Name: Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko oparty na znakowaniu metabolicznym 15N, immunoprecypitacji, ilościowej spektrometrii mas i modulacji powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę QUICK do identyfikacji interakcji białko-białko wykorzystującą metaboliczne znakowanie 15N, immunoprecypitację i ilościową spektrometrię mas. Technika ta skutecznie odróżnia prawdziwe partnerów interakcji od zanieczyszczeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Olivierowi Vallonowi za antiserum przeciwko CF1β. Praca ta była wspierana przez Max Planck Society oraz granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) i Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, projekt GoFORSYS).

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niedawno wprowadziliśmy dwa ulepszenia metody QUICK: etap sieciowania w celu wychwytywania przejściowych oddziaływań białko-białko (QUICK-X) oraz wytrącanie kontrolne w celu normalizacji nierównych wydajności wytrącania6. Przedstawiamy tutaj protokół zawierający dwa kolejne ulepszenia QUICK: po pierwsze, zastępujemy metodę SILAC5 metabolicznym znakowaniem 15N. Zalety tego rozwiązania polegają na tym, że znakowanie metaboliczne 15N jest znacznie tańsze niż SILAC, jeśli 15N jest dostarczane w postaci prostej soli nieorganicznej. Co więcej, dzięki metabolicznemu znakowaniu 15N metodę QUICK można zastosować do organizmów prototroficznych w odniesieniu do wszystkich aminokwasów, takich jak większość roślin, grzybów i bakterii. Wreszcie, konwersja argininy do proliny, charakterystyczna dla SILAC5,6, nie stanowi problemu przy ilościowym oznaczaniu peptydów znakowanych 15N. Przykładami odpowiednich narzędzi do ilościowej oceny danych proteomicznych 15N są MSQUANT12 lub IOMIQS13.
Po drugie, wprowadzamy modulację powinowactwa jako sposób na specyficzne zmniejszenie ilości białek oddziałujących z danym białkiem docelowym w jednej próbce w porównaniu z inną. Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono uniknąć tworzenia mutantów z wyciszeniem genu (knockdown), które w niektórych systemach modelowych są trudne do wygenerowania lub nie mogą być w ogóle stworzone w przypadku niezbędnych białek docelowych. Co więcej, zapobiega to błędnej interpretacji wynikającej z różnic w ekspresji białek, które mogą wystąpić jako odpowiedź komórki na wyciszenie białka docelowego: jeśli inne białka również zostaną wyciszone i będą wykazywać reakcję krzyżową z surowicą używaną do immunoprecypitacji, zostaną one zinterpretowane jako rzeczywiste partnerzy interakcji białka docelowego. Wreszcie, modulacja powinowactwa eliminuje konieczność ustalania odpowiedniego stosunku przeciwciała do antygenu.
Choć nasz protokół zastosowaliśmy w odniesieniu do Chlamydomonas reinhardtii jako organizmu modelowego, można go łatwo zaadaptować do każdego innego organizmu, który może być hodowany w kulturze komórkowej i jest zdolny do wykorzystania amonu lub azotanu jako źródła azotu. Modulacja powinowactwa kompleksów białkowych przez ATP/ADP może zostać bezpośrednio zastosowana do innych chaperonów, których oddziaływanie z substratami i białkami towarzyszącymi zależy od stanu ATP, takich jak systemy chaperonowe GroEL/HSP60/Cpn60 lub HSP9014,15, lub do każdego innego systemu, w którym powinowactwa wiązania są modulowane przez ATP. Modulacja powinowactwa powinna również działać w przypadkach, gdy powinowactwa w oddziaływaniach białkowych są zmieniane przez specyficzne leki, takie jak radicicol lub geldanamycyna w przypadku systemów HSP9015.
Wyraźnym ograniczeniem naszego protokołu jest fakt, że wymaga on przeciwciał oczyszczonych metodą powinowactwa przeciwko białku docelowemu, o którym wiadomo, że jest wrażliwe na konkretną terapię lub lek modulujący jego powinowactwo do białek partnerskich. W związku z tym nie jest to metoda wysokoprzepustowa.

