Name: Identyfikacja partnerów oddziałujących z białkami za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa do izolacji partnerów oddziałujących z białkami eIF4E. Technika TAP umożliwia identyfikację kompleksów białkowych w badaniach interakcji wirus-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane ze stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship przyznanego dr Ianowi Goodfellowowi.

1. Generowanie linii komórkowych: transfekcja / ekspresja pMEP4
<ol>
	<li>Przeprowadź transfekcję komórek wektorem ekspresyjnym pMEP4 i dokonaj selekcji za pomocą 100 μg hygromycyny B /ml (Roche), aż do całkowitego usunięcia komórek kontrolnych (mock). Plazmid pMEP4 utrzymuje się episomalnie, więc nie ma potrzeby izolowania konkretnych klonów.</li>
	<li>Ekspresję w komórkach zawierających wektor pMEP4 można indukować poprzez traktowanie 10 μM CdCl2 przez 16 godzin. Ekspresję i indukowalność należy potwierdzić w małej skali przed amplifikacją linii komórkowych. Białko z tagiem TAP można łatwo wykryć, ponieważ domeny białka G wiążą się z przeciwciałami niemal wszystkich gatunków. Do puryfikacji na dużą skalę zazwyczaj wymagane jest 10 konfluentnych kolb o powierzchni 175 cm2. Odpowiada to w przybliżeniu 2 X108 komórek wykazujących ekspresję.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lizatu komórkowego
<ol>
	<li>Zeskrob komórki do PBS i połącz je w jednej probówce o pojemności 50 ml. Wirować przy 1200X g przez 5 minut (powinno to dać na początku 2-3 ml osadu komórkowego, który po przemyciu zredukuje się do około 1,5 ml). </li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie w schłodzonym do temperatury lodowej PBS (za każdym razem 50 ml).</li>
	<li>Zlizować komórki w 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5 % Glycerol, 0,2 % NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4 oraz inhibitor proteaz). Uwaga: NaF, Na3VO4 oraz inhibitory proteaz należy dodać bezpośrednio przed użyciem. Pipetować 10 razy w górę i w dół, a następnie pozostawić na 5 minut w lodzie. Przeciągać przez strzykawkę z tępą igłą 5-10 razy, a następnie ponownie pozostawić na 5 minut w lodzie. Powtórzyć przeciąganie przez strzykawkę i pozostawić na kolejne 5 minut w lodzie.</li>
	<li>Przeprowadzić dwukrotny cykl zamrażania i rozmrażania lizatu (ciekły N2 / lub suchy lód i etanol). Nie dopuścić do ogrzania próbki powyżej 4°C. Uwaga: próbkę tę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu rozpoczęcia dalszej obróbki.</li>
	<li>Rozdzielić próbkę do probówek 1,5 ml i usunąć niezlizowane komórki oraz debris poprzez wirowanie (10 minut w 4°C, 16,000X g). </li>
	<li>Zebrać supernatant, połączyć go w probówce Falcon o pojemności 15 ml i (opcjonalnie) przefiltrować przez filtr 0,45 μm przed pobraniem próbki 20 μl do kwantyfikacji wydajności białka. Pobrać kolejną alikwot 50 μl do dalszej analizy (Próbka 1).</li>
</ol>
3. Wiązanie do agarozy z królika IgG
(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce z chłodnicą w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)
<ol>
	<li>Delikatnie resuspender roztwór IgG-agarosy króliczej (Sigma-Aldrich), obracając butelkę. Pobrać 380 μl IgG-agarosy (używając przyciętego końcówki do pipety 1 ml) i usunąć roztwór transportowy/konserwujący poprzez odwirowanie przez 1 minutę. Przemyć agarozę trzykrotnie w schłodzonym buforze lizującym (4°C), wykorzystując wirowanie w celu oczyszczenia. Końcowa ilość agarozy powinna wynosić około 250 μl spakowanych kulek.</li>
	<li>Dodać oczyszczony lizat komórkowy z punktu 2.6 (w probówce typu falcon 15 ml) do przemytej agarosy IgG króliczej i inkubować przez 3 godziny (lub przez noc) w temperaturze 4°C przy użyciu mieszadła obrotowego.</li>
	<li>Odwirować kulki agarozowe przez 5 minut w temperaturze 4°C i zebrać nadsącz do późniejszej analizy (Próbka 2). Uwaga: Białko z tagiem TAP powinno być teraz związane z kulkami.</li>
</ol>
4. Cięcie proteazą TEV
(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4oC przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)
<ol>
	<li>Trzykrotnie przemyj koraliki agarozowe z królika IgG w schłodzonym buforze lizującym (4°C), stosując wirowanie w celu sklarowania (uwaga: bufor lizujący nie powinien zawierać inhibitorów proteaz). Należy zachować ostrożność, aby nie usunąć ani nie zgubić koralików podczas etapów płukania.</li>
	<li>Koraliki przemyj dodatkowo dwukrotnie buforem do trawienia proteazą TEV (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl oraz 0.2 % NP-40), stosując wirowanie w celu sklarowania. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały płyn z koralików.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę do trawienia proteazą TEV; dla każdej próbki dodaj 467.5 μl H2O, 25 μl 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT oraz 2.5 μl (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Dodaj 500 μl tej mieszaniny do każdej próbki upakowanych koralików i przenieś całą zawiesinę do probówki 1.7 ml z warstwą poślizgową (Costar). Przed inkubacją pobierz aلیکwot 30 μl do późniejszej analizy (Próbka 3).</li>
	<li>Inkubuj reakcję z proteazą TEV przez noc w temperaturze 4°C, korzystając z miksera obrotowego. Należy pamiętać, że w zależności od natury białka przynęty i dostępności miejsca cięcia proteazy TEV można zastosować krótszy czas inkubacji, jednak minimalny czas inkubacji powinien zostać wyznaczony empirycznie.</li>
</ol>
5. Wiązanie do kulek Ultralink Immobilized Streptavidin Plus
(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że wskazano inaczej)
<ol>
	<li>Odwiruj mieszaninę reakcji cięcia TEV zawierającą paciorki agarozowe z przeciwciałem rabbit IgG przez 5 minut przy 1200X g (4°C). Pobierz 20 μl alikwotu oczyszczonego supernatantu do analizy (Próbka 4)</li>
	<li>Przenieś pozostały supernatant (około 480 μl) do nowej, nasmarowanej probówki 1,5 ml (Costar) i pozostaw na lodzie. Nie wylewaj tego supernatantu – zawiera on białko przynęty cięte przez TEV oraz wszelkie powiązane białka wiążące.</li>
	<li>Dodaj 500 μl schłodzonego buforu do lizy (Sekcja 2.3) do pozostałych paciorków agarozowych z rabbit IgG i resuspenduj. Odwiruj tę mieszaninę, aby oczyścić paciorki, a następnie usuń supernatant i połącz go z supernatantem z kroku 5.2. Pozostaw tę probówkę na lodzie (powinna teraz zawierać ~980 μl próbki).</li>
	<li>Zachowaj paciorki agarozowe z rabbit IgG do późniejszej analizy (Próbka 5). Uwaga: jeśli ta próbka zostanie poddana elektroforezie SDS-PAGE (lub western blotowi), pojawi się dużo tła ze względu na obecność ciężkich i lekkich łańcuchów IgG.</li>
	<li>W międzyczasie delikatnie zresuspenduj paciorki agarozowe Ultralink Immobilized Streptavidin Plus (Pierce), obracając butelką. Używając końcówki do pipety 200 μl z odciętym końcem, odmierz 70 μl paciorków streptawidynowych na próbkę do nasmarowanych probówek 1,5 ml i usuń roztwór transportowy/konserwujący poprzez wirowanie. Uwaga: paciorki te są bardzo małe, dlatego można użyć końcówek „dziubastych” lub płaskich/wąskich, aby zminimalizować stratę paciorków podczas płukania.</li>
	<li>Trzykrotnie przemyj paciorki streptawidynowe schłodzonym buforem do lizy (4°C), stosując wirowanie w celu oczyszczenia. W każdej probówce powinno pozostać około 45-50 μl upakowanych paciorków.</li>
