Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Ogólnym celem tej ulepszonej metody multipleksowej jest zwiększenie liczby próbek białek, które mogą być analizowane jednocześnie, przy jednoczesnym zmniejszeniu błędu próbki i czasu instrumentu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się, chorób neurodegeneracyjnych, innych chorób związanych z wiekiem i nowotworów, które są związane z patogenezą, progresją, diagnozą, rokowaniem i celami terapeutycznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać kompleksowy obraz zmian białek w wielu warunkach.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w chorobę Alzheimera w modelu mysim, można ją również zastosować do próbek tkanek od pacjenta z chorobą Alzheimera lub szeregiem innych zaburzeń. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z tym, ponieważ istnieje kilka próbek do jednoczesnej obsługi w krótkim czasie. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że acetylację można połączyć z izoberycznym znakowaniem w celu nitrowania białek, co zmotywowało nas do tego, aby technika działała globalnie dla wszystkich peptydów.

Badanie to przeanalizuje tkanki mózgu, serca i wątroby z mysiego modelu choroby Alzheimera i grupy kontrolnej typu dzikiego. Przenieś od 60 do 90 miligramów każdej próbki tkanki do probówki do lizy i dodaj 500 mikrolitrów PBS z ośmioma molowymi mocznikami. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego.

Usunąć homogenat tkankowy z probówki do lizy i przenieść do probówki do mikrowirówki. Przepłukać probówkę do lizy 100 do 500 mikrolitrami PBS z ośmioma molowymi mocznikami i połączyć roztwór płuczący z homogenatem tkankowym. Odwirować homogenat tkankowy przez 15 minut.

Pobrać supernatant z każdej próbki. Po wykonaniu testu BCA w celu określenia stężenia białka, dodaj 100 mikrogramów białka z każdej próbki do indywidualnie znakowanych probówek wirówkowych. Dodać ditiotreitol do każdej próbki.

I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Dodać jodoacetamid, IAM, do każdej próbki i inkubować na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Następnie dodaj L-cysteinę do każdej próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po 30 minutach dodać tris bufor z chlorkiem wapnia w celu rozcieńczenia mocznika do końcowego stężenia dwóch molowych. Do każdej próbki dodać trypsynę poddawaną działaniu tosilimitotophenylethylecholer metylu ketona L1. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia należy wygasić trawienie białka poprzez błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania. Przed znakowaniem dimetylacji próbki peptydów są odsalane, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i suszone przez wirowanie próżniowe. Aby rozpocząć procedurę znakowania dimetylu, należy rozpuść peptydy w 1% kwasie octowym rozpuszczonym w HPLC lub wodzie o jakości nanoczystej.

Wyjmij 50-mikrogramową porcję każdej próbki do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozostałą część rozpuszczonych peptydów należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do przyszłych eksperymentów. W krokach, które zostaną zademonstrowane w następnej kolejności, kluczowe znaczenie ma szybkie dodanie odczynników, tak aby reakcje chemiczne umożliwiające zachodziły przez ten sam czas dla wszystkich próbek.

Dodać osiem mikrolitrów 60-milimolowego roztworu formaldehydu do próbek w celu oznakowania za pomocą lekkiej dimetylacji. Dodać osiem mikrolitrów 60-milimolowego roztworu formaldehydu znakowanego węglem 13 deuterem do próbek w celu znakowania za pomocą ciężkiej dimetylu. Dodać osiem mikrolitrów 24-milimolowego cyjanoborowodorku sodu do próbek oznaczonych dimetylacją światła.

Dodać osiem mikrolitrów 24-milimolowego cyjanoboroduderydu sodu do próbek oznaczonych ciężką dimetyloacją. Próbki należy zwirować, a następnie delikatnie wstrząsnąć na wytrząsarce probówkowej przez około 10 minut w temperaturze pokojowej. Ugasić reakcje, dodając 16 mikrolitrów 1% amoniaku przez pięć minut.

Ponownie zakwasić mieszaniny reakcyjne, dodając osiem mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego. Połącz lekkie i ciężkie dimetylowate peptydy, aby uzyskać w sumie sześć próbek. Odsalanie próbki należy przeprowadzić zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

I wysuszyć próbki przez wirowanie próżniowe. Aby uzyskać izobaryczne znakowanie dimetylowanych próbek, najpierw rozpuść 100 mikrogramów dimetyloanowych peptydów i wodorowęglanu trietyloamonu lub buforu TEAB. Następnie należy przygotować odczynniki izobaryczne zgodnie z protokołem producenta zestawu do znakowania izobarycznego.

Dodać odpowiednią objętość, w tym przypadku 41 mikrolitrów rozpuszczonego odczynnika do znakowania izobarycznego do każdej z próbek peptydów i wirować przez około 10 sekund. Wytrząsać próbki na wytrząsarce w probówce do mikrowirówek przez około godzinę w temperaturze pokojowej. Aby wygasić reakcje, dodaj 8 mikrolitrów hydroksyloaminy do każdej próbki.

I inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć sześć oznakowanych próbek w jedną mieszaninę i odsolić. Przygotować peptydy do chromatografii cieczowej, rozpuszczając peptydy w wodzie o spektrometrii mas z 0,1% kwasem mrówkowym.

Dodać rozpuszczone peptydy do probówki mikrowirówkowej zawierającej filtr o średnicy 0,65 mikrometra. I odwirować przy 12 000 g przez jedną minutę. Wyjmij i wyrzuć filtr.

Przefiltrowane peptydy przenieść do fiolki z automatycznym samplerem. Wstrzyknąć sześć mikrolitrów każdej próbki frakcji silnej kationowymienności do kolumny pułapki. Opakowanie do dwóch centymetrów z materiałem Carbon 18.

Uruchom metody spektrometru masowego separacji analitycznej i akwizycji danych. Przeprowadzono 12-pleksową analizę tkanek mózgu, serca i wątroby z mysiego modelu choroby Alzheimera i grupy kontrolnej typu dzikiego. Dane prekursorowe wykazały lekkie i ciężkie peptydy dimetylowane reprezentowane przez piki na m/z 643,854 i 647,875.

Peptydy te zostały wyselekcjonowane, niezależnie wyizolowane i rozdrobnione za pomocą dysocjacji wywołanej przez zmowę w celu wygenerowania tych widm. Wyniki poszukiwań wskazywały, że piki należały do peptydu kinazy fosfoglicerynianowej białka. Piki te zostały dodatkowo wyizolowane w celu tandemowej spektrometrii mas dysocjacji kolucyjnej o wyższej energii, a jony reporterowe są obserwowane, jak pokazano.

Oba zestawy widm trójstopniowej spektrometrii mas są niezbędne do uzyskania informacji o 12 próbkach. W tym przykładzie stosunek liczby jonów kontrolnych między chorobą Alzheimera a liczbą jonów kontrolnych typu dzikiego jest podobny w dwóch replikacjach biologicznych dla tkanek mózgu, wątroby i serca. Wartości zmiany krotności dla każdego porównania sugerują, że poziomy kinazy fosfoglieranu One w mózgu i sercu są wyższe u myszy z chorobą Alzheimera, ale niższe w wątrobie.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około pięć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas obchodzenia się z próbką. W ramach tej procedury można przeprowadzić metody separacji, takie jak silna wymiana kationowa lub frakcjonowanie o wysokim pH, w celu zwiększenia głębokości dziennej i pokrycia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak poprawić multipleksowanie próbek za pomocą C-Pilota.