Name: Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę cPILOT do multipleksowania próbek w badaniach proteomicznych choroby Alzheimera. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek tkankowych, redukując błędy i czas analizy instrumentalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują RASR za grant University of Pittsburgh Start-up Funds oraz NIH, NIGMS R01 (GM 117191-01).

Oświadczenie etyczne: Myszy zostały zakupione od niezależnej, niekomercyjnej instytucji badań biomedycznych i umieszczone w Wydziale Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Pittsburghu.
1. Ekstrakcja białek i wytwarzanie peptydów do znakowania chemicznego
<ol>
	<li>Ekstrakcja białka z tkanek, komórek lub płynów ustrojowych.
	<ol>
		<li>Homogenizować 60-90 mg tkanki (np. mózgu, serca i wątroby) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (1x PBS) z 8 M mocznikiem (500 μL) za pomocą homogenizatora mechanicznego. W razie potrzeby do buforu można dodać inhibitory proteazy lub fosfatazy. W tym projekcie nie zostały one wykorzystane. Dla homogenizatora należy zastosować następujące parametry: kulki A matrycy lizy, 4 m/s, 20 s. Tkanka serca może wymagać do 9 cykli homogenizacji. 
		UWAGA: W razie potrzeby do buforu można dodać inhibitory proteazy lub fosfatazy. Nie zostały one wykorzystane w tym badaniu.
		<ol>
			<li>Usunąć homogenat tkankowy z probówki do lizy i przenieść do probówki do mikrowirówki. Przepłukać probówki lizujące 100-500 μl PBS z 8 M mocznikiem i połączyć roztwór płuczący z homogenatem tkankowym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować homogenizowane tkanki (9,447 x g, 4 °C, 15 min) i zebrać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Dalsze rozcieńczanie buforem może być konieczne, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie. Uzyskane stężenia dla próbek z tych tkanek mieściły się w przedziale 6-13 μg/μL.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Dodać wzorzec wewnętrznej kontroli jakości (np. alfakazeina bydlęca lub inne białko egzogenne) o stosunku 1 μg wzorzec:100 μg próbki białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie próbki
<ol>
	<li>Dodać 100 μg (100 x 10-6 g) białka z każdej próbki do indywidualnie znakowanych probówek wirówek. Objętość zależy od stężenia białka (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Dodać ditiotreitol (DTT) (stosunek molowy odczynnika 40:1 do próbki) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Obliczenie stosunku molowego opiera się na masie białkowej albuminy surowicy bydlęcej (BSA), która wynosi 66,5 x 103 g/mol.</li>
	<li>Dodać jodoacetamid (IAM) (stosunek molowy odczynnika 80:1 do próbki) do każdej próbki. Inkubować na lodzie w ciemności przez 2 godziny. Reakcję tę przeprowadza się na lodzie przez 2 godziny, aby zapobiec reakcjom ubocznym.</li>
	<li>Dodaj L-cysteinę (stosunek odczynnika 40:1 do mola próbki) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 20 mM bufor Tris z 10 mM CaCl2 (pH 8,2) w celu rozcieńczenia mocznika do końcowego stężenia 2 M.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać trypsynę poddaną działaniu L-1-tozyloamido-2 fenyloetylochlorometylu (TPCK) (stosunek substratu do mola enzymu) (stosunek 50:1 substratu do mola enzymu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Stłumić trawienie białka przez błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
3. Odsalanie próbek
<ol>
	<li>Ponownie zakwasić próbki, dodając kwas mrówkowy (FA). Dodaj tyle FA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1%. Jeśli próbki są pierwotnie w temperaturze -80 °C, należy je rozmrozić na lodzie przed ponownym zakwaszeniem.</li>
	<li>Odsolić peptydy za pomocą wkładów C18 hydrofilic lipophilic balanced (HLB) 10 mg, jak opisano wcześniej16.</li>
	<li>Wysuszyć próbki przez odwirowanie próżniowe (5 Torr, 45 °C, 77 x g) do objętości ~10 μL.</li>
</ol>
4. Etykietowanie dimetylacji (N-termini)
<ol>
	<li>Rozpuścić peptydy w 1% kwasie octowym (0,25 μg/μl) rozpuszczonym w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub w wodzie o czystości nanoczystej. Przenieść porcję 50 μg do nowej probówki do mikrowirówki (1,5 ml) i przechowywać pozostałą część w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 8 μl 60 mM (4%) CH2O (37% wag./v) lub 60 mM (4%) 13CD2O (20% wag./v) do próbek w celu znakowania odpowiednio lekką lub ciężką dimetylocją. Zazwyczaj dodaje się 4 μl odczynnika na 25 μg peptydów (kroki 4.2, 4.3, 4.6).</li>