	<li>Przenieś supernatant po cięciu proteazą TEV (tj. 980 μl próbki z kroku 5.3) do probówki zawierającej przemyte paciorki streptawidynowe i inkubuj przez 3 godziny (lub przez noc) w 4°C, używając mieszadła obrotowego.</li>
	<li>Odwiruj paciorki streptawidynowe przez 5 minut w 4°C i usuń supernatant do późniejszej analizy (Próbka 6). Trzykrotnie przemyj paciorki streptawidynowe schłodzonym buforem do lizy (4°C), stosując wirowanie w celu oczyszczenia. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń cały pozostały bufor do płukania.</li>
</ol>
6. Elucja biotynowa peptydu wiążącego streptawidynę i białka przynęty
(Uwaga: Wszystkie wirowania należy przeprowadzać przy 1200X g w wirówce chłodzącej w temperaturze 4°C przez 1 minutę, chyba że zaznaczono inaczej)
<ol>
	<li>Eluuj białka z znacznikiem z kulek streptawidynowych, dodając 500 μl PBS:Biotyny (1 mM D-biotyny) i inkubując w 4°C przez 3 godziny (lub przez noc) przy użyciu miksera rotacyjnego.</li>
	<li>Odwiruj kulki streptawidynowe przez 5 minut w 4°C i przenieś supernatant do wcześniej nasmarowanej probówki 1,5 ml (Uwaga: jest to końcowa próbka/elucja (Próbka 7)).</li>
	<li>Dodaj kolejne 500 μl Biotyny:PBS do pozostałych kulek streptawidynowych i inkubuj w 4°C przez 2-3 godziny (lub przez noc) przy użyciu miksera rotacyjnego.</li>
	<li>Powtórz krok 6.2 i połącz obie elucje (Próbka 7). Tę końcową elucję można przechowywać w -80°C.</li>
	<li>Aby ocenić wydajność elucji biotyną, zamroź pozostałe kulki streptawidynowe, a następnie zagotuj je w buforze do próbek SDS (Próbka 8) (rekomendacja: LaneMarker 5x reducing sample buffer od Fisher).</li>
</ol>
7. Stężenie białka
<ol>
	<li>Końcowy eluat (Próbka 7) musi zostać skoncentrowany przed analizą ze względu na niskie stężenie białek i stosunkowo dużą objętość. Można to osiągnąć, używając kolumn wirówkowych Vivaspin o niskiej masie cząsteczkowej (&lt;5 KDa) (Vivascience). Należy dążyć do skoncentrowania objętości do mniej niż 100 μl. Taka końcowa próbka może zostać podgrzana do wrzenia i przechowywana w buforze do próbek białkowych (zaleca się: LaneMarker 5x reducing sample buffer od Fisher).</li>
</ol>
8. Analiza
<ol>
	<li>Próbki 1-8 można analizować metodą western blot w celu określenia wydajności procesu pull down. Uwaga: Większość przeciwciał wtórnych wykazuje reaktywność krzyżową z domenami białka G białka fuzyjnego, jednak zostają one usunięte po trawieniu proteazą TEV.</li>
	<li>Próbkę 7 można analizować za pomocą 1D lub 2D SDS-PAGE. Barwienie można przeprowadzić metodą srebrową lub Coomassie (zalecane zestawy: SilverQuest Silver staining oraz Colloidal Blue Coomassie staining od firmy Invitrogen). Identyfikację białek można przeprowadzić za pomocą spektrometrii mas.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy 1D SDS-PAGE końcowego eluatu (Próbka 7) z niniejszego protokołu w celu identyfikacji partnerów wiążących eIF4E znakowany TAP przedstawiono na Ryc. 2. Ten reprezentatywny żel odzwierciedla złożony i liczny charakter oddziaływań eIF4E z innymi białkami w komórce. Porównanie z kontrolą negatywną, również pokazaną na Ryc. 2, wygenerowaną z linii komórkowej wykazującej jedynie znacznik TAP, ilustruje specyficzność tego procesu pull-down z użyciem przynęty eIF4E. W tym przypadku 15% skoncentrowanego końcowego eluatu (Próbka 7) poddano analizie 1D SDS-PAGE przy użyciu dostępnych komercyjnie gotowych żeli gradientowych, a następnie barwiono zestawem do barwienia srebrem Silverquest firmy Invitrogen.
Zazwyczaj od 50 do 85% pozostałego stężonego eluatu końcowego (Próbka 7) analizuje się za pomocą barwienia Colloidal Coomassie (Invitrogen). Próbki (wycinki żelu/prążki) z całej ścieżki zostały następnie wyekstrahowane i poddane analizie metodą spektrometrii mas.
Białka zidentyfikowane w wyniku immunoprecypitacji eIF4E przefiltrowano poprzez odrzucenie partnerów wiążących występujących w kontroli negatywnej, aby wyeliminować niespecyficzne oddziaływania. Końcowy zestaw białek zidentyfikowanych za pomocą tej metody znacznikowania TAP białka eIF4E przedstawiono na Rysunku 2, który jest reprezentatywny dla białek wykrytych tą techniką. Dodatkowo zidentyfikowano również szereg podjednostek eIF3 (dane nie zostały przedstawione).
<img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="Schemat oczyszczania TAP: transfekcja HEK293, liza komórek, wiązanie IgG, cięcie TEV, wiązanie streptawidyny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat procedury tandemowego oczyszczania powinowactwem. Sześciostopniowy protokół tandemowego oczyszczania powinowactwem (TAP) obejmuje generowanie linii komórkowej, lizę komórek, immunoprecypitację przy użyciu agarozy z IgG królika, cięcie proteazą TEV, oczyszczanie powinowactwem przy użyciu kulek ze streptawidyną i na koniec elucję biotyny.
<img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="Schemat żelu SDS-PAGE przedstawiający prążki białkowe, analiza kompleksu TAP-eIF4E, markery masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Tandemowa puryfikacja powinowactwa białka eIF4E myszy. Partnerzy oddziałujący z eIF4E z tagiem TAP na końcu N-końcowym zostali oczyszczeni z eukariotycznych komórek HEK293 zgodnie z załączonym protokołem. Frakcję 20% końcowego eluatu (Próbka 7) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE na gotowym żelu gradientowym 4-12% (ścieżka TAP-eIF4E). Analogiczna analiza została przeprowadzona dla samego tagu (ścieżka TAP). Białka zidentyfikowano za pomocą barwienia srebrem. Białka zidentyfikowane następnie metodą spektrometrii mas z tej samej próbki zostały wyróżnione na tym żelu. 
Skróty: eIF4G; eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 gamma, PABP; białko wiążące poliA, eIF4A: eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4 alfa, SBP-eIF4e; pozostałe białko przynęty TAP zawierające peptyd wiążący streptawidynę połączony z eukariotycznym czynnikiem inicjacji translacji 4E, 4EBPs; eukariotyczne białka wiążące czynnik inicjacji translacji 4E, eIF4eNiF1l eukariotyczny czynnik importu jądrowego czynnika inicjacji translacji 4E 1, SBP; pozostały peptyd wiążący streptawidynę z peptydu TAP po odcięciu przez TEV.

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li>
<li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein%2C+NAP1%2C+affects+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li>
<li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li>
<li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep%2FFLAG+%28SF%29-TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li>
<li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP%2FUSP7%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li>
<li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li>
<li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factor+4E%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj technika znakowania TAP demonstruje wysoce specyficzną i rygorystyczną metodę izolacji partnerów wiążących białka przynęty w komórkach eukariotycznych. Podejście to można zastosować zarówno do białek komórkowych, jak i wirusowych. Z naszej wiedzy wynika, że jest to pierwszy przypadek zastosowania takiej techniki w odniesieniu do czynnika inicjacji translacji eIF4E. Identyfikacja znanych białek wiążących eIF4E, takich jak eIF4G i 4EBPs, przy użyciu tej techniki potwierdza zasadność takiego podejścia. Dodatkowo, identyfikacja pozostałego składnika kompleksu eIF4F, a mianowicie eIF4A, oraz PABP potwierdza, że oddziaływania pośrednie i kompleksy trzeciorzędowe pozostają nienaruszone podczas procesu oczyszczania. Wyraźna była również identyfikacja wielu izoform kanonicznych białek wiążących eIF4e. Są one opisane bardziej szczegółowo na Rysunku 2.
W odniesieniu do ograniczeń tej metody, należy zachować ostrożność przy wyborze białka przynęty oraz decyzji o umieszczeniu znacznika TAG na terminusie N- lub C-. Przed pełnoskalową puryfikacją zaleca się przeprowadzenie testu funkcjonalnego lub zbadanie lokalizacji białka fuzyjnego za pomocą mikroskopii, aby upewnić się, że pochodna z znacznikiem jest funkcjonalna. Białka błonowe lub jądrowe mogą nie zostać uwolnione w stosunkowo łagodnych warunkach detergentowych opisanych w etapie lizy. Podobnie jak w przypadku wszystkich immunoprecypitacji i podobnych testów pull-down, można modyfikować rodzaj i stężenie detergentu w buforze do lizy w celu zwiększenia wydajności lizy. Można również zmodyfikować stężenie jonowe buforów do lizy i płukania, aby zwiększyć lub zmniejszyć rygorystyczność puryfikacji. Istnieje również możliwość przeprowadzenia wstępnej puryfikacji w standardowych, łagodnych warunkach (opisanych powyżej), a następnie podzielenia kulek z streptawidyną (sekcja 5.8) na 4-5 aliquotów, które mogą być następnie płukane w coraz silniejszych warunkach jonowych. Może to pozwolić użytkownikowi na zidentyfikowanie optymalnych warunków usuwających niespecyficznie oddziałujące białka. Cały proces można również przeprowadzić z wykorzystaniem transfekcji przejściowej, gdy partnerzy oddziałujące są znani, a ich obecność lub brak jest określana wyłącznie za pomocą późniejszego western blotu. W takim przypadku sugerujemy użycie dwóch szalek z komórkami o powierzchni 100cm2, z których każda zostanie transfektowana 8 μg plazmidu ekspresyjnego. Ta zmodyfikowana procedura jest szczególnie użyteczna przy badaniu zdolności pochodnych mutantów białka fuzyjnego TAP do oddziaływania ze znanymi partnerami wiążącymi.
Analiza próbek od 1 do 8 na żelach SDS-PAGE barwionych srebrem (lub metodą western blot, jeśli dostępny jest odpowiedni przeciwciało) stanowi doskonały sposób na rozwiązywanie problemów w przypadku, gdy technika ta nie przynosi zadowalających wyników. Wykorzystując to systematyczne podejście do pobierania próbek, można przeanalizować wydajność każdej precypitacji opartej na powinowactwie oraz specyficznej elucji. Próbki od pierwszej do ósmej należy pobierać podczas optymalizacji protokołu dla każdej nowej przynęty.
Technika znakowania TAP stanowi potężną i niezawodną alternatywę dla innych podejść, takich jak metody pull-down z użyciem GST, testy drożdżowego systemu dwuhybrydowego itp. Etapy podwójnego oczyszczania powinowactwa oraz specyficznej elucji (cięcie TEV i elucja biotynowa) zapewniają wysoką specyficzność i rygorystyczność, które są utrzymywane przez cały proces oczyszczania. Co kluczowe, technikę tę można zastosować do dowolnego białka, co czyni ją doskonałą metodą identyfikacji partnerów wiążących dla interesującego badacza białka docelowego.

<table><tbody><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Roche Group</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z IgG królika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2909</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza AC-TEV</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Kulkowe nośniki Ultralink Immobilized Streptavidin Plus</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53116</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator wirówkowy Vivaspin 500 (5KDa)</td><td>Vivaspin</td><td>V50112</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebrem SilverQuest</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Coomassie Novex Colloidal Blue</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>Probówki smarowane 1,7 ml</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet mikrokapilarnych</td><td>VWR international</td><td>37001-150</td><td></td></tr><tr><td>Gradientowe żele NuPage 4-12% Bis-Tris</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>CdCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor do próbek SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>PN39000</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Kluczowym i często ograniczającym etapem w zrozumieniu funkcji białek gospodarza i wirusa jest identyfikacja oddziałujących z nimi komórkowych lub wirusowych partnerów białkowych. Istnieje wiele podejść umożliwiających identyfikację partnerów oddziałujących, w tym system drożdżowych dwuhybryd oraz testy pull-down z użyciem białek rekombinowanych i immunoprecypitacja białek endogennych z następczą identyfikacją za pomocą spektrometrii mas1. Niedawne badania podkreśliły użyteczność oczyszczania za pośrednictwem podwójnych znaczników powinowactwa, połączonego z dwoma specyficznymi etapami elucji, w identyfikacji oddziałujących białek. Podejście to, nazwane tandemową puryfikacją powinowactwa (TAP), było początkowo stosowane u drożdży2,3, lecz w ostatnim czasie zostało zaadaptowane do zastosowań w komórkach ssaków4-8.
W ramach dowodu koncepcji opracowaliśmy metodę tandemowego oczyszczania powinowactwem (TAP) z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanego eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF4E9,10. Komórkowy czynnik translacji eIF4E jest kluczowym komponentem kompleksu eIF4F zaangażowanego w zależną od czapeczki inicjację translacji10. Zastosowany w niniejszym badaniu znacznik TAP składa się z dwóch jednostek Białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę, rozdzielonych sekwencją cięcia proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV). Zastosowany w niniejszym badaniu znacznik TAP składa się z dwóch jednostek Białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę, rozdzielonych sekwencją cięcia proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV)8. Aby uniknąć konieczności tworzenia klonalnych linii komórkowych, opracowaliśmy szybki system oparty na ekspresji białka przynęty z znacznikiem TAP z plazmidu utrzymywanego episomalnie na bazie pMEP4 (Invitrogen). Ekspresja znakowanego mysiego eIF4E z tego plazmidu była kontrolowana za pomocą indukowalnego chlorkiem kadmu promotora metalotioneiny.
Liza komórek ekspresyjnych, a następnie oczyszczanie powinowactwem poprzez wiązanie z agaroza z IgG królika, cięcie proteazą TEV, wiązanie z agarozą sprzężoną ze streptawidyną i następująca po tym elucja biotyną pozwoliły na zidentyfikowanie licznych białek, które wydawały się specyficzne dla pull-down eIF4E (w porównaniu do kontrolnych linii komórkowych ekspresujących sam znacznik TAP). Tożsamość białek ustalono poprzez wycięcie prążków z 1D SDS-PAGE i późniejszą tandemową spektrometrię mas. Zidentyfikowane komponenty obejmowały znane białka wiążące eIF4E: eIF4G oraz 4EBP-1. Ponadto zidentyfikowano inne komponenty kompleksu eIF4F, którego częścią jest eIF4E, a mianowicie eIF4A oraz białko wiążące Poly-A. Zdolność do identyfikacji nie tylko znanych bezpośrednich partnerów wiązania, ale także wtórnych białek oddziałujących, dodatkowo podkreśla użyteczność tego podejścia w charakteryzacji białek o nieznanej funkcji.

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Kluczowym i często ograniczającym etapem w zrozumieniu funkcji białek gospodarza i białek wirusowych jest identyfikacja oddziałujących ze sobą białek komórkowych lub wirusowych...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie metody znanej jako tandemowe oczyszczanie powinowactwa (Tandem affinity purification) do izolacji białek wiążących. Witajcie, jestem dLAN Bailey z sekcji wirusologii w Imperial College London. W naszym laboratorium badamy interakcje między wirusami a gospodarzami dla różnych przedstawicieli rodzin wirusów.Identyfikacja białek oddziałujących z innymi białkami komórkowymi lub wirusowymi stanowi doskonały punkt wyjścia do badania interakcji między wirusem a gospodarzem podczas infekcji. W tym filmie wyjaśnię jedną z metod stosowanych w naszym laboratorium: tandemową oczyszczanie białek, czyli tagowanie TAP. Tag TAP użyty w niniejszym badaniu to tag N-terminalny składający się z dwóch jednostek białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę.Są one oddzielone sekwencją cięcia proteazy TEV, która umożliwia specyficzne eluowanie białka przynęty. W tym przykładzie mysi EIF4E znajduje się na końcu C tego konstruktu fuzyjnego. Protokół znakowania TAP jest procedurą składającą się z sześciu kroków.Po transfekcji i wygenerowaniu linii komórkowych, komórki są indukowane do ekspresji białka z tagiem przed poddaniem ich działaniu łagodnego buforu lizującego. W celu oczyszczenia białka przynęci oraz wszelkich potencjalnych partnerów oddziałujących w celu wygenerowania linii komórkowych, stosuje się dwa etapy oczyszczania powinowactwa i dwa specyficzne roztwory. Komórki HEC 2 93 powinny zostać poddane transfekcji wektorem ekspresyjnym P met cztery.Komórki z białkiem przynęty z tagiem TAP są następnie selekcjonowane przy użyciu 100 µg/ml hygromycyny B. Ponieważ plazmid jest utrzymywany episomalnie, nie ma potrzeby izolowania konkretnych klonów. 