Name: Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Poznaj zintegrowany przepływ pracy proteomiki ilościowej próbek tkanek łączący metody znakowane i bezoznakowe przy użyciu spektrometrii mas Orbitrap Fusion. To podejście usprawnia odkrywanie biomarkerów i analizę dynamiki białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy projektowi MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projektowi #34_IITB do SS i MASSFIITB Facility w IIT Bombay wspieranym przez Departament Biotechnologii (BT/PR13114/INF/22/206/2015) do przeprowadzenia wszystkich eksperymentów związanych z MS.

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez instytucjonalne komisje rewizyjne oraz komisję etyki Indyjskiego Instytutu Technologii w Bombaju (IITB-IEC/2016/026). Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w tym badaniu.
1. Przygotowanie lizatu tkankowego
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki na lodzie, aby proteazy były nieaktywne. Upewnij się, że skalpele i wszelkie używane probówki są sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
<ol>
	<li>Weź ~ 30 mg tkanki do probówki do ubijania kulek, dodaj 200 μL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zwiruj ją. 
	UWAGA: W tym badaniu do przygotowania lizatu pobrano świeżo mrożone tkanki guza mózgu ludzkiego. Protokół może być stosowany do każdej świeżo zamrożonej tkanki z pewnymi zmianami w zależności od rodzaju tkanek (tkanki miękkie lub twarde) i złożoności komórkowej tkanek.</li>
	<li>Następnie obróć probówkę, aby osadzić tkankę i ostrożnie usuń PBS za pomocą pipety. Wykonaj kolejne płukanie PBS, jeśli w tkance nadal pozostały ślady krwi.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu do lizy mocznika (8 M mocznika, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) i koktajl inhibitorów proteazy () zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Objętość buforu do lizy powinna być wystarczająca do zmielenia tkanki podczas procesu sonikacji i zawieszenia tego, co jest ekstrahowane. Zbyt mała ilość buforu do lizy może skutkować nieefektywną lizą tkanek, natomiast zbyt duża ilość buforu do lizy spowoduje rozcieńczenie lizatu białkowego.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie i poddaj sonifikację tkanki o amplitudzie 40% przez 2,5 minuty z cyklami pulsacyjnymi 5 s (odpowiednio ON/OFF).</li>
	<li>Dodaj kulki cyrkonu do probówek i homogenizuj tkankę za pomocą ubijaka do kulek przez 90 s z 5-minutową inkubacją na lodzie. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Gdy tkanka jest odpowiednio homogenizowana, inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować próbkę o sile 6,018 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia resztek komórek od supernatantu.</li>
	<li>Zebrać supernatant do świeżo oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C w postaci podwielokrotności do dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja białek i kontrola jakości lizatów tkankowych
<ol>
	<li>Określić ilościowo stężenie białka w lizacie tkankowym za pomocą odczynnika Bradforda, jak opisano w pliku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Po ilościowym określeniu białka uruchom 10 μg lizatu tkankowego na 12% żelu SDS-PAGE, aby sprawdzić jakość lizatu. 
	UWAGA: Dalsze przetwarzanie musi być przeprowadzane wyłącznie w odniesieniu do lizatów, które przeszły kontrole jakości.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne białek
UWAGA: Kroki trawienia enzymatycznego są pokazane w Rysunek 1a.
<ol>
	<li>Do trawienia weź 50 μg białek i dodaj ddH2O, aby uzupełnić objętość do 20 μl.</li>
	<li>Teraz przygotować 20 mM Tris (2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) z podstawowego (0,5 M TCEP), dodając 0,8 μl z wywaru do lizatu białkowego w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych w białkach i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Przygotować 40 mM jodoacetamidu (IAA) w ddH2O i dodać 1,6 μl w celu alkilowania zredukowanych reszt cysteiny. Inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać bufor rozcieńczający zawierający 25 mM Tris pH 8,0 i 1 mM CaCl2 w stosunku 1:8, aby rozcieńczyć stężenie mocznika w próbce do mniej niż 1 M. W tym momencie sprawdź pH. 
	UWAGA: Jeśli używasz trypsyny jako enzymu trawiącego, upewnij się, że stężenie mocznika jest mniejsze niż 1 M.</li>
	<li>Aby przeprowadzić trawienie, dodaj trypsynę w stosunku enzym/substrat 1:50. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C w suchej łaźni wstrząsającej przez 16 godzin w celu nocnego trawienia. 
	UWAGA: Enzym trypsyna jest wysoce reaktywną proteazą, która jest podatna na samotrawienie. Zachowaj szczególną ostrożność i szybko dodaj trypsynę nad lodem.</li>
	<li>Po 16 godzinach inkubacji wysuszyć strawione peptydy w koncentratorze próżniowym.</li>
</ol>
4. Odsalanie strawionych peptydów
UWAGA: Aby przeprowadzić odsalanie peptydów, użyj końcówek etapu C18.
<ol>
	<li>Aktywuj końcówkę stopnia C18, dodając 50 μl metanolu. Odwirować końcówkę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat zebrany na dnie probówki. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Dodaj 50 μl acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym, aby przepłukać końcówkę sceny. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat zebrany na dnie probówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,1% (v/v) FA, aby zrównoważyć kolumnę. Ponownie przeprowadzić wirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Rozpuść wysuszone strawione peptydy w 50 μl 0,1% kwasu mrówkowego. 
	UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz końcówek stage podczas przechodzenia przez próbkę. Końcówki etapów nie powinny być całkowicie wysuszone na etapie wirowania, ponieważ suszenie może prowadzić do utraty peptydów.</li>
	<li>Dodać rozpuszczone peptydy do aktywowanej końcówki stopnia i przepuścić próbkę przez końcówkę stopnia przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok co najmniej cztery razy. Przechowywać przepływ w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby przepłukać próbkę, dodać 50 μl 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego. Powtórzyć etap wirowania i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>W celu elucji peptydów dodać 50 μl 40% (v/v) ACN w 0,1% kwasie mrówkowym (v/v) i przepuścić przez końcówkę etapu przez odwirowanie. Zebrać filtrat do świeżej probówki. Powtórz ten krok z 50% i 60% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i zbierz filtrat w tej samej świeżej probówce.</li>
	<li>Wysuszyć odsolone peptydy zebrane w świeżej probówce za pomocą koncentratora próżniowego. 
	UWAGA: Wysuszone odsolone peptydy są gotowe do wstrzyknięcia lub można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. W przypadku długotrwałego przechowywania (>6 miesięcy) peptydy należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja odsolonych peptydów
<ol>
	<li>Wysuszone odsolone peptydy rozpuścić w 0,1% FA.</li>
	<li>Przetrzyj fotometryczną płytkę pomiarową niestrzępiącą się chusteczką przy użyciu 70% etanolu.</li>
	<li>Użyj 2 μl 0,1% FA, aby ustawić ślepą próbę.</li>
	<li>Dodać 2 μl przygotowanych próbek na płytkę w kontrpróbach.</li>
	<li>Umieścić płytkę w spektrofotometrze i zmierzyć absorbancję przy 205 nm i 280 nm.</li>
	<li>Oblicz absorpcję molową (ε) za pomocą następującego wzoru: 
	ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205] 
	UWAGA: Absorpcja molowa (ε) jest miarą prawdopodobieństwa przejścia elektronowego lub tego, jak dobrze gatunek absorbuje określoną długość fali promieniowania, które na niego pada. Wartość ε powinna mieścić się w zakresie od 31 ml mg-1 cm-1 do 33 ml mg-1 cm-1. Jeśli wartość nie mieści się w zakresie, oznacza to, że próbki nie są prawidłowo trawione.</li>
	<li>Obliczyć stężenie peptydu w μg/μl, korzystając z następującego wzoru: 
	Stężenie peptydu = Netto OD (205) / 0,051 * ε</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja bez znaczników (LFQ) strawionych peptydów
UWAGA: Do oznaczania ilościowego bez etykiet, użyj parametrów LC i MS wymienionych w Pliku uzupełniającym 2. Dane o dużym zasięgu uzyskano, gdy w spektrometrze mas przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne tego samego typu próbki.
