Identyfikacja partnerów oddziałujących z białkami za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie metody znanej jako oczyszczanie powinowactwa w tandemie w celu wyizolowania partnerów wiążących białka. Cześć, nazywam się dLAN Bailey i pracuję na wydziale wirusologii w Imperial College London. W naszym laboratorium pracujemy nad interakcjami między różnymi członkami rodziny wirusów.

Identyfikacja białek, które oddziałują z innymi białkami komórkowymi lub wirusowymi, jest doskonałym punktem wyjścia do zbadania interakcji między wirusem a jego gospodarzem podczas infekcji. W tym filmie wyjaśnię jedno z podejść, które stosujemy w naszym laboratorium, oczyszczanie tandemowe i elektryczne lub tagowanie kranem. Znacznik Tap użyty w tym badaniu to znacznik końcowy N składający się z dwóch jednostek białka G i peptydu wiążącego paciorkowiec adin.

Są one oddzielone sekwencją rozszczepienia proteazy TEV, która umożliwia specyficzną elucję białka przynęty. W tym przykładzie, myszy, EIF cztery E znajduje się na końcu C tej konstrukcji fuzji. Protokół tagowania kranu to sześcioetapowa procedura.

Po transfekcji i wytworzeniu linii komórkowych komórki są indukowane do ekspresji białka abate tagu, zanim znajdą się w łagodnym buforze do lizy. Dwa etapy oczyszczania powinowactwa i dwa specyficzne roztwory są stosowane do oczyszczania przynęty i wszelkich potencjalnych oddziałujących partnerów w celu wytworzenia linii komórkowych. Komórki HEC 2 93 należy transfekować kodowaniem wektora ekspresji P met four.

Komórki białkowe przynęty znakowane stuknięciem są następnie selekcjonowane za pomocą stu mikrogramów na promil higromycyny B. Ponieważ plazmid jest utrzymywany w episo, nie ma potrzeby izolowania określonych klonów. 10 zlewających się flasów komórek indukuje się przez traktowanie 10 mikromolowym chlorkiem kadyny przez 16 godzin przed zeskrobaniem do pożywki. Zawieszone komórki są następnie przenoszone do probówek 15 M, a komórki granulowane przez wirowanie.

Komórki te są następnie trzykrotnie przemywane lodowatym PBS, zanim zostaną ostatecznie granulowane. Krok drugi komórek komórek polega na tym, że znajdują się w pięciu mililitrach zimnego buforu do lizy przez wielokrotne pipetowanie przed pozostawieniem na lodzie na pięć minut. Aby zapewnić wydajną lizę, komórki są następnie wstrzykiwane przez wąskotorową, igłę i zamrażane przez rozmrożenie.

Powstały stan umieszcza się w probówkach o średnicy 1,5 mililitra, a unli komórki i zanieczyszczenia są usuwane przez wirowanie. Warto zauważyć, że rozmiar granulek jest znacznie zmniejszony po tym etapie wirowania. Supernatanty lizatu są następnie łączone w probówce Falcon o średnicy 15 mil i przepuszczane przez filtr o średnicy 0,45 mikrometra w celu usunięcia wszelkich dodatkowych zanieczyszczeń.

Do późniejszej analizy należy pobrać 50 mikrolitrowych podwielokrotności tego lizatu. Ta próbka jest określana jako próbka pierwsza. Krok trzeci, wiązanie z królikiem IgG Aeros.

Na tym etapie protokołu znaczniki białka G są immunoprecypitowane przez królicze IgG aros. Aby przydzielić koraliki aros, usuń koniec końcówki małpy. Pomaga to uniknąć uszkodzenia koralików.

Delikatnie ponownie zawiesić roztwór króliczej IgG aro, obracając butelką przed wyjęciem aros do probówki o średnicy 15 mil. Przemyć aros trzykrotnie w schłodzonym buforze do lizy, używając wirowania na niskiej prędkości, aby sklarować kulki na każdym etapie. Granulowane kulki IgG królika powinny być widoczne po odwirowaniu.

Po każdym kroku ostrożnie wyjmij bufor, nie naruszając koralików. Po zakończeniu końcowego płukania dodaj przefiltrowany i sklarowany lizat do zapakowanych kulek i inkubuj przez trzy godziny lub noc. Preferował temperaturę czterech stopni C za pomocą miksera obrotowego.

Po immunoprecypitacji odwirować kulki agros i usunąć supernatant do późniejszej analizy. W razie potrzeby możesz użyć cienkiej końcówki, aby usunąć pozostały płyn z tej tuby. Ten supernatant to próbka drugiego stopnia czwartego rozszczepienia proteazy TEV.

Na tym etapie przynęta jest odcinana od znaczników białka G. Ten etap umożliwia specyficzne rozszczepienie białka przynęty, skutecznie etap elucji z immunoprecypitacji królików IgG aros. Przygotować mieszankę rozszczepienia TEV i dodać ją do kulek aros za pomocą końcówki małpy z usuniętym końcem, przenieść tę mieszaninę do silikonowanej mikroprobówki wirówkowej i odwrócić, aby wymieszać aros z zawiesiną przed nocną inkubacją w temperaturze czterech stopni C, usunąć alico tej reakcji rozszczepienia TEV do analizy.

To jest próbka trzecia. Nocna inkubacja w mieszalniku obrotowym powinna pozwolić na postęp reakcji TEV prawie do zakończenia. Krok piąty, wiązanie w celu unieruchomienia paciorkowców adin strept.

Na tym etapie przynęta Cleve i ewentualni partnerzy wiążący są oczyszczane z roztworu. Po pierwsze, odwiruj reakcję rozszczepienia TEV zawierającą kulki IgG aros królika. Aby zagnieździć aros, należy usunąć OTT oczyszczonego supernatantu do analizy.

To jest próbka czwarta. Ostrożnie usuń cały pozostały supernatant, który zawiera białko przynęty, do świeżej tuby. Ponownie, użyj dobrze.

Zbuduj końcówki peppe, aby usunąć cały możliwy supernatant. Zachowaj koraliki królika IgG aros do późniejszej analizy. To jest próbka piąta.

Aby zapobiec uszkodzeniu paciorkowcowych koralików adin, usuń koniec z końcówki zwierzaka. Delikatnie zawiesić koraliki i usunąć alico do silikonowanej tuby. Przemyć paciorkowca w kulkach buforem S, klarując przez odwirowanie na niskiej prędkości.

Po każdym praniu. Po każdym praniu ostrożnie wyjmij bufor. Koraliki Strept adin są bardzo małe i można je łatwo przemieścić, nawet przy użyciu drobnego.

Zbuduj wskazówki dla zwierząt. Po umyciu paciorków adin strept. Dodać supernatant z reakcji rozszczepienia TEV do tych kulek i inkubować reakcję przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze czterech stopni C, używając mieszalnika obrotowego.

Po inkubacji wirówka ma paciorkowce i usuwa sup natum. To jest próbka szósta. Warto zauważyć.

Białko Beit jest teraz powiązane z pozostałymi kulkami w probówce. Umyj kulki streptawidyny zawierające białko przynęty buforem do lizy. Aby usunąć wszelkie dodatkowe białka zanieczyszczające, usuń pozostały roztwór myjący z kulek i pozostaw je na lodzie.

Krok szósty, elucja biotyny. Na tym etapie biotyna jest dodawana do kulek streptawidyny. Interakcja między biotyną a kulkami streptawidyny przemieszcza przynętę, która wraca do roztworu.

Dodaj roztwór biotyny bezpośrednio do kulek i odwróć, aby wymieszać. Inkubować reakcję w temperaturze czterech stopni C przez trzy godziny lub przez noc za pomocą wirówki z mieszalnikiem obrotowym, mieszaniny aeros biotyny i ostrożnie zebrać mieszaninę do świeżej probówki. Jest to Państwa ostateczny EIT określany jako próbka siódma.

Pozostałe paciorki paciorkowca to próbka ósma. Ze względu na niskie stężenie białka, ten końcowy eluat musi zostać skoncentrowany przed analizą. Osiąga się to za pomocą niskich mas cząsteczkowych, odciętych kolumn wirowych, zmniejszenia objętości poprzez regularne wirowanie monitorujące proces.

Ta skoncentrowana próbka może być podzielona i przeanalizowana na żelach SDS Page firmy kumasi i srebrnej plamie. Jeśli próbki mają być analizowane według specyfikacji masy, zalecamy stosowanie prefabrykowanych żeli komercyjnych. Poszczególne prążki można następnie wyekstrahować, a białka zidentyfikować za pomocą specyfikacji masy.

W tym przypadku przynętą była mysza, EIF dla białka E. Zaletą systemu kranu jest to, że masz możliwość ekspresji interesującego Cię białka w określonej linii komórkowej, a w zależności od linii komórkowej, którą jesteś zainteresowany, daje to również możliwość wyrażania białka na stosunkowo niskich poziomach. Ty decydujesz się na to, a wszystkie modyfikacje potranslacyjne i lokalizacja są zachowywane, dzięki czemu często możesz oczyścić natywny kompleks.