Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Dokładne pomiary ilościowe białek mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznej i przestrzennej współpracy między białkami w celu zrozumienia choroby z powrotem do biologii. Ogólnym celem tego eksperymentu jest zapewnienie zintegrowanego ilościowego przepływu pracy proteomiki dla próbek tkanek, łączącego profilowanie białek bez znaczników i oparte na znacznikach w celu odkrycia biomarkerów. W tym badaniu wykorzystaliśmy instrument Orbitrap Fusion do ilościowego oznaczania białek przy użyciu metod opartych na znacznikach i bez znaczników.

Liza tkanek jest jednym z najważniejszych etapów powodzenia eksperymentu LC-MS-MS. Weź 30 mg tkanki do rurki do ubijania koralików. Po przemyciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy mocznika zawierającego osiem molowych moczników, Tris, NaCl i MgCl2.

Za pomocą sonitora sonicznego sondy zneutralizować zawartość tkanki. Powtórz to dla kolejnego cyklu. Jeśli zauważysz jakąkolwiek nienaruszoną tkankę na dnie probówki, dodaj kulki cyrkonu do probówki i homogenizuj tkankę za pomocą ubijaka do kulek przez 90 sekund, z pięciominutową inkubacją na lodzie.

Odwirować próbki o masie około 6000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić resztki komórek od supernatantu. Zebrać supernatant do świeżej probówki i równomiernie wymieszać roztwór. Określić ilościowo stężenie białka w lizacie tkankowym za pomocą odczynnika Bradforda.

W tym celu zmierz średnicę zewnętrzną próbki przy 595 nanometrach i ekstrapoluj ją za pomocą standardowego wykresu, jak pokazano na tym ekranie. Po ilościowym określeniu białka uruchom 10 mikrogramów lizatu tkankowego na żelu 12% SDS-PAGE, aby sprawdzić jakość lizatów. Pierwszym krokiem w mineralizacji w roztworze jest redukcja wiązań dwusiarczkowych przy użyciu TCEP.

Po dodaniu TCEP inkubować zawartość probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kolejnym krokiem jest alkilowanie, aby zapobiec ponownemu tworzeniu się zredukowanych wiązań dwusiarczkowych. Dodaj środek alkilujący, taki jak jodoacetamid, i inkubuj probówkę w ciemności przez 10 minut.

Po inkubacji obniżyć końcowe stężenie mocznika do mniej niż jednego mola, rozcieńczając czterema do ośmiu objętości buforu rozcieńczającego. W tym momencie wskazane jest sprawdzenie pH. Następnym krokiem jest dodanie trypsyny do probówki i inkubacja rurki przez noc w celu efektywnego trawienia.

Następnego dnia wysusz strawione peptydy w koncentratorze próżniowym i przejdź do etapu odsalania. Aby przeprowadzić odsalanie peptydów, użyj końcówek stage C18. Aktywuj końcówkę C18 stage, dodając 50 mikrolitrów metanolu, odwiruj końcówkę przy 1000 G przez dwie minuty.

Teraz dodaj 50 mikrolitrów acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym, aby umyć końcówkę etapu i ponownie odwiruj końcówkę. Wysuszone strawione peptydy należy rozpuścić w 50 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Dodaj rozpuszczone peptydy do aktywowanej końcówki etapu.

Powtórz ten krok co najmniej cztery razy. Aby umyć próbkę, dodaj 50 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego i powtórz etap wirowania. Do elucji peptydów dodaj 50 mikrolitrów 40% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i przepuść przez końcówkę etapu przez odwirowanie.

Powtórz ten krok z 50% i 60% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i zbierz filtrat do świeżej probówki. Wysuszyć odsolone peptydy za pomocą koncentratora próżniowego. Przed uruchomieniem LC-MS-MS należy określić ilościowo peptydy za pomocą metody Scopes.

W tym celu załaduj dwa mikrolitry odtworzonej próbki do dołka płytki z mikrokroplami i zmierz absorbancję przy 205 nanometrach i 280 nanometrach. Oblicz stężenie ze wzoru opisanego na tym slajdzie. Po wysuszeniu odsolone peptydy są gotowe do oznaczania ilościowego na podstawie etykiety.

W przypadku etykietowania iTRAQ wysuszone peptydy należy rozpuścić w 20 mikrolitrach buforu do rozpuszczania, znajdującego się w zestawie do etykietowania iTROAK. Rozpuść etykiety, dodając etanol z fiolki dołączonej do zestawu i dokładnie wymieszaj. Wskazane jest, aby wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodaj jednorodnie wymieszane etykiety iTRAQ do odpowiednich probówek i pozwól, aby zaszła reakcja etykietowania. Pod koniec reakcji zgasić nadmiar niezwiązanej etykiety w probówce, dodając wodę klasy MS i inkubować przez pół godziny do jednej godziny. Teraz przenieś całą oznaczoną zawartość do jednej probówki i wysusz oznaczone peptydy.