<ol>
	<li>Konfiguracja chromatografii cieczowej
	<ol>
		<li>Po ilościowym określeniu odsolonych peptydów pobrać 2 μg peptydów do fiolki i uzupełnić objętość do 10 μl przy użyciu 0,1% FA. Stężenie odsolonych peptydów wyniesie 200 ng/μL.</li>
		<li>Otworzyć automatyczny próbnik systemu chromatografii cieczowej (patrz Tabela materiałów) i umieścić fiolkę w autosamplerze.</li>
		<li>Użyj 0.1% (v/v) FA, aby zrównoważyć kolumnę wstępną i kolumnę analityczną.</li>
		<li>Pobrać 1 μg odsolonego, strawionego peptydu z fiolki i załadować go do kolumny.</li>
		<li>Ustaw gradient LC zgodnie ze złożonością próbki. W tym eksperymencie gradient LC stosowano przez 120 minut do ilościowego oznaczania próbek tkanek bez znaczników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja MS: Przed optymalizacją jakichkolwiek testów proteomicznych należy przeprowadzić kontrolę jakości instrumentu, monitorując niektóre peptydy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przy użyciu dowolnego oprogramowania pod kątem przydatności systemu i analizując pokrycie BSA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A,B). Parametry akwizycji zostały ustawione w przyrządzie za pomocą oprogramowania do akwizycji danych MS (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie, kliknij dwukrotnie Konfiguracja instrumentu i wybierz szablon z peptides-ID z domyślnymi parametrami.</li>
		<li>Ustaw parametry MS za pomocą pliku uzupełniającego 2 i zapisz go jako nową metodę.</li>
		<li>Teraz otwórz oprogramowanie, aby wypełnić szczegóły próbki; kliknij dwukrotnie Ustawienia sekwencji i wprowadź szczegóły, takie jak typ próbki, nazwa próbki, lokalizacja zapisu pliku, plik metody instrumentu, objętość wstrzyknięcia i pozycja próbki.</li>
		<li>Po wypełnieniu wszystkich informacji wybierz wiersz i rozpocznij uruchamianie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja oparta na znacznikach (iTRAQ) strawionych peptydów
UWAGA: Kwantyfikacja na podstawie etykiet może być przeprowadzona przy użyciu różnych etykiet izobarycznych, takich jak odczynniki iTRAQ lub TMT, itp. W tym przypadku iTRAQ 4-plex został użyty do znakowania strawionych peptydów z trzech próbek tkanek. Procedura etykietowania iTRAQ 4-plex jest opisana poniżej.
<ol>
	<li>Znakowanie strawionych peptydów za pomocą odczynników iTRAQ. 
	UWAGA: W tym eksperymencie użyto peptydów z trzech próbek tkanek. Z każdej próbki tkanki pobiera się 80 μg strawionych peptydów do czterech probówek w celu oznakowania odczynnikami iTRAQ (114, 115, 116 i 117) (szczegółowe parametry doświadczalne znajdują się w pliku uzupełniającym 3).
	<ol>
		<li>Przed użyciem odczynnika iTRAQ należy doprowadzić każdą fiolkę odczynnika do temperatury pokojowej (około 5 min). Obracać przez około 30 sekund, aby roztwór znalazł się na dnie każdej fiolki. 
		UWAGA: Upewnij się, że w każdej fiolce powinno znajdować się 10-15 μl roztworu.</li>
		<li>W przypadku znakowania iTRAQ należy rozpuścić wysuszone peptydy w 20 μl buforu do rozpuszczania znajdującego się w zestawie do etykietowania iTRAQ.</li>
		<li>Rozpuść etykiety, dodając 70 μl etanolu z fiolki dołączonej do zestawu, mieszaj roztwór przez 30 s i wiruj przez 10 s. 
		UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Dodać jednorodnie wymieszane etykiety iTRAQ (114, 115, 116 i 117) do odpowiednich probówek zawierających próbki peptydów i pozwolić na przeprowadzenie reakcji znakowania.</li>
		<li>Wymieszaj składniki każdej probówki, wirując probówkę przez 30 s, a następnie obracaj probówkę przez 10 sekund, aby sprowadzić mieszaninę z powrotem na dno probówki. 
		UWAGA: Sprawdź pH roztworu za pomocą bibuły pH. pH powinno być większe niż 8; jeśli nie, dodać do 10 μl buforu do rozpuszczania, aby dostosować pH.</li>
		<li>Inkubować każdą probówkę w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Pod koniec reakcji zgasić nadmiar niezwiązanej etykiety w probówce, dodając wodę klasy MS.</li>
		<li>Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji przenieś całą oznakowaną zawartość do jednej probówki i wysusz znakowane peptydy w koncentratorze próżniowym. 
		UWAGA: Podobną procedurę etykietowania można zastosować w przypadku etykietowania TMT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja chromatografii cieczowej
	<ol>
		<li>Rozpuść próbki w 0,1% kwasie mrówkowym, otwórz automatyczny podajnik próbek nano LC i umieść próbki w autosamplerze. Użyj parametrów wymienionych w Pliku uzupełniającym 2 do konfiguracji LC.</li>
		<li>Ustaw gradient LC zgodnie ze złożonością próbki. W tym eksperymencie zastosowano gradient LC wynoszący 180 minut do ilościowego oznaczania próbek tkanek na podstawie znaczników (iTRAQ). 
		UWAGA: W przypadku mniej złożonych próbek, krótki gradient może skutecznie oddzielić większość peptydów. Jeśli jednak próbka jest bardzo złożona, użyj dłuższego gradientu, aby lepiej oddzielić peptydy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja MS dla techniki iTRAQ
	<ol>
		<li>Ustaw wszystkie parametry MS dla oceny ilościowej opartej na etykiecie w taki sam sposób, jak w przypadku oznaczania ilościowego bez etykiety, z wyjątkiem energii zderzenia, która została ustawiona na 35% dla fragmentacji MS/MS w kwantyfikacji opartej na etykiecie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeanalizować surowe (widmo MS/MS) pliki uzyskane ze spektrometru mas LC za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Baza danych Human Reference Proteome firmy Uniprot (UP000005640) zawierająca 71 785 sekwencji białek została wykorzystana do uzyskania tożsamości białek za pomocą wyszukiwarek Sequest HT i Mascot (v2.6.0). Parametry dla oceny ilościowej bez etykiety i oceny ilościowej opartej na etykietach są opisane w pliku uzupełniającym 4.</li>
</ol>

<ol><li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li>
<li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics%3A+a+new+window+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li>
<li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13(2017).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum%3A+advances+and+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li>
<li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li>
<li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557(2016).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li>
<li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140(2014).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+Technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
<li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+%28CPTAC%29+common+data+analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Proteomika tkanek próbek biologicznych umożliwia nam badanie nowych potencjalnych biomarkerów związanych z różnymi etapami postępu choroby. Wyjaśnia również mechanizm sygnalizacji i szlaki związane z postępem choroby. Opisany protokół ilościowej analizy proteomicznej tkanek zapewnia powtarzalne dane o dobrym pokryciu. Większość kroków została zaadaptowana z instrukcji producenta. W celu uzyskania wysokiej jakości danych najważniejsze są następujące kroki. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania ...

Technologie proteomiczne mają potencjał, aby umożliwić identyfikację i kwantyfikację potencjalnych markerów, które mogą pomóc w wykrywaniu i prognozowaniu choroby1. Ostatnie postępy w dziedzinie spektrometrii mas przyspieszyły badania kliniczne na poziomie białek. Naukowcy starają się sprostać wyzwaniu, jakim jest skomplikowana patobiologia kilku chorób, wykorzystując proteomikę opartą na spektrometrii mas, która obecnie oferuje zwiększoną czułość identyfikacji i kwantyfikacji białek2. Dokładny pomiar ilościowy białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznej i przestrzennej współpracy między białkami u osób zdrowych i chorych3; Jednak taka analiza w skali całego proteomu nie jest łatwa.
Jednym z głównych ograniczeń profilowania proteomicznego próbek klinicznych jest złożoność próbek biologicznych. W celu zbadania proteomu choroby przebadano wiele różnych typów próbek, takich jak linie komórkowe, osocze i tkanki4,5. Linie komórkowe są szeroko stosowane jako modele w eksperymentach in vitro w celu naśladowania różnych etapów postępu choroby. Jednak jednym z głównych ograniczeń linii komórkowych jest to, że łatwo nabywają one zmiany genotypowe i fenotypowe podczas procesu hodowli komórek6. Płyny ustrojowe, takie jak osocze, mogą być atrakcyjnym źródłem do odkrywania biomarkerów; Jednak ze względu na dużą ilość białek i dynamiczny zakres stężenia białek, proteomika osocza jest nieco bardziej wymagająca7. W tym przypadku peptydy pochodzące z najliczniejszych białek mogą tłumić te pochodzące z białek o niskiej obfitości, nawet jeśli stosunek masy do ładunku jest taki sam6. Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat nastąpił postęp w technologiach zubożenia i frakcjonowania, uzyskanie dobrego pokrycia nadal pozostaje głównym ograniczeniem proteomiki osocza8,9. Preferowane jest wykorzystanie tkanek do proteomicznych badań biologii choroby, ponieważ próbki tkanek znajdują się najbardziej bliżej miejsc choroby i oferują wysokie informacje fizjologiczne i patologiczne, aby zapewnić lepszy wgląd w biologię choroby10,11.
W tym manuskrypcie przedstawiliśmy uproszczony protokół dla ilościowej proteomiki próbek tkanek. Do przygotowania lizatu tkankowego użyliśmy buforu zawierającego 8 M mocznika, ponieważ bufor ten jest kompatybilny z badaniami opartymi na spektrometrii mas. Jednak obowiązkowe jest oczyszczenie peptydów w celu usunięcia soli przed wstrzyknięciem ich do spektrometru mas. Ważną kwestią, o której należy pamiętać, jest zmniejszenie stężenia mocznika do mniej niż 1 M przed dodaniem trypsyny do trawienia białek, ponieważ trypsyna wykazuje niską aktywność przy stężeniu 8 M mocznika. Wyjaśniliśmy dwa podejścia do ilościowej proteomiki globalnej: kwantyfikację opartą na znacznikach za pomocą iTRAQ (znaczniki izobaryczne do kwantyfikacji względnej i bezwzględnej) oraz kwantyfikację bez znaczników (LFQ). Proteomika ilościowa oparta na iTRAQ jest stosowana głównie do porównywania wielu próbek różniących się stanem biologicznym (np. próbki normalne kontra próbki chore lub poddane działaniu środka). Podejście to wykorzystuje odczynniki izobaryczne do oznaczania N-końcowych amin pierwszorzędowych peptydów12. Odczynniki iTRAQ zawierają jedną grupę reporterową N-metylopirazyny, grupę równoważącą i jedną grupę estrową N-hydroksysukcynimidu, która reaguje z N-końcowymi aminami pierwszorzędowymi peptydów13. Strawione peptydy z każdego stanu są znakowane określonym odczynnikiem iTRAQ. Po znakowaniu reakcja zostaje zatrzymana, a znakowane peptydy z różnych stanów są łączone w jednej probówce. Ta połączona mieszanina próbek jest analizowana za pomocą spektrometru mas w celu identyfikacji i kwantyfikacji. Po analizie MS/MS generowane są fragmenty jonów reporterowych o małych masach cząsteczkowych, a intensywność jonów reporterowych jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania białek.
Inne podejście, kwantyfikacja bez znaczników jest używana do określenia względnej liczby białek w złożonych próbkach bez znakowania peptydów stabilnymi izotopami.

<table><tbody><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fischer Sicific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy MS</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Merck</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (klasa MS)</td><td>Pierce</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000205</tr><tr><td>Mocznik</td><td>Merck</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 kolumna</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Stage</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>Kulki cyrkonowe/krzemionkowe</td><td>BioSpec Produkty</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ubijak do koralików (homogenizator)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek (spektrofotometr)</td><td>Termometr</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sonics Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td></td> masowy Thermo 88880028 <td></td> Orbitrap Fusion Thermo FSN 10452 <td></td></tr><tr><td>Nano LC</td><td>Thermo</td><td>EASY-nLC1200</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Proteome Discoverer <td></td></tr><tr><td></td><td>Thrermo</td><td>Odkrywca Proteomu 2.2.0.388</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Ostatnie postępy w spektrometrii mas zaowocowały głęboką analizą proteomiczną wraz z generowaniem solidnych i powtarzalnych zestawów danych. Jednak pomimo znacznego postępu technicznego, przygotowanie próbek z próbek biologicznych, takich jak krew pacjenta, płyn mózgowo-rdzeniowy i tkanki, nadal stanowi poważne wyzwanie. Proteomika tkankowa często stanowi atrakcyjne źródło próbek, które pozwalają przełożyć wyniki badań z laboratorium na praktykę kliniczną. Może ujawnić potencjalne potencjalne biomarkery do wczesnej diagnozy raka i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona itp. Proteomika tkankowa dostarcza również wielu informacji ogólnoustrojowych opartych na obfitości białek i pomaga odpowiedzieć na interesujące pytania biologiczne.
Ilościową analizę proteomiczną można podzielić na dwie szerokie kategorie: podejście oparte na etykietach i bezetykietowe. W podejściu opartym na znakowaniu białka lub peptydy są znakowane za pomocą stabilnych izotopów, takich jak SILAC (znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej) lub za pomocą znaczników chemicznych, takich jak ICAT (znaczniki powinowactwa kodowane izotopowo), TMT (znaczniki masy tandemowej) lub iTRAQ (znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej). Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że dokładniejsze oznaczanie ilościowe białek i przy użyciu etykiet izobarycznych można analizować wiele próbek w jednym eksperymencie. Podejście bezetykietowe stanowi opłacalną alternatywę dla podejść opartych na etykietach. Setki próbek pacjentów należących do określonej kohorty można analizować i porównywać z innymi kohortami na podstawie cech klinicznych. W tym miejscu opisaliśmy zoptymalizowany ilościowy przepływ pracy proteomiki dla próbek tkanek przy użyciu metod profilowania proteomu bez znaczników i opartych na znacznikach, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań w naukach przyrodniczych, zwłaszcza projektów opartych na odkrywaniu biomarkerów.

W badaniach proteomicznych typu discovery zastosowaliśmy dwa różne podejścia: proteomikę bez znakowania (label-free) oraz proteomikę z wykorzystaniem znakowania (label-based). Profil białkowy próbek tkanek w elektroforezie SDS-PAGE wykazał obecność nienaruszonych białek, co pozwoliło na przeprowadzenie analizy proteomicznej (Rysunek 2A). Monitorowano kontrolę jakości przyrządu poprzez oprogramowanie do badania przydatności systemu, które wykazało zmienność parametrów pracy urządzeni...

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Dokładne pomiary ilościowe białek mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznej i przestrzennej współpracy między białkami w celu zrozumienia choroby z powrotem do biologii. Ogólnym celem tego eksperymentu jest zapewnienie zintegrowanego ilościowego przepływu pracy proteomiki dla próbek tkanek, łączącego profilowanie białek bez znaczników i oparte na znacznikach w celu odkrycia biomarkerów. W tym badaniu wykorzystaliśmy instrument Orbitrap Fusion do ilościowego oznaczania białek przy użyciu metod opartych na znacznikach i bez znaczników.Liza tkanek jest jednym z najważniejszych etapów powodzenia eksperymentu LC-MS-MS. Weź 30 mg tkanki do rurki do ubijania koralików. Po przemyciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy mocznika zawierającego osiem molowych moczników, Tris, NaCl i MgCl2.Za pomocą sonitora sonicznego sondy zneutralizować zawartość tkanki. Powtórz to dla kolejnego cyklu. Jeśli zauważysz jakąkolwiek nienaruszoną tkankę na dnie probówki, dodaj kulki cyrkonu do probówki i homogenizuj tkankę za pomocą ubijaka do kulek przez 90 sekund, z pięciominutową inkubacją na lodzie.Odwirować próbki o masie około 6000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić resztki komórek od supernatantu. Zebrać supernatant do świeżej probówki i równomiernie wymieszać roztwór. Określić ilościowo stężenie białka w lizacie tkankowym za pomocą odczynnika Bradforda.W tym celu zmierz średnicę zewnętrzną próbki przy 595 nanometrach i ekstrapoluj ją za pomocą standardowego wykresu, jak pokazano na tym ekranie. Po ilościowym określeniu białka uruchom 10 mikrogramów lizatu tkankowego na żelu 12% SDS-PAGE, aby sprawdzić jakość lizatów. Pierwszym krokiem w mineralizacji w roztworze jest redukcja wiązań dwusiarczkowych przy użyciu TCEP.Po dodaniu TCEP inkubować zawartość probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kolejnym krokiem jest alkilowanie, aby zapobiec ponownemu