Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko oparty na znakowaniu metabolicznym 15N, immunoprecypitacji, ilościowej spektrometrii mas i modulacji powinowactwa

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja białek specyficznie oddziałujących z danym białkiem docelowym w ekstraktach komórkowych zawierających białka rozpuszczalne i błonowe. Po pierwsze, osiągnij pełne znakowanie metaboliczne komórek chlamydomonas azotem 14 i azotem 15 i wygeneruj lizaty komórkowe zawierające i pozbawione TP. Opcjonalny etap sieciowania pomaga ustabilizować przejściowe interakcje białek białkowych. Następnie rozdziel lizaty komórkowe na frakcje, wzbogacone białka nierozpuszczalne i błonowe, z których białko docelowe, jego specyficzni partnerzy interakcji.

Białko kontrolne i białka zanieczyszczające są wytrącone immunologicznie i nawiązywane. Teraz wymieszaj białka wytrącone przez odporność, trzykrotnie traw i analizuj je za pomocą tandemowego LCMS. Wyniki rozróżniały prawdziwych i fałszywych partnerów interakcji, pokazując różne proporcje azotu, 14 peptydów azotu i 15 dla białek specyficznie oddziałujących z białkiem docelowym i równym azotem.

14 Proporcje peptydów azotu 15 dla białka docelowego, białka kontrolnego i białek zanieczyszczających. Metodą z wyboru do analizy oddziaływań białek białkowych jest immunoprecyptacja wybranego białka bezpośrednio z jego interakcją. Partnerzy z ekstraktów komórkowych, w których oba występują w ich natywnym potwierdzeniu i stężeniach.

Jednak w tym czasie wytrącane są również białka zanieczyszczające, głównie dlatego, że wchodzą w interakcje z przeciwciałami stosowanymi w nowoczesnych spektrometrach mas, które są niezwykle czułe. Jednoznacznie zidentyfikują również białka zanieczyszczające, a tym samym niemożliwe jest odróżnienie winy od prawdziwych partnerów interakcji. Problem ten można przezwyciężyć za pomocą pokazanej tutaj techniki, która opiera się na znakowaniu metabolicznym 15 N, modulacji powinowactwa immunoprecypitacji, w której pośredniczy stan A TP i ilościowa spektrometria mas.

Technikę pokaże Stefan SCH Malinger, który jest starszym doktorantem w moim laboratorium. Po znakowaniu komórek przez 10 pokoleń przenieś po dwie porcje komórek chlamydomonas znakowanych azotem 14 i azotem 15 do probówek 4G SA, zbieraj przez wirowanie Resus, zawieszaj granulki w dwóch mililitrach lodowatego buforu do lizy i aby przenieść zawiesiny do 15-mililitrowych probówek Falcon, zbierz pozostałe komórki z dodatkowym mililitrem buforu do lizy każda do każdego Eloqua. Dodaj 50 mikrolitrów 25 x inhibitor proteazy i 12,5 mikrolitrów jednego molowego chlorku magnezu sonikate próbki cztery razy po 20 sekund na lodzie, aby uzyskać pełną komórkę ISIS z 22. przerwami pomiędzy nimi w celu schłodzenia.

Przygotuj cztery sześciomililitrowe poduszki z sacharozą w cienkościennych rurkach SW 41 TI. Ostrożnie ułóż całą objętość lizatów komórkowych na poduszkach sacharozy. Zrównoważyć lizą, buforem i wirówką, aby oddzielić rozpuszczalne kompleksy białkowe od błon.

Przenieś rozpuszczalne kompleksy białkowe z góry gradientu do czterech 15-mililitrowych probówek Falcona. Upewnij się, że nie przenosisz części poduszki sacharozy. Następnie do każdej próbki dodaj 10% Triton X 100 do końcowego stężenia 0,5% Dokładnie wymieszaj i dodaj bufor do lizy do całkowitej objętości siedmiu mililitrów.

Do strony SDS i immunologicznych analiz krwi. Odłóż 70 mikrolitrów każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do świeżej stożkowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 70 mikrolitrów dwóch do próbek XSDS. Następnie wyrzuć poduszki sacharozy z cienkościennych probówek SW 41 TI i dodaj trzy mililitry buforu do lizy do każdej granulki.

Dodaj jeden mililitr 10% tritton X 100 do końcowego stężenia 2% Po rozpuszczeniu każdej osadki przez sonikację, dodaj bufor do lizy do całkowitej objętości pięciu mililitrów i odwiruj. Tak jak poprzednio, zbierz górne frakcje błonowych kompleksów białkowych do 15-mililitrowych probówek sokoła. Dodać bufor do lizy zawierający 2% trytonu X 100 do końcowej objętości siedmiu mililitrów.

Użyj 70 mikrolitrów tych próbek do strony SDS i analiz immunologicznych krwi. Najpierw zrównoważyć białko sprzężone z przeciwciałami. Kulki sero z dwoma czteromililitrowymi płukankami buforu do lizy rozcieńczyć do ośmiu mililitrów i podwielokrotności.

Jeden mililitr zawiesiny do każdej z ośmiu 15-mililitrowych probówek Falcon zawierających rozpuszczalne lub błonowe kompleksy białkowe z komórek znakowanych TP i TP zubożonych w azot 14 i azot 15 inkubuje się przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na walce rurowej w celu wytrącenia kompleksów białkowych, granuluje kulki przez odwirowanie, Wyrzuć supernatanty, pozostawiając niewielką objętość płynu na wierzchu kulek, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez białka przylegające do plastikowych ścianek. Przenieś próbki do świeżych stożkowych probówek o pojemności 1,5 mililitra, aby zebrać wszystkie pozostałe koraliki w probówkach sokoła. Dodaj kolejne 0,8 mililitra buforu do lizy zawierającego 0,1% trytonu do każdego wiru, delikatnie odwirować i przenieść bufor z resztkowymi kulkami do probówek einor Po kilku etapach mycia odwirowywać próbki przez 15 sekund w temperaturze 16, 100 razy G i czterech stopniach Celsjusza.

Najpierw usunąć spowieny osadu za pomocą zwykłej pipety. Następnie całkowicie usunąć pozostały supernatant za pomocą 50-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu elucyjnego i inkubować w mieszalniku termicznym z prędkością 800 obr./min, odwirowywać próbki przez 15 sekund w temperaturze 16, 100 razy G i 25 stopni Celsjusza.

Teraz przenieś każdy supernatant do świeżej probówki za pomocą czystej 50-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Dodać również 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do procesu kulek, tak jak w przypadku próbek wcześniej, i połączyć odpowiednie elaty. Pamiętaj, aby zarezerwować 30 mikrolitrów wszystkich próbek EIT do strony SDS i immunologicznych analiz krwi.

Teraz połącz wykluczone osady z dodatniego i ujemnego azotu 14 potraktowanego TP plus i minus A TP i azotu 15 znakowanych białkami rozpuszczalnymi i błonowymi. Następnie przeprowadzić alkilowanie redukcyjne i wstępne trawienie o wysokiej zawartości mocznika, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. Kontynuuj trawienie tryptyku na kole obrotowym przez co najmniej 16 godzin.

W 37 stopniach Celsjusza. Granulki tripsin osadzać przez pięciominutowe wirowanie w temperaturze 16, 100 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść supernatanty do świeżych dwumililitrowych probówek einor.

Umyj stare probówki 50 mikrolitrami 20-milimolowego wodorowęglanu amonu, 0,5% kwasu octowego i połącz je z pierwszymi supernatantami. W celu przygotowania domowych końcówek C 18 do odsalania próbek należy wyciąć dwa krążki z materiału emcor C 18 za pomocą igły strzykawkowej i włożyć je do końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie przebij otwory w pokrywkach czterech dwumililitrowych probówek einor i włóż końcówki, wstępnie przygotuj końcówki C 18 stage za pomocą 50 mikrolitrów roztworu B wirówki przez trzy minuty w temperaturze 800 G i 25 stopni Celsjusza.

Następnie zrównoważyć końcówki etapu C 18 ze 100 mikrolitrami roztworu, wirówką przez trzy minuty w temperaturze 800 G i 25 stopni Celsjusza. Powtórz ten Krok równowagi jeszcze raz. Przystąpić do ładowania 100 mikrolitrów supernatantów próbki z tryptyku mineralizacji na końcówkach C 18 stage wirować przez trzy minuty w temperaturze 800 G i 25 stopni Celsjusza.

Powtórzyć ładowanie kolumny w celu pełnego nałożenia supernatantów próbki. Po umyciu końcówek C 18 stage, wymyj peptydy tryptyczne do świeżej 1,5-mililitrowej probówki einor z 50 mikrolitrami roztworu B wirówki przez trzy minuty w temperaturze 800 G i 25 stopni Celsjusza. Powtórz krok wyjaśniający raz, a następnie wysusz peptydy do końca w prędkości VAC reus.

Zawiesić wysuszone peptydy w 20 mikrolitrach roztworu A i inkubować przez co najmniej godzinę na lodzie, przerywaną dwiema 15-minutowymi inkubacjami w wirówce do kąpieli sonikatowej przez 20 minut w temperaturze 16, 100 razy G i czterech stopniach Celsjusza i zastosować Sennę do nano C-M-S-M-S HSP 70. Wiadomo, że białka szoku cieplnego wchodzą w interakcje ze specyficznymi białkami opiekuńczymi i substratami cos tylko przy braku TP w tych znakowanych azotem 14 ekstraktach komórkowych hs, P, 70 B i CGE jeden, są prawie wyłącznie zlokalizowane we frakcji rozpuszczalnej, niezależnie od stanu A TP. W przeciwieństwie do tego, CF one beta jest zlokalizowany zarówno we frakcji rozpuszczalnej, jak i wzbogaconej w błonę.

Ponieważ sonikacja ścina część CF o jedną beta od membrany znajdującej się w syntezatorach A TP, służy jako kontrola obciążenia dla obu frakcji. Podobne ilości H HSP 70 B wytrącono przeciwciałami anty HSP 70 B z rozpuszczalnych ekstraktów znakowanych azotem 14 i azotem 15 niezależnie od stanu A TP. W przeciwieństwie do tego, niskie poziomy białka HS P 70 B wytrąciły się z frakcji błonowych z nieco większymi ilościami pochodzącymi z frakcji błonowych zubożonych w TP w porównaniu z frakcjami pełnymi TP jako oczekiwane powinowactwo CGE E jeden do hs.

P 70 B jest zależne od kontekstu. Żaden CGE nie był współwytrącany z HS P 70 B.In TP wypełnionymi frakcjami rozpuszczalnymi lub membranowymi. Ilości białka CGE one wytrąconego z HS P 70 B z frakcji zubożonych w TP i frakcji błonowych zubożonych w TP korelują ilościowo z ilością wytrąconego HSP 70 B. Oddziaływanie jednego CGE z HS P 70 B tylko w stanie A DP obserwuje się również w analizie za pomocą spektrometrii mas.

W tym doświadczeniu przygotowano osady dla mieszanin 14 znakowanych ekstraktów azotowych bez TP i azotu, 15 znakowanych ekstraktów zawierających A TP. Podczas gdy ciężkie i lekkie znakowane formy peptydu HS P 70 B wykryto z równą intensywnością, wykryto tylko lekką znakowaną formę jednego peptydu CGE z ekstraktów zubożonych w A TP. Pokazano tutaj te same peptydy z osadu anty HS P 70 D DB pochodzącego z mieszanin wzajemnie znakowanych rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. W związku z tym wykryto tylko ciężką znakowaną formę peptydu CGE One w ekstraktach zubożonych w TP, a także zarówno lekkie, jak i ciężkie znakowane peptydy HSP 70 B.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wrażenie na temat tego, jak przeprowadzić eksperyment z wytrącaniem się wody z przygotowaniem próbki do analizy spektrometrii mas. Nie zapominaj, że zanieczyszczenia ludzkim białkiem, zwłaszcza keratyną, zakłócą pomiary profilaktyczne w spektrometrze mas, dlatego środki ostrożności, takie jak rękawice, czyste środowisko i regiony klasy LCMS, mają kluczowe znaczenie podczas wykonywania tej procedury.