Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej
May 31st, 2024
Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.
Nasze badania koncentrują się na psychoneuroimmunologii i badamy wzajemne oddziaływanie układu odpornościowego z mózgiem i umysłem. Szczególnie interesuje mnie rozszyfrowywanie podgrup pacjentów na podstawie ich statusu immunologicznego, aby znaleźć dla nich odpowiednie metody leczenia. Ostatnie osiągnięcia w naszej dziedzinie obejmują na przykład rozwój ligandów PET, ale obejmują również zaawansowane technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i sekwencjonowanie przestrzennego RNA w celu rozszyfrowania terapii opartych na odporności.
Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie polegające na ilościowym określeniu pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w funkcjonowaniu mózgu, a także w patologii choroby. Nasz protokół oferuje szybką i wiarygodną ocenę ilościową materiału synaptycznego pochłoniętego przez mikroglej, a tym samym zapewnia wgląd w funkcjonalną aktywność mikrogleju. Nasz protokół zainspiruje inne grupy badawcze do włączenia do swoich badań bardziej funkcjonalnych testów, takich jak pochłanianie synaptosomów, a to doprowadzi do lepszego i bardziej wszechstronnego zrozumienia roli mikrogleju w interakcjach neuroimmunologicznych.
Na początek umieść sitko o średnicy 70 mikrometrów na 5-mililitrowej rurce polipropylenowej. Odpipetuj 500 mikrolitrów pożywki z komórek nerwowych. Przenieś zdysocjowany homogenat tkanki hipokampa myszy do probówki przez sitko.
Następnie dwukrotnie naniec pipetą jeden mililitr zimnej pożywki z komórek nerwowych na homogenizator, aby go przepłukać. Teraz dodaj 500 mikrolitrów lodowatego DPBS do granulki, aby ją ponownie zawiesić. Uzupełnić objętość zawiesiny do 1,5 mililitra za pomocą DPBS.
Odpipetować 500 mikrolitrów izotonicznego roztworu Percollu do próbki. Nałożyć roztwór na dwa mililitry zimnego DPBS w wirówce. Następnie odessaj górną warstwę i krążek mielinowy w środkowej fazie.
Następnie dodaj cztery mililitry zimnego DPBS do probówki. Odessać supernatant po jego odwirowaniu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego o utrwalającej żywotności. Odpipetować jeden mililitr zimnego DPBS do próbki przed odwirowaniem próbki w temperaturze 300 G przez pięć minut.
Po odessaniu supernatantu dodać 100 mikrolitrów roztworu barwiącego CD16/CD32. Wirować próbkę przez pięć sekund, a następnie inkubować. Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu FACS do próbki w wirówce.
Odpipetować 100 mikrolitrów wzorca barwienia do probówki. Następnie inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności. Teraz dodaj jeden mililitr buforu FACS do próbki przed odwirowaniem jak poprzednio.
Zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu utrwalającego po odrzuceniu supernatantu. Następnie dodaj dwa mililitry buforu przepuszczalnego do probówki i ponownie odwiruj. Odpipetować 100 mikrolitrów roztworu barwiącego VGLUT1 do osadu.
Następnie wiruj mieszaninę przez około pięć sekund przed inkubacją i odwirowaniem. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 mikrolitrach buforu FACS. Na koniec przefiltruj próbki przez filtr o długości 40 mikrometrów.
Zaobserwowano wyższy sygnał fluorescencyjny VGLUT1-PE z mikrogleju hipokampa w porównaniu z kontrolą izotypu. Wyższy sygnał fluorescencyjny VGLUT1-PE stwierdzono w mikrogleju z opuszki węchowej i niższy sygnał w móżdżku w porównaniu z hipokampem. Najmniejsze natężenie sygnału wykryto w śledzionie makrofagów.
Na początek inkubuj probówkę zawierającą zdysocjowaną tkankę hipokampa myszy w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieś mętną zawiesinę komórkową do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach roztworu mieszającego do mycia.
Następnie przepuść próbkę przez filtr o długości 70 mikrometrów do 5-mililitrowej probówki wirówkowej przed ponownym odwirowaniem. Poddać próbkę wirowaniu w gradiencie Percollu. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach maksymalnego buforu barwiącego i inkubuj.
Teraz odpipetuj jeden mililitr maksymalnego buforu do próbki przed odwirowaniem. Następnie zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu. Następnie przepłucz kolumny pozytywnej selekcji separatora magnetycznego trzema mililitrami maksymalnego buforu.
Delikatnie nanieść 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na kolumnę. Po trzykrotnym umyciu kolumn maksymalnym buforem, umieść kolumny na 15-mililitrowych rurkach stożkowych. Dodaj pięć mililitrów maksymalnego buforu do kolumny.
Następnie odwirować próbki o sile 300 G przez 10 minut. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanego DMEM do granulki. Przenieść 500 mikrolitrów końcowej zawiesiny komórek do dołków 24-dołkowej płytki.
Zastąp 250 mikrolitrów każdej studzienki świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie dodaj trzy mikrogramy synaptosomów znakowanych pHrodo na czerwono na pożywce. Dodaj tę samą objętość nieznakowanych synaptosomów do kontroli ujemnych.
Po inkubacji umyj studzienki zimnym DPBS. Teraz odpipetuj 200 mikrolitrów trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Po 35-sekundowej inkubacji odpipetować jeden mililitr DPBS zawierającego FBS do każdego dołka.