tworzeniu się zredukowanych wiązań dwusiarczkowych. Dodaj środek alkilujący, taki jak jodoacetamid, i inkubuj probówkę w ciemności przez 10 minut.Po inkubacji obniżyć końcowe stężenie mocznika do mniej niż jednego mola, rozcieńczając czterema do ośmiu objętości buforu rozcieńczającego. W tym momencie wskazane jest sprawdzenie pH. Następnym krokiem jest dodanie trypsyny do probówki i inkubacja rurki przez noc w celu efektywnego trawienia.Następnego dnia wysusz strawione peptydy w koncentratorze próżniowym i przejdź do etapu odsalania. Aby przeprowadzić odsalanie peptydów, użyj końcówek stage C18. Aktywuj końcówkę C18 stage, dodając 50 mikrolitrów metanolu, odwiruj końcówkę przy 1000 G przez dwie minuty.Teraz dodaj 50 mikrolitrów acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym, aby umyć końcówkę etapu i ponownie odwiruj końcówkę. Wysuszone strawione peptydy należy rozpuścić w 50 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Dodaj rozpuszczone peptydy do aktywowanej końcówki etapu.Powtórz ten krok co najmniej cztery razy. Aby umyć próbkę, dodaj 50 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego i powtórz etap wirowania. Do elucji peptydów dodaj 50 mikrolitrów 40% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i przepuść przez końcówkę etapu przez odwirowanie.Powtórz ten krok z 50% i 60% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i zbierz filtrat do świeżej probówki. Wysuszyć odsolone peptydy za pomocą koncentratora próżniowego. Przed uruchomieniem LC-MS-MS należy określić ilościowo peptydy za pomocą metody Scopes.W tym celu załaduj dwa mikrolitry odtworzonej próbki do dołka płytki z mikrokroplami i zmierz absorbancję przy 205 nanometrach i 280 nanometrach. Oblicz stężenie ze wzoru opisanego na tym slajdzie. Po wysuszeniu odsolone peptydy są gotowe do oznaczania ilościowego na podstawie etykiety.W przypadku etykietowania iTRAQ wysuszone peptydy należy rozpuścić w 20 mikrolitrach buforu do rozpuszczania, znajdującego się w zestawie do etykietowania iTROAK. Rozpuść etykiety, dodając etanol z fiolki dołączonej do zestawu i dokładnie wymieszaj. Wskazane jest, aby wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie z instrukcjami producenta.Dodaj jednorodnie wymieszane etykiety iTRAQ do odpowiednich probówek i pozwól, aby zaszła reakcja etykietowania. Pod koniec reakcji zgasić nadmiar niezwiązanej etykiety w probówce, dodając wodę klasy MS i inkubować przez pół godziny do jednej godziny. Teraz przenieś całą oznaczoną zawartość do jednej probówki i wysusz oznaczone peptydy.Po rozpuszczeniu próbek w 0,1% kwasie mrówkowym otwórz automatyczny podajnik próbek NanoLC i umieść próbki w autosamplerze. Po umieszczeniu próbek w automatycznym podajniku próbek ważne jest ustawienie odpowiednich parametrów chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. W tym miejscu opisano parametry zarówno dla oceny ilościowej bez etykiety, jak i dla oznaczania ilościowego opartego na iTRAQ za pomocą LC-MS.W przypadku oznaczania ilościowego bez znakowania stosuje się 120-minutowy gradient, w którym wstrzykiwana jest pojedyncza niefrakcjonowana próbka. Czas ten można wydłużyć lub skrócić w zależności od złożoności próbki. W tym eksperymencie ustalono przepływ 300 nanolitrów na minutę z następującym gradientem dla roztworu B, który w tym przypadku składa się z 80% acetonitrylu w 1% kwasie mrówkowym.W ten sam sposób możemy ustawić gradient dla eksperymentu iTRAQ. Ponieważ próbki są niefrakcjonowane, zastosowano gradient 90-minutowy. Parametry MS zarówno dla kwantyfikacji bezetykietowej, jak i dla kwantyfikacji opartej na etykietach iTRAQ można zobaczyć tutaj.Pierwszym krokiem jest ustawienie trybu aplikacji poprzez kliknięcie w parametry globalne. Wybierz tryb peptydowy i ustaw czas trwania metody zgodnie z używanym gradientem LC. Zdefiniuj parametry skanowania dla eksperymentu.Po kliknięciu opcji MS-OT parametry stają się widoczne. Używany typ detektora jest ustawiony na Orbitrap. Inną opcją dostępną w tym instrumencie jest pułapka jonowa.Rozdzielczość została ustawiona na 60 000 i można wybierać spośród różnych dostępnych opcji, w zależności od potrzeb i rodzaju eksperymentu. Zakres masy jest normalny, a zakres skanowania jest ustawiony od 375 do 1700. Pozostałe parametry są domyślne dla aplikacji MS.Próg intensywności został ustawiony, a stan naładowania ustawiony w zakresie od dwóch do sześciu. Wykluczenie dynamiczne zostało ustawione na 40 sekund, a tolerancja masy została utrzymana na poziomie 10. Następny zestaw parametrów zawiera parametry MS-MS.Tryb izolacji został wybrany za pomocą kwadrupola, okno izolacji ustawione na dwa, przesunięcie izolacji zostało ustawione na wyłączone, a typ aktywacji to zwykle HCD dla eksperymentu proteomicznego. Energia zderzenia może być albo stała, albo może być wspomagana. Znakowane próbki wymagają wyższych energii zderzeń, stąd w przypadku eksperymentów iTRAQ zaleca się, aby energia zderzenia była ustawiona na 35, podczas gdy w przypadku eksperymentów LFQ można ją ustawić na 30.Używany tutaj typ detektora to Orbitrap. Tryb zakresu skanowania będzie automatyczny. Pozostałe parametry są domyślne dla eksperymentów iTRAQ i eksperymentu ilościowego bez etykiet.Kliknięcie podsumowania spowoduje wyświetlenie przeglądu wszystkich parametrów LC i MS używanych w eksperymencie. Możesz przyjrzeć się każdemu parametrowi i dokonać korekty. Gdy to zrobisz, kliknij plik i zapisz go jako plik metody.Po zapisaniu możesz uruchomić metodę, a otrzymasz surowe pliki. A następnie te surowe pliki można analizować za pomocą oprogramowania Proteome Discoverer. Rysunek ten przedstawia pokrycie sekwencji BSA w trzech kontrpróbach technicznych, które wynosi 91% w trzech powtórzeniach.Wskazuje to na odtwarzalność urządzenia. Rysunek ten pokazuje jednorodność liczby dopasowań spektralnych peptydów, peptydów i białek zidentyfikowanych w trzech różnych próbkach biologicznych, co ponownie daje wyobrażenie o odtwarzalności instrumentu. W tym przypadku diagram Venna przedstawia wspólne i ekskluzywne białka zidentyfikowane w trzech różnych próbkach w eksperymencie bez znaczników i eksperymencie opartym na znacznikach.Te wykresy słupkowe pokazują liczbę dopasowań widmowych peptydów, grup peptydowych, całkowitych białek, grup białkowych i liczby białek po 1% FDR, zidentyfikowanych w eksperymencie LFQ i iTRAQ. Proteomika tkanek próbek biologicznych umożliwia nam badanie nowych potencjalnych biomarkerów związanych z różnymi etapami postępu choroby. Opisany protokół ilościowej analizy proteomicznej tkanek zapewnia powtarzalne dane o dobrym pokryciu.Stosowanie powtórzeń technicznych zapewnia dobrą odtwarzalność, nawet jeśli próbki są badane w różnych punktach czasowych. Tutaj pokazaliśmy analizę próbek tkanek przy użyciu dwóch metod kwantyfikacji: proteomiki bezznacznikowej i proteomiki opartej na znacznikach. Wybór ilościowych technik proteomicznych może zależeć od liczby próbek, dostępności platform MS i kwestii biologicznej, którą należy się zająć.

comprehensive-workflow-mass-spectrometry-based-shotgun-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Poznaj zintegrowany przepływ pracy proteomiki ilościowej próbek tkanek łączący metody znakowane i bezoznakowe przy użyciu spektrometrii mas Orbitrap Fusion. To podejście usprawnia odkrywanie biomarkerów i analizę dynamiki białek.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów