Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Ogólnym celem tej ulepszonej metody multipleksowej jest zwiększenie liczby próbek białek, które mogą być analizowane jednocześnie, przy jednoczesnym zmniejszeniu błędu pomiarowego i skróceniu czasu pracy urządzenia. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach starzenia się, chorób neurodegeneracyjnych, innych chorób związanych z wiekiem oraz nowotworów, dotyczące patogenezy, progresji, diagnostyki, prognozowania oraz celów terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania kompleksowego obrazu zmian białkowych w wielu różnych warunkach.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat choroby Alzheimera w modelu mysim, może być ona również zastosowana do próbek tkanek pobranych od pacjentów z chorobą Alzheimera lub szeregiem innych schorzeń. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą uznają ją za wymagającą, ponieważ w krótkim odstępie czasu należy przetwarzać jednocześnie kilka próbek. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że acetylację można połączyć z tagowaniem izobarycznym w celu wykrycia nitracji białek, co zmotywowało nas do opracowania techniki działającej globalnie dla wszystkich peptydów.

W niniejszym badaniu przeanalizowane zostaną tkanki mózgu, serca i wątroby z modelu mysiego z chorobą Alzheimera oraz z grupy kontrolnej typu dzikiego. Przenieś od 60 do 90 mg każdej próbki tkanki do probówki do lizy i dodaj 500 µL PBS z 8 M mocznikiem. Zhomogenizuj próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego.

Usunąć homogenat tkanki z probówki do lizy i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi. Przepłukać probówkę do lizy od 100 do 500 µL PBS z 8 M mocznikiem, a następnie połączyć roztwór z płukania z homogenatem tkanki. Wirować homogenat tkanki przez 15 minut.

Zберите supernatant z każdej próbki. Po przeprowadzeniu analizy BCA w celu oznaczenia stężenia białek, przenieście 100 µg białka z każdej próbki do osobno oznakowanych probówek do mikrocentryfugi. Do każdej próbki dodaj ditiotreitol.

Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Do każdej próbki dodać jodoacetamid (IAM) i inkubować na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Następnie do każdej próbki dodać L-cysteinę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po 30 minutach należy dodać bufor Tris z chlorkiem wapnia, aby rozcieńczyć mocznik do stężenia końcowego 2 M. Do każdej próbki należy dodać trypsynę traktowaną L1-tosyl-L-fenyloalanino-L-argininą (TPCK). Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

Następnego dnia należy przerwać trawienie białek poprzez szybkie zamrożenie próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki. Przed znakowaniem dimetylowym próbki peptydów są odsalane, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i suszone za pomocą wirówki próżniowej. Aby rozpocząć procedurę znakowania dimetylowego, należy zrekonstytuować peptydy w 1% kwasie octowym rozpuszczonym w wodzie klasy HPLC lub nanopure.

Przenieś porcję 50 µg każdej z próbek do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Pozostałą część zrekonstytuowanych peptydów przechowuj w temperaturze -80 °C do przyszłych eksperymentów. W krokach, które zostaną zaprezentowane w dalszej części, kluczowe jest szybkie dodawanie odczynników, aby reakcje aktywacji chemicznej przebiegały przez ten sam czas we wszystkich próbkach.

Do próbek przeznaczonych do znakowania lekką dimetylacją należy dodać 8 µL 60 mM roztworu formaldehydu. Do próbek przeznaczonych do znakowania ciężką dimetylacją należy dodać 8 µL 60 mM roztworu formaldehydu znakowanego izotopami węgla 13 i deuteru. Do próbek znakowanych lekką dimetylacją należy dodać 8 µL 24 mM cyjanoborowodorku sodu.

Do próbek oznaczonych ciężką dimetylacją dodać 8 µL 24 mM cyjanoborowodorku sodu. Próbki wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie delikatnie potrząsać na wytrząsarce do probówek przez około 10 minut w temperaturze pokojowej. Reakcje zatrzymać, dodając 16 µL 1% amoniaku na pięć minut.

