Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko
December 1st, 2020
To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.
Identyfikacja interakcji białek małocząsteczkowych ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju leków, a także sprzyja zrozumieniu mechanizmów patologicznych leżących u podstaw wirusowych DTC. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową biopanację peptydów rozpoznających leki i globalną walidację miejsc wiązania leków na białkach dla leków małocząsteczkowych będących przedmiotem zainteresowania. Aby przygotować chip czujnika QCM, przymocuj ceramiczny chip czujnika do oscylatora 27-megahercowego aparatu QCM i zarejestruj częstotliwość wewnętrzną w fazie powietrznej przed unieruchomieniem małych cząsteczek.
Po nagraniu odłącz chip i ostrożnie dodaj 20-mikrolitrową kroplę jednomilimolowego roztworu pochodnej drobnocząsteczkowej w 70% etanolu, aby utworzyć samoorganizującą się warstwę mono na złotej elektrodzie chipa czujnika. Umieść chip na szalce Petriego wyłożonej zwilżoną chusteczką, chroń go przed światłem przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie umyj powierzchnię elektrody ultra czystą wodą. Wysuszyć wiór delikatnym naniesieniem powietrza i załadować wiór do aparatu QCM.
Po godzinie zarejestruj zmniejszenie częstotliwości w fazie powietrznej, aby zmierzyć ilość małej cząsteczki, która została unieruchomiona. W przypadku biopanoramowania biblioteki fagów T7 umieść kuwetę z dedykowanym mieszadłem magnetycznym na biosensorze QCM ustawionym na 1000 obrotów na minutę i dodaj osiem mililitrów buforu reakcyjnego do kuwety Podczas mieszania buforu podłącz chip czujnika QCM do oscylatora Przytrzymaj ramię oscylatora, aby zanurzyć chip w buforze i rozpocznij monitorowanie częstotliwości QCM. Gdy gram czujnika zrównoważy się do około trzech herców na minutę dryftu częstotliwości, wstrzyknij osiem mikrolitrów biblioteki fagów T7 do kuwety i zaznacz punkt wstrzyknięcia na czujniku.
Monitoruj zmniejszenie częstotliwości spowodowane wiązaniem się fagów T7 z małą cząsteczką unieruchomioną na powierzchni złotej elektrody. Po 10 minutach zatrzymaj monitor częstotliwości QCM i szybko podnieś oscylator, aby usunąć chip czujnika z partii, odłącz chip czujnika od oscylatora i usuń bufor z chipa. Umieść wysuszony chip czujnika na wilgotnej szalce Petriego i dodaj 20 mikrolitrów kropli komórek gospodarza E-coli w fazie logarytmicznej na złotą elektrodę.
Inkubować naczynie na 96-dołkowym mieszalniku mikropłytkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1000 do 1500 obrotów na minutę przez 30 minut, chroniony przed światłem, aby zwiększyć odzysk związanych siedmiu fagów T7. Pod koniec inkubacji przenieść 20 mikrolitrów zawiesiny E-coli do 200 mikrolitrów pożywki LB. Zgodnie z ogólną procedurą przeprowadzić izolację płytki fagowej w pożywce i sekwencjonowanie DNA, które koduje lek rozpoznający sekwencje peptydowe wyświetlane na każdym kapsydzie faga.
Jako konserwację chipa czujnika użyj 1% roztworu dodecylosiarczanu sodu nasączonego bawełnianym wacikiem, aby wyczyścić powierzchnię elektrody, umyj złotą powierzchnię ultra czystą wodą i osusz elektrodę powietrzem. Następnie potraktuj powierzchnię elektrody pięcioma mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu Parana przez pięć minut, a następnie przepłucz ultra czystą wodą i dwukrotnie wysusz powietrzem. Aby przeprowadzić analizę bioinformatyczną za pomocą RELIC, rozpakuj samodzielny program RELIC na komputerze z systemem operacyjnym Windows i użyj sekwencji aminokwasów wybranego leku, 15 merowych peptydów lub jednego lub wielu białek w każdym pliku tekstowym w szybkim formacie A.
Umieść wymagane pliki tekstowe w folderze AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con lub fast A scan. Kliknij każdy plik wykonywalny w niezależnym folderze, aby otworzyć osobistą wersję FTN 95 i wprowadź odpowiednią nazwę pliku i rozszerzenie w wierszu poleceń, aby uruchomić każdy program i uzyskać wynikowy plik w formacie tekstowym. Uzyskane wynikowe pliki w formacie tekstowym są pokazane tutaj.
Następnie wyeksportuj wynikowy plik tekstowy do arkusza kalkulacyjnego, aby wygenerować wykres zawartości informacji lub skumulowane wyniki podobieństwa obliczone za pomocą ciosu około 62. Dzięki tej strategii udało się zidentyfikować pojedyncze i wiele miejsc wiązania małych cząsteczek na białkach docelowych dla sześciu leków małocząsteczkowych. Na przykład 29 peptydów, które rozpoznają klinicznie zatwierdzony lek Irynotekan unieruchomiony jako samoorganizująca się monowarstwa, zidentyfikowano za pomocą bioczujnika opartego na biosensorze QCM w jednym cyklu biopanowania Późniejsze wyrównanie parami 29 peptydów i acetylocholinoesterazy dało maksymalne wyniki dla określonych reszt aminokwasowych, które były zgodne z tymi, które tworzą miejsce wiązania irynotekanu.
Ten sam podzbiór peptydów został również pomyślnie zidentyfikowany w pobliżu katalitycznej triady w karboksyloesterazy, co wskazuje, że aminokwasy te tworzą rusztowanie do rozpoznawania irynotekanu podczas deestryfikacji. 27 peptydów, które rozpoznają lek przeciwgrypowy Oseltamivir pokrywający powierzchnię złotej elektrody chipa czujnika QCM, z powodzeniem wykryły miejsce wiązania oseltamiwiru w neuraminidazie. To miejsce wiązania składa się z nieustrukturyzowanych pętli peptydowych, które potencjalnie ulegają dynamicznemu ruchowi podczas dokowania z oseltamiwirem.
Leki, regiony, chemikalia, rekombinowane bakteriofagi i bakterie są biologicznymi karawanami i powinny być traktowane zgodnie z protokołem pozyskiwania hodowli. Pamiętaj, aby dla bezpieczeństwa zawsze nosić rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Zgodnie z tą procedurą, białka docelowe dla różnych leków mogą być globalnie walidowane u ludzi, patologicznych wirusów, a nawet roślin, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i potencjalną skuteczność terapeutyczną leków będących przedmiotem zainteresowania.
Przegląd
To badanie przedstawia strategię identyfikacji interakcji leków z peptydami za pomocą biosensora na bazie mikroważenia kwarcowego (QCM). Metoda obejmuje biopanning peptydów rozpoznających leki oraz analizę bioinformatyczną w celu oceny rozpoznawania leków i miejsc wiązania na białkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Rozwój leków
- Biotechnologia
Tło
- Zrozumienie interakcji małej cząsteczki-białko jest kluczowe dla badań nad lekami.
- Potrzebne są metody wysokiego przepływu do biopanningu peptydów.
- Biosensory QCM zapewniają platformę do badania wiązania leków.
- Identyfikowanie miejsc wiązania pomaga w rozwoju terapii.
Cel badania
- Opracowanie metody identyfikacji peptydów wiążących leki.
- Walidacja miejsc wiązania leków na białkach-celach.
- Zwiększenie zrozumienia interakcji leków na poziomie molekularnym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie czujników QCM do wiązania małych cząsteczek.
- Biopanning z wykorzystaniem bibliotek fagów T7 do identyfikacji wiązających peptydów.
- Monitorowanie zmian częstotliwości w QCM w celu oceny interakcji wiązania.
- Analiza bioinformatyczna do oceny sekwencji peptydów.
Główne wyniki
- Udane zidentyfikowanie peptydów rozpoznających leki takie jak Irinotecan i Oseltamivir.
- Charakteryzacja miejsc wiązania na białkach takich jak acetylocholinoesteraza i neuraminiaza.
- Wykazana skuteczność metody w walidacji interakcji leków.
Wnioski
- Strategia skutecznie identyfikuje miejsca wiązania leków na białkach.
- Może być zastosowana do różnych leków w celu uzyskania informacji terapeutycznych.
- Zwiększa zrozumienie mechanizmów molekularnych działania leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