	<li>Dodać 8 μl 24 mM NaBH3CN lub 24 mM NaBD3CN do próbek oznakowanych odpowiednio lekką lub ciężką dimetylowaniem.</li>
	<li>Wirować i wstrząsać na wytrząsarce rurowej przez ~10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Reakcje schładzić dodając 16 μL 1% amoniaku (~28-30% v/v) przez 5 min. Zazwyczaj dodaje się 8 μl odczynnika na 25 μg peptydów.</li>
	<li>Mieszaniny reakcyjne należy ponownie zakwasić, dodając 8 μl 5% FA (98% v/v).</li>
	<li>Połącz lekkie i ciężkie peptydy dimetylowane (rysunek 1), aby uzyskać w sumie sześć próbek. W Tabeli 1 znajduje się opis tagowania i łączenia prób wykorzystanych w tym badaniu.</li>
	<li>Przeprowadzić odsalanie próbki zgodnie z krokami 3.2 i 3.3.</li>
</ol>
5. Znakowanie izobaryczne (pozostałości Lys)
<ol>
	<li>Rozpuść 100 μg dimetylonowych peptydów (1 μg/μL) w 100 mM buforze wodorowęglanu tri-etyloamonu (TEAB) (pH ~ 8,5).</li>
	<li>Przygotować odczynniki izobaryczne zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów/odczynników).</li>
	<li>Dodać rozpuszczone odczynniki izobaryczne (41 μl) do peptydów i wirować przez ~10 s. Wstrząsać próbkami na wytrząsarce w probówce do mikrowirówek przez ~1 h. Schłodzić reakcje 8 μl hydroksyloaminy (10% w/v) i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Połączyć sześć oznakowanych próbek w jedną mieszaninę i odsolić (kroki 3.1-3.3) lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: W celu poprawy pokrycia i głębokości proteomu sugeruje się wielowymiarową strategię separacji, taką jak silna wymiana kationów (SCX).</li>
</ol>
6. Silna wymiana kationów
<ol>
	<li>Wykonaj SCX zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotuj ~1 ml roztworów mrówczanu amonu (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM i 500 mM) z 10% acetonitrylem (ACN), 0,1% FA (pH 3).</li>
		<li>Zdejmij czerwoną nasadkę z górnej części końcówki pipety i postukaj w końcówkę pipety zawiesiną do pakowania, aby upewnić się, że materiał opakowaniowy znajduje się w dolnej części końcówki pipety. 
		UWAGA: Krytyczne: Nie wyrzucaj końcówki pipety do końca protokołu.</li>
		<li>Umieść adapter wirówki na górze probówki do mikrowirówki (2 ml) i zamocuj końcówkę pipety w środku.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu do rozpuszczania SCX na końcówki pipet.</li>
		<li>Odwirowywać końcówki pipet przez 6 minut w temperaturze pokojowej (4 000 x g). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy i wyrzuć odpady.</li>
		<li>Rozpuścić peptydy w 150 μl buforu do rozpuszczania SCX. Upewnij się, że pH wynosi 3.</li>
		<li>Dodać peptydy do końcówek pipet, odwirować (patrz ppkt 6.1.5) i zachować eluent.</li>
		<li>Przenieść filtr i pipetę do nowej probówki do mikrowirówki (2 ml) i dodać 150 μl 20 mM roztworu mrówczanu amonu. Wirować przez 6 minut w temperaturze pokojowej (4 000 x g) i przechowywać eluent.</li>
		<li>Powtórzyć krok 6.1.8 dodatkowo siedem razy, stosując kolejne stężenia (tj. 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM i 500 mM) mrówczanu amonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść osiem frakcji SCX do probówek do mikrowirówek (1,5 ml) i zagęścić je za pomocą odparowania odśrodkowego (patrz krok 3.3).</li>
</ol>
7. Chromatografia cieczowa – tandemowa spektrometria mas (LC-MS/MS) i MS3
<ol>
	<li>Rozpuść peptydy w wodzie o spektrometrii mas z 0,1% FA, przefiltruj i umieść w fiolce z automatycznym samplerem. Przefiltruj peptydy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać rozpuszczone peptydy do probówki mikrowirówki zawierającej filtr 0,65 μm (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wirować peptydy przy 12 000 x g przez 1 minutę. Usuń filtr, wyrzuć i dodaj przefiltrowane peptydy do fiolki z automatycznym samplerem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować fazy ruchomej w następujący sposób: 3% (v/v) ACN z 0,1% FA (A) i 100% ACN z 0,1% FA (B).</li>
	<li>Wstrzyknąć 6 μl każdej próbki frakcji SCX do kolumny pułapki wypełnionej materiałem C18 o średnicy 2 cm (5 μm, 200 A wielkość porów). 
	UWAGA: Czyszczenie próbki na syfon przebiega następująco: 3 min, 0% B; 3 μl/min przy użyciu systemu chromatografii cieczowej 2D (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Uruchom metodę separacji analitycznej. Użyj laserowej kolumny kapilarnej z topionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 75 μm x 13,2 cm z wyciąganą końcówką, wypełnionej materiałem C18 (5 μm, 100 A). Nachylenie wynosi: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL/min, 180 min.</li>
	<li>Uruchom akwizycję danych dla spektrometru mas, gdy metoda separacji analitycznej jest uruchomiona. 
	UWAGA: Parametry skanowania badania MS są następujące: 400-1 600 m/z, rozdzielczość 60 000, cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 106 jonów, maksymalny czas wtrysku 500 ms. Parametry dla CID–MS/MS są następujące: Akwizycja zależna od danych Top 1-7 lub Top 8-14 (DDA), szerokość izolacji 3 m/z, minimalny sygnał 500, 35% znormalizowana energia zderzenia (NCE), 0,25 q aktywacji, czas aktywacji 10 ms, 3 x 104 AGC, maksymalny czas wtrysku 50 ms. Parametry dla HCD–MS3 są następujące: sygnał minimum 200, szerokość izolacji 4 m/z, 60% NCE, czas aktywacji 0,1, 3 x 105 AGC, 250 ms IT, zakres wyboru 300-1,300 m/z MS/MS, z wyłączeniem niefragmentowanego jonu macierzystego.</li>
	<li>Wykonaj każdą analizę w dwóch egzemplarzach zarówno dla pierwszych 1-7, jak i pierwszych 8-14 przebiegów. 
	UWAGA: W przypadku próbek uruchamianych na nowszym modelu instrumentu zawierającego orbitrap lub tribrydowy spektrometr masowy, parametry DDA będą się różnić i mogą być zoptymalizowane tak, aby obejmowały więcej skanów MS/MS i MS3. Dodatkowo, w przypadku instrumentów tribrydowych, należy zastosować synchroniczną selekcję prekursorów (SPS)-MS3.</li>
</ol>
8. Analiza danych16
<ol>
	<li>Przeszukaj pliki RAW za pomocą oprogramowania do analizy białek w odpowiedniej bazie danych, takiej jak mysz Uniprot. 
	UWAGA: Ważne jest, aby utworzyć dwa przepływy pracy dla każdego pliku RAW w celu wyszukania lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych.</li>
	<li>Przeszukaj pliki RAW przy użyciu następujących parametrów: trypsyna z dwoma pominiętymi cięciami, zakres mas peptydów 300-6,000 Da, tolerancja masy macierzystej 15 ppm, tolerancja fragmentacji 1 Da. Modyfikacje statyczne: lekka dimetylacja (+28,031, N-koniec peptydu) lub ciężka dimetylacja (+36,076 Da, N-koniec peptydu), karbamidomtyl (+57,021 Da, C). 
	UWAGA: Czasami ciężki dimetylowany pik wynosi ~ 7 Da (+35.069 Da, N-koniec peptydu) pochodzi z lekkiego dimetylowanego piku i dlatego powinien być włączony do przepływu pracy wyszukiwania ciężkich dimetylowanych peptydów. Modyfikacje dynamiczne: utlenianie (+15,995 Da, M), znacznik izobaryczny 6-plex (229,163 Da, K). Uwzględnij wyszukiwanie w bazie danych wabików, aby uzyskać wskaźniki fałszywych odkryć (np. 1 i 5%) oraz węzeł ilościowy, aby wyszukać intensywności jonów reporterowych znaczników izobarycznych.</li>
	<li>statystyka
	<ol>
		<li>Eksport danych do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego w celu normalizacji wartości jonów reporterowych białek. Dla każdego białka należy podzielić albo medianę stosunków jonów reporterowych, albo intensywność surowych jonów reporterowych przez średni stosunek wzorca wewnętrznego lub intensywności surowych jonów reporterowych wzorca wewnętrznego. Użyj odpowiedniego oprogramowania statystycznego, takiego jak elektroniczny arkusz kalkulacyjny, Perseus lub R, aby określić znaczące zmiany w warunkach próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ong, S. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture%2C+SILAC%2C+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Approach+for+Triplex-Isobaric+Peptide+Termini+Labeling+%28Triplex-IPTL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL).</a> Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).</li>
<li>Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, <a target="_blank" href="NULL">From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting</a>. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).</li>
<li>Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O+Labeling+for+Comparative+Proteomics%3A+Model+Studies+with+Two+Serotypes+of+Adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus.</a> Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).</li>
<li>Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O+Labeling+for+Comparative+Proteomics%3A+Evaluation+of+Endoprotease+Glu-C+as+the+Catalytic+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent.</a> J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+quantitative+proteomics+using+isotope-coded+protein+labels%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels.</a> PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tags%3A+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Protein+Quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+Using+Amine-reactive+Isobaric+Tagging+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%2CN-Dimethyl+Leucines+as+Novel+Isobaric+Tandem+Mass+Tags+for+Quantitative+Proteomics+and+Peptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics.</a> Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+Multiplexing+Capacity+of+TMTs+Using+Reporter+Ion+Isotopologues+with+Isobaric+Masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses.</a> Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Frost, D. C., Greer, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Enabled+12-Plex+DiLeu+Isobaric+Tags+for+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).</li>
<li>Robinson, R. A. S., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Sample+Multiplexing+for+Nitrotyrosine-Modified+Proteins+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li>
<li>Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+%28cPILOT%29+approach+with+selective+MS%283%29+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li>
<li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cPILOT+analysis+of+the+APP%2FPS-1+mouse+liver+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+-+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li>
<li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Multiplexing+with+Cysteine-Selective+Approaches%3A+cysDML+and+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT.</a> J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).</li>
<li>Dephoure, N., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperplexing%3A+A+Method+for+Higher-Order+Multiplexed+Quantitative+Proteomics+Provides+a+Map+of+the+Dynamic+Response+to+Rapamycin+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast.</a> Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron-encoded+mass+signatures+for+multiplexed+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification.</a> Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).</li>
<li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuCode+Labels+for+Relative+Protein+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">NeuCode Labels for Relative Protein Quantification.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).</li>
<li>Braun, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Multiple+Reporter+Ions+from+a+Single+Isobaric+Reagent+Increases+Multiplexing+Capacity+for+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays%3A+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Gu, L., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer%27s+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li>
<li>Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3-based+quantitative+proteomics+using+pulsed-Q+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+Using+Multiple+Proteases+for+Large-Scale+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+Enables+Accurate%2C+Sensitive%2C+and+Multiplexed+Detection+of+Differential+Expression+across+Cancer+Cell+Line+Proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes.</a> Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

cPILOT pozwala na jednoczesny pomiar więcej niż 12 unikalnych próbek. Aby zapewnić pomyślne znakowanie zarówno na N-końcu, jak i na resztach lizyny peptydów, konieczne jest uzyskanie prawidłowego pH dla każdego zestawu reakcji i przeprowadzenie najpierw reakcji dimetylacji w celu znakowania peptydów. Selektywną dimetylację na N-końcu przeprowadza się przy pH na poziomie ~2,5 (±0,2). Osiąga się to poprzez wykorzystanie różnic w pKA grup aminowych na lizynie i N-końcu. Przy pH 2,5 lizyna jest nieaktywna (pKA ~10,5); jednak...

Proteomika często obejmuje analizę wielu próbek wykorzystywanych do lepszego zrozumienia procesów chorobowych, kinetyki enzymów, modyfikacji potranslacyjnych, reakcji na bodźce środowiskowe, odpowiedzi na leczenie terapeutyczne, odkrywania biomarkerów lub mechanizmów leków. Metody ilościowe mogą być stosowane do pomiaru względnych różnic w poziomach białka w próbkach i mogą być bezznacznikowe lub obejmować znakowanie izotopowe (metaboliczne, chemiczne lub enzymatyczne). Metody znakowania stabilnymi izotopami zyskały na popularności, ponieważ umożliwiają jednoczesną analizę wielu próbek i są odpowiednie dla próbek z różnych komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całych organizmów. Metody oznaczania izotopów1,2,3,4,5,6,7 zwiększają przepustowość eksperymentalną, jednocześnie skracając czas pozyskiwania, koszty i błędy eksperymentalne. Metody te wykorzystują widma masowe prekursorów do pomiaru względnej obfitości białek z pików peptydów. W przeciwieństwie do tego, odczynniki do znakowania izobarycznego8,9,10 generują jony reporterowe, które są wykrywane w widmach MS/MS lub MS3 <sup="xref">11, a te piki są używane do raportowania względnej obfitości białek.
Aktualnym stanem techniki w multipleksowaniu proteomicznym jest 10-plex12 lub 12-plex isobaric tag analysis13. Ulepszone metody multipleksowania próbek (tj. >10 próbek) zostały opracowane przez nasze laboratorium dla tissues14,15,16,17, oraz przez inne do analizy komórek18,19,20, tissues 21, lub targeted peptides22. Opracowaliśmy ulepszoną technikę multipleksowania zwaną połączonym znakowaniem izotopowym prekursorów ze znakowaniem izobarycznym (cPILOT). Global cPILOT jest przydatny do uzyskiwania informacji o względnych stężeniach wszystkich białek w różnych warunkach próbki (≥12)14. Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg pracy cPILOT. Peptydy tryptyczne lub Lys-C są selektywnie znakowane na N-końcu za pomocą dimetylacji przy użyciu niskiego pH2 i przy resztach lizyny za pomocą odczynników 6-plex przy użyciu wysokiego pH. Strategia ta podwaja liczbę próbek, które można analizować za pomocą odczynników izobarycznych, co pomaga obniżyć koszty eksperymentu, a dodatkowo skraca etapy i czas eksperymentu.
cPILOT jest elastyczny, ponieważ opracowaliśmy inne metody badania oksydacyjnych modyfikacji potranslacyjnych, w tym białka modyfikowane 3-nitrotyrozyną14 i peptydy zawierające cysteinę z S-nitrozylacją (oxcyscPILOT)23. Opracowaliśmy również podejście selektywne dla aminokwasów, cysteina cPILOT (cyscPILOT)17. Akwizycja MS3 za pomocą top-ion11 lub metody selektywnej1-jonowej15 może pomóc w zmniejszeniu interferencji jonów reporterowych i poprawie dokładności ilościowej cPILOT. Zastosowanie MS3 w metodzie akwizycji wymaga instrumentu o wysokiej rozdzielczości z analizatorem masy orbitrap, chociaż instrumenty pułapki jonowej o niskiej rozdzielczości mogą również działać24.
Poprzednio, cPILOT był używany do badania białek wątroby16 z mysiego modelu choroby Alzheimera. W tym miejscu opisujemy, jak przeprowadzić globalną analizę cPILOT przy użyciu homogenatów mózgu, serca i wątroby w celu zbadania roli peryferii w chorobie Alzheimera. Eksperyment ten obejmuje replikację biologiczną. Ze względu na wszechstronność cPILOT, zainteresowani użytkownicy mogą wykorzystać tę technikę do badania innych tkanek pod kątem szeregu problemów i układów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Ilość wody - MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>4 L nie jest konieczna</td></tr><tr><td>Acetonitryl - MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td>ilość 4 l nie jest konieczna</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>J.T. Baker</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu (28 - 30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka Analytical</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek</td><td>BCA Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Biorad</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biorad</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreiotol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAM)</td> <td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-1-tozyloamido-2 keton fenyloetylo-cholormetylowy (TPCK) traktowany trypsyną z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich, nauki przyrodnicze</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (CH2O); 36,5 - 38% w H2O</td><td>Sigma Aldrich, nauki</td> <td>przyrodniczeF8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (13CD2O); 20 % wag. w D2O, 98 atomów % D, 99 atomów % 13C</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu; klasa odczynnika, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborodeuterek sodu; 96 atomów % D, 98% CP</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki spinowe z silną wymianą kationową (SCX) zestaw do przygotowania próbki</td><td>Protea BioSciences</td><td>SP-155-24kit</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania izobarycznego (TMT 6 plex) - 6 reakcji (1 x 0,8 mg)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy</td><td>Sigma Aldrich, Chemia</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td>można użyć dowolnego miksera</td></tr><tr><td>Wkłady ekstrakcyjne Oasis HLB 1 cc (10 mg)</td><td>Wody</td><td>186000383</td><td>Są to wkłady C18</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy Visiprep SPE, DL (jednorazowa wkładka), model 24-portowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57265</td><td>Wystarczający jest również model z 12 portami</td></tr><tr><td>Speed-vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>wystarczy dowolna marka speed vac</td></tr><tr><td>Komora do kąpieli wodnej</td><td>Thermo Scientific</td><td>2825/2826</td><td>Wystarczy dowolna marka&nbsp; komory do kąpieli wodnej z kontrolowaną temperaturą.</td></tr><tr><td>Homogenizator mechaniczny (i.e. FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D z automatycznym podajnikiem próbek Nano LC AS-2</td><td>Sciex-Ten</td><td></td> <td>model nie jest już dostępny. Wystarczy dowolny nano LC z automatycznym samplerem.</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Ten</td> <td>model nie jest już dostępny. Można używać innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion lub Orbitrap Fusion Lumos).</td></tr><tr><td>Oprogramowanie białkowe (np. Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Wystarczy każda marka płytek mieszających</td></tr><tr><td>pH-metr (kompatybilny z Tris)</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>Wystarczy pH-metr dowolnej marki</td></tr><tr><td>Bufor pH 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>Wystarczy dowolnej marki buforu pH 10</td></tr><tr><td>pH 7 bufor</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>Dowolny markowy bufor pH 7 jest wystarczający</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek eppendorf, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 1,5</td></tr><tr><td>ml 0,6 ml probówek eppendorf, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-408-120</td><td>Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 0,6 ml</td></tr><tr><td>0,65 &micro; m Ultrafree MC DV filtry odśrodkowe</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>2 mL probówki do mikrowirówek, 72 jednostki</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>Materiał opakowaniowy C18 (5&nbsp; &mikro; m, 100 & Aring ;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61100/000</td><td>Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach będzie wystarczającym</td></tr><tr><td>materiałem opakowaniowym C18 (5&nbsp; &mikro; m, 200 & Aring ;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61200/000</td><td>Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Wystarczający będzie alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach</td></tr></tbody></table>

ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cpilot)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Rośnie zapotrzebowanie na analizę wielu próbek biologicznych w celu zrozumienia chorób i odkrycia biomarkerów. Ilościowe strategie proteomiczne, które umożliwiają jednoczesny pomiar wielu próbek, stały się powszechne i znacznie skracają koszty i czas eksperymentów. Nasze laboratorium opracowało technikę zwaną połączonym znakowaniem izotopowym prekursorów i znakowaniem izobarycznym (cPILOT), która usprawnia multipleksowanie próbek w porównaniu z tradycyjnymi metodami znakowania izotopowego lub izobarycznego. Global cPILOT może być stosowany do próbek pochodzących z komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całych organizmów i dostarcza informacji na temat względnej obfitości białek w różnych warunkach próbki. cPILOT działa poprzez: 1) wykorzystanie warunków buforowych o niskim pH do selektywnego dimetylowania N-końców peptydu oraz 2) wykorzystanie warunków buforowych o wysokim pH do znakowania pierwszorzędowych amin reszt lizyny dostępnymi na rynku odczynnikami izobarycznymi (patrz Tabela materiałów/odczynników). Dostępny stopień multipleksowania próbki zależy od liczby użytych znaczników prekursora i odczynnika do znakowania izobarycznego. Tutaj przedstawiamy analizę 12-plex przy użyciu lekkiej i ciężkiej dimetylacji w połączeniu z sześcio-pleksowymi odczynnikami izobarycznymi do analizy 12 próbek z tkanek myszy w jednej analizie. Ulepszone multipleksowanie jest pomocne w skracaniu czasu i kosztów eksperymentu, a co ważniejsze, umożliwia porównanie wielu warunków próbki (kontrprób biologicznych, stadium choroby, leczenie farmakologiczne, genotypy lub podłużne punkty czasowe) przy mniejszym odchyleniu i błędzie eksperymentalnym. W niniejszej pracy globalne podejście cPILOT jest wykorzystywane do analizy tkanek mózgu, serca i wątroby w replikacjach biologicznych z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego. Global cPILOT może być stosowany do badania innych procesów biologicznych i przystosowany do zwiększenia multipleksowania próbek do ponad 20 próbek.

cPILOT wykorzystuje chemię opartą na aminach do chemicznego znakowania peptydów na N-końcu oraz w resztach lizyny, co zwiększa możliwości multipleksowania próbek. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne dane MS uzyskane z analizy cPILOT w układzie 12-plex tkanek mózgu, serca i wątroby z mysiego modelu choroby Alzheimera oraz kontroli typu dzikiego. Jak pokazano w Tabeli 1, w tej analizie 12-plex uwzględniono dwie powtórzenia biologiczne dla myszy z chorobą ...

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Ogólnym celem tej ulepszonej metody multipleksowej jest zwiększenie liczby próbek białek, które mogą być analizowane jednocześnie, przy jednoczesnym zmniejszeniu błędu pomiarowego i skróceniu czasu pracy urządzenia. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach starzenia się, chorób neurodegeneracyjnych, innych chorób związanych z wiekiem oraz nowotworów, dotyczące patogenezy, progresji, diagnostyki, prognozowania oraz celów terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania kompleksowego obrazu zmian białkowych w wielu różnych warunkach.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat choroby Alzheimera w modelu mysim, może być ona również zastosowana do próbek tkanek pobranych od pacjentów z chorobą Alzheimera lub szeregiem innych schorzeń. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą uznają ją za wymagającą, ponieważ w krótkim odstępie czasu należy przetwarzać jednocześnie kilka próbek. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że acetylację można połączyć z tagowaniem izobarycznym w celu wykrycia nitracji białek, co zmotywowało nas do opracowania techniki działającej globalnie dla wszystkich peptydów.W niniejszym badaniu przeanalizowane zostaną tkanki mózgu, serca i wątroby z modelu mysiego z chorobą Alzheimera oraz z grupy kontrolnej typu dzikiego. Przenieś od 60 do 90 mg każdej próbki tkanki do probówki do lizy i dodaj 500 µL PBS z 8 M mocznikiem. Zhomogenizuj próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego.Usunąć homogenat tkanki z probówki do lizy i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi. Przepłukać probówkę do lizy od 100 do 500 µL PBS z 8 M mocznikiem, a następnie połączyć roztwór z płukania z homogenatem tkanki. Wirować homogenat tkanki przez 15 minut.Zберите supernatant z każdej próbki. Po przeprowadzeniu analizy BCA w celu oznaczenia stężenia białek, przenieście 100 µg białka z każdej próbki do osobno oznakowanych probówek do mikrocentryfugi. Do każdej próbki dodaj ditiotreitol.Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Do każdej próbki dodać jodoacetamid (IAM) i inkubować na lodzie w ciemności przez dwie godziny. Następnie do każdej próbki dodać L-cysteinę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po 30 minutach należy dodać bufor Tris z chlorkiem wapnia, aby rozcieńczyć mocznik do stężenia końcowego 2 M. Do każdej próbki należy dodać trypsynę traktowaną L1-tosyl-L-fenyloalanino-L-argininą (TPCK). Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.Następnego dnia należy przerwać trawienie białek poprzez szybkie zamrożenie próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki. Przed znakowaniem dimetylowym próbki peptydów są odsalane, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i suszone za pomocą wirówki próżniowej. Aby rozpocząć procedurę znakowania dimetylowego, należy zrekonstytuować peptydy w 1% kwasie octowym rozpuszczonym w wodzie klasy HPLC lub nanopure.Przenieś porcję 50 µg każdej z próbek do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Pozostałą część zrekonstytuowanych peptydów przechowuj w temperaturze -80 °C do przyszłych eksperymentów. W krokach, które zostaną zaprezentowane w dalszej części, kluczowe jest szybkie dodawanie odczynników, aby reakcje aktywacji chemicznej przebiegały przez ten sam czas we wszystkich próbkach.Do próbek przeznaczonych do znakowania lekką dimetylacją należy dodać 8 µL 60 mM roztworu formaldehydu. Do próbek przeznaczonych do znakowania ciężką dimetylacją należy dodać 8 µL 60 mM roztworu formaldehydu znakowanego izotopami węgla 13 i deuteru. Do próbek znakowanych lekką dimetylacją należy dodać 8 µL 