Przenieś zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki polipropylenowej przez sitko. Następnie umyj każdą studzienkę dwa razy 500 mikrolitrami lodowatego DPBS. Wirować próbki pobierane przy stężeniu 500 G przez pięć minut.
Następnie inkubować komórki w 100 mikrolitrach roztworu barwiącego przez 10 minut na lodzie. Następnie dodaj CD11b i CD45 do roztworu barwiącego, aby uzyskać końcowe stężenie od 1 do 100. Próbki inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności.
Odpipetować jeden mililitr buforu FACS do próbki. Następnie poddać go końcowemu odwirowaniu w stężeniu 300 G przez 10 minut przed analizą metodą cytometrii przepływowej. Dodatnią fluorescencję PE porównywalną do tej uzyskanej z synaptosomów o pH czwartym zaobserwowano w mikrogleju CD11b dodatnim i CD45 dodatnim.
Przegląd
To badanie przedstawia protokoły pomiaru pożerania synaps vGLUT1-dodatnich oraz synaptosomów z oznaczeniem pHRodo Red przez mikrogleję za pomocą cytometrii przepływowej. Badania koncentrują się na zrozumieniu roli mikrogleju w funkcjonowaniu mózgu i patologii chorób.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Cytometria przepływowa
Tło
- Mikrogleja jest kluczowym graczem w interakcjach neuroimmunologicznych.
- Pożeranie materiału synaptycznego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji mikrogleju.
- Ostatnie postęp w technologiach takich jak sekwencjonowanie RNA pomaga w terapiach opartych na układzie odpornościowym.
- Zrozumienie stanu odpornościowego pacjentów jest niezbędne dla spersonalizowanych terapii.
Cel badania
- Aby ilościowo ocenić pożeranie synaptycznego materiału przez mikrogleję.
- Aby zainspirować włączenie funkcjonalnych testów w badaniach nad mikrogleją.
- Aby dostarczyć wglądu w rolę mikrogleju w funkcjonowaniu mózgu i chorobach.
Stosowane metody
- Cytometria przepływowa została wykorzystana do oceny pożerania przez mikrogleję.
- Głównym modelem biologicznym był dysocjowany tkankowy hipokamp myszy.
- Protokoły obejmowały różne kroki wirowania i barwienia dla izolacji i analizy komórek.
- Kluczowe kroki obejmowały filtrowanie, barwienie na CD16/CD32 oraz wykrywanie VGLUT1.
- Mikroskopia i cytometria przepływowa były niezbędne do analizy sygnałów fluorescencyjnych.
Główne wyniki
- Wyższe fluorescencyjne sygnały VGLUT1-PE obserwowano w mikroglei pochodzącej z hipokampu w porównaniu do kontroli izotypowych.
- Różnice w intensywności fluorescencji były zauważalne w różnych obszarach mózgu.
- Metoda umożliwiła niezawodne ilościowe określenie aktywności mikrogleju związanej z materiałem synaptycznym.
Wnioski
- To badanie ustanawia metodę ilościowego pomiaru pożerania synaps przez mikrogleję.
- Wyniki poprawiają zrozumienie interakcji neuroimmunologicznych i ról mikrogleju w zdrowiu i chorobach.
- Zdobyte wglądy mogą prowadzić do nowych podejść w badaniu wpływu mikrogleju na mechanizmy neuronalne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of microglial engulfment of synaptic material is critical for de-risking neuroimmune targets and clarifying mechanisms underlying synaptic refinement in disease models. The described flow cytometry-based assays enable high-throughput, reproducible measurement of microglial function, supporting predictive confidence in early discovery and translational neuroscience portfolios. Streamlined quantification accelerates functional validation and informs risk-adjusted advancement decisions for neuroimmune therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of microglial activity in synaptic remodeling relevant to neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Supports biological de-risking by providing quantitative evidence of microglial engulfment capacity across brain regions.
- Facilitates mechanistic target validation by linking immune cell function to synaptic outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a scalable, high-throughput alternative to imaging-based engulfment assays for compound or genetic screening.
- Delivers standardized, quantitative readouts suitable for cross-study and cross-site reproducibility.
- Enables rapid evaluation of candidate modulators of microglial function in vitro and in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by quantifying microglial activity in specific brain regions and under pathological conditions.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional biomarker development.
- Provides translational insight into neuroimmune mechanisms implicated in synaptic pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based quantification method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational biomarker development in neuroimmune research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial-mediated synaptic pruning and immune-brain crosstalk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative engulfment metrics for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides fluorescence-based measurements enabling statistical comparison of microglial activity across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and functional biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, standardized workflow adaptable to diverse neuroimmune research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Reduces assay time and labor, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and portfolio triage based on functional microglial readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroimmune assets and translational biomarker initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and neuroimmune cell isolation.
- Demands access to high-quality cytometry instrumentation and analytical software.
- Standardization of staining and gating strategies is essential for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or disease models.
- Assay sensitivity and specificity depend on antibody quality and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
In Vivo Quantification of Microglial Engulfment of Glutamatergic Synapses with Intracellular vGLUT1 Staining
4:27
Flow Cytometric Quantification of In Vitro Microglial Engulfment of Crude Synaptosomes for the Analysis of Synaptic Refinement
