Name: Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę immunobarwienia i FISH w całych zalążkach Arabidopsis thaliana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej. Technika umożliwia ilościową analizę na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Ueli Grossniklaus (Uniwersytet w Zurychu) za wsparcie techniczne i finansowe. Jesteśmy wdzięczni Valerii Gagliardini, Christofowi Eichenbergerowi, Arturo Bolanosowi i Peterowi Kopfowi za ogólne wsparcie laboratoryjne. Badania zostały sfinansowane przez Uniwersytet w Zurychu, granty ze Szwajcarskiej Fundacji Narodowej dla CB (31003A_130722) i Ueli Grossniklaus (31003A_141245 i 31003AB-126006) oraz Agence Nationale de la Recherche dla DG (program ANR-BLANC-2012).

Procedura jest opisana w przepływie pracy na rysunku 1, a konfiguracja do sekcji i zatapiania tkanek jest przedstawiona na rysunku 2.
1. Utrwalenie tkanek
<ol>
	<li>Zbierz 20-30 owocolistków w probówce do mikrofugi zawierającej świeżo przygotowany bufor utrwalający BVO na lodzie.</li>
	<li>Utrwal tkankę przez 30 minut, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówki zawierające owocolistki w utrwalaczu w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę przy 400 x g.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć bufor utrwalający i dodać 1 ml PBT, umieścić probówki na lodzie.</li>
</ol>
2. Sekcja i osadzanie
<ol>
	<li>Przygotuj pięć probówek Eppendorf z każdymi 200 μl świeżo przygotowanej mieszanki 5% akrylamidu.</li>
	<li>Przygotuj pięć szkiełek Superfrost wstępnie oczyszczonych 70% etanolem i oznaczonych ołówkiem.</li>
	<li>Rozmrozić na lodzie jedną porcję 20% APS i 20% NaPS każdy.</li>
	<li>Weź 4-5 owocolistków z odciętą końcówką, umieść je na czystym szkiełku, usuń nadmiar płynu.</li>
	<li>Wykonać podłużne nacięcia cienką igłą i oderwać ścianki owocolistka, aby uwolnić rzędy zalążków, jak pokazano na rysunku 2, unikać suszenia przez przykrycie PBS (nie więcej niż 10 μl).</li>
	<li>Szybko dodaj i wymieszaj 12 μl NaPS, 12 μl APS z podwielokrotnością 200 μl mieszanki akrylamidu.</li>
	<li>Dodać 30 μl aktywowanego akrylamidu do wypreparowanych zalążków.</li>
	<li>Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 20 x 20 mm, pozostaw do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 45-60 min.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Na tym etapie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w słoiku Coplin zawierającym PBS.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek
UWAGA: Wszystkie kroki z wyjątkiem 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 i 3.4.3 są przeprowadzane w słoikach Coplin z 80 ml roztworu pod kapturem chemicznym w temperaturze pokojowej. Szkiełka przenoszone są za pomocą kleszczyków z płaską końcówką.
<ol>
	<li>Klarowanie i utrwalanie tkanek:
	<ol>
		<li>Inkubować 5 minut w metanolu.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w etanolu.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w etanolu:ksylenie (1:1).</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w etanolu.</li>
		<li>Inkubować 5 minut w metanolu.</li>
		<li>Inkubować 15 minut w metanolu i PBT (1:1), uzupełnione 2,5% formaldehydem.</li>
		<li>Płukać 2 x 10 min w PBT. Na tym etapie szkiełka można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie ściany komórkowej:
	<ol>
		<li>Rozmrozić porcję mieszanki do trawienia ściany komórkowej na lodzie.</li>
		<li>Weź zjeżdżalnię ze słoika Coplin, odcedź nadmiar płynu, kładąc go pionowo na ręczniku papierowym.</li>
		<li>Dodać 100 μl mieszanki do wytrawiania w ścianie komórkowej na podkładkę akrylową i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 23 x 46 mm. Powtórz te czynności dla pozostałych slajdów. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze (opisanej w Materiałach).</li>
		<li>Umyj szkiełka 2 x 5 min w PBT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie RNazy A:
	<ol>
		<li>Weź zjeżdżalnię ze słoika Coplin, odcedź nadmiar płynu jak poprzednio.</li>
		<li>Inkubować każde szkiełko ze 100 μl RNAseA w stężeniu 100 μg/ml w PBS z 1% Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Myć szkiełka przez 2 x 5 minut w PBT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po utrwaleniu i przepuszczalności:
	<ol>
		<li>Post-fix przez 20 minut w świeżo przygotowanym PBT-F.</li>
		<li>Płukać szkiełka przez 10 minut w PBT.</li>
		<li>Przepuszczalność przez 2 godziny w PBS z 2% Tween-20 w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Płukać szkiełka przez 2 x 5 min w PBT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Na tym etapie należy przetestować optymalne stężenie przeciwciała pierwszorzędowego, używając różnych rozcieńczeń (1:200, 1:500, 1:1000) przeciwciał.
<ol>
	<li>Inkubować każde szkiełko ze 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBS z 0,2% Tween-20 przez 12-24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myj szkiełka w PBT przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej pod delikatnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Zastosować przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:200 w PBS + 0,2% Tween-20 przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myj szkiełka w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Barwieć przeciw barwieniu 10 μg/ml jodku propidyny w PBS przez 15 minut, a następnie płukać przez 15 minut w PBS pod delikatnym wstrząsem, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj w płynnym utrwalaczu zapobiegającym blaknięciu uzupełnionym 10 μg/ml jodku propidyny. Pozwól medium montażowemu stwardnieć przez 1 godzinę przed uzyskaniem obrazów za pomocą CLSM.</li>
</ol>
5. Obrazowanie ilościowe
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu:
	<ol>
		<li>Uzyskuj obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą CLSM, najlepiej przy użyciu trybu skanowania rezonansowego, który umożliwia lepsze zachowanie sygnałów fluorescencyjnych przy długotrwałym obrazowaniu23, oraz soczewki zanurzeniowej z glicerolem 63X.</li>
		<li>Przetestuj parametry akwizycji, takie jak intensywność lasera, wzmocnienie, otwór, rozmiar woksela i współczynnik powiększenia na początku eksperymentu, aby zdefiniować standardową procedurę akwizycji, której należy ściśle przestrzegać na wszystkich slajdach, aby uzyskać spójne pomiary ilościowe.</li>
		<li>Sprawdź brak przesłuchów między fluorochromami. Jeśli jest obecny, skonfiguruj skanowanie sekwencyjne. Obrazy transmisyjne należy pobierać oddzielnie, a nie jednocześnie.</li>
		<li>Wykonuj szeregową, trójwymiarową akwizycję obrazu z najwyższą możliwą rozdzielczością w wymiarach x i y oraz z 2x nadpróbkowaniem w wymiarze z (reguła Nyquista).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie obrazu:
	<ol>
		<li>Rekonstruuj obrazy seryjne w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania komercyjnego lub open source.</li>
		<li>Zdefiniuj powierzchnie konturu wokół każdego jądra (lub komórki) zainteresowania w 3D.</li>
		<li>Określ ilościowo fluorescencję w każdym kanale jako sumę intensywności pikseli w każdym obiekcie.</li>
		<li>Eksport danych do Excela w celu przeprowadzenia analiz statystycznych. Normalizuj sygnały przeciwciał przeciwko np. sygnałom barwienia DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+introduction+to+the+embryology+of+angiosperms%22">An introduction to the embryology of angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li>
<li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li>
<li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li>
<li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li>
<li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li>
<li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li>
<li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development%3A+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li>
<li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li>
<li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li>
<li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li>
<li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li>
<li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+%28Zea+mays%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li>
<li>Niedojadło, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li>
<li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+%28Illiciaceae%3B+Austrobaileyales%29%3A+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots%2C+eumagnoliids%2C+and+eudicots%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li>
<li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis%3A+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li>
<li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li>
<li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li>
<li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li>
<li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li>
<li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li>
<li>Lysak, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLysak%2C+M+%22Cytogenetic+analyses+of+Arabidopsis+In+Arabidopsis+Protocols%3A+Methods+in+Molecular+Biology%2C+2nd+ed%22">Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).</li>
<li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feulgen+reaction+75+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Procedures+for+In+Situ+Hybridization+to+Chromosomes%2C+Cells%2C+and+Tissue+Sections.+Nonradioactive+in+situ+hybridization+application+manual%22%5BJournal%5D)">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

U roślin kwitnących żeńska linia rozrodcza jest otoczona kilkoma warstwami komórek, w tym jądrem i osłonkami zalążka, co sprawia, że barwienie cytologiczne w całości jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół umożliwiający przygotowanie i przetworzenie dużej liczby zalążków nadających się do barwienia cytologicznego, takiego jak barwienie immunologiczne, barwienie DNA i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całości. Z powodzeniem wykorzystaliśmy go do analizy żeńskiej reprodukcyjnej...

U roślin kwitnących, tworzenie linii rozrodczych zaczyna się od różnicowania SMC, żeńskiego MMC i męskiego mikrosporu komórki macierzystej. MMC rozwija się z podnaskórkowej komórki jądrowej na dystalnym końcu zalążka zalążka, a komórka macierzysta mikrospor rozwija się z tkanki sporogennej w pylniku, które znajdują się głęboko w narządach kwiatowych1. SMC przechodzą mejozę w celu wytworzenia haploidalnych zarodników, które następnie powodują powstawanie gametofitów po mitozie. Żeński gametofit, czyli worek zarodkowy, składa się z jednej komórki jajowej, jednej komórki centralnej, dwóch synergidów i trzech antypodali. Męski gametofit lub pyłek składa się z jednej komórki wegetatywnej i dwóch plemników. Podczas gdy męski gametofit pozostaje stosunkowo dostępnym obiektem badań, żeński gametofit jest osadzony w zalążku, który sam jest zamknięty w owocolistku kwiatowym, a zatem stanowi szczególne wyzwanie dla analiz molekularnych i cytologicznych. Ostatnio jednak mikrodysekcja wspomagana laserem zaoferowała eleganckie rozwiązanie umożliwiające analizy transkryptomiczne w MMC i żeńskich komórkach gametofitycznych2-4. Oprócz analiz ekspresji genów kandydujących, wykorzystujących np. hybrydyzację RNA in situ lub testy genów reporterowych, analizy cytologiczne pozwalają na badanie dynamiki endogennych składników komórkowych za pomocą specyficznego bezpośredniego barwienia komórkowego lub pośredniego barwienia immunologicznego. W szczególności barwienie cytogenetyczne za pomocą barwienia FISH i DNA, wraz z barwieniem immunologicznym modyfikacji chromatyny lub składników chromatyny, są kluczowymi podejściami do wyjaśnienia dynamiki chromatyny i organizacji jądrowej u Arabidopsis5. Zazwyczaj mejoza pociąga za sobą specyficzną dynamikę chromosomów, która została dobrze zbadana w mejocytach męskich roślin6,7; Dalsza wielkoskalowa, specyficzna dla komórek reorganizacja chromatyny, prawdopodobnie odzwierciedlająca dynamiczne przeprogramowanie epigenetyczne, została opisana podczas rozwoju pyłku8-10. W przeciwieństwie do tego, ze względu na względną niedostępność żeńskich mejocytów i gametofitów, badania te pozostają technicznie trudne do zastosowania i często wymagają sekcji lub ręcznej sekcji i trawienia enzymatycznego (patrz poniżej). Ponadto powszechny brak przejrzystości optycznej w pełnym montażu jest przeszkodą w obrazowaniu komórek rozrodczych w nienaruszonych zalążkach w wysokiej rozdzielczości.
Klasyczna metoda cytologicznej analizy organizacji chromosomów w zalążkach z całego wierzchowca wykorzystuje barwienie Feulgena11-13. Polega ona na kwasowej hydrolizie (przy użyciu kwasu podchlorawego) DNA, która prowadzi do denaturacji białek, a tym samym do zniszczenia struktury chromatyny. Alternatywnie, organizację chromosomów w żeńskich mejocytach i komórkach gametofitycznych można zaobserwować za pomocą barwienia DAPI i barwienia immunologicznego na półcienkich odcinkach lub wypreparowanych woreczkach zarodkowych i MMC (na przykład patrz14-18). Oczywiste jest jednak, że ręczne preparowanie i cięcie może być pracochłonne i utrudnia jakościową i ilościową analizę dużej liczby epitopów chromatyny.
Tutaj zapewniamy skuteczny protokół do przygotowania dużej liczby zalążków Arabidopsis odpowiednich do różnych dalszych barwień cytologicznych w całym montażu. Krótko mówiąc, pąki kwiatowe inkubuje się w roztworze utrwalającym, rzędy zalążków są wycinane z owocolistka i zatapiane w akrylamidzie na szkiełku, tak jak ma to miejsce w przypadku mejocytów pyłku19,20. Osadzone zalążki są dalej oczyszczane i utrwalane w metanolu, etanolu i ksylenie przed trawieniem ściany komórkowej i przepuszczalnością. Omówiono możliwe warianty tych kroków. Próbki można następnie wykorzystać do barwienia DNA, barwienia immunologicznego i FISH. Tryb przygotowania jest wydajny i pozwala na równoległe przygotowanie eksperymentów (w ciągu dnia można przygotować do 16 preparatów do różnych analiz końcowych). Opisane zabiegi umożliwiają uzyskanie jednorodnych sygnałów w całej i dobrze zachowanej organizacji histologicznej, komórkowej i jądrowej w komórkach rozrodczych i otaczających komórkach jądrowych, co korzystnie wpływa na jakościowe i ilościowe porównania między typami komórek. Skalibrowane, oparte na CLSM obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, po którym następuje trójwymiarowa rekonstrukcja, umożliwia miarodajne pomiary ilościowe sygnałów fluorescencyjnych. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę procedurę do analizy dynamiki chromatyny w różnicującym MMC21 i rozwijającym się żeńskim gametoficie22; prezentujemy tutaj reprezentatywne wyniki analizy heterochromatyny, barwienia immunologicznego chromatyny, barwienia immunologicznego GFP oraz FISH w zalążkach całych. Ponadto wierzymy, że nasz protokół będzie odpowiedni dla innych tkanek i gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td>Roztwory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO Bufor utrwalający (na podstawie32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehyd, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehyd</td></tr><tr><td>30% Akrylamid:bisakryloamid</td><td></td><td></td><td>3 g akrylamidu, 0,33 g bisakryloamidu, 1x PBS (przygotować 10 ml, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C)</td></tr> <tr><td>200 ml 5% mieszanki akryloamidu w PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30% akryloamidu: bisakryloamidu, 166 ml 1x PBS (świeży z 30% bulionu)</td></tr> <tr><td>20% siarczanu</td><td></td><td></td><td>amonu 0,2 g siarczanu amonu, 1 ml sterylnej wody (przygotować podwielokrotności z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)</td></tr><tr><td>20% siarczyn</td><td></td><td></td><td>sodu 0,2 g siarczynu sodu, 1 ml sterylnej wody (przygotować porcje z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)</td></tr> <tr>Mieszanka <td></td><td></td><td>enzymów ściany komórkowej</td><td>0,5% (w/v) celulazy, 1% (w/v) drylazy, 0,5% (w/v) pektoliazy</td></tr><tr><td>Odczynniki i materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>ksylen</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Drisolase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pektolyaza</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>akrylamid</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisakryloamid</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>siarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anty-trimetylo-histon H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anty-monometylo-histon H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ koza ~ anti ~ królik (H + L)</td> <td>Sonda molekularna</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>RNAzya A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Słoik z kopliny</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> wilgotnościowa <td>Plastikowe pudełko z wilgotnym ręcznikiem papierowym w środku, do pudełka wkłada się plastikową podpórkę do podparcia zjeżdżalni i utrzymania zjeżdżalni przed wodą.</td></tr><tr><td>Prowadnica Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

U roślin kwitnących, przejście od losu komórek somatycznych do rozrodczych jest zaznaczone przez specyfikację komórek macierzystych zarodników (SMC) w organach kwiatowych dorosłej rośliny. Samica SMC (komórka macierzysta megaspory, MMC) różnicuje się w zawiązku zalążka i ulega mejozy. Wyselekcjonowana haploidalna megaspora przechodzi następnie mitozę, tworząc wielokomórkowy żeński gametofit, który da początek gametom, komórce jajowej i komórce centralnej, wraz z komórkami dodatkowymi. Ograniczona dostępność MMC, mejocytów i żeńskiego gametofitu wewnątrz zalążka stanowi techniczne wyzwanie dla analiz cytologicznych i cytogenetycznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności bezpośrednia lub pośrednia immunodetekcja epitopów komórkowych lub jądrowych jest upośledzona przez słabą penetrację odczynników do wnętrza komórki roślinnej, a obrazowanie pojedynczych komórek jest utrudnione przez brak przejrzystości optycznej w tkankach pełnomocowanych.
Dlatego opracowaliśmy skuteczną metodę analizy organizacji jądra i modyfikacji chromatyny w wysokiej rozdzielczości pojedynczej komórki w zalążkach Arabidopsis osadzonych w całości. Polega ona na rozwarstwieniu i zatopieniu utrwalonych zalążków w cienkiej warstwie żelu akrylowego na mikroskopijnym szkiełku. Osadzone zalążki poddawane są zabiegom chemicznym i enzymatycznym mającym na celu poprawę klarowności tkanek i przepuszczalności odczynników do barwienia immunologicznego. Zabiegi te zachowują organizację komórkową i chromatynę, DNA i epitopy białek. Próbki mogą być wykorzystywane do różnych dalszych analiz cytologicznych, w tym barwienia immunologicznego chromatyny, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i barwienia DNA do analizy heterochromatyny. Obrazowanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) o wysokiej rozdzielczości, a następnie rekonstrukcja 3D pozwala na pomiary ilościowe w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Przedstawiamy sprawdzony protokół wielkoskalowego przygotowania i przetwarzania zalążków Arabidopsis, odpowiedni do barwienia cytologicznego w preparatach całych (whole-mount). Dzięki zatopieniu w medium zalążki zachowują strukturę trójwymiarową (Rysunek 3). Ponadto przetwarzanie tkanek, w tym ich klarowanie optyczne, umożliwia obrazowanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości. Rysunek 4 przedstawia barwienie DNA w całych prymordiach zalążków, gdzie heterochromatyna ...

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie pąków kwiatowych Arabidopsis do hybrydyzacji i barwienia immunologicznego całych preparatów. Osiąga się to poprzez utrwalenie świeżych pąków kwiatowych w roztworze fiksacyjnym. Drugim krokiem jest staranne wypreparowanie i zatopienie pąków w miniaturowych podkładkach akrylamidowych bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych.Kolejne etapy przetwarzania tkanek umożliwiają ich klarowanie oraz permeabilizację. Ostatnim krokiem jest inkubacja przetraktowanych próbek z roztworem przeciwciał w celu barwienia immunologicznego lub z oznakowaną sondą w przypadku fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Ostatecznie wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne, a następnie rekonstrukcja trójwymiarowa, pozwalają na analizę ilościową w preparatach całych organów na poziomie pojedynczych komórek.Metodę tę zastosowano początkowo w celu uzyskania informacji o organizacji CT w polu widzenia, jednak można ją również wykorzystać do analizy innych przedziałów komórkowych w innych tkankach oraz u innych organizmów modelowych. Do probówek do wirówki wypełnionych świeżo przygotowanym buforem BBO, schłodzonym na lodzie w ilości 20 do 30 carpals na probówkę, wprowadzi

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczną metodę ilościowej analizy pojedynczych komórek modyfikacji chromatyny i struktury jądra w całych zalążkach u Arabidopsis

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę immunobarwienia i FISH w całych zalążkach Arabidopsis thaliana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej. Technika umożliwia ilościową analizę na poziomie pojedynczych komórek.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów