Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna izolacja kompleksów białkowych z komórek ssaków. Jest to realizowane poprzez najpierw przetransfekcję komórek konstruktem fuzyjnym z tagiem Halo w celu ekspresji białka docelowego. Drugim krokiem jest lizowanie komórek i kowalencyjne wychwycenie kompleksów białkowych na żywicy za pomocą tagu Halo.

Następnie kompleksy białkowe na żywicy są delikatnie płukane w celu usunięcia nieswoistych oddziaływań. Ostatnim krokiem jest elucja kompleksów białkowych z żywicy. W rezultacie metoda pull-down z wykorzystaniem halo tag służy do izolacji i odkrywania nowych oddziaływań białkowych w systemach ssaków.

Metody, które zaprezentujemy Państwu dzisiaj, mogą umożliwić kluczowe odkrycia w dziedzinie proteomiki funkcjonalnej, w tym identyfikację nowych oddziaływań białkowych oraz określenie lokalizacji białek wewnątrz komórek. Procedury te wykonują dziś dwaj nasi starsi naukowcy, Jackie Mendez i Alen Beek. Najpierw, dla każdego białka fuzyjnego lub kontroli, przygotuj jedną szalkę o średnicy 15 cm z 30 ml zawiesiny komórkowej o stężeniu od 3 do 4 × 10⁵ komórek/ml, co odpowiada 1 do 1,2 × 10⁷ komórek łącznie na konstrukt.

Inkubować komórki od 18 do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji przeprowadzić transfekcję konstruktu za pomocą odpowiedniego odczynnika do transfekcji. Po 24 do 48 godzinach od transfekcji usunąć medium i delikatnie przemyć warstwę komórek 20 do 25 ml lodowatego PBS, następnie usunąć PBS i dodać 25 do 30 ml schłodzonego do 4 °C PBS.

Następnie delikatnie zeskrob komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Po zebraniu komórek do probówek stożkowych, odwiruj próbki przez 5 do 10 minut przy 2000 ×g w temperaturze 4 °C. Po odlaniu nadsączu, przechowuj osady komórkowe w temperaturze -80 °C przez minimum 30 minut lub maksymalnie sześć miesięcy.

Dla każdej próbki fuzji lub kontrolnej przygotuj 18 ml buforu do równoważenia żywicy. Delikatnie wymieszaj żywicę, odwracając fiolkę, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Dla każdego eksperymentu wyciągania (pull down) odmierz 200 µL żywicy do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml.

Odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 800 ×g. Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz, nie naruszając żywicy znajdującej się na dnie probówki. Po usunięciu nadsączu dodaj do próbki 800 µL buforu do równoważenia żywicy i wymieszaj dokładnie, kilkakrotnie odwracając probówkę. Następnie.

Wiruj próbkę przez dwie minuty przy 800 ×g. Ostrożnie odlej i usuń nadsącz. Powtórz poprzednie kroki jeszcze dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy przemycia.

Po rozmrożeniu pelletów komórkowych, resuspenduj je w 300 µL wcześniej przygotowanego buforu do lizy ssaków, pipetując w górę i w dół. Następnie przenieś zawiesinę do nowej probówki do mikrocentryfugi i dodaj 6 µL 50 x koktajlu inhibitorów proteaz.

Następnie należy dodać 3 µL RQ1 DNA i mieszać próbkę metodą odwracania przez 10 minut. W temperaturze pokojowej należy zlizować komórki, przepuszczając próbkę od 5 do 10 razy przez igłę strzykawki o rozmiarze 25 lub 27 G. Po odwiruciu próbki z prędkością 14 000 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, należy przenieść klarowny lizat do nowej probówki i umieścić go w lodzie.

Następnie do klarownego lizatu należy dodać kolejne 700 µL wcześniej przygotowanego buforu 1x TBS i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. Usunąć ostatnie porcje płuczące z wcześniej przygotowanych probówek z równoważoną żywicą, uważając, aby nie zaburzyć osadu żywicy na dnie każdej probówki. Następnie do każdej probówki dodać 1 mL rozcieńczonego lizatu.

Inkubować próbki z mieszaniem na rotatorze do probówek przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Następnie wirować probówki z żywicą przez dwie minuty przy 800 ×g. Po odlaniu supernatantu dodać 1 mL buforu do wyrównania żywicy i dokładnie wymieszać, odwracając każdą probkę z żywicą ręcznie kilka razy, a następnie wirować probówki z żywicą przez dwie minuty przy 800 ×g. Odrzucić roztwory po powtórzeniu poprzednich etapów płukania trzy razy.

Do probówek dodaj jeden mililitr buforu do wyrównywania żywicy po inkubacji próbek w temperaturze 22 °C przez pięć minut przy stałej rotacji, odwiruj probówki z żywicą przez dwie minuty przy 800 ×g i odrzuć nadyżynowe płukanki. Następnie resuspenduj żywicę z każdej próbki w 50 µL buforu elucyjnego SDS. Wstrząsaj probówki w temperaturze pokojowej za pomocą automatycznego wstrząsarki do probówek mikrocentryfugowych przez 30 minut.

Po wirowaniu przez dwie minuty przy 800 ×g przenieś EIT do nowych probówek w celu przeprowadzenia analizy. Do analizy western blot lub barwienia srebrem nanieś od 5 do 10 µL próbek na denaturujący żel SDS do spektrometrii mas. Przechowuj 40 µL każdej próbki w temperaturze -20 °C do późniejszych analiz. W ośmiofamianowym szkiełku przedmiotowym dla każdego białka fuzyjnego lub płytki kontrolnej umieść 400 µL komórek HELOC w odpowiednim medium w każdej studni, przy gęstości od 1 do 2 × 10⁵ komórek/mL.

Po inkubacji komórek przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2, przeprowadź transfekcję przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji. Po 18 do 24 godzinach od transfekcji rozcieńcz ligand TMR w stosunku 1:200 w odpowiednim medium komórkowym. Następnie dodaj 100 µL tego roztworu do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj. Następnie inkubuj transfekowane komórki z ligandem przez 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Po zakończeniu odessać pożywkę zawierającą ligand i zastąpić ją 500 µL odpowiedniej pożywki pozbawionej liganda białka fuzyjnego, uprzednio ogrzanej do 37 °C. Po dwukrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, co łącznie daje trzy płukania, umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 30 minut.

Po 30-minutowej inkubacji odessać medium i zastąpić je 500 µl odpowiedniego medium, uprzednio ogrzanego do 37 °C. Następnie obrazować komórki pod mikroskopem, stosując odpowiednie parametry akwizycji; za pomocą protokołu Halo, BRD4 oraz kontroli ekspresji HaloTag obserwuje się sygnał. Ekspresję białka fuzyjnego można również wykryć za pomocą analizy Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko HaloTag lub przeciwciał przeciwko białku przynęty.

Żele barwione srebrem z powtórzeń biologicznych dla Halo BRD four oraz kontrolnych prób pulldown wykazują wysoką powtarzalność i ukazują białka oddziałujące z białkiem BRD four. Wysoka zawartość komponentów PTF B CDK nine i cykliny T, a także białka BRD nine, potwierdza specyficzne wychwycenie kompleksów BRD four. Na żelach widoczne były również inne białka zidentyfikowane jako potencjalne partnerzy w interakcjach z BRD four.

Jako dodatkowy przykład, przeprowadzono złożone izolacje z wykorzystaniem białka Halo HD one. W tym przypadku użyto proteazy TEV do cięcia w regionie łącznika pomiędzy znacznikiem Halo a H DAC one, co spowodowało uwolnienie znacznych ilości białka przynęci HD one. Zgodnie z obserwacjami.

Próbki z immunoprecypitacji HD one wykazały wysoką aktywność HD one, która została zahamowana przez inhibitor HDA saha. Aby dodatkowo wykazać specyficzność, nie zaobserwowano hamowania HDA przy użyciu inhibitora z rodziny sirtuin EX 5 27, a w przypadku zastosowania samego buforu nie wykryto sygnału. Komórki He A transfektowane Halo BRD four i Halo HDAC one zostały oznakowane fluorescencyjnie TMR.

Obrazowanie ligandów wykazało, że oba zlokalizowały się w jądrze komórkowym, co dowodzi, że znacznik nie zmienił fizjologicznej lokalizacji komórkowej jego partnerów fuzyjnych. Zatem po zastosowaniu tej procedury można zidentyfikować wyizolowane białka oraz ich partnerów oddziałujących, a następnie poddać je dalszej analizie przy użyciu różnych metod analitycznych, takich jak spektrometria mas i western blotting.