<table><tbody><tr><td>ProteinA Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3391</td><td></td></tr><tr><td>DMP (dimetylopimelimidyd) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8388</td><td>Przechowywać w warunkach bezwodnych w temp. -20 &amp;deg;C, rozpuścić bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz (kompletny, bez EDTA)</td><td>Roche Applied Science</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adenozyno-5'-trifosforan)</td><td>Carl Roth</td><td>K054</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza kreatynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7886</td><td></td></tr><tr><td>DSP ditiobis[propionian succinimidylo]</td><td>Thermo Sientific</td><td>22585</td><td>Przechowywać w warunkach bezwodnych w temp. 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Cambridge isotope laboratories, Andover, MA</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C (endoproteinaza &lt;br/&gt; Lys-C) </td><td>Roche Applied Science</td><td>11047825001</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki z trypsyną (immobilizowana trypsyna Poroszyme)</td><td>Applied Biosystems</td><td>2-3127-00</td><td>Wymieszać energicznie bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Dysk Empore C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 47 mm</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15n, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Oddziaływania białko-białko są fundamentalne dla wielu procesów biologicznych w komórce. Dlatego ich charakterystyka odgrywa istotną rolę w obecnych badaniach, a dostępny jest szereg metod służących do ich analizy1. Oddziaływania białko-białko są często wysoce dynamiczne i mogą zależeć od lokalizacji subkomórkowej, modyfikacji potranslacyjnych oraz lokalnego środowiska białkowego2. W związku z tym powinny być one badane w ich naturalnym środowisku, do czego metodą z wyboru są podejścia oparte na koimmunoprecypitacji3. Współwytrącone partnerzy interakcji są identyfikowani albo za pomocą immunoblottingu w podejściu celowanym, albo za pomocą spektrometrii mas (LC-MS/MS) w sposób niecelowany. Ta druga strategia jest często negatywnie wpływana przez dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich, wynikających głównie z wysokiej czułości nowoczesnych spektrometrów mas, które z pewnością wykrywają śladowe ilości niespecyficznie wytrąconych białek. Niedawne podejście mające na celu rozwiązanie tego problemu opiera się na idei, że zmniejszone ilości specyficznych partnerów interakcji będą współwytrącać się z danym białkiem docelowym, którego stężenie komórkowe zostało zredukowane przez RNAi, podczas gdy ilości niespecyficznie wytrąconych białek powinny pozostać niezmienione. Metoda ta, nazwana QUICK od QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, wykorzystuje znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowlach komórkowych (SILAC)5 oraz MS do ilościowego określenia zawartości białek immunoprecypitowanych z szczepów typu dzikiego oraz szczepów z knockdownem. Białka występujące w stosunku 1:1 mogą być uznane za zanieczyszczenia, natomiast białka wzbogacone w osadach z typu dzikiego za specyficznych partnerów interakcji białka docelowego. Mimo innowacyjności, QUICK posiada pewne ograniczenia: po pierwsze, SILAC jest kosztowny i ograniczony do organizmów, które idealnie są auksotroficzne w stosunku do argininy i/lub lizyny. Ponadto, podczas podawania ciężkiej argininy, interkonwersja argininy do proliny skutkuje dodatkowymi przesunięciami masy dla każdej proliny w peptydzie i nieznacznie rozcieńcza ciężką argininę lekką, co sprawia, że kwantyfikacja jest bardziej żmudna i mniej dokładna5,6. Po drugie, QUICK wymaga miareczkowania przeciwciał w taki sposób, aby nie uległy one nasyceniu białkiem docelowym w ekstraktach z mutantów z knockdownem.
W niniejszej pracy przedstawiamy zmodyfikowany protokół QUICK, który eliminuje wspomniane ograniczenia metody QUICK poprzez zastąpienie SILAC metabolicznym znakowaniem 15N oraz zastąpienie wyciszania genu za pomocą RNAi modulacją powinowactwa oddziaływań białko-białko. Wykazujemy przydatność tego protokołu, wykorzystując jednokomórkową zieloną algę Chlamydomonas reinhardtii jako organizm modelowy oraz chaperon HSP70B z chloroplastów jako białko docelowe7 (Rysunek 1). Znane jest, że białka HSP70 oddziałują ze swoimi specyficznymi k chaperone'ami i substratami wyłącznie w stanie ADP8. Wykorzystujemy tę właściwość w celu weryfikacji specyficznego oddziaływania HSP70B z jego czynnikiem wymiany nukleotydów CGE19.

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Interakcje białko-białko są fundamentalne dla wielu procesów biologicznych w komórce. Dlatego też ich charakterystyka odgrywa istotną rolę w ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie białek specyficznie oddziałujących z danym białkiem docelowym w ekstraktach komórkowych zawierających białka rozpuszczalne i błonowe. Najpierw należy przeprowadzić pełne znakowanie metaboliczne komórek chlamydomonas azotem 14 i azotem 15 oraz przygotować lizaty komórkowe zawierające i pozbawione TP. Opcjonalny etap sieciowania pomaga ustabilizować przejściowe oddziaływania białko-białko. Następnie lizaty komórkowe rozdziela się na frakcje, wzbogacając je w białka nierozpuszczalne i błonowe, z których izoluje się białko docelowe oraz jego specyficzne partnerzy interakcyjne.Białko kontrolne oraz białka zanieczyszczające są poddawane immunoprecypitacji i elucji. Następnie zmieszaj immunoprecypitowane białka, poddaj je potrójnemu trawieniu i przeanalizuj za pomocą tandemowego LCMS. Wyniki pozwoliły odróżnić rzeczywiste od fałszywych partnerów interakcji, wykazując różne stosunki peptydów azotu 14 do azotu 15 dla białek specyficznie oddziałujących z białkiem docelowym oraz równy poziom azotu.Stosunki izotopów azotu 14 do 15 dla białka docelowego, białka kontrolnego oraz białek zanieczyszczających. Preferowaną metodą analizy oddziaływań białko-białko jest immunoprecypitacja wybranego białka bezpośrednio wraz z jego partnerami interakcyjnymi z ekstraktów komórkowych, w których oba występuje w swoich natywnych konformacjach i stężeniach.Jednakże podczas wykonywania tej procedury wytrącają się również białka zanieczyszczające, głównie dlatego, że oddziałują one z używanymi przeciwciałami, a nowoczesne spektrometry mas są niezwykle czułe. Urządzenia te jednoznacznie zidentyfikują również białka zanieczyszczające, przez co niemożliwe staje się odróżnienie artefaktów od rzeczywistych partnerów interakcji. Problem ten zostaje rozwiązany dzięki przedstawionej tutaj technice, która opiera się na immunoprecypitacji z modulacją powinowactwa z wykorzystaniem metabolicznego znakowania 15 N, w tym przypadku za pośrednictwem stanu ATP, oraz ilościowej spektrometrii mas.Technikę zaprezentuje Stefan SCH Malinger, doktorant w moim laboratorium. Po znakowaniu komórek przez 10 generacji, przenieś po dwie alikwoty komórek chlamydomonas oznakowanych azotem 14 i azotem 15 do probówek 4G SA, a następnie zbierz je poprzez wirowanie. Resuspenduj osady w dwóch mililitrach lodowatego buforu do lizy i przenieś zawiesiny do probówek Falcon o pojemności 15 mililitrów; zbierz pozostałe komórki, dodając do każdej alikwoty dodatkowy jeden mililitr buforu do lizy. Dodaj 50 µL 25x inhibitora proteaz oraz 12,5 µL 1 M chlorku magnezu. Próbki poddaj sonikacji cztery razy po 20 sekund na lodzie w celu całkowitej lizy komórek, z 20-sekundowymi przerwami w celu schłodzenia.Przygotuj cztery poduszki sacharozowe o objętości 6 ml w cienkościennych probówkach SW 41 TI. Ostrożnie nanieś całą objętość lizatów komórkowych na poduszki sacharozowe. Zrównoważ masę probówek za pomocą buforu do lizy i wiruj, aby oddzielić rozpuszczalne kompleksy białkowe od błon.Przenieś rozpuszczalne kompleksy białkowe z górnej części gradientu do czterech probówek Falcon o pojemności 15 ml, uważając, aby nie przenieść części poduszki sacharozowej. Następnie do każdej próbki dodaj 10% Triton X 100 do stężenia końcowego 0,5%. Wymieszaj ostrożnie i dodaj bufor do lizy do uzyskania całkowitej objętości siedmiu mililitrów.Do elektroforezy SDS-PAGE oraz analiz immunologicznych krwi. Odnieś 70 µL każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do nowej probówki stożkowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 70 µL dwukrotnego buforu do próbek SDS. Następnie usuń poduszki sacharozowe z cienkościennych probówek SW 41 TI i dodaj trzy mililitry buforu do lizy do każdego osadu.Dodaj jeden mililitr 10% Triton X 100 do uzyskania stężenia końcowego 2%. Po rozpuszczeniu każdego osadu za pomocą sonikacji, dodaj bufor lizujący do całkowitej objętości pięciu mililitrów i odwiruj. Podobnie jak poprzednio, zbierz górne frakcje kompleksów białek błonowych do probówek Falcon o pojemności 15 mililitrów. Dodaj bufor lizujący zawierający 2% Triton X 100 do uzyskania objętości końcowej siedmiu mililitrów.Wykorzystaj 70 µL tych próbek do elektroforezy SDS-PAGE oraz analizy immunologicznej krwi. Najpierw przeprowadź equilibrację białka sprzężonego z przeciwciałem. Kuleczki serologiczne przemyj dwukrotnie 4 mL buforu lizującego, rozcieńcz do 8 mL i rozdziel na alykwoaty.Do każdej z ośmiu 15 mililitrowych probówek typu Falcon zawierających rozpuszczalne lub błonowe kompleksy białkowe z komórek nasyconych lub pozbawionych TP, znakowanych azotem 14 i azotem 15, należy dodać jeden mililitr zawiesiny. Próbki inkubowano przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze w celu wytrącenia kompleksów białkowych. Następnie oddzielono kuleczki poprzez wirowanie, odrzucając nadsączówki, pozostawiając niewielką objętość cieczy nad kuleczkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami przylegającymi do plastikowych ścianek. Próbki przeniesiono do nowych 1,5 mililitrowych probówek stożkowych, aby zebrać wszystkie pozostałe kuleczki z probówek Falcon. Do każdej z nich dodano kolejne 0,8 mililitrów buforu do lizy zawierającego 0,1% trittonu, wymieszano w wortexie, delikatnie odwirowano i przeniesiono bufor z pozostałymi kuleczkami do probówek Eppendorf. Po kilku etapach płukania próbki wirowano przez 15 sekund przy 16 100 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Najpierw usuń nadnadatoprzekładki z próbek za pomocą zwykłej pipety. Następnie całkowicie usuń pozostałą nadnadatoprzekładkę za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL. Do każdej próbki dodaj 100 µL świeżo przygotowanego buforu elucyjnego i inkubuj w termomikserze przy 800 RPM; odwiruj próbki przez 15 sekund przy 16 100 ×g i 25 °C.Następnie przenieś każdy supernatant do nowej probówki, używając czystej strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL. Do kulek dodaj również 50 µL buforu elucyjnego, postępując tak jak w przypadku próbek, a następnie połącz odpowiednie eluaty. Pamiętaj, aby zarezerwować 30 µL wszystkich EIT z próbek do elektroforezy SDS-PAGE oraz analiz immunologicznych krwi.Następnie połącz eluaty osadów z białek rozpuszczalnych i błonowych znakowanych azotem 14 i azotem 15, poddanych traktowaniu ATP w wariancie plus i minus. Następnie przeprowadź redukcję, alkilację i wstępne trawienie w wysokim stężeniu mocznika zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Kontynuuj trawienie trypsyną na rotatorze przez co najmniej 16 godzin.W temperaturze 37°C. Odwiruj koraliki z trypsyną przez 5 minut przy 16 100 ×g i temperaturze 4°C. Przenieś nadosady do nowych probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml.Wypłucz stare probówki 50 µL 20 mM wodorowęglanu amonu i 0,5% kwasem octowym, a następnie połącz uzyskane roztwory z pierwszymi nadsączami. Aby przygotować domowe końcówki C 18 do odsolenia próbek, wytnij igłą strzykawki dwa krążki z materiału emcor C 18 i włóż je do końcówki pipety o pojemności 200 µL. Następnie wykonaj otwory w nakrętkach czterech probówek einor o pojemności 2 mL i umieść w nich końcówki; przygotuj końcówki C 18, dodając 50 µL roztworu B, a następnie wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C.Następnie należy przeprowadzić equilibrację końcówek StageTip C 18 za pomocą 100 µL roztworu, wirując przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C. Powtórz ten etap equilibracji jeszcze raz. Następnie nałóż 100 µL nadnadkładów z próbek po trawieniu tryptykowym na końcówki StageTip C 18 i wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C.Powtarzaj nakładanie na kolumnę do czasu całkowitego zastosowania nadnadkładów z próbek. Po przemyciu końcówek z fazą C 18, eluuj peptydy trypsynowe do nowej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, używając 50 µL roztworu B; wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C. Powtórz etap elucji raz, a następnie całkowicie osusz peptydy w koncentratorze próżniowym SpeedVac.Zawiesić wysuszone peptydy w 20 µL roztworu A i inkubować przez co najmniej jedną godzinę na lodzie, przerywając ten proces dwiema 15-minutowymi inkubacjami w kąpieli sonikacyjnej i wirowaniem przez 20 minut przy 16 100 ×g i temperaturze 4 °C, a następnie zastosować Senna do nano C-M-S-M-S HSP 70. Wiadomo, że białka szoku cieplnego oddziałują ze specyficznymi coszaeperonami i substratami wyłącznie w obecności ATP; w tych ekstraktach komórkowych znakowanych azotem 14 hs P 70 B i CGE one są zlokalizowane niemal wyłącznie w frakcji rozpuszczalnej, niezależnie od stanu ATP. W przeciwieństwie do tego, CF 1 beta jest zlokalizowana zarówno w frakcji rozpuszczalnej, jak i w frakcjach wzbogaconych w błony.Ponieważ sonikacja odrywa część CF one beta z błony zlokalizowanej w A TP Synthes, służy ona jako kontrola ładowania dla obu frakcji. Podobne ilości H HSP 70 B zostały wytrącone za pomocą przeciwciał anty-HSP 70 B z ekstraktów rozpuszczalnych znakowanych azotem 14 i azotem 15, niezależnie od stanu A TP. W przeciwieństwie do tego, niskie poziomy białka HS P 70 B wytrąciły się z frakcji błonowych, przy czym nieco większe ilości pochodziły z frakcji błonowych z ubytkiem a TP w porównaniu do frakcji nasyconych a TP, zgodnie z oczekiwanym powinowactwem CGE E one do hs.Wiązanie białka HSP70B jest zależne od kontekstu. Żadne białko CGE1 nie współwytrąciło się z HSP70B w frakcjach rozpuszczalnych lub błonowych przy obecności TP. Ilości białka CGE1 współwytrąconego z HSP70B z frakcji rozpuszczalnych pozbawionych TP oraz frakcji błonowych pozbawionych TP korelują ilościowo z ilością wytrąconego HSP70B. Interakcja CGE1 z HSP70B wyłącznie w stanie ADP została również zaobserwowana w analizie spektrometrią mas.W tym doświadczeniu przygotowano osady z mieszanin ekstraktów znakowanych azotem 14 pozbawionych A TP oraz ekstraktów znakowanych azotem 15 zawierających A TP. Podczas gdy ciężka i lekka formy znakowane peptydy HS P 70 B wykryto z taką samą intensywnością, w ekstraktach pozbawionych A TP wykryto jedynie lekką formę znakowaną peptydu CGE one. Przedstawiono tutaj te same peptydy z osadu anti HS P 70 D DB pochodzącego z mieszanin wzajemnie znakowanych rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. Odpowiednio, w ekstraktach pozbawionych A TP wykryto jedynie ciężką formę znakowaną peptydu CGE one, a także obie formy znakowane (lekką i ciężką) peptydów HSP 70 B.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić eksperyment z wytrącaniem białek wraz z przygotowaniem próbek do analizy spektrometrią mas. Należy pamiętać, że zanieczyszczenia białkami ludzkimi, a zwłaszcza keratyną, zakłócą pomiary w spektrometrze mas, dlatego podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak stosowanie rękawiczek, praca w czystym środowisku oraz wykorzystanie odczynników klasy LCMS.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół identyfikacji interakcji białko-białko oparty na 15N metodyczno-oznaczaniu metabolicznym, immunoprecypitacji, ilościowej spektometrii masowej i modulacji afinicji

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj ulepszoną metodę QUICK do identyfikacji interakcji białko-białko wykorzystującą metaboliczne znakowanie 15N, immunoprecypitację i ilościową spektrometrię mas. Technika ta skutecznie odróżnia prawdziwe partnerów interakcji od zanieczyszczeń.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko oparty na znakowaniu metabolicznym 15N, immunoprecypitacji, ilościowej spektrometrii mas i modulacji powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne ¹⁵N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów