Powiązana pułapka chromosomowa do identyfikacji interakcji DNA dalekiego zasięgu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odkrycie i zidentyfikowanie partnerów DNA związanych z dalekiego zasięgu. Osiąga się to poprzez utrwalanie, lizę komórek i trawienie DNA przez pierwszy enzym restrykcyjny, a następnie ligację w celu wytworzenia chimerycznego DNA złożonego z segmentów dwóch powiązanych genów. Następnie do chimerycznego DNA dodaje się łączniki po drugim trawieniu restrykcyjnym Aby ułatwić jego amplifikację, amplifikację PCR przeprowadza się następnie przy użyciu łącznika i przynęty specyficznych dla DNA starterów w celu uzyskania wystarczającej ilości powiązanych fragmentów DNA Uzyskuje się wyniki, które pokazują daleki zasięg związany z DNA przynęty na podstawie analizy sekwencji amplifikowanych fragmentów DNA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przechwytywanie chromosomów lub trzy C, jest to, że A-C-T-S-A może być skutecznie wykorzystana do identyfikacji nieznanego partnera DNA związanego z długim zasięgiem. Natomiast trzy C powstały w celu weryfikacji tylko wcześniej podejrzewanych interakcji. Aby rozpocząć hodowlę zgodnie z tym protokołem, ludzkie komórki w inkubatorze są zasilane 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną 80 do 90% zlewania się.

Do tej demonstracji wykorzystuje się ludzkie komórki białaczki kwasowej prom. Zbierz komórki, wlewając je do 50-mililitrowej probówki NOC i odwiruj z prędkością 1200 obr./min przez 15 minut. Po odwirowaniu usunąć pożywkę przez aspirację.

Dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić osady komórkowe. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru weź około 10 razy do siódmych komórek do objętości 40 mililitrów za pomocą RPMI 1640, pożywki zawierającej 10% FBS. Następnie dodaj 1,7 mililitra 37% formaldehydu, aby utrwalić rozcieńczoną chromatynę.

Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji wygasić reakcję 2,4 mililitra dwumolowej glicyny. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut przy 1200 obr./min i czterech stopniach Celsjusza.

Po usunięciu super natyny, umyj osad raz 40 mililitrami lodowatego PBS, a następnie odwiruj próbkę, aby odzyskać umyte osady komórkowe, ponownie zawieś powstały osad w 40 mililitrach lodowatego buforu do lizy ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy i 0,1 milimolowym PMSF inkubuj próbkę w zimnym pomieszczeniu z rotacją przez 90 minut. Na koniec odwirować próbkę z prędkością 2 500 obr./min przez 15 minut, usunąć supernatynę i otrzymać izolowane jądra. Ponownie zawiesić jądra w 0,5 mililitra jednego buforu XNEB trzy i dodać 15 mikrolitrów 10% SDS.

Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z potrząsaniem. Następnie dodać 45 mikrolitrów 20% Triton X 100 w celu sekwestracji SDS i ponownie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem i porcją 10 razy do szóstej. Jądra lub około 15 mikrogramów służy do trawienia enzymów restrykcyjnych do 55 mikrolitrów roztworu jąder.

Dodać 433 mikrolitry jednego buforu XNEB trzy i 12 mikrolitrów BGL dwa. Aby uzyskać całkowitą objętość reakcji trawienia wynoszącą 500 litrów, inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dezaktywuj enzym restrykcyjny, dodając 95 mikrolitrów 10% SDS i denaturuj enzym przez ogrzewanie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut.

W łaźni wodnej dodaj siedem mililitrów jednego buforu do podwiązywania i 360 mikrolitrów 20% Triton X 100. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Obniż temperaturę do 16 stopni Celsjusza i dodaj 50 mikrolitrów po 400 jednostek na mikrolitr.

T cztery Ligazy DNA. Pozostawić reakcję ligacji do inkubacji w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu ligacji dodać 300 mikrogramów proteinazy K i inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie dodaj pięć mikrogramów RNAA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Oczyść DNA przez ekstrakcję chloroformu fenolowego i wytrącić DNA w izopropanolu, rozpuść wytrącone DNA w 150 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej. Aby dodać łączniki do chimerycznego DNA, najpierw traw DNA, inkubując dwa mikrogramy oczyszczonego DNA z pięcioma jednostkami msp, jedną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin po trawieniu, dezaktywuj MSP jeden w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie wytrącić DNA w etanolu za pomocą jednego mikrolitra pięciu miligramów na mililitr. Glikogen rozpuść powstałe podniebienie DNA w 50 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej. Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów MSP, jeden traktowany DNA z dwoma mikrolitrami 20-mikromolowego oligonukleotydu łącznikowego L i jednym mikrolitrem 20-mikromolowego oligonukleotydu S, a następnie dodaj jeden mikrolitr sterylnej wody destylowanej i sześć mikrolitrów 10 XT z czterema ligazy DNA.

Przykryj mieszaninę płynnym woskiem. Denaturuj oligonukleotydy w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez jedną minutę i pozwól stopniowo ostygnąć do 10 stopni Celsjusza w gradiencie 0,5 stopnia Celsjusza na minutę. Za pomocą termocyklera dodaj jeden mikrolitr 400 jednostek na mikrolitr T cztery ligazy DNA i inkubuj reakcję w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia oczyść DNA ligowane łącznikiem za pomocą zestawu do szybkiego oczyszczania kaya PCR i wymyj w 50 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej. Wybierz starter dla określonego regionu DNA, który ma być badany pod kątem interakcji dalekiego zasięgu. W tym przykładzie Abel zostanie użyty jako podkład lub przynęta.

Przygotuj oczyszczone DNA do pierwszej rundy PCR, łącząc jeden mikrolitr oczyszczonego DNA z jednym mikrolitrem 20 mikromolowych zdolnych do jednego specyficznego startera, 46, 56 i jednym mikrolitrem 20 mikromolowego startera specyficznego dla łącznika 29, 63. Następnie dodaj trzy mikrolitry trzech x ClinTech, polimerazy DNA, jeden koktajl, który został wcześniej zmieszany z 32 P-D-C-T-P zgodnie z pisemnym protokołem, a następnie trzy mikrolitry sterylnej wody destylowanej. Wykonaj amplifikację PCR przy użyciu cyklu termicznego hot start PCR opisanego w pisemnym protokole po zakończeniu cyklu PCR.

Oczyść produkty pierwszej rundy PCR za pomocą zestawu do szybkiego oczyszczania kaya PCR Elute w 30 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej. Użyj jednego mikrolitra pierwszego produktu PCR rozcieńczonego 100 razy, aby przeprowadzić drugą rundę PCR przy użyciu zagnieżdżonych starterów, dodając jeden mikrolitr 20 mikromolowych zdolnych do jednego specyficznego startera, 46 26 i jeden mikrolitr 20 mikromolowego startera specyficznego dla łącznika. Rozdział 29 61.

Ponownie dodaj trzy mikrolitry trzech x ClinTech, polimerazy DNA, jeden koktajl i trzy mikrolitry sterylnej wody destylowanej. Wykonaj drugą rundę PCR, stosując harmonogram cykli termicznych składający się z 25 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 sekund. 67 stopni Celsjusza przez 40 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez jedną minutę, a następnie przedłużenie w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Wizualizuj produkty PCR, uruchamiając 5% żel stronicowy mocznikowy, a następnie skanując naświetlony ekran w obrazie fosfonowym. Każdą opaskę PCR można poddać recyklingowi z żelu poprzez rozpuszczenie pasków żelu w probówce einor zawierającej 60 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej i inkubację w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wirówka. Rozpuszczony żel wytwarza się krótko przy 10 000 obr./min przez 10 sekund.

