Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie pochłaniania danych presynaptycznych przez mikroglej. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie fluorescencyjnych znaczników klasy przedniej do oczu w celu oznaczenia presynaptycznych wejść komórek zwojowych siatkówki w bocznym jądrze narządowym. Drugim krokiem jest przeanalizowanie, naprawienie i zrównoważenie mózgu.

Następnie mózg jest dzielony na sekcje. Ostatnim krokiem jest zamontowanie sekcji mózgu na wardze zakrywającej w celu obrazowania i analizy. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do oceny pochłaniania danych presynaptycznych przez mikroglej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób gleby fagocytarne przyczyniają się do plastyczności i przebudowy obwodów synaptycznych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w przebudowę obwodów synaptycznych w zdrowym mózgu, może być również stosowana do innych systemów, takich jak przebudowa obwodów synaptycznych podczas choroby układu nerwowego. Procedurę zademonstrują technik Chris Heller i Emily Laman, doktorantka z Laboratorium Stevensa.

Rozpocznij tę procedurę od znieczulenia myszy 4% fluorem ISO w komorze indukcyjnej z pleksiglasu. Po jednej do trzech minut upewnij się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia, ściskając ogon. Następnie umieść mysz na boku pod mikroskopem stereoskopowym i umieść stożek nosowy, który dostarcza od trzech do 4% fluoru ISO na pysk.

Aby odsłonić twardówkę, użyj małych nożyczek sprężynowych, aby otworzyć powiekę i odciągnąć skórę. W przypadku noworodków czasami konieczne jest kolejne prostopadłe cięcie w kąciku oka. Zachowaj ostrożność podczas obcinania kącika powieki, ponieważ znajduje się tam naczynie krwionośne.

Użyj sterylnej igły o rozmiarze 30,5, aby przebić mały otwór z boku oka, w którym zaczyna się twardówka. Należy uważać, aby nie uszkodzić soczewki, wkładając igłę na tyle głęboko, aby skos wszedł do oka. Pozwól ciału szklistemu wypłynąć z otworu i użyj sterylnego aplikatora z nacięciem i końcówką, aby wchłonąć płyn.

Gdy ciało szkliste przestanie wypływać z otworu, powoli włóż igłę przymocowaną do strzykawki Hamiltona, która została wstępnie załadowana śledzeniem stopnia przedniego. Barwnik do otworu, powoli wstrzyknij barwnik do oka. Zazwyczaj podjednostka beta toksyny sprzężona z Alexa 5 94, 6 47 lub 4 88 jest używana do stopnia przedniego.

Późne wejścia R GC Pozostaw igłę w otworze na kilka sekund, a następnie powoli ją wyjmij. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć nadmiar płynu i zapobiec wyciekaniu barwnika. Następnie nałóż niewielką ilość maści z antybiotykiem na oko.

Jeśli oko zostało otwarte chirurgicznie. Po wstrzyknięciu delikatnie ustawić powieki razem. Pozostaw mysz pod lampą grzewczą lub na poduszce grzewczej, aż zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu.

Umieść mysz w czystej klatce domowej i monitoruj ją, aby upewnić się, że jest w pełni obudzona przed powrotem do kolonii. Około 24 godziny po wstrzyknięciu należy złożyć ofiarę myszy i przeprowadzić sekcję mózgu. Następnego dnia umieść mózg w probówce Falcona wypełnionej 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wypłucz mózg trzy razy w PBS, najpierw wlewając mózg i PFA do pustej łódki serwatkowej, a następnie użyj szpatułki, aby przenieść mózg do innej łodzi serwatkowej wypełnionej PBS. Umyj mózg jeszcze dwa razy w PBS przed przeniesieniem go do probówki Falcon wypełnionej 30% roztworem sacharozy. Pozostaw go w sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż opadnie na dno probówki.

Następnie usuń wszystkie części mózgu, które nie są potrzebne, za pomocą żyletki. Zamroź mózg na kawałku folii aluminiowej na suchym lodzie. W międzyczasie zamroź etap mikrotomu i napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki pół mililitra 0,1 molowego PP, aby zamontować zamrożony mózg na etapie zamrażania.

Nałóż niewielką ilość OCT na scenę. Gdy OCT zacznie zamarzać, połóż w nim mózg. Strona mózgu, która zostanie przecięta, powinna być skierowana do góry.

Następnie przykryj mózg i OCT bardzo drobno pokruszonym suchym lodem. Pozostaw suchy lód na mózgu na około 30 sekund. Następnie użyj dużego pędzla, aby usunąć suchy lód.

Rozpocznij krojenie plastrów o grubości 40 mikronów. Następnie za pomocą małego wilgotnego pędzla usuń z ostrza sekcje zawierające obszar zainteresowania i przenieś je na 24-dołkową płytkę zawierającą 0,1 mola pb. Po zebraniu skrawków zwizualizuj oznaczenie stopnia przedniego pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym i wybierz sekcje, które zawierają obszar zainteresowania, aby zamontować sekcje na szkiełku.

Najpierw nałóż małą pulę 0,1 mola PB do naładowanego mikroskopu. Przesuń następnie, przenieś skrawki tkanki do puli pb. Następnie za pomocą pędzla ustaw orientację i rozprowadź chusteczki.

Użyj chusteczki Kim, aby usunąć XSPB i uważaj, aby nie odsączyć się z sekcji. Pozostaw je do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Następnie nałóż niewielką kroplę medium montażowego na każdą sekcję i zamontuj szkiełko nakrywkowe na górze na końcu.

Uszczelnij krawędzie szkiełka lakierem do paznokci. Przechowuj szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu pokazania sesji obrazowania. Oto schemat strategii śledzenia nachylenia przedniego.

Wejścia RGC lewego i prawego oka są śledzone odpowiednio za pomocą CTB 6 47 i CTB 5 94. Następnie ocenia się pochłanianie danych wejściowych za pośrednictwem mikrogleju. Oto reprezentatywny obraz DLGN myszy w małym powiększeniu po urodzeniu w piątym dniu po prześledzeniu międzystopniowym danych wejściowych lewego i prawego oka.

Jest to mikroglej pobrany z obszaru granicznego danych wejściowych lewego i prawego oka. Cała fluorescencja CTB poza objętością mikrogleju została odjęta, odsłaniając wejścia RGC, które zostały pochłonięte, oraz renderowanie powierzchni mikrogleju i pochłonięte. Wejścia RGC są pokazane tutaj.

Oto reprezentatywna powierzchnia wyrenderowana mikrogleju myszy P 5, P 9 i P 30. Pochłanianie DLGN danych wejściowych RGC jest znacznie zwiększone podczas szczytowego przycinania w DLGN w porównaniu ze starszym wiekiem. Mikroglej od myszy z niedoborem receptora dopełniacza trzy pochłania znacznie mniej danych wejściowych RGC w porównaniu z dzikimi kolegami z miotu po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łączyć neurony etykietowania i oceniać interakcje synaps mikrogleju.