Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie kompleksów białkowych z komórek ssaków. Osiąga się to poprzez najpierw transekcję komórek za pomocą konstruktu fuzji znaczników halo w celu ekspresji interesującego białka. Drugim krokiem jest pokrojenie komórek i kowalencyjne wychwycenie kompleksów białkowych na żywicy za pomocą znacznika halo.

Następnie kompleksy białkowe na żywicy są delikatnie myte w celu usunięcia wszelkich niespecyficznych interakcji. Ostatnim krokiem jest wymycie kompleksów białkowych z żywicy. Ostatecznie, rozwijane znaczniki halo są wykorzystywane do izolowania i odkrywania nowych interakcji białkowych z systemów ssaków.

Metody, które dziś zademonstrujemy, mogą umożliwić kluczowe odkrycia w dziedzinie proteomiki funkcjonalnej, w tym identyfikację nowych interakcji białkowych i określenie lokalizacji białek wewnątrz komórek. Dzisiaj te procedury wykonują dwaj nasi starsi naukowcy, Jackie Mendez i Alen Beek. Po pierwsze, dla każdej fuzji lub kontroli, przygotuj jedno 15-centymetrowe naczynie z 30 mililitrami komórek w ilości od trzech do czterech razy od 10 do piątej komórki na mililitr lub od jednej do 1,2 razy 10 do siedmiu komórek na konstrukt.

Inkubuj komórki przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po inkubacji przetransfekować konstrukt żądanym odczynnikiem do transfekcji. Po 24 do 48 godzinach, po transfekcji, usuń pożywkę i delikatnie umyj warstwę komórek 20 do 25 mililitrami lodowatego PBS, usuń płukanie PBS i dodaj 25 do 30 mililitrów schłodzonego PBS o czterech stopniach Celsjusza.

Następnie delikatnie zeskrob komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Po zebraniu komórek do stożkowych probówek należy odwirowywać próbki przez pięć do 10 minut w temperaturze 2000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu umieścić granulki komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 30 minut lub maksymalnie sześć miesięcy.

Dla każdej próbki fuzyjnej lub kontrolnej należy przygotować 18 mililitrów buforu do płukania równowagi żywicy. Delikatnie wymieszać żywicę, odwracając fiolkę, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Do każdego eksperymentu z wyciąganiem w dół dozuj 200 mikrolitrów żywicy do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Odwirować próbkę przez jedną minutę w temperaturze 800 razy G. Po odwirowaniu. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając żywicy na dnie probówki. Po odrzuceniu supernatantu dodać do próbki 800 mikrolitrów buforu do płukania równoważącego żywicę i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Po.

Odwirowanie próbki przez dwie minuty w 800 razy. G.Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz poprzednie kroki jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.

Po rozmrożeniu rezus granulek komórkowych zawiesić je w 300 mikrolitrach wcześniej przygotowanej lizy ssaków. Buforować przez pipetowanie w górę iw dół. Następnie przenieś do nowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj sześć mikrolitrów 50 x koktajlu inhibitorów proteazy.

Następnie dodaj trzy mikrolitry RQ one DNA i odwróć próbkę przez 10 minut. W temperaturze pokojowej komórki są przepuszczane przez próbkę od pięciu do 10 razy przez igłę strzykawkową o rozmiarze 25 lub 27. Po odwirowaniu próbki 14 000 razy, G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieś klarowny lizat do nowej probówki i umieść go na lodzie.

Następnie dodaj dodatkowe 700 mikrolitrów wcześniej przygotowanego jednego buforu XTBS do klarownego lizatu i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Usuń końcowe płukanie z wcześniej przygotowanych zrównoważonych probówek z żywicą, nie naruszając żywicy na dnie każdej tubki. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczonego lizatu do każdej probówki.

Inkubować próbki, mieszając je na rotatorze probówkowym przez 15 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po tej wirówce, probówki z żywicą przez dwie minuty w temperaturze 800 razy G. Po odrzuceniu supernatantu dodać jeden mililitr buforu do płukania równowagi żywicy i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie ręcznie odwracając każdą probówkę z żywicą po odwirowaniu probówek z żywicą przez dwie minuty po 800 razy. G. Wyrzuć pranie po wykonaniu poprzednich kroków prania i trzykrotnym powtórzeniu kroków prania.

