Name: PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę LAM-PCR do precyzyjnej lokalizacji miejsc integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta umożliwia badanie dynamiki klonalnej w terapii genowej i ocenę bezpieczeństwa wektorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie zostało zapewnione przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant Centrum Onkologicznego Heidelberg/Mannheim), przez Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), przez VIte + VII Programy Ramowe Komisji Europejskiej (CONSERT, CLINIGENE i PERSIST). Dziękujemy Inie Kutscherze za zademonstrowanie techniki protokołu w filmie.

1. Przygotowanie kaset z linkerem (LC)
<ol>
	<li>Wymieszać 40 μl oligonukleotydu LC1 (Tabela 1), 40 μl oligonukleotydu LC2 (Tabela 1, z odpowiednim zwisem enzymu restrykcyjnego), 110 μl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) i 10 μl 250 mM MgCl2.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i pozwolić reakcji powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 300 μlH2O i skoncentrować dsLinker-DNA na filtrze wirującym. Dodać 80 μlH2Odo eluatu i podwielokrotność 10 μl przygotowanej kasety łącznikowej w probówkach 0,2 PCR.</li>
</ol>
2. Preamplifikacja połączeń genomu wektora
<ol>
	<li>Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
	<ol>
		<li>Określić stężenie próbek DNA. Odpipetować x μl (1-1 000 ng dla LAM/100-1 000 ng dla nrLAM) DNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Objętość DNA powinna być równa w każdej próbce i mieścić się w zakresie od 0,5 do 25 μl.</li>
		<li>Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2. Wymieszać (50 - x) μl mieszanki wzorcowej z każdą próbką DNA w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna amplifikacja wektorowych połączeń genomowych przy użyciu warunków PCR zilustrowanych w tabeli 2. Po zakończeniu PCR dodaj 0,5 μl polimerazy Taq do każdej probówki PCR i ponownie uruchom program PCR. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Separacja magnetyczna produktu PCR
<ol>
	<li>Przygotowanie koralików magnetycznych
	<ol>
		<li>Odpipetować 20 μl (200 μg) kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną do probówki o pojemności 1,5 ml i wystawić na 1 minutę na magnetyczny separator cząstek (MPS) w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Wyjmij probówkę z MPS i ponownie zawieś kulki magnetyczne w 40 μl PSB/ 0,1% BSA (pH 7,5). Wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.</li>
		<li>Przemyć kulki 20 μl roztworu 3 M LiCl (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl roztworu 6 M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj całą reakcję PCR z kroku 2.2 z 50 μl przygotowanych kulek magnetycznych. Inkubować na wytrząsarce poziomej (300 obr./min) co najmniej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ten etap umożliwia wiązanie biotynylowanego produktu PCR z kulkami pokrytymi streptawidyną (kompleks DNA-Bead). Kompleks kulek DNA może być inkubowany na wytrząsarce przez noc lub przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.</li>
	<li>Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 100 μl H2O. Natychmiast przejdź do kroku 4 dla LAM lub kroku 5 dla nrLAM.</li>
</ol>
4. Procedura LAM
<ol>
	<li>Synteza dwuniciowego DNA (dsDNA) (tylko LAM)
	<ol>
		<li>Wystaw kompleks DNA-Bead z kroku 3.3 na MPS na 1 minutę i odrzuć supernatant. Dodać 8,25 μlH2O, 1 μl 10x buforu heksanukleotydowego, 0,25 μl dNTP (10 mM) i 0,5 μl (2 U) polimerazy Klenowa. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 90 μlH2Oi wystawić na działanie MPS przez 1 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 100 μlH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przegląd ograniczeń
	<ol>
		<li>Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Dodać 8,5 μl H2O, 1 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i 0,5 μl enzymu restrykcyjnego i inkubować reakcję przez 1 godzinę. Powtórz krok 4.1.2. 