24 mM cyjanoborowodorku sodu.Do próbek oznaczonych ciężką dimetylacją dodać 8 µL 24 mM cyjanoborowodorku sodu. Próbki wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie delikatnie potrząsać na wytrząsarce do probówek przez około 10 minut w temperaturze pokojowej. Reakcje zatrzymać, dodając 16 µL 1% amoniaku na pięć minut.Ponownie zakwaszyć mieszaniny reakcyjne, dodając 8 µL 5% kwasu mrowieniowego. Połączyć peptydy dimetylowane lekkie i ciężkie, aby przygotować łącznie sześć próbek. Przeprowadzić odsalanie próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie należy wysuszyć próbki za pomocą wirówki próżniowej. Aby rozpocząć znakowanie izobaryczne próbek dimetylowanych, w pierwszej kolejności należy zrekonstytuować 100 µg dimetylowanych peptydów w buforze wodorowęglanu trietylammonium, czyli TEAB. Następnie należy przygotować odczynniki izobaryczne zgodnie z protokołem producenta zestawu do znakowania izobarycznego.Dodaj odpowiednią objętość, w tym przypadku 41 µL rozpuszczonego odczynnika do znakowania izobarycznego do każdej z próbek peptydów i wymieszaj w wstrząsarku typu vortex przez około 10 sekund. Inkubuj próbki na wstrząsarce do probówek do mikrocentryfugi przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przerwać reakcje, dodaj 8 µL hydroksyloaminy do każdej próbki.Następnie inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Połącz sześć oznakowanych próbek w jedną mieszaninę i przeprowadź odsolenie. Przygotuj peptydy do chromatografii cieczowej, rekonstytuując je w wodzie klasy do spektrometrii mas z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego.Przenieś zrekonstytuowane peptydy do probówki do mikrocentryfugi zawierającej filtr 0,65 µm. Następnie wiruj z prędkością 12 000 ×g przez jedną minutę. Wyjmij i wyrzuć filtr.Przenieś przefiltrowane peptydy do fiolki do autopróbnika. Wstrzyknij 6 µL każdej próbki frakcji z silnej wymiany kationowej na kolumnę pułapkową. Wypełnij ją do 2 cm materiałem C18.Uruchom metody spektrometru mas dla rozdzielania analitycznego i akwizycji danych. Przeprowadzono analizę cPilot 12-plex tkanek mózgu, serca i wątroby z modelu mysiego choroby Alzheimera oraz kontroli typu dzikiego. Dane prekursorów wykazały lekkie i ciężkie peptydy dimetylowane reprezentowane przez piki przy m/z 643,854 i 647,875.Peptydy te zostały wybrane, wyizolowane niezależnie i poddane fragmentacji metodą dysocjacji indukowanej zderzeniami w celu wygenerowania tych widm. Wyniki wyszukiwania wykazały, że piki należą do peptydu białka fosfoglicerynianowej kinazy 1. Piki te zostały poddane dalszej izolacji w celu przeprowadzenia tandemowej spektrometrii mas z wykorzystaniem dysocjacji zderzeniowej o wysokiej energii, a jony reporterowe są widoczne zgodnie z przedstawionym schematem.Oba zestawy widm spektrometrii mas trzystopniowej są niezbędne do uzyskania informacji na temat 12 próbek. W tym przykładzie stosunki jonów dla choroby Alzheimera do kontroli typu dzikiego są podobne w dwóch powtórzeniach biologicznych dla tkanek mózgu, wątroby i serca. Wartości krotności zmiany (fold change) dla każdego porównania sugerują, że poziomy kinazy fosfoglicerynianowej 1 w mózgu i sercu są wyższe u myszy z chorobą Alzheimera, ale niższe w wątrobie.Po opanowaniu tej techniki, prawidłowo wykonana procedura zajmuje około pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy zwrócić szczególną uwagę na ostrożność w obchodzeniu się z próbkami. W ramach tej procedury można zastosować metody rozdziału, takie jak silna wymiana kationowa lub frakcjonowanie przy wysokim pH, w celu zwiększenia głębokości i zakresu analizy w ciągu doby.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zwiększyć multipleksowanie próbek przy użyciu C-Pilot.

enhanced-sample-multiplexing-tissues-using-combined-precursor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę cPILOT do multipleksowania próbek w badaniach proteomicznych choroby Alzheimera. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek tkankowych, redukując błędy i czas analizy instrumentalnej.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT) (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Przeglądaj więcej filmów