Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odkrycie i identyfikacja partnerów DNA powiązanych na dużych odległościach. Jest to osiągane poprzez fiksację, lizę komórek i trawienie DNA pierwszym enzymem restrykcyjnym, a następnie ligację w celu stworzenia chimerycznego DNA składającego się z fragmentów dwóch powiązanych genów. Następnie do chimerycznego DNA, po drugim trawieniu restrykcyjnym, dodawane są linkery. Aby ułatwić jego amplifikację, przeprowadzana jest amplifikacja PCR z użyciem starterów specyficznych dla linkera i DNA przynęty (bait DNA), w celu uzyskania wystarczającej ilości powiązanych fragmentów DNA. Na podstawie analizy sekwencji amplifikowanych fragmentów DNA uzyskuje się wyniki wskazujące partnerów DNA powiązanych na dużych odległościach z DNA przynęty.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak chromosome confirmation capture lub 3C, jest możliwość wykorzystania A-C-T-S-A do skutecznej identyfikacji nieznanego, oddalenie powiązanego partnera DNA. Metoda 3C powstała natomiast wyłącznie w celu weryfikacji wcześniej podejrzewanych oddziaływań. Aby rozpocząć ten protokół, należy hodować ludzkie komórki w inkubatorze z dodatkiem 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia 80–90% konfluencji.

W tej demonstracji wykorzystano ludzkie komórki białaczki o przedwczesnej różniczce kwasowej. Komórki należy zebrać, przelewając je do probówki NOC o pojemności 50 ml, a następnie wirować przy 1200 RPM przez 15 minut. Po wirowaniu należy usunąć medium poprzez aspirację.

Dodaj 5 ml pożywki hodowlanej, aby resuspender osady komórkowe. Po policzeniu komórek za pomocą hemocytometru, przenieś około 1×10⁷ komórek do objętości 40 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Następnie dodaj 1,7 ml 37% formaldehydu, aby utrwalić rozcieńczoną chromatynę.

Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji zatrzymać reakcję, dodając 2,4 milliliters dwumolowej glicyny. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut przy 1200 RPM i czterech stopniach celsius.

Po usunięciu nadsączu przemyć osad raz 40 ml lodowatego PBS, a następnie odwirować próbkę, aby odzyskać przemyty osad komórkowy. Powstały osad zawiesić w 40 ml lodowatego buforu do lizy z dodanymi świeżo inhibitorami proteaz i 0,1 mM PMSF. Inkubować próbkę w pomieszczeniu chłodniczym przy jednoczesnym obracaniu przez 90 minut. Na koniec odwirować próbkę z prędkością 2 500 RPM przez 15 minut, usunąć nadsącz i wyizolować jądra komórkowe. Zawiesić jądra w 0,5 ml 1x buforu NEB 3 i dodać 15 µL 10% SDS.

Inkubować próbkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Następnie dodać 45 µL 20% Triton X 100 w celu sekwestracji SDS i ponownie inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy wytrząsaniu, a następnie podzielić na aliquoty o stężeniu 1 × 10⁶. Jądra komórkowe w ilości około 15 µg są wykorzystywane do trawienia enzymami restrykcyjnymi w 55 µL roztworu jąder.

Dodaj 433 µL buforu 1X NEB Buffer 3 oraz 12 µL BglII. Aby uzyskać całkowitą objętość reakcji trawienia wynoszącą 500 µL, inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia dezaktywuj enzym restrykcyjny, dodając 95 µL 10% SDS, a następnie zdenaturuj enzym, podgrzewając go w temperaturze 65 °C przez 20 minut.

W łaźni wodnej dodaj 7 mL 1x buforu do ligacji oraz 360 µL 20% Triton X 100. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Obniż temperaturę do 16 °C i dodaj 50 µL roztworu o stężeniu 400 jednostek na µL.

Dodaj T4 DNA ligazę. Inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez cztery godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu ligacji dodaj 300 µg proteinazy K i inkubuj w temperaturze 65°C przez noc.

Następnie dodać 5 µg RNAA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. DNA oczyścić metodą ekstrakcji fenolo-chloroformowej, a następnie wytrącić DNA w izopropanolu i rozpuścić wytrącone DNA w 150 µl sterylnej wody destylowanej. Aby dołączyć linkery do chimerycznego DNA, należy najpierw poddać DNA trawieniu, inkubując 2 µg oczyszczonego DNA z 5 jednostkami msp1 w temperaturze 37 °C przez 4–6 godzin; po trawieniu dezaktywować MSP1 w temperaturze 65 °C przez 10 minut.

Następnie wytrącić DNA w etanolu z dodatkiem 1 µL glikogenu o stężeniu 5 mg/mL. Powstały osad DNA rozpuścić w 50 µL sterylnej wody destylowanej. Następnie wymieszać 50 µL DNA poddanego działaniu MSP1 z 2 µL 20 µM oligonukleotydu łącznika L oraz 1 µL 20 µM oligonukleotydu S, a następnie dodać 1 µL sterylnej wody destylowanej i 6 µL 10X buforu T4 DNA Ligase.

Przykryj mieszaninę płynnym woskiem. Zdenaturuj oligonukleotydy w temperaturze 50 °C przez jedną minutę, a następnie pozwól im stopniowo ostygnąć do 10 °C w gradiencie 0,5 °C na minutę. Za pomocą termocyklera dodaj 1 µL ligazy DNA T4 o stężeniu 400 units/µL i inkubuj reakcję w temperaturze 15 °C przez noc.

Następnego dnia należy oczyścić DNA z ligowanymi linkerami, korzystając z zestawu do szybkiego oczyszczania PCR kaya, a następnie eluować w 50 µL sterylnej wody destylowanej. Następnie należy wybrać primer dla specyficznego regionu DNA, który będzie badany pod kątem oddziaływań dalekiego zasięgu. W tym przykładzie jako primer lub przynęta zostanie wykorzystany Abel.

Przygotuj oczyszczone DNA do pierwszej rundy PCR, łącząc 1 µL oczyszczonego DNA z 1 µL 20 µM specyficznego startera able one 46 56 oraz 1 µL 20 µM specyficznego startera linkera 29 63. Następnie dodaj 3 µL 3x ClinTech, koktajlu polimerazy DNA I, który został wcześniej zmieszany z 32 P-D-C-T-P zgodnie z protokołem pisemnym, a następnie 3 µL sterylnej wody destylowanej. Przeprowadź amplifikację PCR, stosując cykl termiczny hot start PCR opisany w protokole pisemnym po zakończeniu cyklu PCR.

Produkty pierwszej rundy PCR należy oczyścić za pomocą zestawu kaya quick PCR purification kit i eluować w 30 µl sterylnej wody destylowanej. W celu przeprowadzenia drugiej rundy PCR z użyciem starterów zagnieżdżonych należy użyć 1 µl produktu pierwszej reakcji PCR rozcieńczonego 100-krotnie, dodając 1 µl 20 µM specyficznego startera able one, 46 26, oraz 1 µl 20 µM specyficznego startera linker. 29 61.

Następnie dodaj 3 µL 3x ClinTech, DNA polymerase, one cocktail oraz 3 µL sterylnej wody destylowanej. Przeprowadź drugą rundę PCR zgodnie z programem cyklery: 25 cykli obejmujących 95 °C przez 20 sekund, 67 °C przez 40 sekund oraz 72 °C przez jedną minutę, a następnie końcową elongację w temperaturze 72 °C przez pięć minut.

Wizualizuj produkty PCR, przeprowadzając elektroforezę na żelu PAGE z 5% urea, a następnie skanując naświetlony ekran w obrazowniku fosforyzującym. Każdy prążek PCR można odzyskać z żelu, rozpuszczając paski żelu w probówce typu Eppendorf zawierającej 60 µL sterylnej wody destylowanej i inkubując w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Odwiruj rozpuszczone produkty żelowe krótko przy 10 000 RPM przez 10 sekund.

Należy zebrać wszystkie próbki. Odpipować 1 µL do wykorzystania jako matrycę DNA do przeprowadzenia reakcji PCR z wykorzystaniem prime repair. 29 61 46 26.

Stosując te same warunki, które opisano powyżej, po oczyszczeniu można przeprowadzić analizę sekwencjonowania za pomocą narzędzia online w celu określenia lokalizacji chromosomowej. Po wejściu na stronę bioinformatyki genomu należy kliknąć blatt, aby otworzyć nowe okno, a następnie wkleić sekwencję DNA. Po przesłaniu sekwencji DNA pojawią się wyniki wyszukiwania BLATT.

Kliknij przeglądarkę na trafieniu o 100% identyczności, aby wyświetlić lokalizację sekwencji DNA. Region able one został użyty jako przynęta do określenia jego dalekosiężnych oddziaływań DNA. Do analizy 3C wybrano dwa miejsca BglII oraz jedno miejsce BamHI. W drugiej rundzie PCR zestaw starterów 46 26 29 61 został użyty do amplifikacji able M1, 46 30 29 61 do able M2, a 46 36 29 61 do able M3.

Typowy obraz żelu ujawnia od jednego do kilku prążków, co pokazano tutaj dla klonów able M1, able M dwa oraz able M trzy. Sekwencja DNA klonu able M1 została przedstawiona, aby wykazać, że każdy fragment z testu A CT składa się z dwóch połączonych segmentów DNA. Jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, natomiast drugi segment pochodzi od powiązanego partnera.

Segmenty są łączone ze sobą za pomocą pierwszej sekwencji rozpoznawania enzymu restrykcyjnego. Druga sekwencja rozpoznawania enzymu znajduje się na końcu powiązanej sekwencji partnera. Klonowalny fragment M1 zawiera DNA z regionu ABLE one zlokalizowanego w chromosomie 9 q32.4, a powiązany partner znajduje się w chromosomie 3 p3 i został zidentyfikowany jako proc two.

Podobnie, partner powiązany z able M dwa został zlokalizowany w chromosomie pięć Q 21.1, podczas gdy klon able M trzy zidentyfikowano jako powiązanie wewnątrzchromosomalne w pobliżu locus ABLE jeden, w przeciwieństwie do testów three C. Metodologia przedstawiona w tym filmie pozwoli na wyselekcjonowanie najpowszechniejszych oddziaływań dalekozasięgowych. Jednakże, poprzez zwiększenie liczby cykli PCR R, możliwe jest zidentyfikowanie również dodatkowych, rzadszych powiązań. Stosując region imprintingu i kontroli lub ICR w locus IGF dwa H 19 jako DNA przynęty w komórkach fibroblastów mysich, w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście A CT zastosowano różne programy cykli.

Test A CT może być również wykorzystany do identyfikacji różnic w architekturze jądra komórkowego oraz oddziaływań dalekiego zasięgu pomiędzy komórkami prawidłowymi a komórkami nowotworowymi. Homogenizowano prawidłową tkankę okrężnicy oraz tkankę raka okrężnicy, a następnie przeprowadzono test A CT zgodnie z opisanymi tutaj procedurami. Przedstawiono tutaj strukturę DNA regionu ICR w locus IGF two H 19 oraz gen IGF two dpn.

Dwa miejsca dla testu A CT; startery znakowane użyte w drugiej rundzie PCR są oznaczone strzałkami i numerami w różnych kolorach. Wzór żelu dla testu A CT przedstawia wyniki PCR z zastosowaniem startera 29 61 wraz z parą starterów 41, 61, 41 63, 51 45 lub 51 51. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w prawidłowej tkance jelita grubego, są oznaczone żółtymi strzałkami, a prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego po jego opracowaniu, są oznaczone czerwonymi strzałkami.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii molekularnej do eksploracji architektury jądra komórkowego oraz regulacji genów w sposób trójwymiarowy.