Name: Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji pochłaniania materiału synaptycznego przez mikroglia za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia szybką analizę aktywności mikroglia w tkance mózgu myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Reginie Piske za pomoc techniczną w izolacji mikrogleju oraz dr Caio Andreta Figueiredo za pomoc w pozyskiwaniu obrazów mikroskopowych na rysunku uzupełniającym S1. Dziękujemy placówce FACS MDC za wsparcie techniczne. Niniejszy manuskrypt częściowo przedstawia reprezentatywne dane przedłożone do czasopisma Brain, Behavior and Immunity Journal w 2024 roku. Rysunek 1A, rysunek 2A i rysunek uzupełniający S3A zostały utworzone przy użyciu BioRender.com.

Ogólny widok procedury eksperymentalnej jest graficznie zilustrowany w Rysunek 1A. Wszystkie doświadczenia związane z obchodzeniem się z żywymi zwierzętami zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt i zostały zatwierdzone przez Regionalne Biuro ds. Zdrowia i Opieki Społecznej w Berlinie (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Niemcy). Myszy trzymano w grupach w wentylowanych klatkach w standardowych warunkach laboratoryjnych z cyklem światła/ciemności trwającym 12:12 godzin w ośrodku dla zwierząt w Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka (MDC). Żywność i wodę dostarczano ad libitum. Patrz Tabela 1 dla składu i odczynników oraz Tabela materiałów dla szczegółowych informacji dotyczących wszystkich odczynników, przyrządów i materiałów użytych w tym protokole. W przypadku testu specyficznego dla vGLUT1 użyliśmy terminu in vivo* w całym manuskrypcie, aby potwierdzić, że cytometria przepływowa wymaga homogenizacji tkanek i izolacji komórek, a mikroglej wykazuje około 95% żywotności po procedurze izolacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B i rysunek uzupełniający S1). Dlatego zachowują zdolność do pochłaniania materiału synaptycznego ex vivo, przez krótki czas, aż do utrwalenia. W związku z tym oznaczanie ilościowe mikrogleju vGLUT1+ obejmuje zarówno in vivo, jak i krótkotrwałe pochłanianie ex vivo aż do etapu utrwalenia.
1. Wewnątrzkomórkowe barwienie vGLUT1 do wykrywania in vivo* pochłonięcia synaps glutaminergicznego przez mikroglej
UWAGA: Poniższa procedura izolacji komórek została zaadaptowana z16. Wszystkie etapy izolacji komórek powinny być przeprowadzane na lodzie.
<ol>
	<li>Znieczulić myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu. Perfuzję myszy dosercowo za pomocą 10 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) przez ~ 2 min. 
	UWAGA: Na próbkę przypada jedna mysz (n).</li>
	<li>Wyjmij mózg z czaszki i zachowaj go w 1 ml pożywki z komórek nerwowych. 
	UWAGA: Pożywka komórek nerwowych, taka jak pożywka Hibernate-A, jest stosowana w celu zapewnienia wysokiej żywotności komórek po procesie dysocjacji tkanek.</li>
	<li>Przenieś mózg na szalkę Petriego wypełnioną 1 ml lodowatego podłoża z komórek nerwowych i rozkrój hipokampy, jak opisano wcześniej17.</li>
	<li>Przenieś hipokampy do homogenizatora Dounce wypełnionego 1 ml pożywki z komórek nerwowych i oddziel tkankę za pomocą luźnego tłuczka około ~25 delikatnymi pociągnięciami.</li>
	<li>Umieść sitko o wielkości 70 μm na probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml i dodaj 500 μl pożywki z komórek nerwowych. Przenieść homogenat tkankowy do probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml przez sitko.</li>
	<li>Przepłukać homogenizator Dounce 2x 1 ml zimnej pożywki z komórek nerwowych i odwirować próbki o masie 400 × g przez 8 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl lodowatego DPBS za pomocą delikatnego pipetowania. Zapewnić jednorodną zawiesinę i uzupełnić końcową objętość do 1,5 ml za pomocą DPBS.</li>
	<li>Dodać 500 μl izotonicznego roztworu Percollu do próbki, delikatnie ją zawiesić i zalać kolejnymi 2 ml zimnego DPBS.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 3 000 × g przez 10 minut przy pełnym przyspieszeniu i bez hamowania. Odessać górną warstwę, a także krążek mielinowy w środkowej fazie. 
	UWAGA: Wszystkie poniższe etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 oC, o ile nie określono inaczej.</li>
	<li>Dodać 4 ml zimnego DPBS i odwirować próbki o masie 400 × g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu barwiącego o żywotności, który można utrwalić, a następnie inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnego DPBS do próbki i odwirować próbki o masie 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i dodać 100 μl roztworu barwiącego CD16/CD32 (1/200 w buforze FACS). Wirować przez ~5 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Barwienie CD16/CD32 to obróbka wstępna mająca na celu zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciał z komórkami zawierającymi FcR, takimi jak mikroglej, przed zastosowaniami takimi jak cytometria przepływowa.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS do próbki i odwirować w stężeniu 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i dodać 100 μl wzorcowej mieszaniny barwienia I (1/100 anty-CD11b/ anty-CD45 + 1/200 anty-Ly6C/ anty-Ly6G w 1x buforze FACS). Próbki należy inkubować przez 20 minut w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS do próbki i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 250 μl buforu utrwalającego. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 25 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1x buforu do permeabilizacji (PERM) i odwirować 300 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 100 μl vGLUT1 lub kontrolnego roztworu barwiącego izotyp. Wirować przez ~5 s i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 50 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1x buforu PERM i odwirować 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml buforu FACS do próbek.</li>
	<li>Wirować przy 300 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS i przepuścić próbki przez filtr siatkowy o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Analizuj intensywność fluorescencji vGLUT1 z pojedynczego/żywotnego/CD11b++/CD45+ mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. Używaj makrofagów śledziony jako kontroli negatywnej dla każdego eksperymentu.
	<ol>
		<li>Wyizoluj śledziony, delikatnie uciskając dwukrotnie zmieloną tkankę śledziony przez filtr siatkowy o średnicy 70 μm. Przepłukać filtry 40 ml DPBS i zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować 350 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić powstały osad w 1 ml roztworu buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Dodać 10 ml DPBS do próbki po inkubacji i odwirować przy 350 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z krokami barwienia opisanymi w krokach 1.11 i 1.17. 
		UWAGA: Strategia bramkowania jest przedstawiona na rysunku uzupełniającym S2 w celu zdefiniowania makrofagów śledziony jako CD11b ++/ CD45 ++/ Żywotna populacja komórek.</li>
		<li>Strategia bramkowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
		<ol>
			<li>Bramka pierwotna: Dostosuj obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) [oś x] i obszar rozproszenia bocznego (SSC-A) [oś y], aby uwzględnić populację mikrogleju w obszarze bramkowanym i wykluczyć szczątki komórkowe.</li>
			<li>Dostosuj obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) [oś x] i wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) [oś y], aby wykluczyć dublety. Podkoszulki pojawiają się jako przekątna na tym wykresie kropkowym.</li>
			<li>Dostosuj CD11b-PECy7 [oś y] i CD45-APC [oś x] i bramkować populację z wysokim poziomem powierzchniowym CD11b i średnim poziomem CD45 jako mikroglejem.</li>
			<li>Wyklucz martwe komórki w bramce ujemnej FITC [oś y]. OPCJONALNIE: Wyklucz również komórki, które są dodatnie dla Ly6C- i Ly6G-FITC w bramce FITC-ujemnej, aby wykluczyć makrofagi związane z OUN z analizy. 
			UWAGA: W przeciwieństwie do żywych komórek, martwe komórki z uszkodzonymi błonami umożliwiają przedostanie się do cytoplazmy możliwego do utrwalenia barwnika żywotności, co zwiększa ilość znakowania białek18. W związku z tym martwe komórki będą jaśniejsze niż żywe komórki, które są zawarte w zdefiniowanej bramce.</li>
			<li>Dostosuj CD45-APC [oś x] i vGLUT1-PE [oś y]; populacja, która znajduje się powyżej bramki progowej, w której nie wykryto żadnych pozytywnych zdarzeń w próbce śledziony (wewnętrzna biologiczna kontrola ujemna, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1E) jest uważana za frakcję vGLUT1-dodatnią w próbce.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie in vitro pochłaniania surowych synaptosomów przez mikroglej
<ol>
	<li>Surowy preparat synaptosomów i znakowanie czerwienią pHrodo 
	UWAGA: Wszystkie poniższe kroki powinny odbywać się na lodzie.
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki od 1.1 do 1.2.</li>
		<li>Przenieś mózg na szalkę Petriego wypełnioną 1 ml lodowatej pożywki z komórek nerwowych i ostrożnie przeprowadź sekcję hipokampa. Zawsze trzymaj szalkę Petriego na lodzie. W następnym kroku użyj hipokampów do izolacji mikrogleju.</li>
		<li>Przenieś resztę mózgu (z wyjątkiem móżdżku i opuszki węchowej) do homogenizatora Dounce wypełnionego 1 ml odczynnika do ekstrakcji białek synaptycznych i delikatnie dysocjuj tkankę za pomocą luźnego tłuczka z około ~30 uderzeniami. Uzupełnij jedną tabletkę inhibitora proteazy na 10 ml odczynnika ekstrakcyjnego i wyizoluj synaptosomy zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Odczynniki do ekstrakcji białek synaptycznych, takie jak SynPER19, są używane do przygotowania synaptosomów, które zawierają biologicznie aktywne białka pre- i postsynaptyczne.</li>
		<li>Rozpuść surowy osad synaptosomu w 500 μl 0,1 M Na2roztworu CO3 . Wybarwić próbkę synaptosomu 10 μl 0,2 mM czerwieni pHrodo. Surowe próbki synaptosomów inkubować w temperaturze pokojowej (24–25 °C) przez 1,5 godziny, delikatnie mieszając.</li>
		<li>Dodać 1 ml zimnego DPBS do próbki, odwirować przez 1 minutę z pełną prędkością (20,815 × g) i zassać supernatant.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.5 łącznie 7 razy, aby usunąć z próbek nadmiar nadmiaru czerwieni pHrodo.</li>
		<li>Po ostatnim wirowaniu należy wykonać standardowy test BCA w celu ilościowego określenia stężenia białka w próbce.</li>
		<li>Opcjonalnie: zatrzaskowe zamrożenie próbek synaptosomów w DPBS z 5% DMSO przy użyciu ciekłego azotu i przechowywanie ich przez 3 tygodnie w temperaturze -80 °C. Przykryj probówki folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próba in vitro surowego wchłonięcia synaptosomów przy użyciu świeżo wyizolowanego dorosłego mikrogleju
	<ol>
		<li>Przygotować płyn CSF i zrównoważyć go z 95% O2:5% CO2 przez 30 min. 
		UWAGA: W przypadku kroków 2.2.2-2.2.4 należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania roztworu do trawienia na bazie papainy.</li>
		<li>Dodać 4 ml płynu mózgowo-rdzeniowego do fiolki nr 2 w zestawie do papainy. Umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na ~10 minut, aż roztwór papainy stanie się klarowny.</li>
		<li>Dodać 400 μl płynu mózgowo-rdzeniowego do fiolki 3 w zestawie do papainy. Mieszać delikatnie ~10 razy, powoli pipetując.</li>
		<li>Dodać 200 μl z fiolki 3 do fiolki 2 (zrekonstruowanej w kroku 2.2.3). Zachowaj pozostałą część fiolki 3.</li>
		<li>Weź hipokampy wypreparowane w kroku 2.1.2 i zmiel rozcięte hipokampy za pomocą skalpela.</li>
		<li>Przenieść rozdrobnione hipokampy do probówki dysocjatora tkanek wypełnionej 2 ml roztworu enzymu przygotowanego w kroku 2.2.5. Umieścić rurkę w dysocjatorze tkankowym i uruchomić program: 37C_ABDK_01 (trwa ~30 min).</li>
		<li>Umieścić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na ~20 minut i rozcierać mieszaninę co 5 minut za pomocą pipety o pojemności 1 ml, nie pozostawiając żadnych pęcherzyków. 
		UWAGA: Proces ten należy kontynuować, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana i stanie się całkowicie jednorodna, aby zapewnić skuteczną dysocjację. Wszystkie poniższe etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 o °C, chyba że określono inaczej.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć mętną zawiesinę komórkową do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.</li>
		<li>W ciągu tych 5 minut należy przygotować następującą mieszaninę do przemywania (5 ml) na próbkę; dodać 500 μl odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidu dostarczonego w zestawie do papainy do 4,5 ml aCSF. Dodać pozostały roztwór z fiolki 3 z kroku 2.2.5 do mieszanki do mycia.</li>
		<li>Odrzucić supernatant z etapu 2.2.8 i natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze mieszającym do przemywania (wash).</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez filtr 70 μm do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 5 ml. Odwirować próbki o masie 300 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Kontynuuj etap wirowania gradientowego Percoll opisany wcześniej w krokach 1.7-1.9.</li>
		<li>Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym MACS, powoli pipetując w górę iw dół. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu MACS do każdej próbki i odwirować przy 300 × g przez 8 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu MACS.</li>
		<li>Umieść kolumny wyboru dodatniego w separatorze magnetycznym. Zrównoważyć kolumny, przepłukując je 3 ml buforu MACS.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać i nanieść 500 μl zawiesiny komórek na kolumnę. Przemyć kolumny 3x 3 ml buforu MACS.</li>
		<li>Wyjmij kolumny z separatora magnetycznego i umieść je na stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml buforu MACS do kolumny i natychmiast wypłucz komórki za pomocą pulchnika. Odwirować próbki o masie 300 × g przez 10 minut.</li>
		<li>W tym okresie przygotuj 20 ml 40% FBS w DPBS. Podgrzej 1 ml DMEM na próbkę w temperaturze do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Rozpuść końcowe osady komórkowe w 1 ml wstępnie podgrzanego DMEM. Wysiewaj około ~150 000-200 000 komórek w 500 μl podgrzanego DMEM na dołek na 24-dołkowej płytce. Jako kontrolę, zasiej podobną liczbę komórek w 1-2 dodatkowych dołkach. Sprawdź zbieganie się komórek we wszystkich studzienkach za pomocą mikroskopu świetlnego. 
		UWAGA: Jeśli docelowym regionem mózgu jest hipokamp lub porównywalnie małe obszary mózgu, można zebrać 5 myszy na próbkę (n), aby wyizolować ~ 150 000 mikrogleju. Dla całego mózgu wystarczy 1 mysz na n, aby uzyskać podobną liczbę komórek przy użyciu obu protokołów izolacji. Alternatywnie, ~ 40 000 komórek można posiać na 96-dołkowych płytkach w końcowej objętości 100 μl, aby rozpocząć test pochłaniania. Zmniejsza to liczbę analizowanych komórek, ale także zmniejsza liczbę myszy używanych na n. Niedobór białka spowodowany brakiem FCS w DMEM wywoła fagocytozę.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1-2 godziny w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ). 
		UWAGA: Ten krok ma na celu odzyskanie sił po podatnych na stres skutkach procedury izolacji przed rozpoczęciem testu funkcjonalnego pochłaniania.</li>
		<li>Bardzo powoli wyjmij 250 μl pożywki z każdej studzienki, dodaj 250 μl świeżego, wstępnie podgrzanego DMEM do każdej studzienki i dodaj 3 μg synaptosomów znakowanych czerwono pHRodo na wierzchu. Sprawdź zbieg komórek we wszystkich studzienkach za pomocą mikroskopu świetlnego.
		<ol>
			<li>W przypadku studzienek kontroli ujemnej dodaj taką samą ilość nieznakowanych synaptosomów do ekstra dobrze obsianych komórkami.</li>
			<li>W przypadku studzienek testowych należy upewnić się, że studzienka 1 zawiera tylko komórki; studzienka 2 zawiera komórki + nieznakowane synaptosomy; studzienka 3 zawiera komórki + 3 μg czerwieni pHrodo; studzienka 4 zawiera DMEM + 3 μg czerwieni pHrodo.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować komórki z synaptosomami przez 2 godziny w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ).</li>
		<li>Wyjmij pożywkę i umyj studzienki zimnym DPBS. Dodaj 200 μl roztworu trypsyny/EDTA na dołek, aby odłączyć komórki na 35 sekund.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 40% FBS w DPBS na studzienkę i przenieś komórki do probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml przez sitko. Podczas tego procesu utrzymuj zarówno płytkę, jak i rurkę na lodzie, aby ułatwić odłączanie komórek.</li>
		<li>Umyj każdą studzienkę 2x za pomocą 500 μl lodowatego DPBS. Odwirować pobrane próbki o masie 500 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić komórki w roztworze barwiącym zawierającym 1/200 CD16/CD32 w 100 μl buforu FACS i inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Po inkubacji dodać CD11b i CD45 do roztworu barwiącego o końcowym stężeniu 1/100 z każdego z nich. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Przemyć próbki 1 ml buforu FACS i odwirować je z stężeniem 300 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w 250 μl buforu FACS i zarejestrować co najmniej 100 000 zdarzeń za pomocą cytometrii przepływowej. Analizuj intensywność fluorescencji czerwieni pHrodo z mikrogleju CD11b++/CD45+.</li>
		<li>Strategia bramkowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C)
		<ol>
			<li>Dostosuj bramkę główną: Obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) [oś x] i obszar rozproszenia bocznego (SSC-A) [oś x], aby uwzględnić populację mikrogleju w obszarze bramkowanym i wykluczyć szczątki komórkowe.</li>
			<li>Dostosuj obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) [oś x] i wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) [oś y], aby wykluczyć dublety. Podkoszulki pojawiają się jako przekątna na tym wykresie kropkowym.</li>
			<li>Dostosuj CD11b-PECy7 [oś y] i CD45-APC [oś x] i bramkuj populację z wysokim poziomem powierzchniowym CD11b i średnim poziomem CD45 jako mikroglej.</li>
			<li>Obliczyć medianę intensywności fluorescencji pHrodo-PE z tej populacji. Użyj tych samych komórek inkubowanych z nieznakowanymi synaptosomami jako kontroli negatywnej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Flow Cytometry-Based Assays for Microglial Engulfment of Synaptic Materials

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contribute+to+circuit+defects+in+Mecp2+null+mice+independent+of+microglia-specific+loss+of+Mecp2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression.</a> eLife. 5, e15224(2016).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Filipello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+innate+immune+receptor+TREM2+is+required+for+synapse+elimination+and+normal+brain+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The microglial innate immune receptor TREM2 is required for synapse elimination and normal brain connectivity.</a> Immunity. 48 (5), 979-991 (2018).</li>
<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nat Med. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), New York, N.Y. 712-716 (2016).</li>
<li>Di Liberto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+under+T+cell+attack+coordinate+phagocyte-mediated+synaptic+stripping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons under T cell attack coordinate phagocyte-mediated synaptic stripping.</a> Cell. 175 (2), e19 458-471 (2018).</li>
<li>Bisht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+microglia%3A+A+new+phenotype+predominantly+associated+with+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states.</a> Glia. 64 (5), 826-839 (2016).</li>
<li>Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+the+hippocampus+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3349(2022).</li>
<li>Aw, E., Zhang, Y., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+responses+to+peripheral+type+1+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial responses to peripheral type 1 interferon.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 340(2020).</li>
<li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+synaptic+proteins+in+microglia+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of synaptic proteins in microglia by flow cytometry.</a> Front Mol Neurosci. 13, 149(2020).</li>
<li>Norris, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JEM%22%5BJournal%5D)">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).</li>
<li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal%2C+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sci%22%5BJournal%5D)">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799(2022).</li>
<li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024).</li>
<li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793</a> (2024).</li>
<li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li>
<li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024).</li>
<li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405(2018).</li>
<li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228(2018).</li>
<li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li>
<li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937(2021).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+J.+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Easthope, E. Strategies for intracellular flow cytometry success. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022).</li>
<li>Paduano, F. Isotype control antibodies, Key points. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore</a> (2024).</li>
<li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024).</li>
<li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEAST%3A+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015(2023).</li>
<li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).</li>
<li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Udoskonalanie synaps poprzez interakcję mikrogleju-synapsy jest intrygującym obszarem badań w dziedzinie neuroimmunologii, oferującym obiecujące informacje na temat roli mikrogleju w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych. W 2011 r.; Paolicelli i wsp. dostarczyli dowodów na obecność materiału synaptycznego w mikrogleju, rzucając światło na ich udział w procesie pochłaniania synaps4. W innym intrygującym badaniu wykorzystano obrazowanie poklatkowe i organotypowy model hodowli wycinków mózgu ex vivo i stwierdzono, że mikroglej angażuje się w proces fagocytarny znany jako trogocytoza, w którym pochłania struktury presynaptyczne, a nie całą strukturę synaptyczną23. Niedawna publikacja wykorzystująca nowy transgeniczny model myszy, który umożliwia pomiar fagocytozy w nienaruszonej tkance, wykazała przycinanie przez glej Bergmanna in vivo po uczeniu motorycznym24. W związku z tym istnieją wystarczające dowody wskazujące na udział komórek glejowych w pochłanianiu synaptycznem, w tym mikrogleju. Jednak stopień, w jakim ta funkcja mikrogleju wpływa na dynamiczny i selektywny proces przycinania synaptycznego, wymaga dalszych dowodów.
Niemniej jednak kwantyfikacja objęcia synaps przez mikroglej służy jako cenny wskaźnik i zapewnia częściowy wgląd w złożoną dynamikę interakcji mikroglej-synaps, zwłaszcza udoskonalenia synaptycznego. Kompleksowy przegląd podsumował obecne protokoły stosowane do badania pochłaniania synaps przez mikroglej25. Pragniemy podkreślić, że nasze protokoły są optymalizowane w oparciu o istniejące protokoły, które są już używane. Metody przedstawione w tym badaniu zapewniają szybką i wysokoprzepustową kwantyfikację mikrogleju obejmującego synapsy w różnych wypreparowanych obszarach mózgu. W zależności od regionu mózgu, analiza co najmniej 10 000 komórek mikrogleju w ciągu maksymalnie dwóch dni jest możliwa dla obu metodologii, co czyni je cennymi dla równoległego testowania wielu modeli myszy.
Przyznajemy, że oznaczanie ilościowe mikrogleju vGLUT1+ obejmuje zarówno in vivo , jak i krótkotrwałe pochłanianie ex vivo aż do etapu fiksacji. Dlatego sugerujemy, że nasz test przedstawia szybki i niezawodny sposób ilościowego oznaczania materiału synaptycznego wewnątrz mikrogleju jako pierwszy krok przed walidacją in vivo przy użyciu podejść takich jak IHC.
Kolejną wadą analizy za pomocą cytometrii przepływowej jest ograniczona dostępność przeciwciał dla markerów synaptycznych, szczególnie dla synaps hamujących. Trudno jest znaleźć komercyjnie dostępne, bezpośrednio sprzężone przeciwciała, które wykazują jasny sygnał dla tych markerów. Biorąc pod uwagę długi czas optymalizacji wymagany do przetestowania różnych przeciwciał ukierunkowanych na markery synaptyczne, ważne jest, aby podzielić się ze społecznością naukową dobrze zoptymalizowanymi procedurami barwienia wewnątrzkomórkowego różnymi przeciwciałami, tak jak robimy to w tym badaniu.
Jeśli chodzi o analizę danych w tym badaniu, użyliśmy kontroli izotypu jako technicznych kontroli ujemnych, aby uwzględnić niespecyficzne wiązania przeciwciała vGLUT1, ponieważ zapewniają one oszacowanie niespecyficznego wiązania przeciwciała w próbce, jednocześnie optymalizując testy oparte na cytometrii przepływowej26. Jednak kontrole izotypowe zostały w większości zoptymalizowane pod kątem wykrywania niespecyficznego sygnału tła z procedur barwienia powierzchni i nie są optymalne dla kontroli barwienia wewnątrzkomórkowego 27,28. Dlatego nie należy na nich polegać w celu rozróżnienia między populacjami negatywnymi i pozytywnymi podczas barwienia wewnątrzkomórkowego, które obejmuje etapy utrwalania i przepuszczalności, które mogą wpływać na wykrywanie antygenu, autofluorescencję i jasność fluoroforu29. Takie procedury barwienia wewnątrzkomórkowego wymagają zastosowania odpowiednich biologicznych kontroli wewnętrznych w celu określenia dodatniej populacji komórek wybarwionych na obecność markera wewnątrzkomórkowego29. Tak więc, biorąc pod uwagę, że stosujemy protokół barwienia wewnątrzkomórkowego, zastosowaliśmy wewnętrzną biologiczną kontrolę negatywną (makrofagi śledziony) i określiliśmy granicę między populacjami pozytywnymi i negatywnymi zgodnie z makrofagami śledziony wyizolowanymi od tych samych myszy. Wyróżniliśmy populację dodatnią powyżej bramy, w której nie ma pozytywnych zdarzeń vGLUT1 z makrofagów śledziony, które służą jako biologiczna kontrola negatywna (ryc. 1).
Obie metody przedstawione w tym badaniu oferują ogromny potencjał do wstępnej analizy objęcia synaps przez mikroglej w szybki i wysokoprzepustowy sposób, analizując ponad 10 000 komórek z małych obszarów mózgu, a to nie jest osiągalne przy użyciu standardowych technik mikroskopowych. Dlatego metody te oferują znaczną przewagę nad metodami pracochłonnymi i czasochłonnymi, a ponadto zapewniają bardziej kompleksową analizę pochłaniania synaptycznego, umożliwiając analizę większej liczby mikrogleju. Ponadto metoda in vitro przedstawiona w tym badaniu jest szczególnie przydatna do testowania wpływu różnych metod leczenia na objęcie synaps przez mikroglej. Umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie wpływu leczenia na mikroglej bez czynników zakłócających związanych z innymi typami komórek. Ponadto służy jako pośrednie podejście do udowodnienia potencjalnego wpływu mikrośrodowiska lub innych typów komórek na proces pochłaniania synaptycznego. Dlatego dochodzimy do wniosku, że metody te, zwłaszcza gdy są stosowane równolegle, oferują intuicyjne i korzystne alternatywy dla analizy pochłaniania mikrogleju przez materiały synaptyczne.
Jednak analiza świeżo wyizolowanego mikrogleju za pomocą testów fagocytarnych ex vivo opartych na FACS może mieć kilka wad. Po pierwsze, bardzo ważne jest zastosowanie dobrze zoptymalizowanych protokołów, które generują świeżo wyizolowany mikroglej z dorosłego mózgu, unikając jednocześnie aktywacji ex vivo i reakcji na stres mikrogleju. Dissing-Olesen i wsp. włączyli zastosowanie inhibitorów transkrypcji i translacji w celu przezwyciężenia tego problemu, stosując procedurę dysocjacji tkanek w temperaturze 37 oC 30. Z drugiej strony Mattei i in. przedstawili zimny, mechaniczny protokół dysocjacji tkanek, aby uniknąć indukowania ekspresji ex vivo genów związanych ze stresem16 i dostosowaliśmy ten protokół w pierwszej sekcji, aby uniknąć aktywacji ex vivo odpowiedzi mikrogleju związanej ze stresem przed wewnątrzkomórkowym barwieniem vGLUT1. Zastosowaliśmy protokół dysocjacji tkanek enzymatycznych w drugiej sekcji przed testem pochłaniania synaptosomów in vitro, biorąc pod uwagę wyższą wydajność mikrogleju po dysocjacji tkanek opartej na papainie (dane nie pokazane). Mikroglej nieuchronnie pozostaje w temperaturze 37 oC w warunkach hodowli podczas inkubacji z synaptosomami, a inkubacja w temperaturze 37 oC może rzeczywiście wywołać zmiany w mikrogleju, co jest powszechną wadą wszystkich testów in vitro i procedur hodowli komórkowych. Dlatego sugerujemy równoległe stosowanie obu prezentowanych protokołów, aby dojść do szerszego wniosku w zakresie objęcia synaps przez mikroglej.
Ponadto ważne jest, aby dokładnie zdefiniować strategię bramkowania w celu wybrania mikrogleju CD11b++/CD45+ , biorąc pod uwagę obecność innych komórek odpornościowych w miąższu mózgu, które również wyrażają te markery31. Co ważniejsze, przy wyborze markerów specyficznie ukierunkowanych na mikroglej (np. TMEM119, P2RY12), ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że mogą one ulegać zmianom w poziomach ekspresji w stanach patologicznych i zapalnych32, a takie zmiany należy rozważyć przed ustanowieniem panelu FACS w celu ilościowego określenia pochłonięcia synaps przez mikroglej. Na koniec należy podkreślić, że żadna z omówionych wcześniej metod, w tym podejścia in vivo oparte na IHC i mikroskopii, nie jest w stanie samodzielnie uchwycić aktywnego i selektywnego przycinania synaps przez mikroglej. Metody te nie są w stanie odróżnić aktywnego przycinania przez mikroglej od biernego wymiatania resztek synaptycznych w miąższu mózgu. Dlatego podczas oceny i omawiania danych konieczne jest wyraźne rozróżnienie między tymi odrębnymi pojęciami.

Mikroglej to komórki odpornościowe rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Stale skanują swoje mikrootoczenie i zapewniają nadzór1,2. Co więcej, często wchodzą w interakcje z synapsami i pośredniczą w precyzyjnym dostrojeniu aktywności synaptycznej 3. W ten sposób stały się kluczowym graczem w procesie udoskonalania synaptyków.
Rola mikrogleju w udoskonalaniu synaps poprzez pochłanianie synaps została wykazana przez różne grupy badawcze3,4,5,6,7. Zakłócenia w tym procesie mogą przyczyniać się do patologii zaburzeń neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych, takich jak schizofrenia i choroba Alzheimera8. Nieprawidłowe udoskonalenie synaps przez mikroglej zostało już wykryte w różnych mysich modelach zaburzeń neurologicznych5,9,10. Dlatego identyfikacja odrębnych mechanizmów leżących u podstaw pochłaniania synaps przez mikroglej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii zaburzeń neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych8.
Ukierunkowanie na pochłanianie synaps przez mikroglej ma ogromny potencjał zarówno do interweniowania w postępie choroby, jak i do uzyskania wglądu w mechanizmy leżące u podstaw zaburzeń neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych. Aby ułatwić takie badania, potrzebne są szybkie i wysokoprzepustowe podejścia. Obecne podejścia metodologiczne obejmują testy in vivo, ex vivo i in vitro, które umożliwiają wykrycie materiału synaptycznego w mikrogleju. Ogólnie rzecz biorąc, wykrywanie pochłaniania synaps przez mikroglej opiera się w dużej mierze na metodach immunohistochemicznych (IHC) i mikroskopowych5,6,11, które są pracochłonne i wykazują ograniczenia w analizie dużej liczby mikrogleju.
Biorąc pod uwagę te ograniczenia techniczne, konieczne jest zbadanie alternatywnych metodologii. Aby temu zaradzić, zoptymalizowaliśmy podejście oparte na cytometrii przepływowej, które umożliwia wydajną, bezstronną i wysokoprzepustową analizę objęcia synaps przez mikroglej. Wybraliśmy hipokamp jako główny obszar zainteresowania ze względu na jego wysoki stopień przebudowy synaps i plastyczności12, ale protokół można dostosować do różnych regionów mózgu. Chociaż cytometria przepływowa była już stosowana w poprzednich badaniach do wykrywania pochłaniania mikrogleju przez synapsy13,14,15, niniejszym przedstawiamy metodologię krok po kroku wykorzystującą obecnie dostępne na rynku, sprzężone z fluoroforem przeciwciało vGLUT1. Ponadto zapewniamy komplementarne podejście in vitro do wysokoprzepustowych badań przesiewowych pochłaniania mikrogleju w materiale synaptycznym przy użyciu surowych synaptosomów.

<table><tbody><tr><td>1 ml Homogenizator Dounce</td><td>Active Motif</td><td>Cat# 40401</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Probówki</td><td>Eppendorf</td><td>Cat# 0030119452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45</td><td>BD</td><td>Cat# 559864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C</td><td>BD</td><td>Cat# 553104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G</td><td>BD</td><td>Cat# 551460</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce</td><td>Cat# 23227</td><td></td></tr><tr><td>C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 Przeciwciało</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#14-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Cytofix/Cytoperm BD</td><td></td><td>Cat# 554714</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp; (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówki z polistyrenu z okrągłym dnem&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>utrwalany barwnik żywotności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# L34969</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A medium</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A1247501</td><td></td></tr><tr><td>LS-columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington</td><td>Cat# LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Th.Geyer</td><td>Cat# 17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11339283</td><td></td></tr><tr><td>pHrodoRed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P36600</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Roche</td><td>Cat# 5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# 11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Steritop E-GP Sterylny system filtracji</td><td>Merck</td><td>Cat# SEGPT0038</td><td></td></tr><tr><td>SynPer Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 87793</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 Przeciwciało</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-120-764</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Mikroglej odgrywa kluczową rolę w udoskonalaniu synaps w mózgu. Analiza objęcia synaps przez mikroglej jest niezbędna do zrozumienia tego procesu; jednak obecnie dostępne metody identyfikacji pochłaniania mikrogleju przez synapsy, takie jak immunohistochemia (IHC) i obrazowanie, są pracochłonne i czasochłonne. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiamy testy in vitro i in vivo*, które umożliwiają szybkie i wysokoprzepustowe ilościowe określenie objęcia synaps przez mikroglej za pomocą cytometrii przepływowej.
W podejściu in vivo* przeprowadziliśmy wewnątrzkomórkowe barwienie vGLUT1 po wyizolowaniu świeżych komórek z mózgów dorosłych myszy, aby określić ilościowo pochłanianie synaps vGLUT1+ przez mikroglej. W teście pochłaniania synaptosomów in vitro użyliśmy świeżo wyizolowanych komórek z mózgu dorosłej myszy do ilościowego określenia pochłonięcia synaptosomów znakowanych czerwono pHrodo przez mikroglej. Protokoły te razem zapewniają efektywne czasowo podejście do ilościowego określania pochłaniania synaps przez mikroglej i stanowią obiecującą alternatywę dla pracochłonnych metod opartych na analizie obrazu. Usprawniając analizę, testy te mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia roli mikrogleju w udoskonalaniu synaps w różnych modelach choroby.

W niniejszym projekcie zoptymalizowano i przedstawiono dwa protokoły służące do pomiaru pochłaniania synaps przez mikroglej in vivo* oraz in vitro. W pierwszym protokole skupiono się na pochłanianiu synaps dodatnich pod kątem vGLUT1 in vivo*. Jako punkt wyjścia wykorzystano wcześniej opublikowany protokół14. Jednakże przeciwciała do FACS użyte w tym protokole nie są już dostępne, dlatego wprowadzono wiele etapów optymalizacji oraz nową metodę izolacji mikrogleju16. Z tego powodu protokół zaprezentowany w niniejszej pracy zasługuje na udostępnienie społeczności naukowej jako kompleksualna aktualizacja dotychczas opublikowanych metod.
W celu ilościowego określenia stopnia pochłaniania synaps przez mikroglej wykorzystano samce myszy C57BL/6N w wieku 11–14 tygodni. Hipokamp wybrano jako główny obszar zainteresowania ze względu na wysoki stopień remodelowania i plastyczności synaptycznej12. Analizie poddano procent mikrogleju wykazującego obecność vGLUT1 oraz intensywność fluorescencji (MFI) vGLUT1-PE specyficzną dla mikrogleju w hipokampie myszy C57BL/6N. Makrofagi śledzionowe pochodzące od tych samych zwierząt posłużyły jako biologiczna kontrola negatywna w każdym doświadczeniu. Przetestowano przeciwciało vGLUT1, wykazując silniejszy sygnał fluorescencji vGLUT1-PE w mikrogleju hipokampa w porównaniu z kontrolą izotypową i makrofagami śledzionowymi (Rysunek 1B-E)
Ponadto porównaliśmy fagocytozę synaps przez mikroglej w móżdżku oraz w opuszce węchowej (jako kolejnym punkcie odniesienia dla wysokiej plastyczności synaptycznej)20. Stwierdziliśmy silniejszy sygnał fluorescencji vGLUT1 w mikrogleju z opuszki węchowej oraz słabszy sygnał w móżdżku w porównaniu do hipokampa (Rysunek 1F). Najniższa intensywność sygnału została wykryta w makrofagach śledziony, które służyły jako wewnętrzna kontrola negatywna (Rysunek 1E). Dodatkowo, aby przetestować immunoreaktywność naszego przeciwciała przeciwko vGLUT1, wykorzystaliśmy myszy Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP. YFP jest ekspresjonowane przez neurony glutaminergiczne u tych myszy, co oznacza, że populacja YFP-dodatnia powinna zawierać również frakcję vGLUT1-dodatnią. Stosując ten protokół barwienia, wykryliśmy, że 98,7% populacji YFP-dodatniej jest vGLUT1-dodatnią, co potwierdziło wydajność naszego przeciwciała (Rysunek uzupełniający S3).
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają skuteczność przeciwciała vGLUT1 oraz przedstawionego protokołu barwienia. Wykazujemy, że protokół ten oraz przeciwciało mogą być z pewnością wykorzystywane do ilościowego określania pochłaniania synaps in vivo w sposób wysokoprzepustowy i szybki w porównaniu z innymi podejściami eksperymentalnymi.
Przechodząc do metody in vitro, wyizolowaliśmy dorosłą mikrogleję i inkubowaliśmy ją ze świeżo wyizolowanymi synaptosomami znakowanymi pHrodo Red, pochodzącymi od tych samych zwierząt, aby określić ilościowo ich fagocytozę in vitro (Ryc. 2A). Synaptosomy znakowaliśmy pHrodo Red, który naturalnie zwiększa sygnał fluorescencji w kwaśnym pH otoczenia21. Świeżo wyizolowane synaptosomy poddaliśmy działaniu różnych wartości pH (pH = 4 i pH = 11). Po potwierdzeniu wzrostu sygnału fluorescencji przy niskim pH w eksperymencie typu proof-of-principle (Ryc. 2B), inkubowaliśmy te synaptosomy ze świeżo wyizolowaną mikrogleją przez 1,5-2 h. W ramach kontroli inkubowaliśmy mikrogleję z nieznakowanymi synaptosomami. Następnie analizowaliśmy sygnał fluorescencji pHrodo Red-PE z mikroglei CD11b++/CD45+ i zaobserwowaliśmy dodatnią fluorescencję PE, która była porównywalna z sygnałem uzyskanym z synaptosomów przy pH = 4 (Ryc. 2C). Zatem metoda ta zapewnia szybką i wysokoprzepustową analizę fagocytozy synaptosomów in vitro i może zostać rozszerzona na blaszki amyloidowe lub fagocytozę innych potencjalnych celów po przeprowadzeniu niezbędnych kroków optymalizacyjnych. Rzeczywiście, Rangaraju i wsp. określili ilościowo fagocytozę beta-amyloidu przez mikrogleję, stosując podobne podejście oparte na cytometrii przepływowej22. Podsumowując, te dwie metody zapewniają rzetelną, wydajną i wysokoprzepustową kwantyfikację fagocytozy synaps przez mikrogleję zarówno in vivo, jak i in vitro.
<img alt="Analiza hipokampa, cytometria przepływowa, ekspresja vGLUT1, schemat przygotowania tkanek, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza fagocytozy synaps vGLUT1+ przez mikroglej in vivo*. (A) Ilustracja graficzna przebiegu eksperymentu przedstawiająca etapy wewnątrzkomórkowego barwienia vGLUT1. (B) Strategia bramkowania w celu zdefiniowania populacji pojedynczych/CD11b++/CD45+/ żywych komórek z hipokampa. Populacja ta została wykorzystana do analizy vGLUT1-MFI oraz do określenia procentowej zawartości mikrogleju vGLUT1+ w hipokampie. Bramka zaznaczona czerwonym prostokątem wskazuje frakcję komórek vGLUT1+ w całej próbce. (C) Histogram przedstawia intensywność fluorescencji vGLUT1-PE. (D) Bramka zaznaczona czerwonym prostokątem wskazuje brak pozytywnej frakcji komórek wykazujących immunoreaktywność z Isotype-PE. Histogram przedstawia intensywność fluorescencji Isotype-PE. (E) Bramka zaznaczona czerwonym prostokątem wskazuje brak pozytywnej frakcji komórek wykazujących immunoreaktywność z vGLUT1-PE w makrofagach śledziony. Histogram przedstawia intensywność fluorescencji vGLUT1-PE. Bramka zaznaczona na histogramie rozpoczyna się na poziomie, na którym kończy się vGLUT1-MFI ze śledziony (~104), i jest wykorzystywana do analizy frakcji pozytywnej dla vGLUT1 w próbkach mózgu. (F) Nałożone na siebie histogramy przedstawiają porównanie intensywności fluorescencji PE makrofagów śledziony (szary) oraz mikrogleju z hipokampa (czerwony), móżdżku (fioletowy) i opuszki węchowej (jasnoniebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda cytometrii przepływowej dla komórek CD11b+. Izolacja synaptosomów, schemat barwienia, wyniki analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza pochłaniania synaptosomów przez mikroglej in vitro. (A) Graficzna ilustracja przebiegu eksperymentu przedstawiająca etapy testu pochłaniania synaptosomów in vitro. (B) Synaptosomy inkubowane przy dwóch różnych wartościach pH wykazują niski sygnał fluorescencji pHrodo Red-PE przy pH = 11 i wysoką fluorescencję pHrodoRed-PE przy pH = 4. (C) Populacja komórek Single/CD11b++/CD45+ została wykorzystana do analizy natężenia fluorescencji pHrodo Red-PE. Jako kontrolę negatywną wykorzystano mikroglej inkubowany z niebarwionymi synaptosomami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Lista buforów i odczynników użytych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rysunek uzupełniający S1: Reprezentatywny obraz świeżo wyizolowanej mikroglei dorosłych. Obraz uzyskany za pomocą mikroskopu świetlnego z obiektywem 20x po zastosowaniu protokołu dysocjacji tkanki z użyciem papainy oraz izolacji mikroglei CD11b+ metodą MACS. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S2: Reprezentatywne wykresy FACS przedstawiające strategię bramkowania w celu zdefiniowania makrofagów śledziony. Śledzionę wykorzystano jako kontrolę negatywną w eksperymentach w każdej serii pomiarowej podczas badania fagocytozy synaps przez mikroglej w hipokampie. Powyższe wykresy FACS definiują makrofagi śledziony jako populację żyjącą CD11b++/CD45++. Populacja ta została wykorzystana do ustalenia progu pozwalającego na ilościowe określenie liczby mikrogleju vGLUT1+ w próbkach mózgu, które znajdują się powyżej bramki tego progu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S3: Reprezentatywne wykresy FACS przedstawiające strategię bramkowania w celu przetestowania wydajności przeciwciała vGLUT1. (A) Graficzna ilustracja przebiegu eksperymentu przedstawiająca etapy barwienia vGLUT1. Do przetestowania immunoreaktywności przeciwciała vGLUT1 wykorzystano neurony glutaminergiczne YFP+. (B) Strategia bramkowania w celu zdefiniowania populacji YFP+ z hipokampusa myszy Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP, które posłużyły jako kontrola pozytywna do przetestowania wydajności przeciwciała vGLUT1 stosowanego w FACS. Frakcję YFP+ wybrano w celu specyfikacji synaps glutaminergicznych. W tej populacji przeanalizowano immunoreaktywność przeciwciała vGLUT1, aby zweryfikować jego właściwości. W porównaniu do (C) kontroli izotypowej; 97,9% frakcji komórek YFP-dodatnich jest wykrywane jako (D) vGLUT1-dodatnie. (E) Nałożony histogram przedstawia porównanie fluorescencji PE pomiędzy izotypem a przeciwciałem vGLUT1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Nasze badania koncentrują się na psychoneuroimmunologii i badamy wzajemne oddziaływanie układu odpornościowego z mózgiem i umysłem. Szczególnie interesuje mnie rozszyfrowywanie podgrup pacjentów na podstawie ich statusu immunologicznego, aby znaleźć dla nich odpowiednie metody leczenia. Ostatnie osiągnięcia w naszej dziedzinie obejmują na przykład rozwój ligandów PET, ale obejmują również zaawansowane technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i sekwencjonowanie przestrzennego RNA w celu rozszyfrowania terapii opartych na odporności.Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie polegające na ilościowym określeniu pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w funkcjonowaniu mózgu, a także w patologii choroby. Nasz protokół oferuje szybką i wiarygodną ocenę ilościową materiału synaptycznego pochłoniętego przez mikroglej, a tym samym zapewnia wgląd w funkcjonalną aktywność mikrogleju. Nasz protokół zainspiruje inne grupy badawcze do włączenia do swoich badań bardziej funkcjonalnych testów, takich jak pochłanianie synaptosomów, a to doprowadzi do lepszego i bardziej wszechstronnego zrozumienia roli mikrogleju w interakcjach neuroimmunologicznych.Na początek umieść sitko o średnicy 70 mikrometrów na 5-mililitrowej rurce polipropylenowej. Odpipetuj 500 mikrolitrów pożywki z komórek nerwowych. Przenieś zdysocjowany homogenat tkanki hipokampa myszy do probówki przez sitko.Następnie dwukrotnie naniec pipetą jeden mililitr zimnej pożywki z komórek nerwowych na homogenizator, aby go przepłukać. Teraz dodaj 500 mikrolitrów lodowatego DPBS do granulki, aby ją ponownie zawiesić. Uzupełnić objętość zawiesiny do 1,5 mililitra za pomocą DPBS.Odpipetować 500 mikrolitrów izotonicznego roztworu Percollu do próbki. Nałożyć roztwór na dwa mililitry zimnego DPBS w wirówce. Następnie odessaj górną warstwę i krążek mielinowy w środkowej fazie.Następnie dodaj cztery mililitry zimnego DPBS do probówki. Odessać supernatant po jego odwirowaniu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego o utrwalającej żywotności. Odpipetować jeden mililitr zimnego DPBS do próbki przed odwirowaniem próbki w temperaturze 300 G przez pięć minut.Po odessaniu supernatantu dodać 100 mikrolitrów roztworu barwiącego CD16/CD32. Wirować próbkę przez pięć sekund, a następnie inkubować. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu FACS do próbki w wirówce.Odpipetować 100 mikrolitrów wzorca barwienia do probówki. Następnie inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności. Teraz dodaj jeden mililitr buforu FACS do próbki przed odwirowaniem jak poprzednio.Zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu utrwalającego po odrzuceniu supernatantu. Następnie dodaj dwa mililitry buforu przepuszczalnego do probówki i ponownie odwiruj. Odpipetować 100 mikrolitrów roztworu barwiącego VGLUT1 do osadu.Następnie wiruj mieszaninę przez około pięć sekund przed inkubacją i odwirowaniem. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 mikrolitrach buforu FACS. Na koniec przefiltruj próbki przez filtr o długości 40 mikrometrów.Zaobserwowano wyższy sygnał fluorescencyjny VGLUT1-PE z mikrogleju hipokampa w porównaniu z kontrolą izotypu. Wyższy sygnał fluorescencyjny VGLUT1-PE stwierdzono w mikrogleju z opuszki węchowej i niższy sygnał w móżdżku w porównaniu z hipokampem. Najmniejsze natężenie sygnału wykryto w śledzionie makrofagów.Na początek inkubuj probówkę zawierającą zdysocjowaną tkankę hipokampa myszy w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieś mętną zawiesinę komórkową do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach roztworu mieszającego do mycia.Następnie przepuść próbkę przez filtr o długości 70 mikrometrów do 5-mililitrowej probówki wirówkowej przed ponownym odwirowaniem. Poddać próbkę wirowaniu w gradiencie Percollu. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach maksymalnego buforu barwiącego i inkubuj.Teraz odpipetuj jeden mililitr maksymalnego buforu do próbki przed odwirowaniem. Następnie zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu. Następnie przepłucz kolumny pozytywnej selekcji separatora magnetycznego trzema mililitrami maksymalnego buforu.Delikatnie nanieść 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na kolumnę. Po trzykrotnym umyciu kolumn maksymalnym buforem, umieść kolumny na 15-mililitrowych rurkach stożkowych. Dodaj pięć mililitrów maksymalnego buforu do kolumny.Następnie odwirować próbki o sile 300 G przez 10 minut. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanego DMEM do granulki. Przenieść 500 mikrolitrów końcowej zawiesiny komórek do dołków 24-dołkowej płytki.Zastąp 250 mikrolitrów każdej studzienki świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie dodaj trzy mikrogramy synaptosomów znakowanych pHrodo na czerwono na pożywce. Dodaj tę samą objętość nieznakowanych synaptosomów do kontroli ujemnych.Po inkubacji umyj studzienki zimnym DPBS. Teraz odpipetuj 200 mikrolitrów trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Po 35-sekundowej inkubacji odpipetować jeden mililitr DPBS zawierającego FBS do każdego dołka.Przenieś zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki polipropylenowej przez sitko. Następnie umyj każdą studzienkę dwa razy 500 mikrolitrami lodowatego DPBS. Wirować próbki pobierane przy stężeniu 500 G przez pięć minut.Następnie inkubować komórki w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego przez 10 minut na lodzie. Następnie dodaj CD11b i CD45 do roztworu barwiącego, aby uzyskać końcowe stężenie od 1 do 100. Próbki inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności.Odpipetować jeden mililitr buforu FACS do próbki. Następnie poddać go końcowemu odwirowaniu w stężeniu 300 G przez 10 minut przed analizą metodą cytometrii przepływowej. Dodatnią fluorescencję PE porównywalną do tej uzyskanej z synaptosomów o pH czwartym zaobserwowano w mikrogleju CD11b dodatnim i CD45 dodatnim.

quantification-microglial-engulfment-synaptic-material-using-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem umożliwiającym izolację i badanie specyficznych populacji komórek. Niniejszy protokół opisuje etapy izolacji komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ślimaka noworodków myszy transgenicznych. Przed rozdzieleniem metodą cytometrii przepływowej, zdysocjowane komórki ślimaka zostały znakowane przy użyciu substratów β-galaktozydazy sprzężonych z fluorochromami.

Izolacja komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Poznaj metodę kwantyfikacji pochłaniania materiału synaptycznego przez mikroglia za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia szybką analizę aktywności mikroglia w tkance mózgu myszy.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów