Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie Arabidopsis Vues do hybrydyzacji całego wierzchowca i barwienia immunologicznego. Osiąga się to poprzez utrwalenie świeżych pąków kwiatowych w roztworze utrwalającym. Drugim krokiem jest dokładne wypreparowanie i osadzenie vues w miniaturowych podkładkach akrylowych bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych.

Następnie przetwarzanie tkanek umożliwia ich klarowanie i przenikanie. Ostatnim krokiem jest inkubacja potraktowanych próbek z roztworem przeciwciał do barwienia immunologicznego lub znakowaną sondą do fluorescencji w hybrydyzacji C-d. Ostatecznie, obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, po którym następuje trójwymiarowa rekonstrukcja, pozwala na analizę ilościową całego montażu na poziomie pojedynczej komórki.

Metoda ta została początkowo zastosowana w celu zapewnienia wglądu w organizację CT w widoku, ale można ją również zastosować do analizy innych przedziałów komórkowych w innych tkankach zanurzenia i w innych organizmach modelowych W mikroprobówkach fuge wypełnionych świeżo przygotowanym buforem BBO schłodzonym na lodzie w ilości od 20 do 30 nadgarstków na probówkę ustaw rurki tak, aby delikatnie kołysały się w temperaturze pokojowej przez pół godziny. Następnie wiruj probówki przez minutę w temperaturze 400 Gs. Następnie ostrożnie odessaj supernatanty, wyrzuć je i dodaj mililitr PBT do nadgarstków. Umieść rurki na lodzie, aby zamontować każdą rurkę nadgarstka.

Przygotowałem się na lodzie. Pięć probówek zawierających 200 mikrolitrów. Świeżo przygotowana mieszanka 5% akrylamidu.

Pięć czystych szkiełek super frost oznaczonych ołówkiem, myśl Eloqua o wartości 20%a PS i myśl Eloqua o wartości 20% NAPS z jednej rurki nadgarstka. Weź cztery lub pięć z odciętą końcówką i umieść je na jednym szkiełku. Usunąć nadmiar płynu, ostrożnie pipetując za pomocą cienkich igieł.

Wykonaj podłużne nacięcia w nadgarstkach i usuń ściany nadgarstka, aby uwolnić rzędy vues. Ten krok będzie wymagał praktyki. Zapobiegaj wysychaniu vues, dodając do 10 mikrolitrów PBS, a następnie do mikroprobówki fuge zawierającej mieszankę akrylamidu.

Szybko dodaj 12 mikrolitrów NAPS i 12 mikrolitrów PS. Dobrze wymieszaj roztwór z pipetowaniem i szybko dodaj 30 mikrolitrów tego aktywowanego akrylamidu. Wymieszaj na szkiełku z wypreparowanymi vues. Delikatnie umieść małe szkiełko nakrywkowe na preparacie i pozwól roztworowi spolimeryzować w temperaturze pokojowej przez około godzinę.

Przygotuj każdy slajd w ten sposób później. Użyj żyletki, aby odłupać szkiełka nakrywkowe. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w słoiku coplan z PBS lub bezpośrednio przystąpić do przetwarzania.

Generalnie przetwarzanie powinno odbywać się w słoikach coplan z 80 mililitrami roztworu. I pod wyciągiem. Rozpocznij od sklarowania tkanek poprzez inkubację w serii roztworów metanolu i etanolu, roztworu ksylenu etylu jeden do jednego i ponownie w etanolu, a następnie metanolu.

Każda kąpiel trwa od pięciu do 30 minut. Zobacz protokół tekstowy. Następnie przez 15 minut należy użyć roztworu metanolu PBT z 2,5% formaldehydem w stosunku jeden do jednego.

Następnie przepłucz tkankę w PBT dwa razy przez 10 minut na kąpiel. Następnie szkiełka można przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli to konieczne. Następnie wyjmij ze słoika do sześciu szkiełek i odcedź nadmiar płynu.

Umieść je na bibułce i szybko dodaj 100 mikrolitrów schłodzonego enzymu trawiącego ścianę komórkową. Wymieszaj na podkładkach. Następnie przykryj szkiełka dużymi szkiełkami nakrywkowymi.

Inkubuj szkiełka przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Ważne jest, aby zoptymalizować temperaturę trawienia CO dla każdego nowego roztworu enzymatycznego, ponieważ ten krok ma kluczowe znaczenie dla jednorodnego barwienia później. Umyj szkiełka dwukrotnie PBT przez pięć minut na pranie.

Następnie opróżnij teraz szkiełka do każdego slajdu. Dodać 100 mikrolitrów RNA A w PBS zakończonym 1% tween i inkubować szkiełka przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze po inkubacji, przemyć szkiełka dwukrotnie PBT jak poprzednio, a następnie ponownie utrwalić tkankę, inkubując szkiełka w kąpieli świeżo przygotowanego PBTF przez 20 minut. Spłucz PBTF jednym praniem w PBT przez 10 minut.

Następnie przejdź do przenikania tkanek, inkubując szkiełka w PBS z 2% tween przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj dwóch płukań w PBT przez pięć minut, aby usunąć przepuszczalny roztwór. Następnie przystąp do barwienia immunologicznego.

Rozpocznij od inkubacji szkiełek w pierwotnym przeciwciałie będącym przedmiotem zainteresowania. Na każde szkiełko nanieść 100 mikrolitrów podwielokrotności przeciwciała rozcieńczonego w PBS i z 0,2% pośrednim. Przenieś szkiełka do wilgotnej komory i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin.

Myj szkiełka w kąpieli z PBT przez dwie do czterech godzin, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego rozcieńczonego jeden do 200 w PBS z 0,2% między 20 i inkubuj szkiełka przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Godzinna kąpiel w PBT z delikatnym kołysaniem jest wystarczająca do umycia szkiełek z niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.

Następnie przeciwbarwić DNA roztworem 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny w PBS. Pozostaw barwienie na 15 minut, a następnie umyj szkiełka PBT, delikatnie kołysząc przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Teraz zamontuj szkiełka za pomocą pożywki zapobiegającej blaknięciu uzupełnionej 10 mikrogramami na mililitr jodku propidyny.

Po odczekaniu na godzinę zobrazuj preparaty pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki zanurzeniowej 63 x z glicerolem. Dlatego podczas akwizycji obrazu bardzo ważne jest, aby ustawienia skanowania były identyczne między próbkami, aby umożliwić porównawczą kwantyfikację i użycie trybu detekcji liniowej. Później zrekonstruuj obrazy seryjne w trójwymiarowe struktury, podziel każde jądro na segmenty i użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D do ilościowego określenia sygnałów.

Korzystając z tego solidnego protokołu przygotowania na dużą skalę, całe Mount Vues zachowają swoją trójwymiarową strukturę. Struktury subkomórkowe stają się widoczne z dużą szczegółowością, jak w przypadku chromatyny. Podczas barwienia DNA heterochromatyna pojawia się jako jasne i dobrze zdefiniowane ogniska bez konieczności stosowania dekonwolucji.

Protokół ten pozwala na równoległe barwienie immunologiczne kilkoma przeciwciałami w jednej rundzie. Na przykład marker permisywny związany z chromatyną U, H trzy trimm metylowanej lizyny cztery i marker związany z heterochromatyną H 3 monometylolizyna 27 zostały wykryte w jednym eksperymencie na różnych powtórzonych szkiełkach w celu analizy dynamiki chromatyny. Inną kompatybilną techniką jest fluorescencyjna hybrydyzacja C dwóch lub ryb ryb do 45 s. Rybosomalne.

Powtórzenia DNA wykorzystano do zdefiniowania regionów organizacji jądrowej. Sonda została bezpośrednio oznaczona Alexa 4 88, a DNA zostało wybarwione licznikami Do analizy fikcyjnej bardzo ważne jest przetestowanie różnych rozcieńczeń i czasów inkubacji w organizmie, aby zidentyfikować warunki, które dają solidny i hogene sygnał o najniższym możliwym poziomie. I skrucha ciała.

Ponieważ metoda ta zapewnia doskonałe zachowanie tkanki i optymalne przenikanie do analizy organizacji chromatyny przez pojedyncze komórki, toruje drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórek roślinnych lub epigenetyki epigenetyki roślin do badania organizacji jądrowej lub subkomórkowej na poziomie pojedynczej komórki i w całym kontekście człowieka.