Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie optymalnej pozycji chromosomalnej dowolnego elementu DNA za pomocą losowej insercji za pośrednictwem transpozonów, eksperymentów konkursowych i sekwencjonowania całego genomu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji DNA, takie jak znaczenie chromosomalnej lokalizacji elementu genetycznego. Zaletą tej techniki jest to, że łączy losową insercję opartą na transpozonach z wyborem najlepiej przystosowanego klonu przez przewagę wzrostu.

Tutaj jest to uproszczone przez region E.coli DARS2. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację chromosomów Escherichia coli, można ją również zastosować do innych bakterii. Po przygotowaniu ogniw elektrokompetentnych, takich jak MG1655 delta DARS2 zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj jeden mikrogram pNKBOR DARS2 do 40 mikrolitrów komórek i przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety o odstępie 0,2 centymetra.

Włóż kuwetę do komory elektroporacji. Następnie naelektryzuj ogniwa przy napięciu 18 kilowoltów, 500 omów i 25 mikrofaradach. Stała czasowa powinna wynosić około pięciu milisekund i nie powinno wystąpić żadne wyładowanie łukowe.

Szybko odzyskaj zawiesinę bakteryjną, ponownie zawieszając ją w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego bulionu LB i przenosząc do 15-mililitrowej probówki. Inkubować komórki w napowietrzonych warunkach wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut bez doboru antybiotyków. Następnie połóż bakterie na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia policz kolonie z elektroporacji. Jedna kolonia jest uważana za równą jednej insercji transpozonu chromosomowego. Dodaj jeden mililitr bulionu LB do każdego talerza i zmyj wszystkie kolonie.

Użyj ponownie tego samego mililitra bulionu LB, aby zwiększyć stężenie bakterii. Następnie zbierz wszystkie kolonie w tej samej 50-mililitrowej tubce. Wirować probówkę, aby zamrozić materiał wyjściowy i wymieszać jeden mililitr zawiesiny komórkowej z jednym mililitrem 50% glicerolu na lodzie.

Przenieś probówki do suchego lodu na 10 minut. Po zamrożeniu kultur przenieś je do zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić bibliotekę transpozonów z minus 80 stopni Celsjusza na lodzie.

Wymieszać przez pipetowanie, a następnie przenieść 100 mikrolitrów biblioteki transpozonów do 10 mililitrów LB w 15-mililitrowej probówce. Hoduj komórki napowietrzane ciągłym wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin do fazy stacjonarnej. Dostosuj parametry do różnych warunków wzrostu zgodnie z potrzebami.

Aby rozmnażać populację bakterii mniej więcej co 10 pokoleń, przenieś 10 mikrolitrów wcześniej nieruchomej fazy do 10 mililitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki i hoduj kulturę przez kolejne osiem godzin do fazy stacjonarnej. Po każdych 100 pokoleniach rywalizacji zachowaj pięć jednomililitrowych próbek i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj sondę do Southern blot przeciwko jednokilobajtowemu przekrojowi NKBOR przez amplifikację PCR przy użyciu określonych starterów, jak podano tutaj.

Uruchom przykłady przy użyciu następującego programu. Oznacz wynikowy fragment PCR dATP znakowany P32 przy użyciu systemu losowych starterów zgodnie ze Smithem i przygotuj całkowite DNA komórkowe zgodnie z protokołem tekstowym. Trawić całkowite DNA komórkowe za pomocą Pvul, który przecina NKBOR zawierający obszar zainteresowania poza regionem objętym sondą.

Wykonaj Southern blot przy użyciu 0,7% żelu agarozowego według Loebnera-Olsena i von Freieslebena. Aby wykorzystać łatwe chodzenie po genach do identyfikacji miejsc insercji DARS2 z pojedynczych klonów, po 700 szacowanych generacjach konkurencji, wyizoluj genomowe DNA dla matrycy PCR, najpierw rozprowadzając bakterie na płytce agarowej LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Zaszczep bulion LB pojedynczymi koloniami i hoduj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś 20 mikrolitrów do 200 mikrolitrów autoklawowanej wody destylowanej. Zmieszaj kolonie do roztworu, a następnie podgrzej mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwiruj próbki z maksymalną prędkością przez pięć minut, a następnie zachowaj lizat komórkowy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Następnie zaprojektuj trzy zagnieżdżone startery do wyżarzania w wybranym transpozonie, jak pokazano poniżej. Użyj 200 nanogramów genomowego DNA, zagnieżdżonego startera i losowego startera, aby przygotować 20-mikrolitrową reakcję PCR. Następnie uruchom próbki przy użyciu następującego programu.

Do drugiej amplifikacji użyj jednego mikrolitra pierwszej reakcji jako matrycy i użyj zagnieżdżonego startera dwa i tego samego startera losowego. Przeprowadzić trzecią reakcję w podobny sposób, używając zagnieżdżonego startera trzy, tego samego losowego startera i jednego mikrolitra z drugiej reakcji jako matrycy. Uruchom produkty z końcowej reakcji PCR na 1,5% żelu agarozowym i statynie z bromkiem etydyny.

Wytnij prążek w zakresie od 100 do 800 par zasad i wyizoluj DNA za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie ze wskazówkami producenta. Aby przeprowadzić cytometrię przepływową, zrównoważ każdą kulturę bakteryjną, utrzymując ją w fazie wzrostu wykładniczego przez co najmniej 10 pokoleń. Zmierz OD600 i upewnij się, że nigdy nie przekracza 0,3.

Aby przeprowadzić wybieg ryfampicyny zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś jeden mililitr kultury do 15-mililitrowej probówki zawierającej 30 mikrolitrów RIF-CEF. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez co najmniej cztery godziny. W przypadku próbki EXP przenieś jeden mililitr wykładniczo rosnącej kultury do 1,5 mililitrowej probówki na lodzie.

Następnie zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 15 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach lodowatego 10-milimolowego trisu o pH 7,5 i dodać jeden mililitr lodowatego 77% etanolu. Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia.

Zabarwić komórki, zbierając od 100 do 300 mikrolitrów utrwalonych komórek przez odwirowanie w temperaturze 15 000 razy G przez 15 minut. Usunąć supernatant i użyć 130 mikrolitrów roztworu do barwienia DNA, aby ponownie zawiesić osad. Następnie inkubować próbki na lodzie i w ciemności przez 10 minut.

Na koniec użyj cytometrii przepływowej, aby określić pochodzenie na komórkę, względną masę komórki i względną zawartość DNA. Po ekstrakcji DNA z początkowej puli transpozonów i co około 100 z 700 pokoleń konkurencji, DNA przecięto za pomocą Pvul, o którym wiadomo, że przecina transpozon NKBOR DARS2 raz w regionie nieobjętym sondą i wykonano Southern blot. Jak pokazano tutaj, początkowa pula DARS2 nie miała wyraźnych prążków, co pokazuje, że DARS2 został losowo wstawiony do całego chromosomu.

Z biegiem czasu pojawił się wzorzec, w którym początkowa duża pula klonów DARS2 rozwinęła się tylko w jeden lub kilka trwałych klonów DARS2. Sekwencjonowanie całego genomu wykorzystano do identyfikacji miejsc insercji DARS2 z puli startowej. A po 400, 500 i 700 pokoleniach konkurencji w reprezentatywnym podzbiorze sekwencjonowanych insercji, 98% wszystkich insercji DARS2 znaleziono w pobliżu lokalizacji chromosomu DARS2 typu dzikiego.

A 2% znaleziono w innym miejscu chromosomu. Wcześniej wykazano, że komórki z niedoborem DARS2 inicjują replikację w synchronizacji i mają spadek stężenia pochodzenia w stosunku do komórek typu dzikiego. W tym przypadku obecność elementu DARS2 na końcu nie przywraca synchronizacji ani zawartości pochodzenia komórkowego do poziomów typu dzikiego, podczas gdy wybrane klony DARS2 IR i RPPH inicjują replikację w synchronizacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić optymalną pozycję chromosomalną danego elementu DNA. Odbywa się to poprzez losowe insercje oparte na transpozonach, po których następują eksperymenty konkursowe, a na końcu sekwencjonowanie całego genomu.