Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie metody znanej jako tandemowe oczyszczanie powinowactwa w celu wyizolowania białkowych partnerów wiązania. Dzień dobry, nazywam się dLAN Bailey z sekcji wirusologii w Imperial College London. W naszym laboratorium badamy interakcje wirus-gospodarz dla różnych przedstawicieli rodzin wirusów.

Identyfikacja białek oddziałujących z innymi białkami komórkowymi lub wirusowymi stanowi doskonały punkt wyjścia do badania wzajemnych zależności między wirusem a jego gospodarzem podczas infekcji. W tym filmie wyjaśnię jedno z podejść stosowanych w naszym laboratorium – tandemową oczyszczanie białek, czyli tagowanie TAP. Tag TAP wykorzystany w tym badaniu to tag N-końcowy składający się z dwóch jednostek białka G oraz peptydu wiążącego streptawidynę.

Są one rozdzielone sekwencją cięcia proteazy TEV, która umożliwia specyficzną elucję białka przynęty. W tym przykładzie mysi EIF4E znajduje się na C-końcu tej konstrukcji fuzyjnej. Protokół znakowania TAP jest procedurą składającą się z sześciu kroków.

Po transfekcji i wygenerowaniu linii komórkowych, indukuje się ekspresję białka z tagiem przed poddaniem komórek lizie w łagodnym buforze lizującym. W celu oczyszczenia białka przynęty oraz wszelkich potencjalnych partnerów oddziaływań stosuje się dwa etapy oczyszczania powinowactwa i dwa specyficzne roztwory. Komórki HEK 293 należy transfekować wektorem ekspresyjnym P met four.

Komórki z białkiem przynęty znakowanym tagiem TAP są następnie selekcjonowane za pomocą 100 µg/ml higromycyny B. Ponieważ plazmid jest utrzymywany episomalnie, nie ma potrzeby izolowania konkretnych klonów. 10 konfluencyjnych kolb komórek jest indukowanych poprzez traktowanie 10 µM chlorkiem kadmu przez 16 godzin, a następnie komórki są zeskrobane do medium. Zawiesinę komórkową przenosi się następnie do probówek 15 mL, a komórki są pelletowane przez wirowanie.

Komórki te są następnie przemywane trzykrotnie lodowatym PBS, a na koniec wirowane w celu otrzymania osadu. Krok drugi: lizę komórek przeprowadza się w 5 ml zimnego buforu do lizy poprzez wielokrotne pipetowanie, po czym próbki pozostawia się w lodzie na pięć minut. Aby zapewnić wydajną lizę, komórki są następnie przepuszczane przez strzykawkę z wąską, tępą igłą, a następnie poddawane cyklowi zamrażania i rozmrażania.

Otrzymany lizat przenosi się do probówek o pojemności 1,5 ml, a niezlizowane komórki oraz resztki usuwa poprzez wirowanie. Należy zauważyć, że po tym etapie wirowania rozmiar osadu jest znacznie zredukowany. Następnie nadsączniki z lizatów łączy się w probówce typu Falcon o pojemności 15 ml i przepuszcza przez filtr o wielkości porów 0,45 µm w celu usunięcia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń.

Należy pobrać 50 µL aliquoty tego lizatu do dalszej analizy. Próbkę tę określa się jako próbka pierwsza. Krok trzeci, wiązanie z rabbit IgG Aeros.

Na tym etapie protokołu znaczniki białka G są immunoprecypitowane przy użyciu kulek agarozy z IgG królika. Aby pobrać kulki agarozy, odetnij końcówkę tipa. Pomaga to uniknąć uszkodzenia kulek.

Należy delikatnie resuspender roztwór kulek z przeciwciałami królika IgG, obracając butelkę, a następnie przenieść kuleczki do probówki 15 ml. Kuleczki należy przemyć trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy, stosując wirowanie z niską prędkością w celu oczyszczenia kuleczek na każdym etapie. Po wirowaniu osad kuleczek z przeciwciałami królika IgG powinien być widoczny.

Po każdym etapie ostrożnie usuń bufor, aby nie naruszyć osadu kulek. Po zakończeniu ostatniego przemywania dodaj przefiltrowany i sklarowany lizat do upakowanych kulek i inkubuj przez trzy godziny lub przez noc. Zaleca się prowadzenie inkubacji w temperaturze 4 °C przy użyciu mieszadła obrotowego.

Po immunoprecypitacji odwiruj kulki agarozy i usuń nadsącz do późniejszej analizy. W razie potrzeby można użyć cienkiej końcówki do pipety, aby usunąć pozostały w probówce płyn. Nadsącz ten stanowi próbkę dwa, krok cztery: cięcie proteazą TEV.

W tym kroku przynęta zostaje odcięta od znaczników białka G. Krok ten umożliwia specyficzne odcięcie białka przynęty, co w praktyce stanowi etap elucji z immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał IgG królika. Przygotować mieszaninę do cięcia TEV i dodać ją do kulek za pomocą końcówki do pipety z odciętym końcem, następnie przenieść tę mieszaninę do silikonizowanej probówki do mikrowirówki i odwrócić, aby zawiesić kulki przed inkubacją nocną w temperaturze 4 °C. Pobrać alikwot tej reakcji cięcia TEV do analizy.

To jest próbka trzecia. Inkubacja nocna na mieszalniku obrotowym powinna pozwolić na niemal całkowity przebieg reakcji TEV. Krok piąty, wiązanie w celu unieruchomienia na kulkach streptawidynowych.

W tym kroku przynęta Cleve oraz wszelkie potencjalne partnerzy wiążący są oczyszczane z roztworu metodą powinowactwa. Najpierw odwiruj reakcję cięcia TEV zawierającą kulki aros z królika IgG. Aby uzyskać osad z kulek aros, pobierz OTT klarownego naddatku do analizy.

To jest próbka czwarta. Ostrożnie przenieś cały pozostały nadsącz, zawierający białko przynętę, do nowej probówki. Ponownie użyj końcówki o małej średnicy.

Użyj końcówek z filtrem (tzw. pipette tips), aby usunąć cały możliwy nadsącz. Zachowaj kulki agarozowe z przeciwciałami IgG królika do późniejszych analiz. Jest to próbka piąta.

Aby zapobiec uszkodzeniu kulek strep adin, odetnij końcówkę z końcówki do pipety. Delikatnie resuspenduj kulki i przenieś aliquot do probówki zylikonizowanej. Przemyj kulki strep za pomocą buforu S, klarując zawiesinę poprzez wirowanie z niską prędkością.

Po każdym myciu. Po każdym myciu ostrożnie usuń bufor. Kulki streptawidynowe są bardzo małe i mogą zostać łatwo przemieszczone, nawet przy użyciu precyzyjnych narzędzi.

Przygotowanie koralików streptawidynowych. Po przemyciu koralików streptawidynowych, dodać nadsącz z reakcji cięcia TEV do koralików i inkubować mieszaninę przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C, używając mieszadła rotacyjnego.

Po inkubacji odwirować kuleczki streptawidyna-haween i usunąć nadsącz. Jest to próbka sześć. Do odnotowania.

Białko przynęta jest teraz związane z pozostałymi kuleczkami w probówce. Przemyj kuleczki streptawidyny zawierające białko przynętę buforem do lizy. Aby usunąć wszelkie dodatkowe zanieczyszczające białka, odlej pozostały roztwór piorący z kuleczek i pozostaw je w lodzie.

Krok szósty, elucja biotyną. Na tym etapie do kuleczek streptawidyny dodaje się biotynę. Oddziaływanie biotyny z kuleczkami streptawidyny wypiera przynętę, która powraca do roztworu.

Dodaj roztwór biotyny bezpośrednio do kulek i wymieszaj poprzez odwracanie probówki. Inkubuj reakcję w temperaturze four degrees C przez trzy godziny lub przez noc, używając wirówki z mieszadłem obrotowym, mieszanina biotyny i aerozolu, a następnie ostrożnie przelej mieszaninę do nowej probówki. Jest to końcowy EIT określany jako próbka siedem.

Pozostałe kulki strept havein stanowią próbkę ósmą. Ze względu na niskie stężenie białka, ten końcowy eluat musi zostać zagęszczony przed analizą. Osiąga się to przy użyciu kolumienek wirówkowych z niskim progiem odcięcia masy cząsteczkowej, redukując objętość poprzez wirowanie i regularnie monitorując ten proces.

Tę skoncentrowaną próbkę można podzielić i przeanalizować na żelach SDS-PAGE za pomocą barwienia kumasy oraz barwienia srebrem. Jeśli próbki mają być analizowane metodą spektrometrii mas, zalecamy stosowanie gotowych żeli komercyjnych. Następnie można wyciąć poszczególne prążki i zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas.

W tym przypadku przynętą było białko mysie, EIF dla białka E. Zaletą systemu TAP jest możliwość ekspresji badanego białka w określonej linii komórkowej, a w zależności od wybranej linii, system ten pozwala również na ekspresję białka na stosunkowo niskim poziomie, jeśli tak zostanie to zaplanowane, przy zachowaniu wszystkich modyfikacji potranslacyjnych i lokalizacji, co często umożliwia oczyszczenie natywnego kompleksu.