10 konfluencyjnych kolb komórek poddaje się indukcji poprzez traktowanie 10 µM chlorkiem kadmu przez 16 godzin, a następnie komórki są zeskrobane do pożywki. Zawieszone komórki przenosi się następnie do probówek 15 ml, a komórki są pelletowane poprzez wirowanie.Komórki te są następnie płukane trzykrotnie lodowatym PBS, a na koniec poddawane wirowaniu w celu otrzymania osadu. Krok drugi: lizę komórek przeprowadza się w 5 ml zimnego buforu do lizy poprzez wielokrotne pipetowanie, po czym próbki pozostawia się na lodzie przez 5 minut. Aby zapewnić wydajną lizę, komórki są następnie przepuszczane przez strzykawkę z wąską, tępą igłą i poddawane cyklowi zamrażania i rozmrażania.Uzyskany lizat rozdzielono do probówek 1,5 ml, a następnie usunięto nieprzelyzowane komórki i zanieczyszczenia poprzez wirowanie. Należy zauważyć, że po tym etapie wirowania rozmiar osadu jest znacznie mniejszy. Nadnadkładami z lizatów połączono w probówce Falcon 15 ml i przepuszczono przez filtr 0,45 mikrometra w celu usunięcia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń.Należy pobrać 50 µL alikwoty tego lizatu do późniejszej analizy. Próbka ta jest określana jako próbka jeden. Krok trzeci, wiązanie z przeciwciałami anty-IgG królika.Na tym etapie protokołu znaczniki białka G są immunoprecypitowane za pomocą kulek agarozy z przeciwciałami króliczymi IgG. Aby nanieść kulki agarozy, należy odciąć końcówkę tipa. Pomaga to uniknąć uszkodzenia kulek.Delikatnie resuspenduj roztwór rabbit IgG aro, obracając butelkę, a następnie przenieś aros do probówki 15 ml. Przemyj aros trzykrotnie w schłodzonym buforze lizującym, stosując wirowanie z niską prędkością w celu oczyszczenia kulek na każdym etapie. Po odwirowaniu powinny być widoczne osady kulek rabbit IgG.Po każdym kroku ostrożnie usuń bufor, nie naruszając osadzenia kulek. Po zakończeniu ostatniego płukania dodaj przefiltrowany i sklarowany lizat do upakowanych kulek i inkubuj przez trzy godziny lub przez noc. Zaleca się prowadzenie inkubacji w temperaturze 4°C przy użyciu mieszadła rotacyjnego.Po immunoprecypitacji odwiruj kuleczki agarozy i pobierz nadsącz do późniejszej analizy. W razie potrzeby można użyć końcówki o małej średnicy, aby usunąć pozostałą ciecz z probówki. Nadsącz ten stanowi próbkę dwa krok cztery trawienie proteazą TEV.W tym kroku przynęta zostaje odcięta od znaczników białka G. Etap ten umożliwia specyficzne odcięcie białka przynęty, co w praktyce stanowi krok elucji z immunoprecypitacji przy użyciu IgG króliczego. Przygotować mieszaninę do trawienia TEV i dodać ją do kulek za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem, przenieść tę mieszaninę do silikonizowanej probówki do mikrowirówki i odwrócić, aby zawiesić kulki przed inkubacją przez noc w temperaturze 4°C, a następnie pobrać alikvot z tej reakcji trawienia TEV do analizy.To jest przykład trzeci. Inkubacja przez noc na mieszalniku rotacyjnym powinna pozwolić na niemal całkowite dobiegnięcie reakcji TEV. Krok piąty: wiązanie w celu unieruchomienia kulek z streptawidyną.W tym kroku przynęta Cleve oraz wszelkie potencjalne partnery wiążące są oczyszczane z roztworu metodą powinowactwa. W pierwszej kolejności odwiruj mieszaninę z reakcji cięcia TEV zawierającą kulki aros z IgG królika. Aby uzyskać osad z kulek aros, pobierz odpowiednią ilość klarownego supernatantu do analizy.To jest próbka czwarta. Ostrożnie przenieś cały pozostały nadsącz zawierający białko przynętę do nowej probówki. Ponownie użyj końcówki z wąskim otworem.Użyj końcówek z filtrem, aby usunąć cały możliwy nadsącz. Zachowaj kulki aros z przeciwciałami królika IgG do późniejszej analizy. Jest to próbka piąta.Aby zapobiec uszkodzeniu kulek strep adin, odetnij końcówkę z tipa do pipety. Delikatnie resuspenduj kulki i przenieś aliquot do probówki sylikonizowanej. Przemyj kulki strep having za pomocą buforu S, oczyszczając je poprzez wirowanie z niską prędkością.Po każdym praniu. Po każdym praniu ostrożnie usuń bufor. Kulki streptavidynowe są bardzo małe i mogą zostać łatwo przemieszczone, nawet przy użyciu precyzyjnych narzędzi.Przygotowanie próbek. Po przemyciu kulek strept adin dodaj nadsącz z reakcji cięcia TEV do tych kulek i inkubuj reakcję przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C, używając mieszadła obrotowego.Po inkubacji odwiruj próbkę, aby osadzić kulki streptawidyna-haewina, a następnie usuń nadsącz. Jest to próbka szósta. Do odnotowania.Białko przynęta jest teraz związane z pozostałymi kuleczkami w probówce. Przemyj kuleczki streptawidynowe zawierające białko przynętę buforem do lizy. Aby usunąć wszelkie dodatkowe zanieczyszczające białka, odlej pozostały roztwór piorący z kuleczek i pozostaw je na lodzie.Krok szósty, elucja biotyną. Na tym etapie do kulek z streptawidyną dodaje się biotynę. Oddziaływanie między biotyną a kulkami z streptawidyną wypiera przynętę, która powraca do roztworu.Dodaj roztwór biotyny bezpośrednio do kulek i odwróć probówkę, aby wymieszać. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 4 °C przez trzy godziny lub przez noc, używając wirówki z funkcją mieszania rotacyjnego, a następnie ostrożnie przelej mieszaninę biotyny i aerozolu do nowej probówki. Jest to końcowy EIT, określany jako próbka siedem.Pozostałe koraliki strept havein stanowią próbkę ósmą. Ze względu na niskie stężenie białka, ten końcowy eluat musi zostać zagęszczony przed analizą. Osiąga się to przy użyciu kolumn wirowych z niskim odcięciem masy cząsteczkowej, redukując objętość poprzez wirowanie i regularnie monitorując ten proces.Tę skoncentrowaną próbkę można podzielić i przeanalizować na żelach SDS-PAGE za pomocą barwienia kumasylem lub srebrem. Jeśli próbki mają być analizowane za pomocą spektrometrii mas, zalecamy stosowanie gotowych żeli komercyjnych. Następnie można wyciąć poszczególne prążki i zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas.W tym przypadku przynętą była mysia przeciwciała EIF przeciwko białku E. Zaletą systemu TAP jest możliwość ekspresji białka zainteresowania w konkretnej linii komórkowej, a w zależności od wybranej linii, system ten pozwala również na ekspresję białka na stosunkowo niskim poziomie, jeśli tak zdecydujesz. Ponieważ wszystkie modyfikacje potranslacyjne oraz lokalizacja zostają zachowane, często można w ten sposób oczyścić natywny kompleks.

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja partnerów oddziaływujących z białkami za pomocą tandemowej czystości powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Drosophila słynie z potężnej manipulacji genetycznej, ale nie z przydatności do dogłębnej analizy biochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy procedurę opartą na TAP, która ma na celu identyfikację oddziałujących partnerów dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu muchy. Procedura ta może potencjalnie prowadzić do powstania nowych kierunków badań.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Poznaj metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa do izolacji partnerów oddziałujących z białkami eIF4E. Technika TAP umożliwia identyfikację kompleksów białkowych w badaniach interakcji wirus-gospodarz.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów