PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie dokładnych pozycji integracji wektorów wirusowych w genomie. Osiąga się to poprzez początkową liniową reakcję PCR z biotynylowanymi starterami w celu wzbogacenia o sekwencje połączeń genomu wektora z genomowego DNA na fazie stałej w serii reakcji, generowane jest dwuniciowe DNA ze znanymi sekwencjami DNA na obu końcach produktu, co pozwala na wykładniczą amplifikację połączeń genomu wektora. Następnie adaptery do sekwencjonowania są włączane do produktów PCR jagnięcych.

W celu sekwencjonowania i scharakteryzowania nieznanego flankującego DNA za pomocą głębokiego sekwencjonowania, fragmenty te ujawniają dokładne pozycje integracji wektorowych. Rezultatem jest różnorodność wzmocnionych połączeń widzianych przez elektroforezę żelową. Metoda ta zapewnia wgląd w rozmieszczenie miejsc integracji wektorów wirusowych u pacjentów z kliniczną terapią genową.

Może być również stosowany w innych badaniach, takich jak insercja, mutageneza, badania przesiewowe, infekcje wirusowe, rak i klonalność komórek macierzystych lub różnorodność komórek T. Procedura zostanie zademonstrowana przez ina RA, technika z mojego laboratorium Do tej procedury najpierw przygotuj kasety łącznikowe, wymieszaj 40 mikrolitrów każdego z dwóch LCO Lego ze 110 mikrolitrami chlorowodorku tris i 10 mikrolitrami chlorku magnezu w mikroprobówce wirówkowej. Następnie ustaw mieszaninę do inkubacji w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie powoli schładzaj do temperatury pokojowej przez noc.

Następnego dnia dodaj 300 mikrolitrów wody do przygotowanego dwuniciowego łącznika, DNA, i przefiltruj je przez mikroprobówkę wirówkową. Zakręć filtrem, aby zebrać skoncentrowane DNA łącznika w ouit. Następnie odzyskaj ouit z filtra.

Dodaj 80 mikrolitrów wody do ouit i odpipetuj 10 mikrolitrów porcji do probówek PCR. Użyj PCR do wstępnej amplifikacji połączeń genomu wektora w 50 mikrolitrowych probówkach reakcyjnych dla jagnięciny.

Dodaj od jednego nanograma do jednego mikrograma próbki DNA na 50 mikrolitrów reakcji. W przypadku jagnięciny NR należy użyć co najmniej 100 nanogramów DNA. Nie dodawać więcej niż 25 mikrolitrów wykonać PCR zgodnie z tabelą drugą w tekście.

A po zakończeniu dodaj dodatkowe 0,5 mikrolitra technologii do każdej reakcji i uruchom program PCR po raz drugi. Najpierw przygotuj koraliki magnetyczne. Dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych strept ENC do 1,5 mililitrowej probówki i umieść je na separatorze kulek magnetycznych na jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie odrzucić upór supernatantu. Zawieś kulki w 40 mikrolitrach PBS z BSA i umieść kulki z powrotem na separatorze na kolejną minutę. Zastąp supernatant 20 mikrolitrami trzymolowego roztworu chlorku litu.

I znowu połóż koraliki na separatorze na minutę. Na koniec zastąpić supernatant 50 mikrolitrami sześciomolowego roztworu chlorku litu. Teraz dodaj mieszaninę kulek magnetycznych do produktu reakcji PCR i pozostaw tę mieszaninę do inkubacji przez dwie godziny do nocy w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem.

Biotynylowane DNA i paski tava oraz powlekane kulki tworzą kompleksy, które mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do czterech dni. Kontynuuj z jagnięciną lub jagnięciną NR Ze względu na jego wysoką czułość. L-A-M-P-C-R jest podatny na zanieczyszczenie, jeśli jest wykonywany z uwagą.

To jest środowisko klasy PCR. I szczególna dbałość o czystość najwyższej wagi. Aby skutecznie amplifikować nieznane boczne DNA bez zanieczyszczania próbek, najpierw wystaw kompleksy na minutę na separator, a następnie zawiesij kulki DNA w 100 mikrolitrach wody.

Następnie wystaw kompleksy na działanie separatora na minutę. I tym razem ponownie zamieszaj kompleksy kulek DNA w mieszaninie z 8,25 mikrolitrami wody. Jeden mikrolitr buforu nukleotydowego HEXA, ćwierć mikrolitra NTP D DN i pół mikrolitra polimerazy kanowej.

Inkubuj tę mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj 90 mikrolitrów wody i wystawij reakcję na działanie separatora przez kolejną minutę. Następnie ponownie zawieś kompleksy kulek DNA w 100 mikrolitrach wody.

Użyć separatora przez kolejną minutę i przygotować reakcję enzymu restrykcyjnego. Po usunięciu supernatantu. Dodaj 8,5 mikrolitra wody, jeden mikrolitr buforu enzymu restrykcyjnego i pół mikrolitra enzymu restrykcyjnego.

Wybierając enzym restrykcyjny, upewnij się, że nie ma on żadnych miejsc w pierwotnym miejscu wiązania używanym w reakcji amplifikacji wstępnej lub za nim. Po pozostawieniu enzymów do reakcji przez godzinę w idealnej temperaturze dodaj 90 mikrolitrów wody. Użyj separatora na minutę i ponownie zawieś kompleksy BDNA w przemyciu 100 mikrolitrów wody.

Powtórzyć separację i przygotować reakcję podwiązywania. Dodaj do kulek pięć mikrolitrów wody, jeden mikrolitr 10 x bufor szybkiego łącza. Jeden mikrolitr TP, jeden mikrolitr szybkiej ligazy DNA i mikrolitr kasety łącznikowej wykonane na początku zabiegu.

Pozwól tej reakcji trwać przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zakończ reakcję, dodając 90 mikrolitrów wody i oddzielając kulki, a następnie przemyj w 100 mikrolitrach wody. A następnie kolejna separacja w celu denaturacji zsyntetyzowanego DNA ponownie zawieś kulki w pięciu mikrolitrach 0,1 normalnego wodorotlenku sodu i pozwól mieszaninie wstrząsnąć przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie oddziel kompleksy na minutę i zbierz natynę SUP, która zawiera wstępnie amplifikowane połączenie genomu wektora. Natychmiast przystąp do wykładniczego wzmocnienia lub przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zacznij od wystawienia kompleksów na działanie separatora na minutę.

I resus zawieszający kulki DNA w 100 mikrolitrach wody. I oddziel je ponownie i usuń supernatant. Do reakcji ligacji dodać 6,5 mikrolitra wody, jeden mikrolitr ligazy cyrkującej, 10 x bufor reakcyjny.

Pół mikrolitra chlorku magnezu, pół mikrolitra TP, jeden mikrolitr oligonukleotydów łącznikowych SS i pół mikrolitra ligazy cir. Po godzinie w temperaturze 60 stopni Celsjusza zakończ reakcję 90 mikrolitrami wody za pomocą separatora perełkowego Resus zawieszając kulki w kolejnych 100 mikrolitrach jednego, ponownie używając separatora i zbierając kompleksy płuczące w 10 mikrolitrach wody. Rozpocząć od przygotowania wzorcowej mieszanki PCR zgodnie z opisem w tabeli trzeciej tekstu.

Dodaj 48 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do dwóch mikrolitrów produktów jagnięcych lub jagnięcych NR w probówkach PCR o pojemności 200 mikrolitrów i uruchom PCR zgodnie z opisem w tekście, jak poprzednio, przygotuj więcej paciorkowców w kulkach i ponownie zawieś je w sześciu molowym chlorku litu. Użyj 20 mikrolitrów do jagnięciny lub 50 mikrolitrów do jagnięciny NR. Następnie dodaj kulki do tej samej objętości produktów reakcji PCR i inkubuj je na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez dwie godziny do nocy w temperaturze pokojowej, zbierz kompleks kulek DNA i przemyj go 100 mikrolitrami wody, jak wykazano wcześniej.

Teraz zawiesić kompleks w 0,1 normalnego wodorotlenku sodu i inkubować kulki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie wystawić kulki na działanie separatora na minutę i zebrać supernatant zawierający amplifikowane DNA do nowej probówki. Używając amplifikowanego DNA jako matrycy, użyj dwóch mikrolitrów do przeprowadzenia PCR, jak opisano w tabeli czwartej tekstu.

Wizualizacja produktów za pomocą elektroforezy żelowej w celu oczyszczenia produktów. Wymieszaj 40 mikrolitrów z 44 mikrolitrami kulek magnetycznych o temperaturze pokojowej i czystych XP i inkubuj je przez pięć minut. Następnie oddziel koraliki na dwie minuty na magnesie.

Po usunięciu supernatantu umyj kulki dwukrotnie za pomocą 200 mikrolitrów 70% etanolu, a następnie ponownie zawieś kulki i 30 mikrolitrów wody za pomocą 40 nanogramów startera fuzyjnego DNAA. PCR może być używany do dodawania adapterów specyficznych do sekwencjonowania. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli piątej.

Sprawdź produkty na żelu. Przeglądanie wyników PCR jagniąt za pomocą elektroforezy żelowej o wysokiej rozdzielczości jest najlepszym wyborem analizy diagnostycznej dla porównania. Chociaż 2%aros również działa, nie działa tak dobrze.

Klonalność produktów NR LAMB, PCR nie może być zdiagnozowana wizualnie. Żel 2%agros jest jednak całkowicie wystarczający, aby określić sukces protokołu. Po zsekwencjonowaniu produktów PCR można znaleźć lokalizację wektorów w genomie gospodarza.

Na podstawie tych danych możliwe jest rejestrowanie lokalizacji miejsc insercji w regionach kodowania i w pobliżu miejsc rozpoczęcia transkrypcji po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią genową do zbadania bezpieczeństwa biologicznego wektorów transferu genów zarówno w modelach przedklinicznych, jak i w klinicznych badaniach klinicznych terapii genowej.