Name: Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Odkryj metodę identyfikacji interakcji lek-peptyd przy użyciu biosensora QCM. Strategia obejmuje biopanning bibliotek fagowych T7 i analizę bioinformatyczną do walidacji miejsc wiązania leków na białkach docelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje doktorom Yujiro Hayashi i Hayato Ishikawie za dostarczenie oseltamiwiru, a także dr Lee Makowskiemu za udostępnienie samodzielnych programów RELIC. Autor dziękuje również Tetsuyi Kawagoe za pomoc techniczną w eksperymencie QCM. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
OŚWIADCZENIE O DOSTĘPNOŚCI DANYCH
Samodzielne programy RELIC oraz dane sekwencyjne wybranych peptydów o powinowactwie do leków, jak również sekwencje białek z bazy danych proteomu użyte w tym artykule, są dostępne u tego autora na żądanie (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).

UWAGA: Poniżej przedstawiono kroki do badania przesiewowego fagów T7 rozpoznających leki za pomocą biosensora QCM i odzyskiwania przesianych fagów poprzez zakażenie E. coli (BLT5615). Protokoły syntezy pochodnej małej cząsteczki, która tworzy samoorganizującą się monowarstwę (SAM) oraz budowy 15-merowej biblioteki losowych peptydów wyświetlanych przez fagi T7 można znaleźć gdzie indziej6,7.
1. Przygotowanie układu czujnika QCM
<ol>
	<li>Podłącz ceramiczny chip czujnika do oscylatora aparatu QCM 27 MHz i zarejestruj częstotliwość wewnętrzną (Hz) w fazie powietrznej przed unieruchomieniem małych cząsteczek.</li>
	<li>Odłącz chip i upuść 20 μl roztworu (1 mM w 70% etanolu) pochodnej małocząsteczkowej, która tworzy SAM, na złotą elektrodę chipa czujnika za pomocą pipety. 
	UWAGA: Kryształ chipa czujnika, w którym znajduje się złota elektroda (Au, grubość 0,1 mm, średnica wewnętrzna 2,5 mm, 4,9 mm2) jest niezwykle cienki i może łatwo pękać (SiO2, grubość 0,06 mm, średnica wewnętrzna 9 mm). Dlatego należy ostrożnie pipetować.</li>
	<li>Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (około 20 °C) na szalce Petriego z wilgotną chusteczką i osłoną przed światłem w pomieszczeniu.</li>
	<li>Delikatnie umyj powierzchnię elektrody ultraczystą wodą, a następnie usuń krople wody, przedmuchując powietrze strzykawką lub miotełką do kurzu.</li>
	<li>Skonfiguruj chip czujnika dla aparatu QCM i zarejestruj zmniejszenie częstotliwości w fazie powietrznej, aby zmierzyć ilość małej cząsteczki, która została unieruchomiona. 
	UWAGA: Co najmniej 100 Hz wewnętrznej częstotliwości jest niezbędne do udanego unieruchomienia małych cząsteczek (1 Hz unieruchamia 30 pg).</li>
</ol>
2. Biopanoramowanie biblioteki fagów T7 za pomocą biosensora QCM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Ustaw kuwetę z dedykowanym mieszadłem magnetycznym na biosensorze QCM i wlej 8 ml buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) do kuwety.</li>
	<li>Przymocuj układ czujnika QCM do oscylatora i pociągnij w dół ramię oscylatora, aby zanurzyć chip w mieszanym buforze z prędkością 1000 obr./min.</li>
	<li>Rozpocznij monitorowanie częstotliwości QCM na komputerze osobistym (PC) i poczekaj, aż sensorgram zrównoważy się do około 3 Hz/min dryftu częstotliwości.</li>
	<li>Wstrzyknąć 8 μl biblioteki fagów T7 (1-2 × 10pfu/ml) do kuwety (stężenie końcowe: 1-2 × 107 pfu/ml) i zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na czujniku.</li>
	<li>Monitoruj zmniejszenie częstotliwości spowodowane wiązaniem fagów T7 z małą cząsteczką unieruchomioną na powierzchni złotej elektrody przez 10 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj monitor częstotliwości QCM, wyjmij chip czujnika z oscylatora i usuń bufor, przedmuchując powietrze i/lub odprowadzając chusteczkami.</li>
	<li>Umieścić chip czujnika na wilgotnej szalce Petriego i wrzucić 20 μl zawiesiny E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5—1,0 po wstrząsaniu w temperaturze 37 °C przez dodanie IPTG do 1 mM) komórek gospodarza w fazie logarytmicznej na złotą elektrodę.</li>
	<li>Zamknij pokrywkę naczynia i przykryj ją folią aluminiową, aby zablokować światło.</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 30 minut na 96-dołkowym mieszalniku do mikropłytek (1000-1500 obr./min) w celu zwiększenia odzysku związanych fagów T7.</li>
	<li>Odzyskać 20 μl roztworu i zawiesić go w 200 μl pożywki LB. 
	UWAGA: Próbki otrzymane na tym etapie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.</li>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń roztworu faga do izolacji płytki nazębnej i sekwencjonowania DNA zgodnie z ogólną procedurą opisaną w instrukcjach producenta8,9.</li>
	<li>Przetrzyj powierzchnię złotej elektrody bawełnianym wacikiem nasączonym 1% roztworem dodecylosiarczanu sodu.</li>
	<li>Umyj złotą powierzchnię ultraczystą wodą z butelki do mycia, a następnie usuń krople wody, przedmuchując powietrze strzykawką lub miotełką do kurzu.</li>
	<li>Upuść 5 μl roztworu piranii (Conc. H2SO4: 30% H2O2 = 3:1) na powierzchnię złota i pozostaw na 5 minut.</li>
	<li>Ponownie umyj złotą powierzchnię wodą, a następnie wysusz, przedmuchując powietrze i/lub odprowadzając chusteczkami.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.14 i 2.15. 
	UWAGA: Roztwór piranii należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Używaj tego płynu ostrożnie, ponieważ jest to bardzo mocny kwas. Obróbka trwająca dłużej niż 5 minut powoduje erozję chipa czujnika.</li>
</ol>
3. Analiza bioinformatyczna przy użyciu zestawu programów Receptor Ligand Contact (RELIC) (Rysunek 2)10,11
<ol>
	<li>Rozpakuj samodzielny program RELIC na komputerze z systemem operacyjnym MS Windows.</li>
	<li>Dopasuj sekwencje aminokwasowe 15-merowych peptydów o powinowactwie wybranym za pomocą leku lub losowo wybranym z nieprzesiewowej biblioteki rodzicielskiej w każdym pliku w formacie tekstowym (name.txt).</li>
	<li>Wpisz sekwencję aminokwasową pojedynczego lub wielu białek w każdym pliku tekstowym w formacie FASTA lub pobierz pliki tekstowe bazy danych w formacie FASTA z dowolnej bazy danych białek (np. UniProt (http://www.uniprot.org/) lub DrugBank (https://www.drugbank.ca/).</li>
	<li>Umieść pliki tekstowe (i pliki PDB dla HETEROalign) w folderze niezbędnym do uruchomienia każdego programu RELIC.</li>
	<li>Kliknij plik wykonywalny (program.exe) dla plików AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon i FASTAskan w folderze niezależnym, aby otworzyć osobistą wersję FTN95.</li>
	<li>Wpisz odpowiednią nazwę pliku wraz z rozszerzeniem (name.txt) w komunikacie polecenia, aby uruchomić każdy program i uzyskać wymagany plik w formacie tekstowym.</li>
	<li>Wyeksportuj wynikowy plik tekstowy do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel), aby wygenerować wykres zawartości informacji (INFO) lub skumulowane wyniki podobieństwa obliczone za pomocą BLOSUM62 (DOPASUJ, HETEROalign). 
	UWAGA: Oryginalny serwer RELIC (http://relic.bio.anl.gov) nie jest już dostępny, a niektóre autonomiczne programy RELIC, które działają na komputerach z platformą Windows, można pobrać od odpowiedniego autora (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).</li>
</ol>

<ol><li>Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+map+of+molecular+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">A comprehensive map of molecular drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).</li>
<li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+for+small+bioactive+molecules%3A+finding+the+needle+in+the+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack.</a> Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).</li>
<li>Piggott, A. M., Karuso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+cellular+targets+of+natural+products+using+T7+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).</li>
<li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology+for+target+determination+of+small-molecule+therapeutics%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).</li>
<li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+phage+display+technology+for+the+determination+of+the+targets+for+small-molecule+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).</li>
<li>Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+QCM+Biosensor-Based+T7+Phage+Display+Combined+with+Bioinformatics+Analysis+for+Target+Identification+of+Bioactive+Small+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule.</a> Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).</li>
<li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+disordered+portion+of+the+Brz2001-binding+site+on+a+plant+monooxygenase%2C+DWARF4%2C+using+a+quartz-crystal+microbalance+biosensor-based+T7+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Devevelopment+Technologies%22%5BJournal%5D)">Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display.</a> ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).</li>
<li>Novagen. T7 Select® System Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen%22">Novagen</a>. , TB178 1009JN (2009).</li>
<li>Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen%22">Novagen</a>. , TB247 1109JN (2009).</li>
<li>Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELIC--a+bioinformatics+server+for+combinatorial+peptide+analysis+and+identification+of+protein-ligand+interaction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites.</a> Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).</li>
<li>Makowski, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMakowski%2C+L+%22Phage+Nanobiotechnology%22">Phage Nanobiotechnology</a>. Petrenko, V. A., Smith, G. P. , RSC Publishing. Ch. 3 33-54 (2011).</li>
<li>Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+on+the+clinical+experience%2C+pharmacology%2C+and+continued+development+of+the+camptothecins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).</li>
<li>Harel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+complex+of+the+anticancer+prodrug+7-ethyl-10-%5B4-%281-piperidino%29-1-piperidino%5D-carbonyloxycamptothecin+%28CPT-11%29+with+Torpedo+californica+acetylcholinesterase+provides+a+molecular+explanation+for+its+cholinergic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action.</a> Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).</li>
<li>Dodds, H. M., Rivory, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+the+inhibition+of+acetylcholinesterases+by+irinotecan+%28CPT-11%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11).</a> Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).</li>
<li>Bencharit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+CPT-11+activation+by+mammalian+carboxylesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases.</a> Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).</li>
<li>Kim, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+neuraminidase+inhibitors+possessing+a+novel+hydrophobic+interaction+in+the+enzyme+active+site%3A+design%2C+synthesis%2C+and+structural+analysis+of+carbocyclic+sialic+acid+analogues+with+potent+anti-influenza+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).</li>
<li>Hoffmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+pharmacokinetics+of+oseltamivir+and+oseltamivir+carboxylate+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DrugBank+5.0%3A+a+major+update+to+the+DrugBank+database+for+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).</li>
<li>Takakusagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+biopanning+of+T7+phage-displayed+peptides+reveals+angiomotin+as+a+potential+receptor+of+the+anti-angiogenic+macrolide+Roxithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).</li>
<li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-cycle+affinity+selection+of+binding+proteins+or+peptides+specific+for+a+small-molecule+using+a+T7+phage+display+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).</li>
<li>Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayer+%28SAM%29+of+small+organic+molecule+for+efficient+random-peptide+phage+display+selection+using+a+cuvette+type+quartz-crystal+micobalance+%28QCM%29+device%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Engineering%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device.</a> World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).</li>
<li>Kusayanagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+agent+doxorubicin+binds+to+Fanconi+anemia+group+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).</li>
<li>Takakusagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+C10+biotinylated+camptothecin+%28CPT-10-B%29+binding+peptides+using+T7+phage+display+screen+on+a+QCM+device%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).</li>
<li>Rodi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+molecule+binding+sites+within+proteins+using+phage+display+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym artykule przedstawiono strategię biopanowania peptydów rozpoznających leki w oparciu o biosensory QCM, a następnie analizę bioinformatyczną w celu walidacji interakcji lek-białko przy użyciu zidentyfikowanych peptydów. Projektowanie małocząsteczkowych pochodnych do immobilizacji na złotej elektrodzie biosensora jest ważnym krokiem, ponieważ wprowadzony łącznik może utrudniać wiązanie i zbieranie peptydu rozpoznającego lek. Aby tego uniknąć, przygotowuje się pochodne o różnych pozycjach wprowadzonego linkera23. Alternatywnie, w celu unieruchomienia hydrofobowych małych cząsteczek, chip czujnika zanurza się w wodzie objętościowej na 10-centymetrowej szalce Petriego, a roztwór 20 μl małej cząsteczki (10 mM roztwór w dimetylosulfotlenku) upuszcza się na złotą elektrodę bioczujnika, aby pokryć jego powierzchnię i inkubuje przez 5 minut. Pozwala to na zachowanie częstotliwości wewnętrznej małych cząsteczek poniżej stu herców, która jest utrzymywana przez co najmniej 10 minut podczas biopanowania. Rzeczywiście, korzystając z takiej immobilizacji, peptydy wybrane przez powinowactwo Osel wyraźnie podkreśliły miejsce wiązania Osel w NA (Figura 3).
T7 używany do przygotowania biblioteki peptydów jest genetycznie modyfikowany przy użyciu kasety NNK15, która koduje 32 kodony dla wszystkich 20 standardowych aminokwasów i hamuje pojawianie się kodonów 2 stop (UAA, UGA) i pojawia się tylko UAG (Figura 1) 6,7. Jest to ważne dla prezentacji 15-merowych peptydów o pełnej długości i zwiększenia różnorodności biblioteki. System wyświetlania fagów T7 ma techniczny limit wyświetlania wynoszący 107—109 fagów T7. Jednak różnorodność biblioteki 15-merowych peptydów wynosi teoretycznie 2015 (3,27 × 1019); W związku z tym nie można go wykorzystać do kompletnej budowy biblioteki. Niemniej jednak, wyszukiwanie podobieństw lub eksploracja zachowanych motywów pozwala na wykrycie aminokwasów składających się na miejsca wiązania leków w białkach, nawet przy tak ograniczonej różnorodności peptydów w bibliotece. Ponadto 3-5 rozciągnięć aminokwasów w peptydzie bibliotecznym (szybkość pojawiania się wynosi od 1/203 do 1/205, co można zrealizować za pomocą systemu wyświetlania fagów T7) bierze udział w rozpoznawaniu leków małocząsteczkowych; W związku z tym nie jest wymagane 100% dopasowanie sekwencji peptydowych do sekwencji aminokwasów 15-merowych stanowiących miejsce wiązania leku białka docelowego. Rzeczywiście, około 30 peptydów wybranych pod kątem powinowactwa z powodzeniem podkreśliło miejsce wiązania białka docelowego dla każdego testowanego leku (Figura 4). W ten sposób różnorodność użytej macierzystej biblioteki fagów T7 (1,7 × 107 pfu / ml) może być wykorzystana do heurystycznej rekonstrukcji miejsca wiązania leku.
Zazwyczaj 3-5 kopii fagów T7, które wykazywały te same sekwencje, co sekwencje 15-merowych aminokwasów zawierających odcinki aminokwasów rozpoznających leki, pojawiało się w 16 arbitralnie izolowanych płytkach, co wskazuje na sukces selekcji powinowactwa zgodnie z naszym protokołem. Oznacza to, że w 96 wyizolowanych płytkach (liczba ta jest związana z formatem mikropłytki) zebrano 18-30 różnych sekwencji peptydowych rozpoznających leki, które są następnie identyfikowane za pomocą sekwencjonowania DNA i uzyskiwania odpowiedniej sekwencji aminokwasów. W obecnej strategii wstrzyknięcie 8 μl biblioteki fagów T7 do kuwety zawierającej 8 ml buforu (1000-krotne rozcieńczenie biblioteki) jest odpowiednie do zmniejszenia niespecyficznego wiązania fagów T7. Aby zwiększyć różnorodność peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa, kilkukrotne powtórzenie selekcji jednocyklowej i zastosowanie 16 lub 32 izolacji płytek na badanie przesiewowe okazało się bardziej skuteczne niż izolacja z pojedynczego roztworu na raz. Na przykład, aby skutecznie zebrać około 30 różnie sekwencjonowanych peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa, przeprowadzono 3-6 zestawów selekcji jednocyklowej, w każdym eksperymencie wyizolowano 16 lub 32 płytki. Pojawienie się identycznych sekwencji we wszystkich 16 lub 32 blaszkach fagowych T7 wskazuje na przypadkowe wykrycie tła lub może spowodować zanieczyszczenie jako przeniesienie. Natomiast brak fagów T7 o tej samej sekwencji lub wyglądzie wielu fagów T7 z peptydami krótszymi niż długość 15 merów wskazuje, że fagi T7 w populacji pojawiły się niespecyficznie z dużym prawdopodobieństwem. Ponieważ redukcja częstości QCM zachodzi w tym samym stopniu nawet w takich przypadkach, powodzenie selekcji powinno być kompleksowo ocenione poprzez sekwencjonowanie DNA wyizolowanego faga T7, a następnie analizę bioinformatyczną sekwencji aminokwasowych peptydów. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnego protokołu wyświetlania fagów T7, powtarzanie rund selekcji jest mniej skuteczne, ponieważ zmienność i liczba fagów T7 są małe i nie są skoncentrowane nawet po powtórzeniu etapów amplifikacji i selekcji23.
Co ważne, metoda ta ma zastosowanie do eksploracji miejsc wiążących małe cząsteczki w proteomach ludzi, wirusów chorobotwórczych, a nawet roślin. Co ciekawe, prawdopodobnie nieustrukturyzowana krótka długość wyświetlania peptydów na kapsydzie faga T7 może naśladować dynamikę molekularną peptydów białek podczas dokowania z małą cząsteczką; Może to odzwierciedlać dynamiczne wiązanie24. Poza ograniczeniami technicznymi metod konwencjonalnych, strategia ta, mająca zastosowanie do identycznych protokołów dla małych cząsteczek, może rozszerzyć proteom leku, a także zapewnić większą szczegółowość analizy interakcji lek-białko.
Należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia techniczne tego podejścia. Synteza organiczna jest niezbędna do immobilizacji małych cząsteczek na powierzchni złotej elektrody chipa biosensora. Dla osób, które nie są ekspertami w dziedzinie chemii organicznej, niektóre odczynniki do immobilizacji są dostępne na rynku do mechanicznego utrwalania małej cząsteczki przez sprzężenie. Co więcej, pewne bezsensowne fragmenty peptydów mogą skutkować wykryciem części białka nieistotnej dla dokowania leku jako wyników fałszywie dodatnich. Odpowiada to empirycznie domenom bogatym w arkusze beta lub leucynę bogatym w reszty leucyny lub waliny, które są kodowane przez więcej kodonów niż inne standardowe aminokwasy, gdy wytwarzane są kopie faga T7. Kontrolowanie długości peptydu bibliotecznego może kontrolować występowanie wyników fałszywie dodatnich. W przeciwieństwie do tego, mogą wystąpić przypadki, w których reszty aminokwasowe w miejscu wiązania leku, które są zaangażowane w dokowanie, jak wykazano za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub analizy NMR, nie są wykrywane. Można to rozwiązać, zbierając większą liczbę peptydów rozpoznających leki lub zmieniając kierunek mocowania małych cząsteczek na złotej elektrodzie.
Wiele interakcji lek-białko, które są związane z głównymi i wtórnymi skutkami zażywania narkotyków, może być jeszcze niezidentyfikowanych w proteomie; Ponadto enzymy i transportery odpowiedzialne za wchłanianie, dystrybucję, metabolizm, wydalanie i toksyczność leków mogą być nadal niezidentyfikowane. Wiązanie z białkami nie zawsze jest odpowiedzialne za bioaktywność leku. W związku z tym połączenie innych informacji z testów biologicznych poprawi identyfikację podstawowych celów leków odpowiedzialnych za główne i niepożądane skutki leków. Dalsze adaptacje tej zwięzłej techniki zwiększą praktyczność i przepustowość eksploracji miejsc wiązania białek w szerokiej gamie leków małocząsteczkowych. Przedstawiona w niniejszym artykule metoda w znacznym stopniu przyczyni się nie tylko do prowadzenia badań podstawowych w dziedzinach pokrewnych, ale także do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności terapeutycznej lub innych skutków biologicznych leków stosowanych klinicznie.

Identyfikacja celów wiążących leki jest niezbędna do rozwoju leków, jak również do zrozumienia molekularnych mechanizmów chorób. W szczególności białka receptorowe i enzymatyczne są najważniejszymi celami molekularnymi bioaktywnych małych cząsteczek1. Chociaż wychwytywanie powinowactwa jest dobrze znaną techniką identyfikacji białek wiążących leki2, ograniczenia techniczne, takie jak niska rozpuszczalność białek, często utrudniają walidację celów leków2. Co najważniejsze, unieruchomione małe cząsteczki tracą stopień swobody niezbędny do dokowania i mogą być niedostępne dla wewnętrznie zlokalizowanych miejsc wiązania na większych białkach docelowych. Co więcej, nieprawidłowe fałdowanie białek, niemożność analizy warunków kokrystalizacji i ograniczenia wynikające z wielkości cząsteczki często utrudniają stosowanie krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych tego typu analiz eksperymentalnych do badania interakcji lek-białko.