		UWAGA: Reakcję inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta enzymu restrykcyjnego. Upewnij się, że w obrębie lub za miejscem wiązania startera używanym do wstępnej amplifikacji w DNA będącym przedmiotem zainteresowania nie ma miejsca ograniczenia. Aby uzyskać informacje na temat wyboru odpowiednich kombinacji enzymów restrykcyjnych/enzymów restrykcyjnych, patrz punkt 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie łącznika ds (LK)
	<ol>
		<li>Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Dodaj 5 μl H2O, 1 μl 10x bufor FastLink, 1 μl ATP (10 mM), 2 μl kasety Linker z kroku 1.2 i 1 μl Ligazy DNA Fast-Link (2 U/μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz krok 4.1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Denaturacja zsyntetyzowanego dsDNA
	<ol>
		<li>Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Zawiesić kompleks DNA-kulek w 5 μl 0,1 N NaOH. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce poziomej.</li>
		<li>Wystaw kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i zbierz wstępnie amplifikowane połączenie wektor-genom zawierające supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przejść do kroku 6 lub przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Procedura nrLAM
<ol>
	<li>Podwiązanie łącznika jednoniciowego (ssLC) (tylko nrLAM)
	<ol>
		<li>Wystaw kompleks DNA-Bead z kroku 3.3 na MPS na 1 minutę i odrzuć supernatant. Dodać 6,5 μl H2O, 1 μl CircLigase 10x bufor reakcyjny, 0,5 μl MnCl2 (50 mM), 0,5 μl ATP (1 mM), 1 μl oligonukleotydu ssLinker i 0,5 μl CircLigaze (100 U/μl). Inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 90 μlH2Oi wystawić na działanie MPS przez 1 minutę. Wyrzucić supernatant i przemyć kompleks DNA-Bead w 100 μl H2O. Ponownie wystawić na działanie MPS przez 1 minutę, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 10 μl H2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wzmocnienie wykładnicze I
<ol>
	<li>Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
	<ol>
		<li>Pobrać pipetę z 2 μl matrycy DNA (z etapu 4.4.2 (LAM) lub 5.1.2 (nrLAM)) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
		<li>Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 3. Dodać 48 μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 6.1.1 i amplifikować połączenia genomu wektora za pomocą warunków PCR, jak pokazano w tabeli 3. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Separacja magnetyczna produktu PCR
<ol>
	<li>Przygotuj koraliki magnetyczne zgodnie z przykładem w krokach 3.1.1 - 3.1.3. Zawiesić kulki w 20 μl (dla LAM) lub 50 μl (dla nrLAM) roztworu 6 M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Zmieszać 20 μl (LAM) lub 50 μl (nrLAM) reakcji PCR z etapu 6.1.2 z przygotowanymi kulkami magnetycznymi (etap 7.1) i inkubować na wytrząsarce poziomej (300 obr./min) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kompleks kulek DNA może być inkubowany na wytrząsarce przez noc lub przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.</li>
	<li>Wystawić kompleks DNA-kulki na działanie MPS przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-kulki w 100 μl H2O. Wystawić kompleks DNA-kulki na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić kompleks DNA-kulek w 20 μl (LAM) lub 5 μl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce poziomej, wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i zebrać amplifikowane DNA zawierające supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przejść do kroku 8.1 lub przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
8. Wzmocnienie wykładnicze II
<ol>
	<li>Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
	<ol>
		<li>Pobrać pipetę z 2 μl matrycy DNA (z kroku 7.3) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
		<li>Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 4. Dodać 48 μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 8.1.1 i amplifikować połączenia genomowe wektora za pomocą warunków PCR, jak pokazano w tabeli 4. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uwidocznić produkty (nr)LAM-PCR, załaduj 10 μl produktu PCR z kroku 8.1.2 na 2% żel agarozowy. Jeśli prążki są widoczne, przeanalizuj 10 μl produktu LAM-PCR na żelu o wysokiej rozdzielczości. UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenny. Pracuj bardzo ostrożnie i zawsze noś odpowiednie rękawice.</li>
</ol>
9. Przygotowanie do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
<ol>
	<li>Oczyszczanie produktów (nr)LAM-PCR
	<ol>
		<li>Zmieszaj 40 μl produktu PCR z kroku 8.1.2 z 44 μl kulek magnetycznych AMPure XP o temperaturze pokojowej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wystawić na działanie MPS przez dodatkowe 2 minuty.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć 200 μl 70% EtOH na MPS.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-kulki w 30 μlH2O. Inkubować przez 1 minutę i przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 0,2 ml. Określ stężenie oczyszczonego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fusionprimer PCR w celu dodania adapterów specyficznych dla sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.</li>
		<li>Odpipetować x μl (40 ng) DNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Objętość DNA powinna być równa w każdej próbce i mieścić się w zakresie od 0,5 do 25 μl.</li>
		<li>Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 5. Dodać (50 - x) μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 9.2.2 i wprowadzić adaptery do sekwencjonowania do produktów (nr)LAM-PCR w warunkach PCR, jak pokazano w tabeli 5. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Aby uwidocznić produkty Fusionprimer-PCR, załaduj 10 μl produktu PCR z kroku 9.2.3 na 2% żel agarozowy. Oczyść pozostały produkt PCR zgodnie z opisem w krokach 9.1.1 - 9.1.3. Przeanalizuj 1 μl oczyszczonego produktu PCR z kroku 9.4 na zautomatyzowanym urządzeniu do elektroforezy o wysokiej rozdzielczości, aby dokładnie określić ilościowo stężenie i wielkość fragmentów produktów Fusionprimer-PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li>
<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+%28LAM-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li>
<li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li>
<li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1%2Fmariner+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li>
<li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li>
<li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiarm+high-throughput+integration+site+detection%3A+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li>
<li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li>
<li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li>
<li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li>
<li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li>
<li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li>
<li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li>
<li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li>
<li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li>
<li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li>
<li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li>
<li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li>
<li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li>
<li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li>
<li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li>
<li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika LAM-PCR pozwala na identyfikację nieznanych sekwencji DNA, które flankują znany region DNA. Ze względu na wysoką czułość wynikającą z preamplifikacji połączeń ze specyficznymi starterami hybrydyzującymi w znanej sekwencji DNA, możliwa jest amplifikacja i wykrycie nawet rzadkich połączeń aż do poziomu pojedynczej komórki. Przeciwnie, w sytuacji poliklonalnej LAM-PCR jest w stanie wzmocnić tysiące różnych połączeń w jednej reakcji.
Jednak ze względu na zastosowanie enzymów restrykcyjnyc...

