dla MS i 150 ms dla MS/MS. Wyklucz rozdrobnione jony prekursorowe peptydów z dalszej selekcji z MS/MS na 20–60 sek.</li>
</ol>
11. Akwizycja danych MS/MS
Zidentyfikuj peptydy, porównując pliki RAW widm MS/MS z teoretyczną bazą danych za pomocą algorytmu takiego jak SEQUEST8 przy użyciu tych parametrów (Tabela 1).
Tabela 1. Parametry wyszukiwania w bazie danych peptydów.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr wysokość="19">
			<td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180">Parametry ogólne</td>
			<td>w pełni tryptyczne trawienie z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami</td>
		</tr>
		<tr wysokość="19">
			<td>Tolerancja jonów prekursorowych 25 ppm</td>
		</tr>
		<tr wysokość="19">
			<td>Tolerancja jonów fragmentacyjnych 1,0 Da</td>
		</tr>
		<tr wysokość="35">
			<td height="35" rowspan="2" style="wysokość:36px;">Modyfikacje statyczne</td>
			<td>+57.02146 Da na cysteinie, karboksyamidometylacji</td>
		</tr>
		<tr wysokość="19">
			<td>+28.03130 Da na lizynie i N-końcu peptydu, znacznik lekkiej dimetylacji</td>
		</tr>
		<tr wysokość="19">
			<td height="19" rowspan="2" style="wysokość:19px;">Dynamiczne modyfikacje</td>
			<td>+15.99491 Da na metioninie, utlenianie</td>
		</tr>
		<tr wysokość="19">
			<td>+6,03766 Da na lizynie i N-końcu peptydu, etykieta ciężkiej dimetylacji</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol>
	<li>Filtruj peptydy do 1% wskaźnika fałszywych odkryć za pomocą metody takiej jak strategia celu-wabika9, korzystając z bazy danych otwartych ramek odczytu w orientacji rzeczywistej i odwróconej.</li>
</ol>
12. Kwantyfikacja peptydów
Oblicz obszary ciężkich i lekkich par chromatogramów jonowych ekstrahowanych MS1 (obszary pików MS1) i stosunek sygnału do szumu peptydów (S/N)10. Uwzględnij pary peptydów tylko wtedy, gdy ich średni stosunek sygnału do szumu wynosi powyżej pięciu. Określ ilościowo względną obfitość peptydu w dwóch próbkach jako stosunek powierzchni pików MS1 ciężkich i lekkich wersji tego samego peptydu (stosunek powierzchni piku MS1). Oblicz względną obfitość białka jako medianę stosunku powierzchni piku MS1 dla wszystkich peptydów w białku.

<ol><li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li>
<li>Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li>
<li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li>
<li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li>
<li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li>
<li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li>
<li>Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+N%28%CE%B1%29-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Kilka punktów sprawia, że znakowanie stabilnymi izotopami peptydów za pomocą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) jest atrakcyjną metodą dla proteomiki ilościowej: niedrogie odczynniki do znakowania (odczynniki kosztują mniej niż 1 USD za próbkę), szybka szybkość reakcji (~ 10 min), brak produktów ubocznych, wysoka odtwarzalność (ryc. 3, 4), stabilne produkty reakcji, możliwość użycia dowolnej proteazy i wysoka skuteczność jonizacji znakowanych peptydów. Znakowanie chemiczne za pomocą ReDi jest równ...

Pomiar różnic w stężeniach wielu białek między złożonymi próbkami jest głównym wyzwaniem w proteomice. Coraz częściej odbywa się to poprzez znakowanie białek w każdej próbce różnymi znacznikami izotopowymi, łączenie próbek i stosowanie spektrometrii mas do ilościowego określania różnic stężeń. Istnieje kilka metod stabilnego znakowania izotopowego białek i peptydów. 15Znakowanie N1 i SILAC2 wprowadzają znaczniki izotopowe metabolicznie in vivo, podczas gdy iCAT3, iTRAQ4 i dimetylacja redukcyjna5 dodają stabilne znaczniki izotopowe po ekstrakcji i trawieniu białka. Wśród tych metod dimetylacja redukcyjna (znakowanie ReDi) zyskuje na popularności jako niedroga, powtarzalna metoda ilościowego określania różnic w stężeniach białek w prawie każdym typie próbki.
Etykietowanie ReDi polega na reakcji peptydów z formaldehydem w celu utworzenia zasady Schiffa, która jest następnie redukowana przez cyjanoborowodorek. Ta reakcja dimetylanuje wolne grupy aminowe na N-końcach i łańcuchach bocznych lizyny oraz monometyluje N-końcowe proliny. Opisany tutaj protokół metyluje peptydy w próbce 1 z "lekkim" znacznikiem przy użyciu odczynników z atomami wodoru w ich naturalnym rozkładzie izotopowym oraz w próbce 2 z "ciężkim" znacznikiem przy użyciu deuterowanego formaldehydu i cyjanoborowodorku (rysunek 1). Każda dimetyloowana grupa aminowa na peptydzie powoduje różnicę masy wynoszącą 6,0377 Da między formami lekkimi i ciężkimi, która jest wykorzystywana do rozróżnienia tych dwóch form za pomocą spektrometru masowego. W szczególności względna obfitość peptydów jest określana ilościowo jako stosunek obszarów chromatogramu jonowego wyekstrahowanych MS1 (stosunek powierzchni piku MS1) wersji lekkiej i ciężkiej dla każdej pary jonów peptydowych. Względną obfitość białka oblicza się jako średni stosunek powierzchni piku MS1 między wszystkimi peptydami w białku. W tym raporcie opisujemy solidny protokół przeprowadzania eksperymentów znakowania ReDi za pomocą LC-MS/MS, który obejmuje ekstrakcję peptydów w fazie stałej w odwróconej fazie, znakowanie ReDi na kolumnie, frakcjonowanie peptydów za pomocą podstawowej chromatografii pH z odwróconymi fazami (BPRP) oraz oczyszczanie mieszanin peptydów za pomocą StageTips (Rysunek 2). Omawiamy zalety i ograniczenia stosowania znakowania ReDi w proteomice ilościowej.

<table><tbody><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Wytrącanie białka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wytrącanie białka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>denaturacja, redukcja białka</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>denaturacja, redukcja białka</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>denaturacja, redukcja, białko alkilatowe</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Complete Mini Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>denaturacji, redukcji białka</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>białko alkilatowe</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>resuspens, ekstrakt, etykieta białko</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Ponowne zaparowanie białka</td></tr><tr><td>Lysyl Endoproteaza</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>trawienie białek</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie klasy trypsyny</td><td>Trawienie białek</td><td>Promega</td><td>V5111</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>trawienie białek</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak Wkłady C18</td><td>Wody</td><td>WAT054960</td><td>Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie</td></tr><tr><td>Kolektor ekstrakcyjny</td><td>Wody</td><td>WAT200609</td><td>Ekstrakcja peptydów w odwróconej fazie</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>różne</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" światło" znakowanie peptydów</td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" światło" etykietowanie peptydów</td></tr><tr><td>Deuterowany formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" ciężki" znakowanie peptydów</td></tr><tr><td>Izotopy CDN</td><td>cyjanoborodeuterku sodu</td><td>D-1797</td> <td>" ciężki" znakowanie peptydów</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>znakowanie peptydów</td></tr><tr><td>kolumna C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &mikro; m wielkość cząstek)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>zasadowa chromatografia odwróconych faz pH</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>różne</td></tr><tr><td>dyski C18 Empore 3M</td><td></td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>Wskazówki dotyczące STAGE</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE wskazówki</td></tr></tbody></table>

proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to metoda dokładnego ilościowego określania różnic ekspresji białek między próbkami za pomocą spektrometrii mas. Znakowanie ReDi wykonuje się przy użyciu zwykłych (lekkich) lub deuterowanych (ciężkich) form formaldehydu i cyjanoborowodorku sodu w celu dodania dwóch grup metylowych do każdej wolnej aminy. W tym miejscu demonstrujemy solidny protokół znakowania ReDi i ilościowego porównania złożonych mieszanin białkowych. Próbki białek do porównania są trawione do peptydów, znakowane w celu przenoszenia lekkich lub ciężkich znaczników metylowych, mieszane i współanalizowane przez LC-MS / MS. Względną obfitość białek określa się ilościowo poprzez porównanie obszarów pików chromatogramu jonowego ciężkich i lekkich znakowanych wersji peptydu składowego wyekstrahowanego z pełnego widma MS. Opisana tutaj metoda obejmuje przygotowanie próbki przez ekstrakcję do fazy stałej w odwróconej fazie, znakowanie peptydów ReDi na kolumnie, frakcjonowanie peptydów za pomocą podstawowej chromatografii pH z odwróconymi fazami (BPRP) oraz oczyszczanie peptydów StageTip. Omawiamy zalety i ograniczenia znakowania ReDi w odniesieniu do innych metod indukcji stabilnych izotopów. Zwracamy uwagę na nowatorskie zastosowania wykorzystujące znakowanie ReDi jako szybką, niedrogą i dokładną metodę porównywania obfitości białek w prawie każdym typie próbki.

Oceniono dokładność, precyzję i powtarzalność znakowania ReDi z wykorzystaniem lizatów całych komórek Saccharomyces cerevisiae oraz Clostridium phytofermentans. W pierwszej kolejności ilościowo określono wydajność znakowania ReDi mieszaniny lizatów białkowych C. phytofermentans pochodzących z kultur na celulozie (znakowanie ciężkie, H) i glukozie (znakowanie lekkie, L). Po przefiltrowaniu do poziomu 1% fałszywych odkryć peptydów (FDR), próbka ta zawierała 11 194 unikalne sekwencje peptydowe prz...

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie stężeń wielu białek pomiędzy próbkami za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem gotowych rozwiązań proteomicznych. Celem tym osiąga się poprzez wstępne trawienie białka z każdej próbki w celu otrzymania mieszanin peptydowych. Następnie dwie próbki są mieszane, a peptydy w zmieszanej próbce poddawane są frakcjonowaniu i odsalaniu.Następnie zmieszaną próbkę analizuje się za pomocą spektrometrii mas. W końcowej fazie peptydy są identyfikowane poprzez porównanie widm MS2 z bazą danych typu target-decoy wszystkich potencjalnych peptydów w próbkach, a następnie kwantyfikuje się względną obfitość peptydów pomiędzy próbkami. W rezultacie proteomika pozwala na kwantyfikację względnej obfitości wielu białek w złożonych próbkach.Główną zaletą redukcyjnej demetylacji w porównaniu z innymi metodami znakowania izotopami stabilnymi, takimi jak iLite, jest to, że jest ona szybką, niedrogą i dokładną metodą, która nie wymaga specyficznych cech ani syntetycznego medium, co oznacza, że można ją zastosować do niemal każdego rodzaju próbki. Aby rozpocząć, należy przygotować 1 mg białka komórkowego w 500 µL, wykorzystując sonikację lub praskę francus

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ilościowa proteomika z wykorzystaniem redukcyjnej dimetylowaniu dla stabilnego znacznikowania izotopowego

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

Poznaj metodę ilościowej proteomiki wykorzystującą redukcyjną dimetylację do znakowania stabilnych izotopów w badaniach białek. Technika ta umożliwia szybką, ekonomiczną i precyzyjną analizę złożonych mieszanin białkowych.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Przeglądaj więcej filmów