Po rozpuszczeniu próbek w 0,1% kwasie mrówkowym otwórz automatyczny podajnik próbek NanoLC i umieść próbki w autosamplerze. Po umieszczeniu próbek w automatycznym podajniku próbek ważne jest ustawienie odpowiednich parametrów chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. W tym miejscu opisano parametry zarówno dla oceny ilościowej bez etykiety, jak i dla oznaczania ilościowego opartego na iTRAQ za pomocą LC-MS.

W przypadku oznaczania ilościowego bez znakowania stosuje się 120-minutowy gradient, w którym wstrzykiwana jest pojedyncza niefrakcjonowana próbka. Czas ten można wydłużyć lub skrócić w zależności od złożoności próbki. W tym eksperymencie ustalono przepływ 300 nanolitrów na minutę z następującym gradientem dla roztworu B, który w tym przypadku składa się z 80% acetonitrylu w 1% kwasie mrówkowym.

W ten sam sposób możemy ustawić gradient dla eksperymentu iTRAQ. Ponieważ próbki są niefrakcjonowane, zastosowano gradient 90-minutowy. Parametry MS zarówno dla kwantyfikacji bezetykietowej, jak i dla kwantyfikacji opartej na etykietach iTRAQ można zobaczyć tutaj.

Pierwszym krokiem jest ustawienie trybu aplikacji poprzez kliknięcie w parametry globalne. Wybierz tryb peptydowy i ustaw czas trwania metody zgodnie z używanym gradientem LC. Zdefiniuj parametry skanowania dla eksperymentu.

Po kliknięciu opcji MS-OT parametry stają się widoczne. Używany typ detektora jest ustawiony na Orbitrap. Inną opcją dostępną w tym instrumencie jest pułapka jonowa.

Rozdzielczość została ustawiona na 60 000 i można wybierać spośród różnych dostępnych opcji, w zależności od potrzeb i rodzaju eksperymentu. Zakres masy jest normalny, a zakres skanowania jest ustawiony od 375 do 1700. Pozostałe parametry są domyślne dla aplikacji MS.

Próg intensywności został ustawiony, a stan naładowania ustawiony w zakresie od dwóch do sześciu. Wykluczenie dynamiczne zostało ustawione na 40 sekund, a tolerancja masy została utrzymana na poziomie 10. Następny zestaw parametrów zawiera parametry MS-MS.

Tryb izolacji został wybrany za pomocą kwadrupola, okno izolacji ustawione na dwa, przesunięcie izolacji zostało ustawione na wyłączone, a typ aktywacji to zwykle HCD dla eksperymentu proteomicznego. Energia zderzenia może być albo stała, albo może być wspomagana. Znakowane próbki wymagają wyższych energii zderzeń, stąd w przypadku eksperymentów iTRAQ zaleca się, aby energia zderzenia była ustawiona na 35, podczas gdy w przypadku eksperymentów LFQ można ją ustawić na 30.

Używany tutaj typ detektora to Orbitrap. Tryb zakresu skanowania będzie automatyczny. Pozostałe parametry są domyślne dla eksperymentów iTRAQ i eksperymentu ilościowego bez etykiet.

Kliknięcie podsumowania spowoduje wyświetlenie przeglądu wszystkich parametrów LC i MS używanych w eksperymencie. Możesz przyjrzeć się każdemu parametrowi i dokonać korekty. Gdy to zrobisz, kliknij plik i zapisz go jako plik metody.

Po zapisaniu możesz uruchomić metodę, a otrzymasz surowe pliki. A następnie te surowe pliki można analizować za pomocą oprogramowania Proteome Discoverer. Rysunek ten przedstawia pokrycie sekwencji BSA w trzech kontrpróbach technicznych, które wynosi 91% w trzech powtórzeniach.

Wskazuje to na odtwarzalność urządzenia. Rysunek ten pokazuje jednorodność liczby dopasowań spektralnych peptydów, peptydów i białek zidentyfikowanych w trzech różnych próbkach biologicznych, co ponownie daje wyobrażenie o odtwarzalności instrumentu. W tym przypadku diagram Venna przedstawia wspólne i ekskluzywne białka zidentyfikowane w trzech różnych próbkach w eksperymencie bez znaczników i eksperymencie opartym na znacznikach.

Te wykresy słupkowe pokazują liczbę dopasowań widmowych peptydów, grup peptydowych, całkowitych białek, grup białkowych i liczby białek po 1% FDR, zidentyfikowanych w eksperymencie LFQ i iTRAQ. Proteomika tkanek próbek biologicznych umożliwia nam badanie nowych potencjalnych biomarkerów związanych z różnymi etapami postępu choroby. Opisany protokół ilościowej analizy proteomicznej tkanek zapewnia powtarzalne dane o dobrym pokryciu.

Stosowanie powtórzeń technicznych zapewnia dobrą odtwarzalność, nawet jeśli próbki są badane w różnych punktach czasowych. Tutaj pokazaliśmy analizę próbek tkanek przy użyciu dwóch metod kwantyfikacji: proteomiki bezznacznikowej i proteomiki opartej na znacznikach. Wybór ilościowych technik proteomicznych może zależeć od liczby próbek, dostępności platform MS i kwestii biologicznej, którą należy się zająć.