Aby pobrać wszystkie próbki. Usuń jeden mikrolitr, aby użyć go jako matrycy DNA do przeprowadzenia PCR z pierwszą naprawą. 29 61 46 26.

Korzystając z tych samych warunków, jak opisano powyżej, po oczyszczeniu i sekwencjonowaniu można przeprowadzić analizę za pomocą narzędzia online w celu określenia lokalizacji chromosomów. Po wejściu na stronę bioinformatyki genomu kliknij blatt, aby wygenerować nowe okno i wkleić sekwencję DNA. Po przesłaniu sekwencji DNA pojawią się wyniki wyszukiwania BLATT.

Kliknij przeglądarkę na trafienie ze 100%identity, aby ujawnić lokalizację sekwencji DNA. Zdolny jeden region został użyty jako przynęta do określenia jego interakcji DNA dalekiego zasięgu. Dwa BGL dwa miejsca i jedno BAM H jedno miejsce wybrano do testu A CT w drugiej rundzie zestawu starterów PCR, 46 26 29 61 użyto do amplifikacji zdolnego M1 46,30 29 61 użyto dla zdolnego M dwa i 46, 36 29 61 użyto dla zdolnego M trzy.

Typowy wzór żelowy odsłania od jednego do kilku pasm, jak pokazano tutaj dla zdolnego M1, zdolnego M do dwóch i zdolnego M do trzech tutaj. Pokazano, że sekwencja DNA klonu zdolnego do M1 pokazuje, że każdy fragment z testu CT A składa się z dwóch połączonych segmentów DNA. Jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, podczas gdy drugi segment pochodzi od powiązanego partnera.

Segmenty są połączone ze sobą pierwszą sekwencją rozpoznawania enzymu restrykcyjnego. Druga sekwencja rozpoznawania enzymu pojawi się na końcu skojarzonej sekwencji partnerskiej. Sklonowany zdolny fragment M1 zawiera DNA z regionu ABLE one zlokalizowanego na chromosomie dziewiątym Q 32.4, a powiązany partner znajduje się na chromosomie trzecim P trzy, który został zidentyfikowany jako proc drugi.

Podobnie, zdolny partner stowarzyszony M two został zlokalizowany na chromosomie piątym Q 21.1, podczas gdy klon zdolny M trzy został zidentyfikowany jako związek wewnątrzchromosomalny w pobliżu jednego locus ABLE, w przeciwieństwie do trzech testów C. Metodologia przedstawiona w tym filmie wybierze najbardziej rozpowszechnione interakcje dalekiego zasięgu. Jednak zwiększając liczbę cykli R PCR, możliwe jest zidentyfikowanie dodatkowych rzadziej występujących skojarzeń, a także przy użyciu regionu imprinting and control lub ICR w dwóch locus IGF H 19 jako przynęty DNA w mysich komórkach fiberblast, różne programy cykliczne zastosowano w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście A CT.

Test CT A może być również stosowany do identyfikacji różnic w architekturze jądrowej i interakcji dalekiego zasięgu między normalnymi komórkami a komórkami rakowymi. Normalna tkanka jelita grubego i tkanka raka jelita grubego poddano homogenizacji, a test CT A wykonano zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym dokumencie. Pokazano tutaj strukturę DNA regionu ICR w locus IGF dwa H 19 i IGF dwa gen dpn.

Dwa miejsca testu A CT są oznaczone starterami używanymi w drugiej rundzie PCR, są oznaczone strzałkami i cyframi w różnych kolorach. Wzór żelu w teście A CT reprezentuje wyniki PCR przy użyciu startera 29 61 z dowolną parą starterów 41, 61, 41 63, 51 45 i 51 51. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w normalnej tkance okrężnicy, są oznaczone żółtymi strzałkami, a te prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego, są oznaczone czerwonymi strzałkami Po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rynku do badania architektury jądrowej i regulacji genów w sposób trójwymiarowy.