Name: Powiązana pułapka chromosomowa do identyfikacji interakcji DNA dalekiego zasięgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj metodę ACT do identyfikacji dalekich interakcji DNA w komórkach białaczki promielocytowej człowieka. Ta technika pozwala odkrywać nieznane wcześniej powiązania genomowe i lepiej zrozumieć regulację ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo dziękujemy Adelle Murell oraz Wolfowi Reikowi za udostępnienie ich protokołu 3C. Praca ta była wspierana przez Departament Obrony oraz Służbę Badawczą Departamentu Spraw Weteranów.

1. Fixacja formaldehydem oddziaływań chromatyny dalekiego zasięgu
<ol>
	<li>Hodować ludzką linię komórkową HL-60 w pożywce RPMI1640 z 15% FBS i 1 x penicyliną/streptomycyną do osiągnięcia 80-90% konfluencji w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Zebrać komórki do probówki Nunc 50 ml, odwirować przy 1,200 rpm przez 15 minut, a następnie usunąć pożywkę za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki hodowlanej, aby resuspender osad komórkowy, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odmierzyć około 1 x 107 komórek do objętości 40 ml w RPMI1640 /10% FBS, a następnie dodać 1,7 ml 37% formaldehydu w celu utrwalenia rozcieńczonej chromatyny.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy delikatnym wstrząsaniu, a następnie zneutralizować reakcję za pomocą 2,4 ml 2M glicyny. Wirować przez 15 minut przy 1,200 rpm w temperaturze 4°C i usunąć nadsącz. Przemyć osad raz 40 ml lodowatego PBS, a następnie odwirować osad i usunąć PBS.</li>
</ol>
2. Lizy komórek w celu izolacji jąder
<ol>
	<li>Resuspendować komórki w 40 ml lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) z dodanymi świeżo inhibitorami proteaz (rozcieńczenie 1:500) i 0.1 mM PMSF. Inkubować w pomieszczeniu chłodniczym w rotacji przez 90 minut, odwirować przy 2,500 rpm przez 15 minut i usunąć nadsącz.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymem restrykcyjnym Bgl II
<ol>
	<li>Resuspenduj jądra w 0,5 ml 1 x buforu NEB 3 i dodaj 15 μl 10% SDS. Inkubuj w 37°C przez 1 godzinę przy wytrząsaniu, a następnie dodaj 45 μl 20% Triton X-100 w celu sekwestracji SDS. Inkubuj w 37°C przez 1 godzinę przy wytrząsaniu.</li>
	<li>Do trawienia enzymem restrykcyjnym wykorzystaj alikwot 1 x 106 jąder (około 15 μg, jedną dziesiątą pierwotnej liczby komórek). Pobierz 55 μl roztworu jąder z kroku 3.1 i uzupełnij objętość do 500 μl, dodając 433 μl 1 x buforu NEB 3 oraz 12 μl Bgl II (50U/ul). Inkubuj w 37°C przez noc.</li>
</ol>
4. Ligacja oddziałujących fragmentów DNA
<ol>
	<li>Dezaktywuj enzym restrykcyjny, dodając 95 μl 10% SDS, a następnie zdenaturuj go poprzez ogrzewanie w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Dodaj 7 ml 1 x buforu do ligacji (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) oraz 360 μl 20% Triton X-100 i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Obniż temperaturę do 16°C i dodaj 50 μl ligazy T4 DNA o stężeniu 400 U/μl. Inkubuj próbkę w temperaturze 16 °C przez 4 godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Dodać 300 μg proteinazy K i inkubować w temperaturze 65°C przez noc.</li>
	<li>Dodać 5 μg RNazy A i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut.</li>
	<li>Oczyścić DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform i wyprecypitować DNA w izopropanolu. Rozpuścić DNA w 150 μl sterylnej wody destylowanej.</li>
</ol>
6. Trawienie enzymem Msp I i ligacja z linkerami oligonukleotydowymi
<ol>
	<li>Inkubować 2 μg oczyszczonego DNA z 5 jednostkami Msp I w temperaturze 37°C przez 4-6 godzin. Inaktywować Msp I w 65°C przez 10 minut, a następnie wytrącić DNA w etanolu z dodatkiem 1 μl glikogenu o stężeniu 5 mg/ml. Rozpuścić osad DNA w 50 μl sterylnej wody destylowanej.</li>
	<li>Wymieszać 50 μl DNA traktowanego enzymem Msp I z 2 μl oligonukleotydu linkerowego L o stężeniu 20 μM (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3'), 1 μl oligonukleotydu S o stężeniu 20 μM (5'-cggtgaatc-3'), 1 μl sterylnej wody destylowanej oraz 6 μl 10 x buforu do ligazy DNA T4. Przykryć mieszaninę woskiem ciekłym.</li>
	<li>Denaturować oligonukleotydy w 50°C przez 1 minutę, a następnie stopniowo schładzać do 10°C z gradientem 0,5°C/minutę w termocyklerze.</li>
	<li>Dodać 1 μl ligazy DNA T4 o aktywności 400 U/μl i inkubować w 15°C przez noc. Oczyścić DNA z przyłączonym linkerem za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit i eluować w 50 μl sterylnej wody destylowanej.</li>
</ol>
7. Amplifikacja PCR i analiza sekwencji
<ol>
	<li>Wybierz starter dla konkretnego regionu DNA, który chcesz zbadać pod kątem oddziaływań dalekiego zasięgu (tzw. „przynętę”). W tym przykładzie wykorzystujemy ABL-1.</li>
	<li>Pobierz 1 μl oczyszczonego DNA w celu przeprowadzenia pierwszej rundy PCR, stosując 1 μl 20 μM startera specyficznego dla ABL-1 #4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3'), 1 μl 20 μM startera specyficznego dla linkera #2963 (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3'), 3 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq oraz 3 μl sterylnej wody destylowanej. Przed amplifikacją PCR do 100 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq dodaje się 2 μl 32P-dCTP. Cykl termiczny dla PCR z gorącym startem (hot start PCR) obejmuje 72°C przez 2 min, 95° C przez 2 minuty; 18 cykli: 95°C przez 20 sekund, 65°C przez 40 sekund i 72°C przez 1 minutę; końcowa elongacja jest przeprowadzana w 72°C przez 5 minut.</li>
	<li>Oczyść produkty pierwszej rundy PCR za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit i eluuj DNA do 30 μl sterylnej wody destylowanej.</li>
	<li>Pobierz 1 μl 100-krotnie rozcieńczonego produktu pierwszej reakcji PCR, aby przeprowadzić drugą rundę PCR z użyciem starterów wewnętrznych (nested primers), dodając 1 μl 20 μM startera specyficznego dla ABL-1 #4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3') (Rycyna 1a), 1 μl 20 μM startera specyficznego dla linkera #2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3'), 3 μl 3 x koktajlu polimerazy DNA I Klen Taq oraz 3 μl sterylnej wody destylowanej. Program cykliczny obejmuje 25 cykli: 95°C przez 20 sekund, 67°C przez 40 sekund i 72°C przez 1 minutę, a następnie elongację w 72°C przez 5 minut.</li>
	<li>Wizualizuj produkty PCR, przeprowadzając elektroforezę na żelu 5% urea-PAGE i skanując naświetlony ekran w urządzeniu PhosphoImager (Rycina 1b). Każdą prążkę PCR można odzyskać z żelu, rozpuszczając paski żelu w probówce Eppendorfa zawierającej 60 μl sterylnej wody destylowanej i inkubując w 95°C przez 5 minut. Wirować krótko przy 10 000 obr./min przez 10 s, aby zebrać wszystkie próbki. Pobierz 1 μl do wykorzystania jako matrycę DNA w celu przeprowadzenia PCR z parą starterów 2961/4626 w tych samych warunkach, które opisano powyżej. Analizę sekwencji można przeprowadzić po oczyszczeniu za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification kit.</li>
	<li>Sekwencje DNA analizuje się za pomocą narzędzia online w celu określenia ich lokalizacji chromosomalnej na stronie internetowej: http://genome.ucsc.edu (Rycina 1c). Kliknij „BLAT”, aby przejść do nowego okna, które umożliwia wklejenie sekwencji DNA; po kliknięciu „submit” pojawi się nowe okno prezentujące wyniki wyszukiwania „BLAT Search Results”. Kliknij „browser” przy wyniku o 100% tożsamości, aby przejść do kolejnego okna pokazującego lokalizację sekwencji DNA.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
1. Analiza ACT z wykorzystaniem regionu ABL-1 jako przynęty w celu określenia jego dalekosiężnych oddziaływań DNA
Jak pokazano na rysunku 1a, do testu ACT wybrano dwa miejsca rozpoznawane przez Bgl II oraz jedno miejsce rozpoznawane przez BamH I. W drugiej rundzie PCR do amplifikacji ABL-M1 wykorzystano zestaw starterów 4626/2961, do ABL-M2 zestaw 4630/2961, a do ABL-M3 zestaw 4636/2961. Typowy obraz żelu wykazuje od jednego do kilku prążków (rysunek 1b). Każdy fragment z testu ACT składa się z dwóch połączonych segmentów DNA: jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, natomiast drugi pochodzi od powiązanego partnera, który został połączony z segmentem regionu przynęty za pomocą pierwszej sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny. Druga sekwencja rozpoznawana przez enzym pojawi się na końcu sekwencji powiązanego partnera (rysunek 1c). Sklonowany fragment ABL-M1 zawiera DNA z regionu ABL1 zlokalizowanego w chromosomie 9q32.4 od +133 592 306 do 133 592 399, a powiązany partner znajduje się w chromosomie 3p13 od +71 869 882 do 71 870 107. Tożsamość powiązanych partnerów ustalono poprzez analizę blast ich sekwencji przy użyciu przeglądarki genomu UCSC (GRCh7/hg19 wydanej w lutym 2009 r.). PROK2 został zidentyfikowany jako powiązany partner w locus chr3p13.
Podobnie, partner powiązany z ABL-M2 zlokalizowano w obrębie chr5q21.1, natomiast klon ABL-M3 zidentyfikowano jako powiązanie wewnątrzchromosomalne w pobliżu locus ABL-1.
2. Określanie rzadszych oddziaływań dalekiego zasięgu za pomocą testu ACT
Inne analizy oparte na metodzie 3C wykazały znacznie więcej partnerów oddziałujących niż te, które przedstawiliśmy na Rysunku 1 oraz w locus Igf2/H1912. Opisana przez nas metodologia pozwoli na wyselekcjonowanie najpowszechniejszych oddziaływań dalekiego zasięgu. Jednakże, poprzez zwiększenie liczby cykli PCR, możliwe jest zidentyfikowanie również dodatkowych, rzadszych powiązań (Rysunek 2).
3. Różnice w oddziaływaniach dalekiego zasięgu w komórkach nowotworowych w porównaniu z tkankami prawidłowymi.
Analizę ACT można również wykorzystać do identyfikacji różnic w architekturze jądrowej i oddziaływaniach dalekiego zasięgu między komórkami prawidłowymi a komórkami nowotworowymi (Rysunek 3). Różnice te mogą odzwierciedlać zmiany w architekturze jądra zachodzące podczas transformacji komórkowej, w związku z czym analiza ta może w przyszłości znaleźć zastosowanie w celach diagnostycznych. Podobne wzory prążków w żelu, występujące zarówno w tkankach prawidłowych, jak i nowotworowych, wskazują na to, że analiza ACT jest wiarygodna i powtarzalna. Chociaż analiza ACT pozwala na identyfikację dalekosiężnych partnerów DNA, do weryfikacji obecności zidentyfikowanych powiązań między odległymi loci wymagane są dalsze analizy, takie jak testy FISH i ChIP. Następnie można przeprowadzić badania genetyczne, fizjologiczne i biochemiczne, aby wyjaśnić biologiczne znaczenie tych dalekosiężnych asocjacji DNA.
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Schemat struktury genu, wynik elektroforezy i analiza sekwencji dla badania genu ABL." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1 Analiza ACT z użyciem regionu ABL-1 jako DNA przynęty w komórkach HL-60. a. Struktura DNA w regionie ABL-1. Pierwszym enzymem restrykcyjnym użytym w analizie ACT był Bgl II. Startery do drugiej rundy PCR są również oznaczone strzałkami i odpowiadającymi im numerami starterów. b. Obraz żelu z analizy ACT w 5% urea-PAGE. Para starterów 4626/2961 została użyta do amplifikacji klonu ABL-M1 w zagnieżdżonej reakcji PCR, 4630/2961 została użyta dla klonu ABL-M2, a 4636/2961 dla klonu ABL-M3. c. Sekwencja DNA klonu ABL-M1. Fragment DNA z DNA przynęty ABL-1 jest zaznaczony na czerwono, a powiązany partner DNA jest zaznaczony na cyjanowo. Miejsce rozpoznawane przez Bgl II (AGACTC) zaznaczono na zielono, a miejsce Msp I (CCGG) na fioletowo.
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Analiza cykli PCR; wyniki elektroforezy; porównanie amplifikacji DNA; marker prążków żelowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 Cykle PCR wpływają na wyniki testu ACT. Wykorzystując region kontrolny imprintingowy (ICR) w locus Igf2/H19 jako DNA przynęty w fibroblastach mysich, w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście ACT zastosowano różne programy cykli. 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR nie doprowadziło do amplifikacji sygnału w stopniu umożliwiającym wizualizację. Dwadzieścia pięć cykli w drugim PCR zaowocowało wyraźnymi prążkami, natomiast zwiększenie liczby cykli w drugiej rundzie PCR spowodowało powstanie smug oprócz większej liczby prążków.
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Mapowanie miejsc wiązania CTCF z trawieniem DpnII; elektroforeza DNA tkanki prawidłowej i nowotworowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Wykrywanie różnic w architekturze jądra między prawidłową tkanką jelita grubego a tkanką raka jelita grubego w teście ACT. a. Struktura DNA regionu ICR w locus IGF2/H19 oraz gen IGF2. Oznaczono miejsca Dpn II dla testu ACT. Primery użyte w drugiej rundzie PCR są oznaczone strzałkami i numerami w różnych kolorach, które odpowiadają poszczególnym ścieżkom w panelu b rysunku. b. Wzorzec prążków w teście ACT w 5% urea-PAGE. Prawidłową tkankę jelita grubego MAD03-1423 i tkankę raka jelita grubego MAD04-149 otrzymano z Cooperative Human Tissue Network (CHTN) Western Division. Po homogenizacji każdej z tkanek jelita grubego przeprowadzono test ACT zgodnie z opisanymi tutaj procedurami. Ścieżka 1 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3') zaznaczonej na różowo w panelu a; ścieżka 2 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3') zaznaczonej na pomarańczowo w panelu a; ścieżka 3 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') zaznaczonej na niebiesko w panelu a; ścieżka 4 przedstawia wyniki PCR z użyciem pary primerów #2961 i #5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3') zaznaczonej na zielono w panelu a. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w prawidłowej tkance jelita grubego, są oznaczone żółtymi strzałkami, a prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego, są oznaczone czerwonymi strzałkami. ICR, region kontroli imprintingu; DMR, region różnicowo zmetylowany.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Dekker et al. opracowali metodę przechwytywania konformacji chromosomów (3C) w celu wykrywania częstotliwości oddziaływań między dwoma loci genomicznymi1, a metoda 3C była szeroko stosowana do badania powiązań wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomalnych między dwoma znanymi regionami DNA w komórkach ssaków2-9. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania powiązań DNA w całym genomie, test ACT pozostaje skuteczną techniką badania oddziaływań DNA specyficznych dla konkretnego locus10-11. zmodyfikowaliśmy to podejście, aby zidentyfikować nieznane regiony DNA powiązane ze znanym regionem DNA w hodowlach komórek mysich i ludzkich (Rycina 1). Nazwaliśmy tę metodę testem pułapki chromosomów powiązanych (ACT), ponieważ dostarczyła nam ona niezawodnego i powtarzalnego sposobu identyfikacji nowych, nieznanych partnerów DNA, które łączą się ze znanym docelowym regionem DNA12. Przed zastosowaniem nowatorskich aspektów testu ACT wykonuje się pomyślny test 3C z odpowiednimi kontrolami13. Aby znaleźć jak najwięcej powiązanych regionów DNA, konieczne jest zastosowanie różnych kombinacji pierwszej i drugiej nukleazy restrykcyjnej. Szczególnie ważne jest użycie enzymów restrykcyjnych niewrażliwych na metylację CpG do przeprowadzenia pierwszego etapu ligacji 3C. Wiązanie białek i metylacja DNA mogą również wpływać na wydajność trawienia enzymami restrykcyjnymi i mogą prowadzić do niepowodzenia ligacji powiązanych regionów DNA przy niektórych trawieniach enzymatycznych. Wystąpienie ligacji wewnątrz- lub międzychromosomalnej zależy od sieciowania białko-DNA i odpowiednich map fizycznych obu powiązanych regionów DNA. Zatem niezbędne są niektóre wstępne eksperymenty w celu ustalenia praktycznego, skutecznego stężenia formaldehydu i czasu traktowania w teście ACT. Zakres końcowych stężeń formaldehydu (od 1,5% do 2%) był stosowany w kilku laboratoriach podczas części 3C testu7,9. Alternatywnie, oligonukleotydy używane jako linkery mogą zostać zaprojektowane tak, aby pasowały do lepkiego końca odciętego przez drugą nukleazę restrykcyjną. Chociaż stwierdziliśmy, że 18-20 cykli w pierwszej rundzie PCR i 20-25 cykli w drugiej rundzie PCR mogą zapewnić wyraźne prążki, konieczne jest ustalenie optymalnych warunków PCR dla każdego eksperymentu (Rycina 2). W reakcji PCR może dojść do hybrydyzacji wewnątrzcząsteczkowej między komplementarnymi sekwencjami adapterów na końcu 5' i 3' nici DNA, co hamuje hybrydyzację starterów specyficznych dla adaptera z cząsteczką DNA i skutkuje znacznie niższą wydajnością amplifikacji w pierwszych kilku cyklach. Po amplifikacji docelowego DNA przez określoną liczbę cykli, jego ilość może być znacznie większa niż w przypadku tych niespecyficznych reakcji, co może ułatwić konkurencję o hybrydyzację starterów z docelowymi cząsteczkami DNA. Jest to również powód, dla którego możemy obserwować amplifikację tła oraz powód, dla którego produkt pierwszej rundy PCR musi zostać rozcieńczony w celu zmniejszenia amplifikacji tła. Ważne jest usunięcie nadmiaru starterów z reakcji PCR, aby zmniejszyć tło w drugiej rundzie PCR. Jak we wszystkich eksperymentach opartych na PCR, kluczowe jest zaprojektowanie starterów, które nie znajdują się w regionach sekwencji powtórzonych, które stanowią większość DNA człowieka i myszy. Chociaż nowo opracowana metodologia Hi-C może być stosowana do badania powiązań DNA w całym genomie, test ACT pozostaje skuteczną techniką badania oddziaływań DNA specyficznych dla konkretnego locus.

<table><tbody><tr><td>pożywka RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>akrylamid</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>roztwór ATP, 10mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>proteinaza K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>ligaza T4 DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor proteinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler PTC-100</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań dna

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Informacje genetyczne zakodowane w DNA są zorganizowane w złożoną i ściśle regulowaną strukturę chromatyny. Każdy chromosom zajmuje określony obszar, który może ulegać zmianom w zależności od stadium rozwoju lub cyklu komórkowego. Ekspresja genów może zachodzić w wyspecjalizowanych fabrykach transkrypcyjnych, w których segmenty chromatyny mogą tworzyć pętle wychodzące z różnych terytoriów chromosomowych, co prowadzi do ko-lokalizacji fragmentów DNA, które mogą znajdować się na różnych chromosomach lub w dużej odległości na tym samym chromosomie. Metoda Associated Chromosome Trap (ACT) zapewnia skuteczną metodologię identyfikacji tych dalekosiężnych powiązań DNA w sposób nieobciążony, poprzez rozszerzenie i modyfikację techniki uchwytywania konformacji chromosomów. Analiza ACT umożliwia badanie mechanizmów regulacji transkrypcyjnej w trans i może pomóc w wyjaśnieniu związku między architekturą jądra a ekspresją genów w fizjologii prawidłowej oraz w stanach chorobowych.

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Informacje genetyczne zakodowane w DNA są zorganizowane w złożoną i ściśle regulowaną strukturę chromatyny. Każdy chromosom zajmuje określone terytorium, ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odkrycie i identyfikacja partnerów DNA powiązanych na dużych odległościach. Jest to osiągane poprzez fiksację, lizę komórek i trawienie DNA pierwszym enzymem restrykcyjnym, a następnie ligację w celu stworzenia chimerycznego DNA składającego się z fragmentów dwóch powiązanych genów. Następnie do chimerycznego DNA, po drugim trawieniu restrykcyjnym, dodawane są linkery. Aby ułatwić jego amplifikację, przeprowadzana jest amplifikacja PCR z użyciem starterów specyficznych dla linkera i DNA przynęty (bait DNA), w celu uzyskania wystarczającej ilości powiązanych fragmentów DNA. Na podstawie analizy sekwencji amplifikowanych fragmentów DNA uzyskuje się wyniki wskazujące partnerów DNA powiązanych na dużych odległościach z DNA przynęty.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak chromosome confirmation capture lub 3C, jest możliwość wykorzystania A-C-T-S-A do skutecznej identyfikacji nieznanego, oddalenie powiązanego partnera DNA. Metoda 3C powstała natomiast wyłącznie w celu weryfikacji wcześniej podejrzewanych oddziaływań. Aby rozpocząć ten protokół, należy hodować ludzkie komórki w inkubatorze z dodatkiem 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia 80–90% konfluencji.W tej demonstracji wykorzystano ludzkie komórki białaczki o przedwczesnej różniczce kwasowej. Komórki należy zebrać, przelewając je do probówki NOC o pojemności 50 ml, a następnie wirować przy 1200 RPM przez 15 minut. Po wirowaniu należy usunąć medium poprzez aspirację.Dodaj 5 ml pożywki hodowlanej, aby resuspender osady komórkowe. Po policzeniu komórek za pomocą hemocytometru, przenieś około 1×10⁷ komórek do objętości 40 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Następnie dodaj 1,7 ml 37% formaldehydu, aby utrwalić rozcieńczoną chromatynę.Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji zatrzymać reakcję, dodając 2,4 milliliters dwumolowej glicyny. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut przy 1200 RPM i czterech stopniach celsius.Po usunięciu nadsączu przemyć osad raz 40 ml lodowatego PBS, a następnie odwirować próbkę, aby odzyskać przemyty osad komórkowy. Powstały osad zawiesić w 40 ml lodowatego buforu do lizy z dodanymi świeżo inhibitorami proteaz i 0,1 mM PMSF. Inkubować próbkę w pomieszczeniu chłodniczym przy jednoczesnym obracaniu przez 90 minut. Na koniec odwirować próbkę z prędkością 2 500 RPM przez 15 minut, usunąć nadsącz i wyizolować jądra komórkowe. Zawiesić jądra w 0,5 ml 1x buforu NEB 3 i dodać 15 µL 10% SDS.Inkubować próbkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Następnie dodać 45 µL 20% Triton X 100 w celu sekwestracji SDS i ponownie inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy wytrząsaniu, a następnie podzielić na aliquoty o stężeniu 1 × 10⁶. Jądra komórkowe w ilości około 15 µg są wykorzystywane do trawienia enzymami restrykcyjnymi w 55 µL roztworu jąder.Dodaj 433 µL buforu 1X NEB Buffer 3 oraz 12 µL BglII. Aby uzyskać całkowitą objętość reakcji trawienia wynoszącą 500 µL, inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia dezaktywuj enzym restrykcyjny, dodając 95 µL 10% SDS, a następnie zdenaturuj enzym, podgrzewając go w temperaturze 65 °C przez 20 minut.W łaźni wodnej dodaj 7 mL 1x buforu do ligacji oraz 360 µL 20% Triton X 100. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Obniż temperaturę do 16 °C i dodaj 50 µL roztworu o stężeniu 400 jednostek na µL.Dodaj T4 DNA ligazę. Inkubuj reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez cztery godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakończeniu ligacji dodaj 300 µg proteinazy K i inkubuj w temperaturze 65°C przez noc.Następnie dodać 5 µg RNAA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. DNA oczyścić metodą ekstrakcji fenolo-chloroformowej, a następnie wytrącić DNA w izopropanolu i rozpuścić wytrącone DNA w 150 µl sterylnej wody destylowanej. Aby dołączyć linkery do chimerycznego DNA, należy najpierw poddać DNA trawieniu, inkubując 2 µg oczyszczonego DNA z 5 jednostkami msp1 w temperaturze 37 °C przez 4–6 godzin; po trawieniu dezaktywować MSP1 w temperaturze 65 °C przez 10 minut.Następnie wytrącić DNA w etanolu z dodatkiem 1 µL glikogenu o stężeniu 5 mg/mL. Powstały osad DNA rozpuścić w 50 µL sterylnej wody destylowanej. Następnie wymieszać 50 µL DNA poddanego działaniu MSP1 z 2 µL 20 µM oligonukleotydu łącznika L oraz 1 µL 20 µM oligonukleotydu S, a następnie dodać 1 µL sterylnej wody destylowanej i 6 µL 10X buforu T4 DNA Ligase.Przykryj mieszaninę płynnym woskiem. Zdenaturuj oligonukleotydy w temperaturze 50 °C przez jedną minutę, a następnie pozwól im stopniowo ostygnąć do 10 °C w gradiencie 0,5 °C na minutę. Za pomocą termocyklera dodaj 1 µL ligazy DNA T4 o stężeniu 400 units/µL i inkubuj reakcję w temperaturze 15 °C przez noc.Następnego dnia należy oczyścić DNA z ligowanymi linkerami, korzystając z zestawu do szybkiego oczyszczania PCR kaya, a następnie eluować w 50 µL sterylnej wody destylowanej. Następnie należy wybrać primer dla specyficznego regionu DNA, który będzie badany pod kątem oddziaływań dalekiego zasięgu. W tym przykładzie jako primer lub przynęta zostanie wykorzystany Abel.Przygotuj oczyszczone DNA do pierwszej rundy PCR, łącząc 1 µL oczyszczonego DNA z 1 µL 20 µM specyficznego startera able one 46 56 oraz 1 µL 20 µM specyficznego startera linkera 29 63. Następnie dodaj 3 µL 3x ClinTech, koktajlu polimerazy DNA I, który został wcześniej zmieszany z 32 P-D-C-T-P zgodnie z protokołem pisemnym, a następnie 3 µL sterylnej wody destylowanej. Przeprowadź amplifikację PCR, stosując cykl termiczny hot start PCR opisany w protokole pisemnym po zakończeniu cyklu PCR.Produkty pierwszej rundy PCR należy oczyścić za pomocą zestawu kaya quick PCR purification kit i eluować w 30 µl sterylnej wody destylowanej. W celu przeprowadzenia drugiej rundy PCR z użyciem starterów zagnieżdżonych należy użyć 1 µl produktu pierwszej reakcji PCR rozcieńczonego 100-krotnie, dodając 1 µl 20 µM specyficznego startera able one, 46 26, oraz 1 µl 20 µM specyficznego startera linker. 29 61.Następnie dodaj 3 µL 3x ClinTech, DNA polymerase, one cocktail oraz 3 µL sterylnej wody destylowanej. Przeprowadź drugą rundę PCR zgodnie z programem cyklery: 25 cykli obejmujących 95 °C przez 20 sekund, 67 °C przez 40 sekund oraz 72 °C przez jedną minutę, a następnie końcową elongację w temperaturze 72 °C przez pięć minut.Wizualizuj produkty PCR, przeprowadzając elektroforezę na żelu PAGE z 5% urea, a następnie skanując naświetlony ekran w obrazowniku fosforyzującym. Każdy prążek PCR można odzyskać z żelu, rozpuszczając paski żelu w probówce typu Eppendorf zawierającej 60 µL sterylnej wody destylowanej i inkubując w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Odwiruj rozpuszczone produkty żelowe krótko przy 10 000 RPM przez 10 sekund.Należy zebrać wszystkie próbki. Odpipować 1 µL do wykorzystania jako matrycę DNA do przeprowadzenia reakcji PCR z wykorzystaniem prime repair. 29 61 46 26.Stosując te same warunki, które opisano powyżej, po oczyszczeniu można przeprowadzić analizę sekwencjonowania za pomocą narzędzia online w celu określenia lokalizacji chromosomowej. Po wejściu na stronę bioinformatyki genomu należy kliknąć blatt, aby otworzyć nowe okno, a następnie wkleić sekwencję DNA. Po przesłaniu sekwencji DNA pojawią się wyniki wyszukiwania BLATT.Kliknij przeglądarkę na trafieniu o 100% identyczności, aby wyświetlić lokalizację sekwencji DNA. Region able one został użyty jako przynęta do określenia jego dalekosiężnych oddziaływań DNA. Do analizy 3C wybrano dwa miejsca BglII oraz jedno miejsce BamHI. W drugiej rundzie PCR zestaw starterów 46 26 29 61 został użyty do amplifikacji able M1, 46 30 29 61 do able M2, a 46 36 29 61 do able M3.Typowy obraz żelu ujawnia od jednego do kilku prążków, co pokazano tutaj dla klonów able M1, able M dwa oraz able M trzy. Sekwencja DNA klonu able M1 została przedstawiona, aby wykazać, że każdy fragment z testu A CT składa się z dwóch połączonych segmentów DNA. Jeden segment pochodzi z regionu DNA przynęty, natomiast drugi segment pochodzi od powiązanego partnera.Segmenty są łączone ze sobą za pomocą pierwszej sekwencji rozpoznawania enzymu restrykcyjnego. Druga sekwencja rozpoznawania enzymu znajduje się na końcu powiązanej sekwencji partnera. Klonowalny fragment M1 zawiera DNA z regionu ABLE one zlokalizowanego w chromosomie 9 q32.4, a powiązany partner znajduje się w chromosomie 3 p3 i został zidentyfikowany jako proc two.Podobnie, partner powiązany z able M dwa został zlokalizowany w chromosomie pięć Q 21.1, podczas gdy klon able M trzy zidentyfikowano jako powiązanie wewnątrzchromosomalne w pobliżu locus ABLE jeden, w przeciwieństwie do testów three C. Metodologia przedstawiona w tym filmie pozwoli na wyselekcjonowanie najpowszechniejszych oddziaływań dalekozasięgowych. Jednakże, poprzez zwiększenie liczby cykli PCR R, możliwe jest zidentyfikowanie również dodatkowych, rzadszych powiązań. Stosując region imprintingu i kontroli lub ICR w locus IGF dwa H 19 jako DNA przynęty w komórkach fibroblastów mysich, w pierwszej i drugiej rundzie PCR w teście A CT zastosowano różne programy cykli.Test A CT może być również wykorzystany do identyfikacji różnic w architekturze jądra komórkowego oraz oddziaływań dalekiego zasięgu pomiędzy komórkami prawidłowymi a komórkami nowotworowymi. Homogenizowano prawidłową tkankę okrężnicy oraz tkankę raka okrężnicy, a następnie przeprowadzono test A CT zgodnie z opisanymi tutaj procedurami. Przedstawiono tutaj strukturę DNA regionu ICR w locus IGF two H 19 oraz gen IGF two dpn.Dwa miejsca dla testu A CT; startery znakowane użyte w drugiej rundzie PCR są oznaczone strzałkami i numerami w różnych kolorach. Wzór żelu dla testu A CT przedstawia wyniki PCR z zastosowaniem startera 29 61 wraz z parą starterów 41, 61, 41 63, 51 45 lub 51 51. Unikalne prążki, które pojawiają się tylko w prawidłowej tkance jelita grubego, są oznaczone żółtymi strzałkami, a prążki, które pojawiły się tylko w tkance raka jelita grubego po jego opracowaniu, są oznaczone czerwonymi strzałkami.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii molekularnej do eksploracji architektury jądra komórkowego oraz regulacji genów w sposób trójwymiarowy.

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromosomowa pułapka asocjacyjna do identyfikacji oddziaływań DNA na długich odcinkach

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji i wiąże się z nawrotem choroby i progresją choroby. Ten film opisuje technikę fluorescencji-hybrydyzacji DNA in situ (DNA FISH) na CTC uchwyconych na przewodzie medycznym w celu zbadania konkretnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

3D DNA RYBY: technika lokalizacji określonego genu na chromosomie

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Poznaj metodę ACT do identyfikacji dalekich interakcji DNA w komórkach białaczki promielocytowej człowieka. Ta technika pozwala odkrywać nieznane wcześniej powiązania genomowe i lepiej zrozumieć regulację ekspresji genów.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Przeglądaj więcej filmów