Dodać jeden mililitr buforu do płukania równowagi żywicy do probówek po inkubacji próbek w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez pięć minut ze stałą rotacją, odwirować probówki z żywicą przez dwie minuty w temperaturze 800 razy G i wyrzucić popłuczyny. W tym momencie resus zawiesić żywicę z każdej próbki w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego SDS. Potrząsaj probówkami w temperaturze pokojowej za pomocą automatycznego wytrząsarki do probówek z mikrowirówką przez 30 minut.

Po odwirowaniu przez dwie minuty w temperaturze 800 razy G. Przenieść EIT do świeżych probówek do analizy W przypadku żelu Western blot lub bejcem srebra załadować od pięciu do 10 mikrolitrów próbek na żel denaturujący SDS do spektrometrii mas. Przechowuj 40 mikrolitrów każdej próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. W ośmiostudzienkowym szkle nakrywkowym dla każdego białka fuzyjnego lub płytki kontrolnej, 400 mikrolitrów komórek HELOC w odpowiednich pożywkach w każdym dołku o gęstości od jednego do dwóch razy 10 do piątych komórek na mililitr.

Po inkubacji komórek przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, po 18 do 24 godzinach należy je transfekować żądanym odczynnikiem do transfekcji, po transfekcji rozcieńczyć ligand TMR od jednego do 200 w odpowiednim pożywce komórkowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów tego roztworu do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj. Następnie inkubować transfekowane komórki zawierające ligand przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po zakończeniu odessać pożywkę zawierającą ligand i zastąpić ją 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki pozbawionej liganda znacznika fuzji białek, który został wstępnie ostrzeżony do 37 stopni Celsjusza. Po dwukrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, w sumie trzy prania. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 30 minut.

Po 30-minutowej inkubacji odessać pożywkę i zastąpić 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki, która została wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza. Po tym obrazie obserwuje się komórki pod mikroskopem przy użyciu odpowiednich parametrów akwizycji przy użyciu protokołu halo, BRD four i ekspresji kontrolnej znacznika halo. Ekspresję białka fuzyjnego można również wykryć za pomocą Western blot z przeciwciałami anty halo tag lub przeciwciałami przeciwko białku przynęty.

Srebrne żele barwiące repliki biologiczne Halo BRD four i pull downs wykazują wysoką odtwarzalność i pokazują białka, które oddziałują z białkiem BRD four. Wysoka zawartość składników z PTF B, CDK, nine i Cyclin T, a także białka BRD nine potwierdza specyficzne wychwytywanie kompleksów BRD four. Żele wykazały inne białka zidentyfikowane jako potencjalne interakcje BRD 4.

Jako dodatkowy przykład, przeprowadzono złożone izolacje z białkiem Halo HD one. W tym przypadku proteaza TEV została użyta do rozszczepienia w regionie łącznikowym między znacznikiem Halo a znacznikiem H DAC, uwalniając znaczne ilości białka przynęty HD One. Jak zaobserwowano.

Próbki HD One wykazały wysoki poziom aktywności HD One, który był hamowany przez inhibitor HDA saha. Aby jeszcze bardziej wykazać swoistość, nie zaobserwowano hamowania HDA w przypadku inhibitora z rodziny sirtuin EX 5 27 i nie wykryto żadnego sygnału przy użyciu samego buforu. Komórki He A transfekowane Halo BRD 4 i Halo HDAC 1 były znakowane fluorescencyjnie TMR.

Obrazowanie ligandowe wykazało, że oba są zlokalizowane w jądrze i pokazują, że znacznik nie zmienia fizjologicznej lokalizacji komórkowej swoich partnerów fuzyjnych. Tak więc, zgodnie z tą procedurą, wyizolowane białka i ich oddziałujący partnerzy mogą być identyfikowane i dalej analizowane przy użyciu różnych metod analitycznych, takich jak spektrometria mas i western blotting.