Name: Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę transpozonowych wstawek losowych do określenia optymalnej pozycji chromosomalnej elementów DNA w Escherichia coli. Technika łączy eksperymenty konkurencyjne z sekwencjonowaniem całego genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy zostali sfinansowani z grantów Fundacji Novo Nordisk, Fundacji Lundbeck i Duńskiej Narodowej Fundacji Badawczej (DNRF120) za pośrednictwem Centrum Odpowiedzi i Trwałości Stresu Bakteryjnego (BASP).

1. Kolekcja Biblioteki Transposon
UWAGA: Chromosomalny locus DARS2 został sklonowany do transpozonu opartego na mini Tn10, NKBOR (on pNKBOR)21, co daje w wyniku NKBOR::DARS2 (pJFM1). pNKBOR można uzyskać online22. pNKBOR to wektor samobójczy oparty na R6K, który wymaga białka inicjującego π do replikacji23. Plazmid pJFM1 jest zatem zdolny do replikacji w szczepie E. coli (np. Dh5α λ pir) zawierającym chromosomalną kopię genu pir. Jednakże, gdy pJFM1 jest przekształcany w MG1655 z niedoborem Pir, pJFM1 nie może się replikować, co prowadzi do selekcji klonów opornych na kanamycynę generowanych przez losowe inserpcje NKBOR::DARS2 do chromosomu bakteryjnego. Dla uproszczenia nazywa się je wstawkami DARS2. Zobacz Rysunek 1 dla schematycznego przedstawienia metodologii.
<ol>
	<li>Przygotuj elektrokompetentny MG1655 ΔDARS2 z aktywnie rosnących komórek w bulionie lizogenicznym (LB) hodowanym w temperaturze 37 °C24.</li>
	<li>Elektroporować pJFM1 do elektrokompetentnego MG1655 ΔDARS2, według Gonzalesa i wsp.24
	<ol>
		<li>Dodać 1 μg pJFM1 (w 1 μl wody) do 40 μl elektrokompetentnego E. coli MG1655 ΔDARS2 i przenieść tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety o średnicy 0,2 cm. Włóż kuwetę do komory elektroporacji. Elektroporacja przy napięciu 18 kV, 500 Ω i 25 μF; Stała czasowa powinna wynosić ~5,0 ms i nie powinno wystąpić wyładowanie łukowe.</li>
		<li>Szybko odzyskaj zawiesinę bakteryjną, umieszczając ją ponownie w 1 ml podgrzanego bulionu LB i przenosząc do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Pozwól komórkom zregenerować się poprzez inkubację w napowietrzonych warunkach wzrostu w temperaturze 37 °C przez 30 minut, bez selekcji antybiotyków. Umieść bakterie na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 μg/ml kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz kolonie z elektroporacji: jedna kolonia jest równa jednej insercji transpozonu chromosomowego. 
	UWAGA: Kolonie można liczyć na oko lub za pomocą licznika kolonii. Liczba kolonii jest odwrotnie proporcjonalna do średniej odległości dzielącej transpozony znajdujące się w chromosomie każdego klonu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml bulionu LB do każdej płytki i zmyj wszystkie kolonie; 1 ml bulionu LB powinien wystarczyć do zmycia ~ 100 000 kolonii. Użyj ponownie tego samego 1 ml bulionu LB, aby zwiększyć stężenie bakterii. Zbierz wszystkie kolonie w tej samej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zwirować rurkę i zamrozić materiał wyjściowy (t = 0). Aby go zamrozić, wymieszaj 1 ml zawiesiny komórkowej z 1 ml 50% glicerolu na lodzie. Przenieś probówki do suchego lodu na 10 minut. Po zamrożeniu kultur przenieś je do zamrażarki o temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie spodziewane jest stężenie komórek na poziomie co najmniej 50 000 CFU/ml.</li>
</ol>
2. Eksperyment konkursowy w LB
<ol>
	<li>Rozmrozić bibliotekę transpozonów od -80 °C na lodzie. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Przenieś 100 μl biblioteki transpozonów do 10 ml LB w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Hodować komórki, napowietrzane przez ciągłe wytrząsanie (250 obr./min), przez 8 godzin w temperaturze 37 °C do fazy stacjonarnej (tj. OD600 = ~4,0). Dostosuj te parametry do różnych warunków wzrostu, zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Rozmnażaj populację bakterii przez ciągłe transfery do świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki co ~10 pokoleń. Zrób to, przenosząc 10 μl kultury z poprzedniej fazy stacjonarnej do 10 ml świeżego LB i rosnąc przez kolejne 8 godzin do fazy stacjonarnej (tj. OD600 = ~ 4,0). 
	UWAGA: Ponieważ początkowa i końcowa gęstość optyczna są takie same, 1000-krotne rozcieńczenie odpowiada ~10 generacjom wzrostu (210 = 1,024). Populację bakterii można rozmnażać bezpośrednio na świeże, wstępnie ogrzane podłoże lub przechowywać w temperaturze 0-4 °C (na lodzie) i rozmnażać następnego dnia. LB został tutaj użyty, aby zapewnić jak najwięcej podwojeń komórkowych w jak najkrótszym czasie (czas podwojenia bliski 22 minutom).</li>
	<li>Po każdych 100 generacjach zawodów zachowaj pięć próbek o pojemności 1 ml w temperaturze -80 °C (zgodnie z opisem w kroku 3.3).</li>
	<li>Jeśli oczekuje się, że różnice w dopasowaniu między komórkami zawierającymi poszczególne insercje transpozonów będą niewielkie, czas trwania konkurencji powinien być długi; tutaj użyto 700 pokoleń (t = 700).</li>
</ol>
3. Analiza Southern Blot w celu monitorowania eksperymentu konkurencji w czasie
<ol>
	<li>Przygotuj sondę do Southern blot (1-kb sekcja NKBOR), wykonując amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu określonych starterów: NKBOR_Probe_FW: gatgttggacgagtcggaat i NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 98 °C przez 30 s w celu wstępnej denaturacji. Następnie wykonaj 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s. Do ostatecznego przedłużenia użyj 72 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Matrycą do reakcji PCR był oczyszczony plazmid pNKBOR21.</li>
		<li>Oznacz wynikowy fragment PCR za pomocą [α-32P]dATP przy użyciu systemu losowych starterów, zgodnie z Smith25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj całkowite DNA komórkowe zgodnie z Løbnerem-Olesenem i von Freiesleben26 dla t = 0 i wybranych punktów czasowych do t = 700 szacowanych pokoleń konkurencji.</li>
	<li>Trawić całkowite DNA komórkowe za pomocą PvuI, który przecina NKBOR zawierający obszar zainteresowania tylko raz w regionie nieobjętym sondą; 1 jednostka PvuI może być użyta do całkowitego strawienia 1 μg substratu DNA. 
	UWAGA: Sonda rozpozna fragmenty zawierające część transpozonu, wraz z chromosomalnym DNA o różnej długości, w zależności od miejsca wprowadzenia.</li>
	<li>Wykonaj Southern blot przy użyciu 0,7% żelu agarozowego zgodnie z Løbner-Olesen i von Freiesleben26.</li>
</ol>
4. Identyfikacja najlepiej dopasowanych klonów
<ol>
	<li>Stosuj łatwe chodzenie po genach, jak opisano przez Harrisona i wsp.27, aby zidentyfikować miejsca insercji DARS2 z pojedynczych klonów (wyizolowanych na płytkach LB) po 700 szacowanych generacjach konkurencji; im więcej prążków na Southern blot, tym więcej izolatów jest potrzebnych do pokrycia wszystkich insercji transpozonów.
	<ol>
		<li>Wyizoluj genomowe DNA do matrycy PCR. Rozprowadzić bakterie na płytce agarowej LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Hodować pojedyncze kolonie przez noc w bulionie LB w temperaturze 37 °C, a następnie przenieść 20 μl do 200 μl autoklawowanej wody destylowanej (lub zastosować oczyszczanie DNA, jak w kroku 3.2).
		<ol>
			<li>Wirować do mieszania. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 10 minut i odwirowywać z maksymalną prędkością przez 5 minut. Zachowaj lizat komórkowy w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaprojektuj trzy zagnieżdżone startery do wyżarzania w wybranym transpozonie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2 dla graficznej reprezentacji strategii PCR). 
		UWAGA: Projektowanie zagnieżdżonych starterów powinno zapewnić, że zagnieżdżony starter 3 leży najbliżej znanego końca 5' transpozonu DNA, a następnie zagnieżdżone startery 2 i 1. Odstęp między zagnieżdżonym starterem 3 a końcem 5' znanego transpozonu DNA powinien być wystarczający do odczytania sekwencji ze znanego DNA do nieznanego DNA (w celu znalezienia specyficznego miejsca insercji transpozonu chromosomowego). Dla NKBOR użyto następujących zagnieżdżonych starterów: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg i pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Stosuje się również losowe startery zawierające miejsca rozpoznawania znanych enzymów restrykcyjnych. Aby zapewnić wynik, należy użyć co najmniej dwóch różnych losowych starterów. Miejsca restrykcyjne dla enzymów restrykcyjnych (np. Sau3AI i HindIII) powinny znajdować się na końcu 3' i być poprzedzone dziesięcioma losowymi zasadami, tak aby 5'-NNNNNNNNNNGATC-3' i 5'-NNNNNNNNNNAAGCTT-3' były starterami zawierającymi odpowiednio miejsce Sau3AI (GATC) i miejsce HindIII (AAGCTT), gdzie N = A, T, G lub C.</li>
		<li>Użyj 200 ng genomowego DNA w 20 μl reakcji PCR. Inkubować w temperaturze 98 °C przez 30 s w celu wstępnej denaturacji. Wykonaj 25 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 50 °C przez 15 s i 72 °C przez 4 minuty. Do ostatecznego przedłużenia użyj 72 °C przez 10 minut. Użyj par starterów składających się z zagnieżdżonego startera 1 i jednego z losowych starterów.</li>
		<li>Użyć par starterów składających się z zagnieżdżonego startera 2 i tego samego losowego startera z drugiego wzmocnienia, używając 1 μl jego poprzedniej reakcji jako matrycy.</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.4 z parami starterów składającymi się z zagnieżdżonego startera 3 i tego samego losowego startera.</li>
		<li>Uruchom produkty z końcowej reakcji PCR na 1,5% żelu agarozowym i zabarwić bromkiem etydyny. Wytnij pasmo w zakresie 100-800 pz i wyizoluj DNA za pomocą dowolnego dostępnego zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie ze wskazówkami producenta. Ponownie zawiesić DNA w 15 μl wody. 
		UWAGA: Uwaga. Bromek etydyny jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
		<li>Zsekwencjonuj pasmo wyizolowane w poprzednim kroku (krok 4.1.6), z zagnieżdżonym starterem 3 jako starterem sekwencjonowania, używając sekwencjonowania Sangera u komercyjnego dostawcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj WGS.
	<ol>
		<li>Wykonaj WGS na całkowitym DNA wyekstrahowanym z wybranych próbek pobranych podczas eksperymentu konkursowego, zgodnie z opisem Frimodt-Møller et al4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Wyrównaj odczyty sparowanych końców do 150 Ns ciągłych do NKBOR, AF310136.1 1,904...2,204 za pomocą Bowtie228 z interwałem między podciągami źródłowymi (S,1,1.15) i maksymalną liczbą niejednoznacznych znaków (L,0,0.9).</li>
		<li>Wybierz wyrównane odczyty, a następnie ponownie wyrównaj do obu MG1655 ref|NC_000913.3 oraz NKBOR gb|AF310136 przy użyciu blastN29</li>
		<li>Przypisz pozycje wstawiania transpozycji na skrzyżowaniach MG1655-NKBOR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Pobrać próbki do cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Zrównoważ każdą kulturę, utrzymując ją w fazie wykładniczego wzrostu przez co najmniej 10 pokoleń. Sprawdź OD600 i upewnij się, że nigdy nie przekracza 0.3.</li>
		<li>Pobrać dwa rodzaje próbek przepływowych.
		<ol>
			<li>W przypadku bicia RIF przenieść 1 ml kultury do 15 ml probówki zawierającej 30 μl RIF-CEF (300 μg/ml ryfampicyny i 36 μg/ml cefaleksyny rozpuszczonych w 12,5 mM NaOH). Pozostawić w temperaturze 37 °C na minimum 4 godziny wstrząsania. 
			UWAGA: Ryfampicyna pośrednio blokuje inicjację replikacji chromosomów, jednocześnie pozwalając na kontynuowanie trwających rund replikacji aż do zakończenia. Cefaleksyna zapobiega podziałom komórkowym, co skutkuje wyczerpaniem replikacji (RIF-runout) i akumulacją komórek z w pełni zreplikowanymi chromosomami. Liczba w pełni zreplikowanych chromosomów jest równa liczbie początków w momencie leczenia ryfampicyną i cefaleksyną20.</li>
			<li>W przypadku próbki EXP przenieś 1 ml wykładniczo rosnącej kultury do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw komórki w następujący sposób. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 15 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 100 μl lodowatego 10 mM Tris pH 7,5 i dodać 1 ml lodowatego 77% etanolu. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Zabarwić komórki w następujący sposób. Zebrać 100-300 μl komórek utrwalonych przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 130 μl "roztworu do barwienia DNA" (90 μg/ml mitramycyny, 20 μg/ml bromku etydyny, 10 mM MgCl2 i 10 mM Tris pH 7,5). Umieść próbki na lodzie i w ciemności; Próbki są gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej po 10 minutach 
	UWAGA: Można również użyć innych barwień DNA niż bromek etydyny i mitramycyna30,31.</li>
	<li>Określ pochodzenie na komórkę, względną masę komórki i względną zawartość DNA za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Wykonaj cytometrię przepływową, jak opisano wcześniej32. Uruchomić próbki RIF-runout i EXP, korzystając z instrukcji producenta cytometru przepływowego. W przypadku komórek barwionych bromkiem mithramycyny i etydyny należy użyć fal wzbudzenia o długości 395 i 440 nm i zebrać fluorescencję powyżej 565 nm.
		<ol>
			<li>Aby określić względną masę komórki i względną zawartość DNA, uruchom próbki EXP w celu uzyskania jednoparametrowego rozproszenia światła do przodu w funkcji histogramów liczby komórek i intensywności fluorescencji w stosunku do histogramów liczby komórek dla co najmniej 30 000 zdarzeń odpowiadających sygnałowi komórkowemu.</li>
			<li>Użyj rozkładu światła rozproszonego do przodu jednoparametrowego, aby zmierzyć średnią względną masę komórki. 
			UWAGA: Światło rozproszone do przodu jest miarą średniej masy komórki20.</li>
			<li>Użyj rozkładów intensywności fluorescencji jednoparametrowej, aby zmierzyć średnią zawartość DNA20.</li>
			<li>Stężenie DNA należy obliczyć jako stosunek średniej zawartości DNA do średniej masy komórki20.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ liczbę punktów początkowych w komórce.
		<ol>
			<li>Uruchom próbki bicia RIF, aby uzyskać jednoparametrową intensywność fluorescencji w porównaniu z histogramami liczby komórek dla co najmniej 30 000 zdarzeń odpowiadających sygnałowi komórkowemu.</li>
			<li>Użyj rozkładów jednoparametrowych intensywności fluorescencji, aby określić liczbę chromosomów w każdej komórce20.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz wskaźnik asynchroniczności (Ai).
	<ol>
		<li>Oblicz Ai, zgodnie z opisem Løbnera-Olesena i wsp.32, używając rozkładu intensywności fluorescencji pojedynczych parametrów próbek wybijanych RIF i wzoru Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), gdzie fx to komórki frakcji z liczbą x w pełni zreplikowanych chromosomów. Rozważ inicjacje asynchroniczne, gdy A >0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li>
<li>Sherratt, D. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15065657">Recombination and chromosome segregation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).</li>
<li>Bigot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+motifs+that+control+E.+coli+chromosome+segregation+by+orienting+the+FtsK+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase.</a> EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).</li>
<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Replication+Control+Is+Linked+to+Genomic+Positioning+of+Control+Regions+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli.</a> PLoS Genet. 12 (9), 1006286(2016).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+Replication%2C+Second+Edition%22">DNA Replication, Second Edition</a>. , University Science Books. (1992).</li>
<li>Kaguni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+initiation+at+the+Escherichia+coli+chromosomal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin.</a> Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).</li>
<li>Leonard, A. C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity%3A+taking+directions+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li>
<li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li>
<li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li>
<li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li>
<li>Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeqA%3A+a+negative+modulator+of+replication+initiation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli.</a> Cell. 77 (3), 413-426 (1994).</li>
<li>Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiator+function+of+DnaA+protein+is+negatively+regulated+by+the+sliding+clamp+of+the+E.+coli+chromosomal+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.</a> Cell. 94 (1), 61-71 (1998).</li>
<li>Kato, J., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hda%2C+a+novel+DnaA-related+protein%2C+regulates+the+replication+cycle+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.</a> EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).</li>
<li>Kasho, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaA+binding+locus+datA+promotes+DnaA-ATP+hydrolysis+to+enable+cell+cycle-coordinated+replication+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).</li>
<li>Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+replication+initiation+by+a+novel+chromosomal+locus+exhibiting+exceptional+affinity+for+Escherichia+coli+DnaA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein.</a> Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).</li>
<li>Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+genomic+sequences+of+E.+coli+promote+replicational+initiation+by+directly+reactivating+ADP-DnaA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA.</a> Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).</li>
<li>Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+binding+of+IHF+and+Fis+to+DARS2+regulates+ATP-DnaA+production+and+replication+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).</li>
<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+regions+for+chromosome+replication+are+conserved+with+respect+to+sequence+and+location+among+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains.</a> Front Microbiol. 6, 1011(2015).</li>
<li>Bergthorsson, U., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+chromosome+length+variation+in+natural+isolates+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli.</a> Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).</li>
<li>Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+bacteria%3A+a+promising+tool+in+experimental+and+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology.</a> J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).</li>
<li>Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKBOR%2C+a+mini-Tn10-based+transposon+for+random+insertion+in+the+chromosome+of+Gram-negative+bacteria+and+the+rapid+recovery+of+sequences+flanking+the+insertion+sites+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli.</a> Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).</li>
<li>SHIGEN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://shigen.nig.ac.jp">http://shigen.nig.ac.jp</a> (2017).</li>
<li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li>
<li>Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protocol+for+preparation+of+electrocompetent+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
<li>Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+primed+labeling+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random primed labeling of DNA.</a> Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).</li>
<li>Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+replication+incompatibility+in+Dam+methyltransferase+deficient+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells.</a> EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).</li>
<li>Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+gene+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Easy gene walking.</a> Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+half+of+the+Escherichia+coli+replication+origin+is+not+essential+for+viability%2C+but+facilitates+multi-forked+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).</li>
<li>Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+minichromosomes+in+individual+Escherichia+coli+cells%3A+implications+for+replication+control%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control.</a> EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).</li>
<li>Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li>
<li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAPlotter%3A+circular+and+linear+interactive+genome+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li>
<li>Eckert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+screened+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Adaptive+Laboratory+Evolution+of+Microorganisms+Using+a+Chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li>
<li>Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+position+effects+on+gene+expression+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12.</a> Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Zastosowana tu metodologia wykorzystuje najnowocześniejsze techniki, aby odpowiedzieć na trudne pytanie dotyczące optymalnej pozycji genomowej elementu genetycznego. Losowe wprowadzenie elementu genetycznego (za pośrednictwem transpozonu) umożliwia szybkie i łatwe zebranie tysięcy klonów, które następnie mogą konkurować ze sobą w celu wybrania optymalnej pozycji badanego elementu genetycznego (tj. najlepiej przystosowanego klonu).
W tym przypadku DARS2 został wstawiony do tra...

Na funkcję dowolnego elementu genetycznego może mieć wpływ jego lokalizacja w genomie. U bakterii wynika to głównie z interferencji przez transkrypcję sąsiednich genów, lokalną topologię DNA i/lub dawkowanie genów związane z replikacją. W szczególności procesy replikacji i segregacji DNA są kontrolowane, przynajmniej częściowo, przez niekodujące regiony chromosomowe1, a prawidłowe funkcjonowanie tych regionów zależy od lokalizacji/kontekstu genomu. W przypadku E. coli przykładami są miejsce dif, wymagane do rozdzielczości chromosomu siostrzanego2; Sekwencje KOPS, wymagane do segregacji chromosomów3; oraz regiony datA, DARS1 i DARS2, wymagane do prawidłowej kontroli replikacji chromosomów (poniżej; 4). Przedstawiamy metodę pozwalającą na losowe przemieszczanie, selekcję i określenie optymalnego kontekstu genetycznego danego elementu genetycznego, czego przykładem jest badanie regionu niekodującego DARS2.
U E. coli, DnaA jest białkiem inicjującym odpowiedzialnym za otwarcie nici DNA na początku pojedynczej replikacji, oriC, oraz za rekrutację helikazy DnaB5,6,7. DnaA należy do białek AAA+ (tj. ATPaz związanych z różnorodną aktywnością) i może wiązać zarówno ATP, jak i ADP z podobnymi wysokimi powinowactwami5. PoziomDnaA ATP osiąga szczyt w momencie inicjacji8, gdzieDnaA ATP tworzy multimer na oriC, który wyzwala otwieranie DNA duplex9. Po inicjacji, oriC staje się tymczasowo niedostępny do ponownej inicjacji z powodu sekwestracji przez mechanizm obejmujący wiązanie białka SeqA z hemimetylowanym oriC10,11. Podczas sekwestracji poziomDnaA ATP jest obniżany przez co najmniej dwa mechanizmy: regulacyjną inaktywację DnaA (RIDA)12,13 i zależną od datA hydrolizęDnaA ATP (DDAH)14,15. Zarówno RIDA, jak i DDAH promują konwersjęDnaA ATP do DnaAADP. Przed nową rundą inicjacji, DnaAADP jest reaktywowany do DnaAATP w określonych sekwencjach reaktywujących DnaA (DARS): DARS1 i DARS216,17. Chromosomalne regiony datA, DARS1 i DARS2 są niekodujące i działają w sposób podobny do chaperonu, modulując interkonwersję DnaAATP / DnaAADP. Regiony te, znajdujące się poza początkiem replikacji, umożliwiają składanie kompleksu DnaA dla inaktywacji (datA;14) lub aktywacja (DARS1 i DARS2;17) DnaA. Usunięcie DARS2 w komórce nie zmienia czasu podwojenia masy, ale powoduje inicjację replikacji asynchronicznej15,16,18. Jednak komórki z niedoborem DARS2 mają koszt przystosowania w porównaniu z izogenicznym typem dzikim, zarówno podczas ciągłej konkurencji wzrostu w bogatej pożywce, jak i podczas ustanawiania kolonizacji w jelicie myszy 18. Oznacza to, że nawet niewielkie zmiany w stężeniu asynchronicznym/pierwotnym mają negatywny wpływ na sprawność bakterii. U E. coli występuje presja selekcyjna na utrzymanie symetrii chromosomów (tj. dwa prawie równej długości ramiona replikacyjne)19. Regiony datA, DARS1 i DARS2 mają tę samą względną odległość od oriC we wszystkich szczepach E. coli sekwencjonowanych18, pomimo dużych różnic w wielkości chromosomów.
Tutaj używamy regionu DARS2 E. coli jako przykładu do identyfikacji pozycji chromosomów optymalnej dla jego funkcji. DARS2 został wstawiony do transpozonu NKBOR, a powstały transpozon NKBOR::DARS2 został następnie losowo wstawiony do genomu MG1655 ΔDARS2. W ten sposób wygenerowaliśmy zbiór komórek, z których każda posiada DARS2 umieszczony w innym miejscu na chromosomie. Przeprowadzono eksperyment konkurencji in vitro, w którym wszystkie komórki w kolekcji zostały połączone i rywalizowały ze sobą podczas ciągłego wzrostu LB przez około 700 pokoleń. Wynik eksperymentu konkursowego był monitorowany/określany za pomocą Southern blot, łatwego chodzenia po genach i sekwencjonowania całego genomu (WGS; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Klony punktów końcowych rozdzielone przez łatwe chodzenie po genach scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny parametrów cyklu komórkowego. W analizie cytometrii przepływowej można zmierzyć wielkość komórki, zawartość DNA i synchronizację inicjacji dla dużej liczby komórek. Podczas cytometrii przepływowej przepływ pojedynczych komórek przepuszcza wiązkę światła o odpowiedniej długości fali, aby wzbudzić wybarwione DNA, które jest następnie jednocześnie rejestrowane przez fotopowielacze, które zbierają emitowaną fluorescencję, miarę zawartości DNA, pod warunkiem, że komórki są barwione pod kątem DNA. Światło rozproszone do przodu jest miarą masy komórki20.
Eksperyment konkursowy in vitro, który tutaj prezentujemy, służy do odpowiedzi na pytania dotyczące znaczenia pozycji chromosomalnej i kontekstu genomowego elementu genetycznego. Metoda jest bezstronna i łatwa w użyciu.

<table><tbody><tr><td>Autoklawizowana woda</td><td></td> Mili-Q <td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji, 0,1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser System elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB, proszek (agar Lennox L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Plastikowe szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; Rurki kriogeniczne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U/&mikro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania DNA DECAprime II</td> Spektrofotometr <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Wirówka Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td> Wirówka <td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Ultra czysty</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A typ II A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu (SDS)</td><td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&mikro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-Boran-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>solnySigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Papiery 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>bufor SSC 20 razy; Koncentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej - Frakcja V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu dezoksyrybonukleinowego z jąder łososia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; BioMax &nbsp; film świetlny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cephalexin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mithramycin</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Apogee A10</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu dna w escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Optymalna pozycja chromosomalna danego elementu DNA była/była określana przez losową insercję za pośrednictwem transpozonu, po której następowała selekcja dopasowania. W przypadku bakterii wpływ kontekstu genetycznego na funkcję elementu genetycznego może być trudny do oceny. Kilka mechanizmów, w tym efekty topologiczne, interferencja transkrypcyjna z sąsiednimi genami i/lub dawkowanie genów związane z replikacją, może wpływać na funkcję danego elementu genetycznego. W tym miejscu opisujemy metodę, która pozwala na losową integrację elementu DNA z chromosomem Escherichia coli i wybranie najkorzystniejszych lokalizacji za pomocą prostego eksperymentu konkurencji wzrostu. Metoda wykorzystuje dobrze opisany system losowej insercji oparty na transpozonach, w połączeniu z wyborem najlepiej dopasowanego klonu (klonów) według przewagi wzrostu, procedurę, którą można łatwo dostosować do potrzeb eksperymentalnych. Charakter najlepiej przystosowanego klonu (klonów) można określić poprzez sekwencjonowanie całego genomu w złożonej populacji wieloklonalnej lub przez łatwe chodzenie po genach w celu szybkiej identyfikacji wybranych klonów. W tym przypadku jako przykład użyto niekodującego regionu DNA DARS2, który kontroluje inicjację replikacji chromosomów u E. coli. Wiadomo, że na funkcję DARS2 wpływa dawkowanie genów związane z replikacją; im bardziej DARS2 zbliża się do początku replikacji DNA, tym bardziej staje się aktywny. DARS2 został losowo wprowadzony do chromosomu szczepu z delecją DARS2. Powstałe w ten sposób klony zawierające indywidualne insercje zostały połączone i rywalizowały ze sobą przez setki pokoleń. Na koniec scharakteryzowano najlepiej przystosowane klony i stwierdzono, że zawierają DARS2 umieszczony w bliskiej odległości od pierwotnej lokalizacji DARS2.

Wykonano analizę Southern blot, aby zweryfikować, czy DARS2 była rozłożona losowo w obrębie chromosomu w bibliotece transpozonów (t = 0) oraz czy najsilniejsze klony przetrwały w czasie. Analizę Southern blot przeprowadzono na DNA wyizolowanym z początkowej puli transpozonów (w t = 0) oraz średnio co 10 z 70 generacji konkurencji (Rysunek 3). Całkowite DNA komórkowe z każdego punktu czasowego poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym PvuI, któ...

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest określenie optymalnej pozycji chromosomowej dowolnego elementu DNA przy użyciu losowej insercji za pośrednictwem transpozonów, eksperymentów konkurencyjnych oraz sekwencjonowania całego genomu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu replikacji DNA, takie jak znaczenie lokalizacji chromosomowej elementu genetycznego. Zaletą tej techniki jest połączenie losowej insercji opartej na transpozonach z selekcją najlepiej przystosowanego klonu poprzez przewagę wzrostową.W tym przypadku proces został uproszczony dzięki zastosowaniu regionu DARS2 szczepu E.coli. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w organizację chromosomową Escherichia coli, może być ona również zastosowana do innych bakterii. Po przygotowaniu komórek elektrokompetentnych, takich jak MG1655 delta DARS2, zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 1 µg pNKBOR DARS2 do 40 µL komórek, a następnie przenieść mieszaninę do schłodzonej wcześniej sterylnej kuwety o przerwie 0,2 cm.Włóż kuwetę do komory elektroporacyjnej. Następnie poddaj komórki elektroporacji przy napięciu 18 kilovoltów, oporności 500 ohm i pojemności 25 microfarad. Stała czasowa powinna wynosić około pięciu milisekund, a w trakcie procesu nie powinny wystąpić przepływy prądu (przebicia).Szybko odzyskaj zawiesinę bakteryjną, resuspendując ją w jednym mililitrze podgrzanego wcześniej bulionu LB, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml. Inkubuj komórki w napowietrzanych warunkach wzrostu w temperaturze 37 °C przez 30 minut bez selekcji antybiotykowej. Następnie wysej bakterie na płytki z agarem LB uzupełnionym o 50 µg/ml kanamycyny i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc.Następnego dnia należy policzyć kolonie powstałe w wyniku elektroporacji. Jedną kolonię uznaje się za równoważną jednej insercji transpozonu chromosomalnego. Do każdej płytki należy dodać jeden mililitr bulionu LB i wypłukać wszystkie kolonie.Ponownie wykorzystaj ten sam 1 ml pożywki LB, aby zwiększyć stężenie bakterii. Następnie połącz wszystkie kolonie w jednej probówce o pojemności 50 ml. Wymieszaj zawartość probówki za pomocą vortexa, aby ujednolicić materiał wyjściowy, a następnie wymieszaj 1 ml zawiesiny komórkowej z 1 ml 50% glicerolu na lodzie.Przenieś probówki na suchy lód na 10 minut. Po zamrożeniu kultur przenieś je do zamrażarki z temperaturą -80 °C. Rozmroź bibliotekę transpozonów z temperatury -80 °C na lodzie.Wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie przenieść 100 µL biblioteki transpozonów do 10 mL LB w probówce o pojemności 15 mL. Hodować komórki w warunkach napowietrzania przy ciągłym wstrząsaniu w temperaturze 37 °C przez osiem godzin do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Parametry można dostosować do różnych wybranych warunków hodowli.Aby powielać populację bakteryjną mniej więcej co 10 generacji, należy przenieść 10 µL hodowli w fazie stacjonarnej do 10 mL świeżego, uprzednio ogrzanego pożywki i inkubować kulturę przez kolejne osiem godzin aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Po każdych 100 generacjach konkurencji należy pobrać pięć próbek o objętości 1 mL i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Sondę do analizy Southern blot przeciwko fragmentowi NKBOR o wielkości 1 kb przygotowano poprzez amplifikację PCR z wykorzystaniem specyficznych starterów wymienionych tutaj.Próbki należy poddać analizie zgodnie z poniższym programem. Powstały fragment PCR należy znakować P32-dATP z wykorzystaniem systemu randomly primered zgodnie z metodą Smitha, a całkowite DNA komórkowe przygotować zgodnie z protokołem tekstowym. Całkowite DNA komórkowe należy poddać trawieniu enzymem Pvul, który przecina NKBOR zawierający badany region poza obszarem pokrywanym przez sondę.Przeprowadź analizę Southern blot z użyciem żelu agarozowego 0,7% zgodnie z metodą Loebnera-Olsena i von Freieslebena. Aby zastosować metodę easy gene walking do identyfikacji miejsc insercji DARS2 z pojedynczych klonów, po szacowanych 700 generacjach konkurencji, wyizoluj genomowe DNA do matrycy PCR, najpierw wysiewając bakterie na płytkę z agarem LB i inkubując w temperaturze 37 °C przez noc. Zaszczep bulion LB pojedynczymi koloniami i hoduj je przez noc w temperaturze 37 °C.Następnie przenieś 20 µl do 200 µl autoklawowanej wody destylowanej. Wymieszaj kolonie w roztworze za pomocą wortexa, a następnie podgrzej mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Odwiruj próbki z maksymalną prędkością przez pięć minut, a następnie przechowuj lizat komórkowy w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.Następnie zaprojektuj trzy zagnieżdżone primery, które będą przyłączać się w obrębie wybranego transpozonu, jak pokazano tutaj. Użyj 200 ng genomowego DNA, pierwszego zagnieżdżonego primera oraz randomowego primera, aby przygotować 20 µL reakcji PCR. Następnie przeprowadź analizę próbek zgodnie z poniższym programem.W przypadku drugiej amplifikacji należy użyć 1 µL produktu z pierwszej reakcji jako matrycy oraz zagnieżdżonego primera dwa i tego samego primera randomowego. Trzecią reakcję przeprowadza się w podobny sposób, wykorzystując zagnieżdżony primer trzy, ten sam primer randomowy oraz 1 µL produktu z drugiej reakcji jako matrycy. Produkty z końcowej reakcji PCR należy rozdzielić w 1,5% żelu agarozowym i barwić bromkiem etydyny.Wytnij prążek w zakresie od 100 do 800 par zasad i wyizoluj DNA, używając dowolnego komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA z żelu zgodnie z instrukcją producenta. Aby przeprowadzić cytometrię przepływową, zrównoważ każdą kulturę bakteryjną, utrzymując ją w fazie wzrostu wykładniczego przez co najmniej 10 generacji. Zmierz OD600 i upewnij się, że wartość ta nigdy nie przekroczyła 0,3.Aby przeprowadzić etap wypłukiwania ryfampicyny zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś 1 mL kultury do probówki o pojemności 15 mL zawierającej 30 µL RIF-CEF. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez co najmniej cztery godziny. W przypadku próbki EXP przenieś 1 mL kultury w fazie wzrostu wykładniczego do probówki o pojemności 1,5 mL znajdującej się w lodzie.Następnie zebrać komórki poprzez wirowanie przy 15 000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Osad zawiesić ponownie w 100 µL lodowatego 10 mM TRIS pH 7,5 i dodać 1 ml lodowatego 77% etanolu. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.Obbarw komórki, zbierając od 100 do 300 µL utrwalonych komórek poprzez wirowanie przy 15 000 ×g przez 15 minut. Usuń nadsącz i użyj 130 µL roztworu do barwienia DNA, aby resuspender osad. Następnie inkubuj próbki w lodzie i w ciemności przez 10 minut.Na koniec zastosowano cytometrię przepływową, aby określić pochodzenie poszczególnych komórek, ich względną masę oraz wzglistą zawartość DNA. Po ekstrakcji DNA z początkowej puli transpozonów oraz średnio co 100 z 700 pokoleń konkurencji, DNA trawiono restrykcyjnie enzymem Pvul, który przecina transpozon NKBOR DARS2 raz, w regionie niepokrytym sondą, a następnie przeprowadzono analizę Southern blot. Jak tutaj pokazano, początkowa pula DARS2 nie wykazywała wyraźnych prążków, co wskazuje, że DARS2 został wstawiony losowo w obrębie chromosomu.Z biegiem czasu wyłonił się wzorzec, w którym początkowa duża pula klonów DARS2 przekształciła się w tylko jeden lub kilka utrzymujących się klonów DARS2. Do zidentyfikowania miejsc insercji DARS2 w puli początkowej wykorzystano sekwencjonowanie całego genomu. Po 400, 500 i 700 generacjach konkurencji w reprezentatywnym podzbiorze sekwencjonowanych insercji stwierdzono, że 98% wszystkich insercji DARS2 znajduje się blisko chromosomalnej lokalizacji typu dzikiego DARS2.A 2% znaleziono w innych miejscach chromosomu. Wcześniej wykazano, że komórki z niedoborem DARS2 inicjują replikację synchronicznie i wykazują zmniejszenie stężenia miejsc inicjacji w stosunku do komórek typu dzikiego. W tym przypadku obecność elementu DARS2 w terminatorze nie przywraca synchroniczności ani poziomu komórkowej zawartości miejsc inicjacji do wartości typu dzikiego, podczas gdy wybrane klony DARS2 IR i RPPH inicjują replikację synchronicznie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób wyznaczania optymalnej pozycji chromosomalnej danego elementu DNA. Jest to realizowane poprzez losowe insercje oparte na transpozonych, a następnie eksperymenty konkurencyjne i wreszcie sekwencjonowanie całego genomu.

determination-optimal-chromosomal-location-s-for-dna-element

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Poznaj metodę transpozonowych wstawek losowych do określenia optymalnej pozycji chromosomalnej elementów DNA w Escherichia coli. Technika łączy eksperymenty konkurencyjne z sekwencjonowaniem całego genomu.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach (Wideo) | JoVE Journal

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przeglądaj więcej filmów