Linear-amplifikacyjny PCR (LAM-PCR) pozwala zidentyfikować i scharakteryzować nieznane DNA flankujące sąsiadujące ze znanym DNA dowolnego pochodzenia. Dokładniej mówiąc, LAM-PCR został opracowany w celu lokalizacji miejsc integracji wektorów wirusowych (IS) w genomie gospodarza1,2. Elementy genetyczne, takie jak retrowirusy lub transpozony, integrują swój genom z genomem gospodarza w sposób (pół) losowy3-6. W wielu przypadkach decydujące znaczenie ma dokładna znajomość pozycji, w której te wektory się całkują. Udowodniono, że LAM-PCR jest lepszy od alternatywnych technik, takich jak PCR7 i jego warianty za pośrednictwem ligacji lub odwrócony PCR8. Czułość i solidność tej metody wynika ze wstępnej amplifikacji połączeń wektor-genom i selekcji magnetycznej amplifikowanych produktów PCR. Podobnie jak wspomniane metody alternatywne, LAM-PCR opiera się na użyciu enzymów restrykcyjnych, wprowadzając błąd systematyczny w zdolności wyszukiwania IS9-11. W związku z tym tylko podzbiór repertuaru IS (integrom) może być wykryty w jednej reakcji. Błąd ten jest minimalizowany przez równoległą analizę danej próbki przy użyciu optymalnych kombinacji enzymów restrykcyjnych9. Ostatnio opracowano wariant technologii określany jako nierestrykcyjny LAM-PCR (nrLAM-PCR), który omija stosowanie enzymów restrykcyjnych i umożliwia bezstronną analizę całego genomu próbki w pojedynczej reakcji9,12.
W przeszłości LAM-PCR był używany do identyfikacji przyczynowego retrowirusowego IS powodującego białaczkę u kilku pacjentów w klinicznych badaniach klinicznych terapii genowej13-15. Od tego czasu LAM-PCR został przystosowany do identyfikacji IS od innych wektorów integrujących (wektory lentiwirusowe, transpozony), a także do identyfikacji wzorców integracji wektorów pasywnie integrujących, takich jak wektory związane z adenowirusem (AAV) lub wektory lentiwirusowe z wadą integrazy (IDLV)16-21. Zastosowania LAM-PCR są szeroko rozpowszechnione: tradycyjnie technika ta jest szeroko stosowana do badania składu klonalnego komórek zmodyfikowanych genowo u pacjentów, którzy przeszli terapię genową lub do oceny bezpieczeństwa biologicznego nowych systemów wektorowych poprzez rozwikłanie ich zachowań integracyjnych15,16,22-24. Ostatnio projekt LAM-PCR umożliwił określenie swoistości i aktywności poza celem nukleaz zaprojektowanych za pomocą testu pułapkowania IDLV25.
Ponadto, LAM-PCR pozwala łatwo śledzić losy transdukowanej komórki w czasie w organizmie. Pozwala to na identyfikację protoonkogenów, a także genów supresorowych nowotworów, a także na badanie hematopoezy lub biologii nowotworowych komórek macierzystych26-28. Wreszcie, co nie mniej ważne, LAM-PCR został przystosowany do badania różnorodności receptorów komórek T u ludzi29 (i dane niepublikowane).
Wewnętrzna moc technologii jest wzmocniona przez powiązanie metody z technologiami głębokiego sekwencjonowania, które pozwalają scharakteryzować miliony nieznanych bocznych DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu w całych genomach. W poniższym protokole opisujemy krok po kroku amplifikację i identyfikację flankującego nieznanego DNA w celu identyfikacji wektora lentiwirusowego IS. Oligonukleotydy użyte w protokole wymieniono w tabeli 1. Wyekstrahowane DNA lub cDNA z dowolnego źródła można wykorzystać jako matrycę DNA do LAM-PCR i nrLAM-PCR.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>Można stosować alternatywne polimerazy Taq</td></tr><tr><td>Bufor PCR</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>Zaleca się stosowanie tego buforu Mieszanina</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>lub dowolna inna dNTPs</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy (startery)</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>HPLC oczyszczone</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptawidyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>0,1% wag./obj. BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>22637</td><td>lub dowolny inny dostawca</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A1103,0250</td><td>lub dowolny inny dostawca</td></tr><tr><td>Klenow Polymerase</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina heksanukleotydów</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonukleaza</td><td>NEB</td><td></td><td>lub jakikolwiek inny dostawca</td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>do ligacji DNA Fast-LinkEpicentre Biotechnologies</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA Ligase Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>lub dowolny inny dostawca</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>lub jakikolwiek inny dostawca</td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>lub dowolny inny dostawca</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>Bromek etydyny jest mutagenny</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>lub dowolny inny drabinka DNA</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>lub dowolny inny dostawca</td></tr><tr><td>Magnetyczny separator cząstek Magna-Sep&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K158501</td><td>do stosowania z probówkami o pojemności 1,5 ml</td></tr><tr><td>Magnetyczny separator cząstek Magna-Sep</td> Life <td>Technologies</td><td>K158696</td><td>do stosowania z płytkami 96-dołkowymi</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5, membraną Ultracel-30</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue Gelsystem Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>lub innym systemem do elektroforezy&nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>lub inny Termocykler do płytek 96-dołkowych</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td>lub inna wytrząsarka pozioma</td></tr><tr><td>PCR softtubes 0,2 ml</td><td>Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>lub inne probówki do PCR 0,2</td></tr><tr><td>ml Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>lub inne probówki 1,5 ml</td></tr><tr><td>System dokumentacji żeli</td><td>PeqLab</td><td></td><td>lub dowolny inny system dokumentacji żeli</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 żel prefabrykowany</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroforezy żelowej zanurzonej SEA 2000&nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator elektroforezy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

