Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie stężeń wielu białek pomiędzy próbkami za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem gotowych rozwiązań proteomicznych. Celem tym osiąga się poprzez wstępne trawienie białka z każdej próbki w celu otrzymania mieszanin peptydowych. Następnie dwie próbki są mieszane, a peptydy w zmieszanej próbce poddawane są frakcjonowaniu i odsalaniu.

Następnie zmieszaną próbkę analizuje się za pomocą spektrometrii mas. W końcowej fazie peptydy są identyfikowane poprzez porównanie widm MS2 z bazą danych typu target-decoy wszystkich potencjalnych peptydów w próbkach, a następnie kwantyfikuje się względną obfitość peptydów pomiędzy próbkami. W rezultacie proteomika pozwala na kwantyfikację względnej obfitości wielu białek w złożonych próbkach.

Główną zaletą redukcyjnej demetylacji w porównaniu z innymi metodami znakowania izotopami stabilnymi, takimi jak iLite, jest to, że jest ona szybką, niedrogą i dokładną metodą, która nie wymaga specyficznych cech ani syntetycznego medium, co oznacza, że można ją zastosować do niemal każdego rodzaju próbki. Aby rozpocząć, należy przygotować 1 mg białka komórkowego w 500 µL, wykorzystując sonikację lub praskę francuską do lizy komórek w celu wytrącenia białek. Do czterech objętości białka należy dodać jedną objętość kwasu trójchlorowego i schładzać w lodzie przez 10 minut.

Wirować przy 12 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usunąć nadsącz. Następnie użyć jednego mililitra lodowatego acetonu, aby resuspenderować osad przed ponownym wirowaniem.

Po odessaniu nadsączu, wysuszyć osad w bloku grzewczym o temperaturze 56°C, aby zdenaturować białka i zredukować mostki dwusiarczkowe barwnika. Do ponownego zawieszenia użyć 500 µL buforu denaturującego i redukującego. Resuspendować białka do stężenia około 2 mg/mL.

Inkubować białka przez 30 minut w temperaturze 56 °C, a następnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, w celu alkilacji wolnych grup sulfhydrylowych, dodać 25 µL świeżo przygotowanego 0,3 M IDO acetamidu w wodzie do 500 µL białka i inkubować w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przerwać reakcję, dodając 10 µL 3 mM DTT.

Przechowywać alkilowane białka w temperaturze -80 °C. Aby przeprowadzić trawienie alkilowanych białek po wytrącaniu TCA, użyć 1 M mocznika w 50 mM HEIS o pH 8,2 do resuspensji białka. Przygotować roztwór zapasowy Lys-C, endoproteinazy lub ly C w wodzie o stężeniu 2 µg/µL i dodać enzym do trawionego białka, aby uzyskać stężenie końcowe 10 ng/µL. Próbki pozostawić w temperaturze pokojowej przez sześć godzin lub przez noc. Zawiesić 20 µg trypsyny klasy sekwencyjnej w 40 µL 50 mM kwasu octowego i dodać 5 µL do reakcji trawienia lyce.

Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37°C, aby zaalkilować białka. Dodać kwas trifluorooctowy (TFA) do stężenia końcowego 0,5%. Zamocować kolumnę C18 do manifoldu ekstrakcyjnego. Następnie użyć 6 mL acetonitrylu (ACN), aby zwilżyć kolumnę.

Następnie, przy najwyższym możliwym przepływie, należy użyć sześciu mililitrów 80%a CN 0.1%TFA do przemycia kolumny, a następnie sześciu mililitrów 0.1%TFA do wyrównania kolumny; należy zatrzymać podciśnienie i nałożyć 500 mikrogramów peptydów na kolumnę przy przepływie około jednego mililitra na minutę. Po związaniu peptydów z kolumną należy ponownie uruchomić podciśnienie i przy najwyższym możliwym przepływie użyć 0.1%TFA, a następnie trzech mililitrów buforu z kwasem cytrynowym, aby przemyć kolumnę w celu przeprowadzenia onco, redukcyjnej dimetylacji lub znakowania ready. W komorze z wyciągiem należy przygotować po 12 mililitrów lekkiego i ciężkiego buforu ready do metylacji wolnych peptydów.

Należy dodać 10 mililitrów lekkiego lub ciężkiego gotowego buforu do kolumny przy szybkości przepływu 1 mililitr na minutę. Po podaniu drugiej porcji 10 mililitrów, w celu zapewnienia znakowania, należy użyć 6 mililitrów 0,1% TFA, a następnie 1 mililitr 0,5% kwasu octowego.

Aby wypłukać kolumnę w celu elucji białek, należy wyłączyć próżnię i aplikować 1 mL 40% aCN z 0,5% kwasem octowym przy szybkości przepływu 0,5 mL/min. Następnie należy dodać 1 mL 80% aCN z 0,5% kwasem octowym i, jeśli jest to pożądane, przeprowadzić elucję za pomocą strzykawki o objętości 5 mL. Próbki peptydów znakowanych ciężkimi i lekkimi izotopami należy zmieszać w stosunku 1:1, a następnie poddać analizie spektrometrią masową, aby upewnić się, że znakowanie ciężkie i lekkie było skuteczne. Mieszaninę peptydów należy poddać frakcjonowaniu, aplikując ją najpierw na kolumnę HPLC C 18.

Następnie, po przemyciu kolumny 5%a CN przez pięć minut, zastosuj gradient od 5 do 35%a CN w ciągu 60 minut, aby eluować peptydy w równych frakcjach do płytki 96-dołkowej, a następnie 90%A CN przez jedną minutę. Po dodatkowych czterech minutach przepływu 90%A CN, użyj 5%a CN, aby ponownie wyrównać stan kolumny.

Następnie połącz frakcje w następujący sposób za pomocą wirówki próżniowej. Usuń rozpuszczalnik z połączonych frakcji. Następnie użyj 130 µL jeden M urea 0,5%TFA do resuspensji.

Zawiesić peptydy z następujących frakcji, a następnie przechowywać zestaw frakcji w temperaturze -20°C, aby przeprowadzić ekstrakcję typu „stop and go” na resuspenderowanych frakcjach. Przygotować mikrokolumny typu stage tip C18 z końcówek pipet o pojemności 200 µL, wykorzystując dwa dyski C18 o średnicy wewnętrznej 1,07 mm do ich wypełnienia. Umieścić stage tipy w probówkach do mikrocentryfugi, dodać 130 µL metanolu i odwirować.

Następnie dodaj 130 µL 80% CN 0,5% kwasu octowego przed ponownym wirowaniem; po uprzednim wyrównaniu końcówek przy użyciu 130 µL 0,1% TFA, przenieś mieszaninę peptydów na końcówki i przemyj je. Najpierw 130 µL 0,1% TFA, a następnie 40 µL 0,1% TFA. Na koniec użyj 40 µL 0,5% kwasu octowego w celu elucji peptydów.

W pierwszej kolejności należy dodać 20 µL 40% do CN 0,5% kwasu octowego. Następnie dodaje się 20 µL 80% do CN 0,5% kwasu octowego. Połączyć IIT i poddać filtracji próżniowej w celu osuszenia, aby przeprowadzić mikrokapilarną chromatografię cieczową.

Tandemową spektrometrię mas lub L-C-M-S-M-S rozpoczyna się od użycia 5% kwasu mrówkowego i 5% ACN w celu resuspensji białek do stężenia około 1 µg/µL. Około 1 µg peptydów nanosi się na kolumnę HPLC C18 do odwróconej fazy o wymiarach 100 µm na 20 cm, a następnie eluje przy użyciu gradientu ACN od 6% do 22% w 0,1% kwasie mrówkowym przy szybkości przepływu około 300 nL/min, w czasie od 75 do 100 minut.

Należy użyć spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości i wysokiej dokładności masy, a następnie zidentyfikować peptydy w próbce poprzez porównanie surowych plików widm MS/MS z bazą teoretyczną za pomocą algorytmu takiego jak SEquest, stosując parametry przedstawione tutaj z bazą otwartych ramek odczytu w orientacji bezpośredniej i odwrotnej. Peptydy należy odfiltrować do poziomu 1% wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) przy użyciu metody takiej jak target-decoy. Aby skwantyfikować zidentyfikowane peptydy, należy obliczyć powierzchnie ciężkich i lekkich par ekstrakcyjnych chromatogramów jonowych MS1 oraz stosunki sygnału do szumu dla peptydów; pary peptydów należy uwzględnić tylko wtedy, gdy ich średni stosunek sygnału do szumu przekracza pięć. Względną obfitość peptydu w dwóch próbkach należy określić jako stosunek powierzchni piku MS1 ciężkiej i lekkiej wersji tego samego peptydu. Względną obfitość białek oblicza się jako medianę stosunków powierzchni pików MS1 dla wszystkich peptydów w białku po odfiltrowaniu ich do 1% wskaźnika fałszywych odkryć dla peptydów.

Wydajność znakowania mieszaniny fermentu c phyto z kultur znakowanych ciężko i lekko, zawierającej 11 194 unikalnych sekwencji peptydowych, wyniosła 98%. W podobny sposób przeanalizowano niefrakcjonowany lizat białek visier. Różnice w ekspresji białek w sposób powtarzalny odzwierciedlały stosunki, w jakich mieszano próbki ciężkie i lekkie, w szerokim zakresie proporcji mieszania. Konkretnie, zmiana poziomu 99% białek była mniejsza niż 1,6 dla próbek zmieszanych w stosunku jeden do jednego, w próbkach zmieszanych w stosunku jeden do 10 oraz 10 do jednego.

99% białek mieściło się w zakresie 3,8-krotności oczekiwanego stosunku, co wskazuje na wzrost odchylenia standardowego wraz ze zwiększaniem odległości od mieszaniny w stosunku jeden do jednego. Po zastosowaniu znakowania ready do proteomu Clostridium phyto ferment ilościowo określono ponad 2000 białek, przy czym 94% białek zmierzono w zakresie dwukrotności dla kultur powtórznych hodowanych na podłożu z glukozą. Zmiany dla par powtórzonych kultur były również silnie skorelowane.

Wspólnie eksperymenty te potwierdzają, że proteomika Ready jest dokładną i powtarzalną metodą ilościowego określania różnic w ekspresji białek pomiędzy złożonymi próbkami. Ponieważ technikę tę można zastosować praktycznie do każdego rodzaju próbki, utorowała ona drogę badaczom w dziedzinie proteomiki do badania zmian w ekspresji białek we wszystkich rodzajach próbek, w tym w nowych drobnoustrojach, rybach i komórkach ssaków.