Ponownie zakwaszyć mieszaniny reakcyjne, dodając 8 µL 5% kwasu mrowieniowego. Połączyć peptydy dimetylowane lekkie i ciężkie, aby przygotować łącznie sześć próbek. Przeprowadzić odsalanie próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie należy wysuszyć próbki za pomocą wirówki próżniowej. Aby rozpocząć znakowanie izobaryczne próbek dimetylowanych, w pierwszej kolejności należy zrekonstytuować 100 µg dimetylowanych peptydów w buforze wodorowęglanu trietylammonium, czyli TEAB. Następnie należy przygotować odczynniki izobaryczne zgodnie z protokołem producenta zestawu do znakowania izobarycznego.

Dodaj odpowiednią objętość, w tym przypadku 41 µL rozpuszczonego odczynnika do znakowania izobarycznego do każdej z próbek peptydów i wymieszaj w wstrząsarku typu vortex przez około 10 sekund. Inkubuj próbki na wstrząsarce do probówek do mikrocentryfugi przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przerwać reakcje, dodaj 8 µL hydroksyloaminy do każdej próbki.

Następnie inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Połącz sześć oznakowanych próbek w jedną mieszaninę i przeprowadź odsolenie. Przygotuj peptydy do chromatografii cieczowej, rekonstytuując je w wodzie klasy do spektrometrii mas z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego.

Przenieś zrekonstytuowane peptydy do probówki do mikrocentryfugi zawierającej filtr 0,65 µm. Następnie wiruj z prędkością 12 000 ×g przez jedną minutę. Wyjmij i wyrzuć filtr.

Przenieś przefiltrowane peptydy do fiolki do autopróbnika. Wstrzyknij 6 µL każdej próbki frakcji z silnej wymiany kationowej na kolumnę pułapkową. Wypełnij ją do 2 cm materiałem C18.

Uruchom metody spektrometru mas dla rozdzielania analitycznego i akwizycji danych. Przeprowadzono analizę cPilot 12-plex tkanek mózgu, serca i wątroby z modelu mysiego choroby Alzheimera oraz kontroli typu dzikiego. Dane prekursorów wykazały lekkie i ciężkie peptydy dimetylowane reprezentowane przez piki przy m/z 643,854 i 647,875.

Peptydy te zostały wybrane, wyizolowane niezależnie i poddane fragmentacji metodą dysocjacji indukowanej zderzeniami w celu wygenerowania tych widm. Wyniki wyszukiwania wykazały, że piki należą do peptydu białka fosfoglicerynianowej kinazy 1. Piki te zostały poddane dalszej izolacji w celu przeprowadzenia tandemowej spektrometrii mas z wykorzystaniem dysocjacji zderzeniowej o wysokiej energii, a jony reporterowe są widoczne zgodnie z przedstawionym schematem.

Oba zestawy widm spektrometrii mas trzystopniowej są niezbędne do uzyskania informacji na temat 12 próbek. W tym przykładzie stosunki jonów dla choroby Alzheimera do kontroli typu dzikiego są podobne w dwóch powtórzeniach biologicznych dla tkanek mózgu, wątroby i serca. Wartości krotności zmiany (fold change) dla każdego porównania sugerują, że poziomy kinazy fosfoglicerynianowej 1 w mózgu i sercu są wyższe u myszy z chorobą Alzheimera, ale niższe w wątrobie.

Po opanowaniu tej techniki, prawidłowo wykonana procedura zajmuje około pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy zwrócić szczególną uwagę na ostrożność w obchodzeniu się z próbkami. W ramach tej procedury można zastosować metody rozdziału, takie jak silna wymiana kationowa lub frakcjonowanie przy wysokim pH, w celu zwiększenia głębokości i zakresu analizy w ciągu doby.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zwiększyć multipleksowanie próbek przy użyciu C-Pilot.