PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie dokładnych pozycji integrujących wektorów wirusowych w genomie. Osiąga się to poprzez wstępną liniową reakcję PCR z biotynylowanymi starterami w celu wzbogacenia sekwencji złączy genomu wektora z DNA genomowego w fazie stałej w serii reakcji, w wyniku czego generowany jest dwuniciowy DNA ze znanymi sekwencjami DNA na obu końcach produktu, co umożliwia wykładniczą amplifikację złączy genomu wektora. Następnie do produktów lambda PCR dołącza się adaptery sekwencyjne.

W celu sekwencjonowania i charakterystyki nieznanego flankującego DNA za pomocą sekwencjonowania głębokiego, fragmenty te ujawniają dokładne pozycje integracji wektora. Wynikiem jest zróżnicowanie amplifikowanych złączy widoczne w elektroforezie żelowej. Metoda ta pozwala na poznanie rozkładu miejsc integracji wektorów wirusowych u pacjentów poddanych klinicznej terapii genowej.

Metodę tę można zastosować również w innych badaniach, takich jak badania insercyjne, mutagenne, przesiewowe, infekcje wirusowe, badania nad nowotworami, klonalność komórek macierzystych lub różnorodność limfocytów T. Procedurę zaprezentuje ina RA, technik z mojego laboratorium. W celu przeprowadzenia tej procedury należy najpierw przygotować kasety łącznikowe: w probówce do mikrocentryfugi wymieszać 40 µL każdego z dwóch LCO Legos ze 110 µL chlorku tris oraz 10 µL chlorku magnezu. Następnie mieszaninę należy inkubować w bloku grzejnym w temperaturze 95 °C przez pięć minut, a potem powoli chłodzić do temperatury pokojowej przez noc.

Następnego dnia do przygotowanego dwuniciowego łącznika DNA dodać 300 µL wody, a następnie przefiltrować go do probówki do mikrocentryfugi. Wirować filtr, aby zebrać skoncentrowane DNA łącznika w osadzie. Następnie odzyskać osad z filtra.

Dodać 80 µL wody do probówki i wymieszać za pomocą pipety. Rozdzielić w aliquotach po 10 µL do probówek PCR. Przeprowadzić reakcję PCR w celu wstępnej amplifikacji złączy genomu wektora w 50 µL probówkach reakcyjnych dla lambdy.

Do każdej 50 µL reakcji należy dodać od 1 ng do 1 µg DNA z próbki. W przypadku owiec rasy NR lamb należy użyć co najmniej 100 ng DNA. Nie należy dodawać więcej niż 25 µL; reakcję PCR należy przeprowadzić zgodnie z tabelą 2 w tekście.

Po zakończeniu dodaj dodatkowe 0,5 µL techniki do każdej reakcji i ponownie uruchom program PCR. Najpierw przygotuj kulki magnetyczne. Do probówki o pojemności 1,5 mL dodaj 20 µL kulek magnetycznych powlekanych strept ENC i umieść je w separatorze kulek magnetycznych na jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie odrzucić nadsącz. Zawiesić kuleczki w 40 µL PBS z BSA i ponownie umieścić je w separatorze na kolejną minutę. Zastąpić nadsącz 20 µL roztworu płuczącego chlorku litu o stężeniu 3 M.

Ponownie umieść kulki na separatorze na jedną minutę. Na koniec zastąp nadsącz 50 µL sześciomolarnego roztworu chlorku litu. Teraz dodaj mieszaninę kulek magnetycznych do produktu reakcji PCR i inkubuj tę mieszaninę przez dwie godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu.

Biotynilowane DNA oraz paski tava i powlekane kuleczki utworzą kompleksy, które można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do czterech dni. Kontynuuj z lamb lub NR lamb. Ze względu na wysoką czułość, L-A-M-P-C-R jest podatny na kontaminację w przypadku nieuwagi podczas jego przeprowadzania.

Jest to środowisko klasy PCR. Szczególna dbałość o czystość jest kwestią najwyższej wagi. Aby pomyślnie przeprowadzić amplifikację nieznanych flankujących sekwencji DNA bez zanieczyszczenia próbek, najpierw należy poddać kompleksy działaniu separatora przez minutę, a następnie ponownie zawiesić kulki DNA w 100 µL wody.

Następnie poddaj kompleksy działaniu separatora przez minutę. Tym razem resuspenduj kompleksy koralików z DNA w mieszaninie zawierającej 8,25 µL wody, 1 µL buforu nukleotydowego HEXA, 0,25 µL dNTPs oraz 0,5 µL polimerazy cano.

Inkubować tę mieszaninę w temperaturze 37 °C przez godzinę. Następnie dodać 90 µL wody i poddać reakcję działaniu separatora przez kolejną minutę. Następnie ponownie zawiesić kompleksy kulek z DNA w 100 µL wody do przemywania.

Używaj separatora przez kolejną minutę i przygotuj reakcję enzymu restrykcyjnego. Po usunięciu supernatantu dodaj 8.5 µL wody, 1 µL buforu do enzymu restrykcyjnego oraz 0.5 µL enzymu restrykcyjnego.

Podczas wyboru enzymu restrykcyjnego należy upewnić się, że nie posiada on miejsc cięcia w obrębie lub poniżej miejsca wiązania startera użytego w reakcji amplifikacji preem. Po inkubacji enzymów przez godzinę w optymalnej temperaturze, należy dodać 90 µL wody. Przez minutę używać separatora, a następnie resuspender kompleksy BDNA w 100 µL wody do przemycia.

Powtórz separację i przygotuj reakcję ligacji. Do kulek dodaj 5 µL wody, 1 µL 10 x fast link buffer, 1 µL TP, 1 µL fast link DNA ligase oraz 1 µL kasety łącznika przygotowanej na początku procedury.

Pozostawić tę reakcję na pięć minut w temperaturze pokojowej. Zakończyć reakcję, dodając 90 µL wody i oddzielając kuleczki, a następnie przemyć je w 100 µL wody. Następnie ponownie oddzielić kuleczki, a w celu denaturacji zsyntetyzowanego DNA zawiesić je w 5 µL 0,1 N wodorotlenku sodu i mieszać mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie oddziel kompleksy przez jedną minutę i zbierz nadsącz, który zawiera wstępnie namnożone złącze genomu wektora. Natychmiast przystąp do amplifikacji wykładniczej lub przechowuj w temperaturze -20 °C. Rozpocznij od poddania kompleksów działaniu separatora przez jedną minutę.

Następnie resuspenduj kuleczki DNA w 100 µL wody. Ponownie je odseparuj i usuń nadsącz. Do reakcji ligacji dodaj 6,5 µL wody, 1 µL ligazy circ oraz 10 x bufor reakcyjny.

Pół mikrolitra chlorku magnezu, pół mikrolitra TP, jeden mikrolitr oligosów łącznika SS oraz pół mikrolitra ligazy kolistej. Po godzinie w temperaturze 60°C reakcję kończy się dodaniem 90 mikrolitrów wody, a następnie za pomocą separatora kulek Resus zawiesza się kuleczki w kolejnych 100 mikrolitrach wody. Ponownie używa się separatora, zbierając kompleksy płukania w 10 mikrolitrach wody. Należy rozpocząć od przygotowania mieszaniny PCR (master mix) zgodnie z opisem w tabeli 3 tekstu.

Do 2 µL produktów z jagnięcia lub jagnięcia NR dodać 48 µL master mixu w probówkach do PCR o pojemności 200 µL i przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z opisem w tekście; następnie przygotować więcej kulek streptavidynowych i resuspender je w 6 M chlorku litu. Użyć 20 µL w przypadku jagnięcia lub 50 µL w przypadku jagnięcia NR. Następnie dodać kulki do takiej samej objętości produktów reakcji PCR i inkubować je na wytrząsarce przy 300 RPM przez dwie godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej, zebrać kompleks DNA-kulki i przemyć go 100 µL wody, zgodnie z wcześniejszą procedurą.

Następnie zawiesić kompleks w 0,1 N wodorotlenku sodu i inkubować kuleczki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Następnie umieścić kuleczki w separatorze na jedną minutę i zebrać nadsącz zawierający namnożone DNA do nowej probówki. Wykorzystując namnożone DNA jako matrycę, użyć 2 µL tego roztworu do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z opisem w tabeli 4 w tekście.

Produkty należy zwizualizować za pomocą elektroforezy żelowej w celu ich oczyszczenia. 40 µl produktów wymieszać z 44 µl kulek magnetycznych am pure XP w temperaturze pokojowej i inkubować przez pięć minut. Następnie kulki należy oddzielić, umieszczając próbkę na magnesie na dwie minuty.

Po usunięciu supernatantu należy dwukrotnie przemyć kuleczki 200 µL 70% etanolu, a następnie resuspender kuleczki w 30 µL wody z użyciem 40 ng primera fuzyjnego DNAA. Do dodania adapterów specyficznych dla sekwencjonowania można wykorzystać PCR. Szczegółowe informacje podano w tabeli pięć.

Sprawdź produkty na żelu. Analiza wyników lamb PCR za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy żelowej jest najlepszym wyborem w ramach analizy diagnostycznej porównawczej. Choć żel 2% agarose również działa, nie jest on tak skuteczny.

Klonowalności produktów PCR w metodzie NR LAMB nie można zdiagnozować wizualnie. Żel agarozowy 2% jest jednak całkowicie wystarczający, aby określić powodzenie protokołu. Po zsekwencjonowaniu produktów PCR można zlokalizować wektory w genomie gospodarza.

Na podstawie tych danych możliwe jest rejestrowanie lokalizacji miejsc insercji w regionach kodujących oraz w pobliżu miejsc startu transkrypcji. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny terapii genowej do analizy bezpieczeństwa biologicznego wektorów transferu genów zarówno w modelach przedklinicznych, jak i w klinicznych badaniach nad terapią genową.