Użycie biopanoramowania wyświetlacza fagów T7 jest skutecznym sposobem na określenie miejsca wiązania białek dla przynęt małocząsteczkowych3. W szczególności skuteczna jest losowa biblioteka peptydów wyświetlana przez fagi T7, którą można skonstruować poprzez wstawienie syntetycznego DNA do miejsca wielokrotnego klonowania. W porównaniu z biblioteką fagów T7 wyświetlającą białka, krótkie peptydy można łatwo zaprojektować tak, aby były wyświetlane na kapsydzie faga T7 bez ograniczeń fizycznych, który może sterycznie kontaktować się z dowolnym lekiem drobnocząsteczkowym umocowanym na stałym podłożu2. Co więcej, wprowadzenie biosensora mikrowagi kwarcowej (QCM) do platformy biopanoramowania z wyświetlaczem fagów T7 pozwala na identyfikację takich słabych, ale specyficznych interakcji krótkich peptydów z lekami poprzez monitorowanie zmniejszenia częstotliwości QCM4,5. Związany T7 jest następnie bezpośrednio odzyskiwany przez zakażenie gospodarza Escherichia coli (BLT5615), a następnie określa się sekwencję DNA regionu, który koduje wybrany peptyd o powinowactwie, zawierający krótkie segmenty rozpoznające lek. Dalsza analiza sekwencji aminokwasów w populacji peptydów dostarcza informacji na temat rozpoznawania leków. Wyrównanie parami in silico uratowanych sekwencji aminokwasów może być wykorzystane do uzyskania informacji na temat celu biologicznego leku w obrębie wybranego proteomu. Ta wysokoprzepustowa identyfikacja fragmentów białek o powinowactwie do leku może być wykorzystana do heurystycznej rekonstrukcji miejsca wiązania leku w sposób podobny do rekonstrukcji starożytnego artefaktu z odłamków ceramiki6. W szczególności to unikalne podejście może być przydatne, gdy konwencjonalne podejścia proteomiczne zawodzą .
Tutaj prezentujemy opartą na biosensorach strategię biopanowania peptydów wyświetlanych przez fagi T7 oraz analizę bioinformatyczną w celu walidacji docelowych małych cząsteczek. Poza ograniczeniami technicznymi stosowanymi w metodach konwencjonalnych, strategia ta umożliwia identyfikację miejsc wiązania leków na białkach docelowych dla dowolnej małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania w ramach identycznego protokołu.

<table><tbody><tr><td>AFFINIXQN</td><td>ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)</td><td>QCM2008-STKIT</td><td>Zawiera szklaną kuwetę, magnes mieszający, oprogramowanie do obsługi i analizy z komputerem z systemem Windows&nbsp;</td></tr><tr><td>AADIV</td><td>Northeastern University (Lee Makowski)</td><td>AADIV.exe</td><td>Oblicza częstość występowania każdego z 20 aminokwasów w każdej pozycji rekombinowanej wstawki, a także ogólną częstotliwość niezależną od pozycji każdego aminokwasu w tym zestawie sekwencji peptydowych. Szacuje również z grubsza różnorodność sekwencji biblioteki wyświetlania za pomocą metody próbkowania statystycznego opartej na sekwencjach uzyskanych od ograniczonej liczby losowo próbkowanych członków biblioteki.</td></tr><tr><td>Ceramiczny chip czujnika</td><td>ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)</td><td>QCMST27C</td><td>4 chipy czujników/pakiet</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>09-0850</td><td></td></tr><tr><td>FASTAcon</td><td>Northeastern University (Lee Makowski)</td><td>FASTAcon.exe</td><td>Identyfikuje białka z populacji z krótkim sekwencje konsensusu.</td></tr><tr><td>FASTAskan</td><td>Northeastern University (Lee Makowski)</td><td>FASTAskan.exe</td><td>Wymienia białka o wysokim podobieństwie do populacji peptydów.</td></tr><tr><td>Zestaw do immiblizacji dla AFFINIX</td><td>ULVAC, Inc. (Tokio, Japonia)</td><td>Odczynnik QCMIMKT</td><td>SAM i odczynnik sprzęgający aminy</td></tr><tr><td>INFO Northeastern</td><td>University (Lee Makowski)</td><td>INFO.exe</td><td>Zapewnia matematyczną miarę prawdopodobieństwa zaobserwowania określonej sekwencji peptydowej przez losowy przypadek (tj. niespecyficzne wiązanie), a nie przez selekcję ze względu na określoną właściwość (powinowactwo do małej cząsteczki).</td></tr><tr><td>Płynna pożywka</td><td>LB Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>L3522</td><td>Autoklaw na 20 min</td></tr><tr><td>MECZ Northeastern</td><td>University (Lee Makowski)</td><td>MATCH.exe</td><td>Identyfikuje wszelkie odcinki reszt aminokwasowych w określonym białku, które wykazują znaczące podobieństwo do grupy peptydów wybranych pod kątem powinowactwa. Dane wyjściowe w postaci wykresu diagramu klastra i skumulowanego podobieństwa obliczone na podstawie zmodyfikowanej macierzy BLOSUM62 z krótkim oknem (5&ndash; 6 aminokwasów długości).</td></tr><tr><td>MOTIF1</td><td>Northeastern University (Lee Makowski)</td><td>MOTIF1.exe</td><td>Poszukuje trzech ciągłych motywów sekwencji aminokwasów w populacji peptydów.</td></tr><tr><td>MOTIF2</td><td>Northeastern University (Lee Makowski)</td><td>MOTIF2.exe</td><td>Wyszukuje wzorce trzech aminokwasów i nie zezwala na konserwatywne podstawiania aminokwasów, ale dopuszcza identyczne długości przerw.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Kontakty ligandowe receptora (RELIC)</td><td>Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)</td><td>https://www.relic.anl.gov</td><td>Obecnie niedostępne (Samodzielny program może być używany przez autora korespondencji na życzenie)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck (Kenilworth, NJ, USA)</td><td>252859</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptory i białka enzymatyczne to ważne biomolekuły, które działają jako cele wiążące dla małych cząsteczek bioaktywnych. W związku z tym szybka i globalna walidacja interakcji lek-białko jest wysoce pożądana nie tylko dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności terapeutycznej, ale także dla oceny cech leku, takich jak adsorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie i toksyczność (ADMET) do zastosowań klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na biosensorach strategię wysokiej przepustowości do biopanowania krótkich peptydów wyświetlanych za pomocą fagów T7, które można łatwo wyświetlić na kapsydzie faga. Pokazano również późniejszą analizę sekwencji aminokwasowych peptydów zawierających krótkie segmenty, jako "uszkodzone relikty", miejsc wiązania leków za pomocą programów bioinformatycznych w zestawie kontaktów ligandów receptorowych (RELIC). Stosując tę metodę do dwóch klinicznie zatwierdzonych leków, przeciwnowotworowego irynotekanu i przeciwgrypowego oseltamiwiru, w niniejszym artykule wyjaśniono szczegółowy proces zbierania sekwencji peptydowych rozpoznających lek i podkreślania miejsc wiązania leków przez białka docelowe. Opisaną tutaj strategię można zastosować do dowolnych małych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania.

Reprezentatywne wyniki dla dwóch klinicznie zatwierdzonych leków przedstawiono na Rysunku 3. Irynotekan (Rysunek 3A), rozpuszczalny w wodzie prolek naturalnej kamptotecyny stosowany w leczeniu zaawansowanego raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuca, jest przekształcany w wątrobie do SN-38, który hamuje topoizomerazę I w komórkach nowotworowych12. Ponadto związek ten bezpośrednio hamuje acetylocholinoesterazę (AChE)13,14. Dzięki zastosowanej strategii, za pomocą podzbiorów jednocyklowego biopanningu opartego na biosensorze QCM, zidentyfikowano 29 peptydów rozpoznających Iri unieruchomiony jako SAM. Następujące wyrównanie parowe 29 peptydów i AChE dało maksymalne wyniki dla Y121, Q225, F290, E327, H440 oraz Y442 i wyróżniło odpowiedni fragment w strukturze trójwymiarowej. Pozostałości aminokwasowe te były zgodne z tymi tworzącymi miejsce wiązania Iri w AChE. Ten sam podzbiór peptydów pomyślnie zidentyfikował E99, L100, L252, L305, I387 oraz V474 w pobliżu triady katalitycznej (S221, E353 i H467) w karboksylesterase (CE), co wskazuje, że aminokwasy te tworzą rusztowanie dla rozpoznawania Iri podczas jego deestryfikacji15. Takich pozostałości aminokwasowych w centrum katalitycznym nie można zidentyfikować bezpośrednio za pomocą konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej lub analizy NMR, ponieważ reakcja enzymatyczna przebiega sprawnie i nie tworzy stabilnego kompleksu statycznego w ogólnych warunkach eksperymentalnych. Zatem kombinatoryczna detekcja miejsc wiązania leków w wielu białkach, w tym w kompleksach pośrednich, które mogą tworzyć się z enzymami podczas reakcji metabolicznych dla konkretnego leku, jest możliwa przy użyciu peptydów wyselekcjonowanych pod kątem powinowactwa do jednego leku.
Rysunek 3B przedstawia pozostałe wyniki uzyskane dla oseltamiwiru (Osel), leku przeciwgrypowego, który jest aktywowany do oseltamiwiru karboksylanu, hamującego z kolei neuraminidazę (NA) wirusa grypy16. 27 peptydów rozpoznających Osel, pokrywających powierzchnię złotej elektrody chipa sensorycznego QCM, skutecznie wykryło miejsce wiązania Osel w NA16. Miejsce wiązania to składa się z nieustrukturyzowanych pętli peptydowych, które potencjalnie podlegają dynamicznemu ruchowi podczas dokowania z Osel. Peptydy rozpoznające Osel na kapsydzie faga T7 mogą naśladować to dynamiczne dokowanie podczas wiązania się z Osel unieruchomionym na powierzchni złotej elektrody chipa sensorycznego QCM. U młodych pacjentów z grypą zidentyfikowano neuropsychiatryczne zdarzenia niepożądane (NPAEs), których wpływ na pacjentów może być związany z samą chorobą, a nie z lekiem. Badania wykazały, że Osel jest aktywnie usuwany z ośrodkowego układu nerwowego (CNS) gryzoni za pośrednictwem białek oporności wielolekowej (MDR) w barierze krew-mózg (BBB)17. Rzeczywiście, w naszym badaniu jedno z białek z klasy MDR uzyskało wysoki wynik (top 5% z 4 396 w bazie danych białek DrugBank 1.018), obok innych transporterów, enzymów związanych z neurotransmiterami oraz receptorów. Badane jest znaczenie farmakologiczne tych białek w odniesieniu do występowania działań niepożądanych Osel.
Do tej pory, stosując naszą strategię, pomyślnie zidentyfikowano pojedyncze i wielokrotne miejsca wiązania małych cząsteczek na białkach docelowych dla sześciu leków małocząsteczkowych (Rycyna 4). W przypadku Brz2001 oraz roksitromycyny (RXM) za pomocą różnych pul peptydów, których liczba i sekwencje aminokwasowe całkowicie się różniły, zidentyfikowano identyczne miejsca wiązania leku na białku docelowym7,19. Co więcej, pojedyncze pule peptydów uzyskane dla Iri, RXM i Osel doprowadziły do zidentyfikowania wielu miejsc wiązania na różnych białkach dla każdego z leków, takich jak AChE i CE dla Iri (Rycina 3A)20, angiomotyna i CYP3A4 dla RXM19,21, a także NA i białko związane z MDR dla Osel. Zidentyfikowano nieznany cel molekularny dla związku przeciwnowotworowego doxorubicin (FANCF)22 oraz przeciwangiogennego antybiotyku makrolidowego RXM (angiomotyna)19.
<img alt="Proces phagingu, schemat biosensora QCM pokazuje wtryskiwanie, monitorowanie częstotliwości, odzysk DNA, sekwencjonowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie biopanningu biblioteki peptydów prezentowanych na fagach T7 z wykorzystaniem biosensora QCM. Biblioteka fagów T7 prezentujących losowe peptydy jest wtryskiwana do kuwety zawierającej bufor (podczas mieszania), w której zanurzony jest chip biosensora QCM i ustabilizowana zostaje częstotliwość. Po monitorowaniu spadku częstotliwości wynikającego z wiązania fagów T7 z małymi cząsteczkami unieruchomionymi na powierzchni złotej elektrody chipu sensora, chip jest odłączany od oscylatora. Następnie DNA z przywiązanego faga T7 jest bezpośrednio odzyskiwane po infekcji gospodarza E. coli (BLT5615). Powstałe fagi T7 są izolowane poprzez tworzenie plam łyseć, a na koniec sekwencja aminokwasowa peptydu wyselekcjonowanego pod kątem powinowactwa do leku, prezentowanego na kapsydzie faga T7, jest określana zgodnie z ogólną metodą phagingu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy podobieństwa białek; przesyłanie sekwencji, porównywanie, histogram, wyniki diagramu klastrowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie ilościowej oceny porównania sekwencji między peptydami wybranymi za pomocą leku a pojedynczymi lub wieloma białkami. Sekwencje peptydów wybranych za pomocą leku są odpowiednio dopasowywane do pierwotnych sekwencji aminokwasowych pojedynczych i wielu białek, a podobieństwo w każdym zestawie 3—5 aminokwasów jest sumarycznie punktowane poprzez dopasowanie parowe zgodnie z zmodyfikowaną macierzą BLOSUM62. Powstały wykres lub diagram wskazuje reszty lub fragmenty stanowiące potencjalne miejsce wiązania leku na białku. Dalsza analiza z wykorzystaniem odpowiedniego programu RELIC uwidacznia miejsce wiązania na strukturze trójwymiarowej (jeśli dostępny jest plik PDB) lub szereguje całe białka, które mogą być celem wiązania (program HETEROalign jest obecnie niedostępny). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dynamika wiązania irynotekanu; wyniki podobieństwa MATCH; centra aktywne AChE i CE; analiza białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki zbierania peptydów i późniejszej analizy bioinformatycznej. (A) Irynotekan (przeciwnowotworowy prolek, inhibitor topoizomerazy I). Oddziaływanie fagów T7 monitorowano przez 10 min jako spadek częstotliwości QCM. DNA związanych fagów T7 odzyskano i zsekwencjonowano w celu wyznaczenia odpowiadającej im sekwencji aminokwasowej. Sekwencje aminokwasowe 29 peptydów 15-merowych, zebranych przy użyciu podzbioru jednorazowego biopanningu, uwypukliły aminokwasy tworzące miejsce wiązania Iri w AChE [PDB ID 1U65]. Dalsza ocena z wykorzystaniem tych samych 29 peptydów wskazała sąsiednie reszty aminokwasowe (reszty rusztowowe dla deestryfikacji) triady katalitycznej w CE, enzymie wątrobowym przekształcającym Iri w SN-38 (postać aktywna) [PDB ID: 1K4Y]. Od wyników tych odjęto wyniki podobieństwa 103 losowo wybranych peptydów z nieprzesianej biblioteki macierzystej7,19, aby wyeliminować błąd biblioteki. Rysunki te zostały powielone z Ref. 20 za zgodą wydawnictwa Elsevier. (B) Oseltamiwir (lek przeciw grypie). 27 peptydów zawierających aminokwasy rozpoznające Osel wskazało na nieuporządkowane części miejsca wiązania Osel dla neuraminidazy (NA) (enzym wirusowy) [PDB ID: 2HT7]. Globalna walidacja podobieństwa sekwencji między 27 peptydami a 4 396 białkami w bazie DrugBank 1.018 wykazała, że NA znajduje się w zakresie górnych 5%, obok ludzkich białek gospodarza związanych z funkcjami ośrodkowego układu nerwowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela aktywności małych cząsteczek; obejmuje struktury, dane o peptydach i cele dla analizy naukowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61873/61873fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Podsumowanie małych cząsteczek, których cele wiązania zostały zidentyfikowane przy użyciu tej strategii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61873/61873fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Identyfikacja interakcji białek małocząsteczkowych ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju leków, a także sprzyja zrozumieniu mechanizmów patologicznych leżących u podstaw wirusowych DTC. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową biopanację peptydów rozpoznających leki i globalną walidację miejsc wiązania leków na białkach dla leków małocząsteczkowych będących przedmiotem zainteresowania. Aby przygotować chip czujnika QCM, przymocuj ceramiczny chip czujnika do oscylatora 27-megahercowego aparatu QCM i zarejestruj częstotliwość wewnętrzną w fazie powietrznej przed unieruchomieniem małych cząsteczek.Po nagraniu odłącz chip i ostrożnie dodaj 20-mikrolitrową kroplę jednomilimolowego roztworu pochodnej drobnocząsteczkowej w 70% etanolu, aby utworzyć samoorganizującą się warstwę mono na złotej elektrodzie chipa czujnika. Umieść chip na szalce Petriego wyłożonej zwilżoną chusteczką, chroń go przed światłem przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie umyj powierzchnię elektrody ultra czystą wodą. Wysuszyć wiór delikatnym naniesieniem powietrza i załadować wiór do aparatu QCM.Po godzinie zarejestruj zmniejszenie częstotliwości w fazie powietrznej, aby zmierzyć ilość małej cząsteczki, która została unieruchomiona. W przypadku biopanoramowania biblioteki fagów T7 umieść kuwetę z dedykowanym mieszadłem magnetycznym na biosensorze QCM ustawionym na 1000 obrotów na minutę i dodaj osiem mililitrów buforu reakcyjnego do kuwety Podczas mieszania buforu podłącz chip czujnika QCM do oscylatora Przytrzymaj ramię oscylatora, aby zanurzyć chip w buforze i rozpocznij monitorowanie częstotliwości QCM. Gdy gram czujnika zrównoważy się do około trzech herców na minutę dryftu częstotliwości, wstrzyknij osiem mikrolitrów biblioteki fagów T7 do kuwety i zaznacz punkt wstrzyknięcia na czujniku.Monitoruj zmniejszenie częstotliwości spowodowane wiązaniem się fagów T7 z małą cząsteczką unieruchomioną na powierzchni złotej elektrody. Po 10 minutach zatrzymaj monitor częstotliwości QCM i szybko podnieś oscylator, aby usunąć chip czujnika z partii, odłącz chip czujnika od oscylatora i usuń bufor z chipa. Umieść wysuszony chip czujnika na wilgotnej szalce Petriego i dodaj 20 mikrolitrów kropli komórek gospodarza E-coli w fazie logarytmicznej na złotą elektrodę.Inkubować naczynie na 96-dołkowym mieszalniku mikropłytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1000 do 1500 obrotów na minutę przez 30 minut, chroniony przed światłem, aby zwiększyć odzysk związanych siedmiu fagów T7. Pod koniec inkubacji przenieść 20 mikrolitrów zawiesiny E-coli do 200 mikrolitrów pożywki LB. Zgodnie z ogólną procedurą przeprowadzić izolację płytki fagowej w pożywce i sekwencjonowanie DNA, które koduje lek rozpoznający sekwencje peptydowe wyświetlane na każdym kapsydzie faga.Jako konserwację chipa czujnika użyj 1% roztworu dodecylosiarczanu sodu nasączonego bawełnianym wacikiem, aby wyczyścić powierzchnię elektrody, umyj złotą powierzchnię ultra czystą wodą i osusz elektrodę powietrzem. Następnie potraktuj powierzchnię elektrody pięcioma mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu Parana przez pięć minut, a następnie przepłucz ultra czystą wodą i dwukrotnie wysusz powietrzem. Aby przeprowadzić analizę bioinformatyczną za pomocą RELIC, rozpakuj samodzielny program RELIC na komputerze z systemem operacyjnym Windows i użyj sekwencji aminokwasów wybranego leku, 15 merowych peptydów lub jednego lub wielu białek w każdym pliku tekstowym w szybkim formacie A.Umieść wymagane pliki tekstowe w folderze AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con lub fast A scan. Kliknij każdy plik wykonywalny w niezależnym folderze, aby otworzyć osobistą wersję FTN 95 i wprowadź odpowiednią nazwę pliku i rozszerzenie w wierszu poleceń, aby uruchomić każdy program i uzyskać wynikowy plik w formacie tekstowym. Uzyskane wynikowe pliki w formacie tekstowym są pokazane tutaj.Następnie wyeksportuj wynikowy plik tekstowy do arkusza kalkulacyjnego, aby wygenerować wykres zawartości informacji lub skumulowane wyniki podobieństwa obliczone za pomocą ciosu około 62. Dzięki tej strategii udało się zidentyfikować pojedyncze i wiele miejsc wiązania małych cząsteczek na białkach docelowych dla sześciu leków małocząsteczkowych. Na przykład 29 peptydów, które rozpoznają klinicznie zatwierdzony lek Irynotekan unieruchomiony jako samoorganizująca się monowarstwa, zidentyfikowano za pomocą bioczujnika opartego na biosensorze QCM w jednym cyklu biopanowania Późniejsze wyrównanie parami 29 peptydów i acetylocholinoesterazy dało maksymalne wyniki dla określonych reszt aminokwasowych, które były zgodne z tymi, które tworzą miejsce wiązania irynotekanu.Ten sam podzbiór peptydów został również pomyślnie zidentyfikowany w pobliżu katalitycznej triady w karboksyloesterazy, co wskazuje, że aminokwasy te tworzą rusztowanie do rozpoznawania irynotekanu podczas deestryfikacji. 27 peptydów, które rozpoznają lek przeciwgrypowy Oseltamivir pokrywający powierzchnię złotej elektrody chipa czujnika QCM, z powodzeniem wykryły miejsce wiązania oseltamiwiru w neuraminidazie. To miejsce wiązania składa się z nieustrukturyzowanych pętli peptydowych, które potencjalnie ulegają dynamicznemu ruchowi podczas dokowania z oseltamiwirem.Leki, regiony, chemikalia, rekombinowane bakteriofagi i bakterie są biologicznymi karawanami i powinny być traktowane zgodnie z protokołem pozyskiwania hodowli. Pamiętaj, aby dla bezpieczeństwa zawsze nosić rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Zgodnie z tą procedurą, białka docelowe dla różnych leków mogą być globalnie walidowane u ludzi, patologicznych wirusów, a nawet roślin, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i potencjalną skuteczność terapeutyczną leków będących przedmiotem zainteresowania.

biosensor-based-high-throughput-biopanning-bioinformatics-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Odkryj metodę identyfikacji interakcji lek-peptyd przy użyciu biosensora QCM. Strategia obejmuje biopanning bibliotek fagowych T7 i analizę bioinformatyczną do walidacji miejsc wiązania leków na białkach docelowych.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko (Wideo) | JoVE Journal

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Przeglądaj więcej filmów