pcr za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego dna flankującego

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplifikacyjny PCR (LAM-PCR) został opracowany do badania hematopoezy w genach skorygowanych komórek pacjentów leczonych terapią genową z integrującymi systemami wektorowymi. Ze względu na stabilną integrację wektorów retrowirusowych, miejsca integracji mogą być wykorzystywane do badania losów klonalnych poszczególnych komórek i ich potomstwa. LAM-PCR po raz pierwszy dostarczył dowodów na to, że białaczka u pacjentów leczonych terapią genową wywodzi się z nadekspresji sąsiedniego protoonkogenu wywołanej przez prowirusy. Wysoka czułość i swoistość LAM-PCR w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak odwrócony PCR i PCR za pośrednictwem ligacji (LM)-PCR, osiąga się poprzez początkowy etap preamplifikacji (liniowy PCR 100 cykli) przy użyciu biotynylowanych starterów specyficznych dla wektorów, które umożliwiają przeprowadzanie kolejnych etapów reakcji w fazie stałej (kulki magnetyczne). LAM-PCR jest obecnie najbardziej czułą dostępną metodą identyfikacji nieznanego DNA, które znajduje się w pobliżu znanego DNA. Niedawno opracowano wariant LAM-PCR, który omija trawienie restrykcyjne, eliminując w ten sposób błąd wyszukiwania miejsc integracji i umożliwia kompleksową analizę lokalizacji prowirusów w genomach gospodarza. Poniższy protokół wyjaśnia krok po kroku amplifikację sekwencji 3', jak i 5'- sąsiadujących ze zintegrowanym wektorem lentiwirusowym.

LAM-PCR prowadzi do amplifikacji połączeń genomu wektora o określonej wielkości fragmentu dla każdego połączenia. Wielkość poszczególnych fragmentów PCR zależy od odległości między lokalizacją znanego DNA w genomie a najbliższą sekwencją rozpoznawania enzymu restrykcyjnego. Pozwala to na wizualizację różnorodności amplifikowanych połączeń w analizowanych próbkach za pomocą elektroforezy żelowej, np. poprzez sprawdzenie, czy na żelu obecne są tylko pojedyncze (monoklonalne), kilka (oligoklonalne) czy liczne (poli...

Linear-amplifikacja (LAM)-PCR to metoda opracowana w celu określenia dokładnych pozycji integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta ewoluowała, aby stać się lepszą metodą badania dynamiki klonalnej u pacjentów z terapią genową, bezpieczeństwa biologicznego nowych technologii wektorowych, różnorodności komórek T, modeli rakowych komórek macierzystych itp.

PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie dokładnych pozycji integrujących wektorów wirusowych w genomie. Osiąga się to poprzez wstępną liniową reakcję PCR z biotynylowanymi starterami w celu wzbogacenia sekwencji złączy genomu wektora z DNA genomowego w fazie stałej w serii reakcji, w wyniku czego generowany jest dwuniciowy DNA ze znanymi sekwencjami DNA na obu końcach produktu, co umożliwia wykładniczą amplifikację złączy genomu wektora. Następnie do produktów lambda PCR dołącza się adaptery sekwencyjne.W celu sekwencjonowania i charakterystyki nieznanego flankującego DNA za pomocą sekwencjonowania głębokiego, fragmenty te ujawniają dokładne pozycje integracji wektora. Wynikiem jest zróżnicowanie amplifikowanych złączy widoczne w elektroforezie żelowej. Metoda ta pozwala na poznanie rozkładu miejsc integracji wektorów wirusowych u pacjentów poddanych klinicznej terapii genowej.Metodę tę można zastosować również w innych badaniach, takich jak badania insercyjne, mutagenne, przesiewowe, infekcje wirusowe, badania nad nowotworami, klonalność komórek macierzystych lub różnorodność limfocytów T. Procedurę zaprezentuje ina RA, technik z mojego laboratorium. W celu prz

linear-amplification-mediated-pcr-localization-genetic-elements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzmocnienie liniowe pośredniczone przez PCR – Lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanych otaczających DNA

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną i efektywną strategię usuwania bio-cząsteczek obecnych w próbkach 'touch DNA', wraz z ulepszonym protokołem amplifikacji obejmującym jednoetapową 5 μl mikroobjętościową lizę/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie krótkich profili powtórzeń tandemowych (STR) dawcy (dawców) biocząstek.

Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Poznaj metodę LAM-PCR do precyzyjnej lokalizacji miejsc integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta umożliwia badanie dynamiki klonalnej w terapii genowej i ocenę bezpieczeństwa wektorów.

PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Przeglądaj więcej filmów