Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne ¹⁵N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie białek specyficznie oddziałujących z danym białkiem docelowym w ekstraktach komórkowych zawierających białka rozpuszczalne i błonowe. Najpierw należy przeprowadzić pełne znakowanie metaboliczne komórek chlamydomonas azotem 14 i azotem 15 oraz przygotować lizaty komórkowe zawierające i pozbawione TP. Opcjonalny etap sieciowania pomaga ustabilizować przejściowe oddziaływania białko-białko. Następnie lizaty komórkowe rozdziela się na frakcje, wzbogacając je w białka nierozpuszczalne i błonowe, z których izoluje się białko docelowe oraz jego specyficzne partnerzy interakcyjne.

Białko kontrolne oraz białka zanieczyszczające są poddawane immunoprecypitacji i elucji. Następnie zmieszaj immunoprecypitowane białka, poddaj je potrójnemu trawieniu i przeanalizuj za pomocą tandemowego LCMS. Wyniki pozwoliły odróżnić rzeczywiste od fałszywych partnerów interakcji, wykazując różne stosunki peptydów azotu 14 do azotu 15 dla białek specyficznie oddziałujących z białkiem docelowym oraz równy poziom azotu.

Stosunki izotopów azotu 14 do 15 dla białka docelowego, białka kontrolnego oraz białek zanieczyszczających. Preferowaną metodą analizy oddziaływań białko-białko jest immunoprecypitacja wybranego białka bezpośrednio wraz z jego partnerami interakcyjnymi z ekstraktów komórkowych, w których oba występuje w swoich natywnych konformacjach i stężeniach.

Jednakże podczas wykonywania tej procedury wytrącają się również białka zanieczyszczające, głównie dlatego, że oddziałują one z używanymi przeciwciałami, a nowoczesne spektrometry mas są niezwykle czułe. Urządzenia te jednoznacznie zidentyfikują również białka zanieczyszczające, przez co niemożliwe staje się odróżnienie artefaktów od rzeczywistych partnerów interakcji. Problem ten zostaje rozwiązany dzięki przedstawionej tutaj technice, która opiera się na immunoprecypitacji z modulacją powinowactwa z wykorzystaniem metabolicznego znakowania 15 N, w tym przypadku za pośrednictwem stanu ATP, oraz ilościowej spektrometrii mas.

Technikę zaprezentuje Stefan SCH Malinger, doktorant w moim laboratorium. Po znakowaniu komórek przez 10 generacji, przenieś po dwie alikwoty komórek chlamydomonas oznakowanych azotem 14 i azotem 15 do probówek 4G SA, a następnie zbierz je poprzez wirowanie. Resuspenduj osady w dwóch mililitrach lodowatego buforu do lizy i przenieś zawiesiny do probówek Falcon o pojemności 15 mililitrów; zbierz pozostałe komórki, dodając do każdej alikwoty dodatkowy jeden mililitr buforu do lizy. Dodaj 50 µL 25x inhibitora proteaz oraz 12,5 µL 1 M chlorku magnezu. Próbki poddaj sonikacji cztery razy po 20 sekund na lodzie w celu całkowitej lizy komórek, z 20-sekundowymi przerwami w celu schłodzenia.

Przygotuj cztery poduszki sacharozowe o objętości 6 ml w cienkościennych probówkach SW 41 TI. Ostrożnie nanieś całą objętość lizatów komórkowych na poduszki sacharozowe. Zrównoważ masę probówek za pomocą buforu do lizy i wiruj, aby oddzielić rozpuszczalne kompleksy białkowe od błon.

Przenieś rozpuszczalne kompleksy białkowe z górnej części gradientu do czterech probówek Falcon o pojemności 15 ml, uważając, aby nie przenieść części poduszki sacharozowej. Następnie do każdej próbki dodaj 10% Triton X 100 do stężenia końcowego 0,5%. Wymieszaj ostrożnie i dodaj bufor do lizy do uzyskania całkowitej objętości siedmiu mililitrów.

Do elektroforezy SDS-PAGE oraz analiz immunologicznych krwi. Odnieś 70 µL każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do nowej probówki stożkowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 70 µL dwukrotnego buforu do próbek SDS. Następnie usuń poduszki sacharozowe z cienkościennych probówek SW 41 TI i dodaj trzy mililitry buforu do lizy do każdego osadu.

Dodaj jeden mililitr 10% Triton X 100 do uzyskania stężenia końcowego 2%. Po rozpuszczeniu każdego osadu za pomocą sonikacji, dodaj bufor lizujący do całkowitej objętości pięciu mililitrów i odwiruj. Podobnie jak poprzednio, zbierz górne frakcje kompleksów białek błonowych do probówek Falcon o pojemności 15 mililitrów. Dodaj bufor lizujący zawierający 2% Triton X 100 do uzyskania objętości końcowej siedmiu mililitrów.

Wykorzystaj 70 µL tych próbek do elektroforezy SDS-PAGE oraz analizy immunologicznej krwi. Najpierw przeprowadź equilibrację białka sprzężonego z przeciwciałem. Kuleczki serologiczne przemyj dwukrotnie 4 mL buforu lizującego, rozcieńcz do 8 mL i rozdziel na alykwoaty.

Do każdej z ośmiu 15 mililitrowych probówek typu Falcon zawierających rozpuszczalne lub błonowe kompleksy białkowe z komórek nasyconych lub pozbawionych TP, znakowanych azotem 14 i azotem 15, należy dodać jeden mililitr zawiesiny. Próbki inkubowano przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze w celu wytrącenia kompleksów białkowych. Następnie oddzielono kuleczki poprzez wirowanie, odrzucając nadsączówki, pozostawiając niewielką objętość cieczy nad kuleczkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami przylegającymi do plastikowych ścianek. Próbki przeniesiono do nowych 1,5 mililitrowych probówek stożkowych, aby zebrać wszystkie pozostałe kuleczki z probówek Falcon. Do każdej z nich dodano kolejne 0,8 mililitrów buforu do lizy zawierającego 0,1% trittonu, wymieszano w wortexie, delikatnie odwirowano i przeniesiono bufor z pozostałymi kuleczkami do probówek Eppendorf. Po kilku etapach płukania próbki wirowano przez 15 sekund przy 16 100 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Najpierw usuń nadnadatoprzekładki z próbek za pomocą zwykłej pipety. Następnie całkowicie usuń pozostałą nadnadatoprzekładkę za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL. Do każdej próbki dodaj 100 µL świeżo przygotowanego buforu elucyjnego i inkubuj w termomikserze przy 800 RPM; odwiruj próbki przez 15 sekund przy 16 100 ×g i 25 °C.

Następnie przenieś każdy supernatant do nowej probówki, używając czystej strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL. Do kulek dodaj również 50 µL buforu elucyjnego, postępując tak jak w przypadku próbek, a następnie połącz odpowiednie eluaty. Pamiętaj, aby zarezerwować 30 µL wszystkich EIT z próbek do elektroforezy SDS-PAGE oraz analiz immunologicznych krwi.

Następnie połącz eluaty osadów z białek rozpuszczalnych i błonowych znakowanych azotem 14 i azotem 15, poddanych traktowaniu ATP w wariancie plus i minus. Następnie przeprowadź redukcję, alkilację i wstępne trawienie w wysokim stężeniu mocznika zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Kontynuuj trawienie trypsyną na rotatorze przez co najmniej 16 godzin.

W temperaturze 37°C. Odwiruj koraliki z trypsyną przez 5 minut przy 16 100 ×g i temperaturze 4°C. Przenieś nadosady do nowych probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml.

Wypłucz stare probówki 50 µL 20 mM wodorowęglanu amonu i 0,5% kwasem octowym, a następnie połącz uzyskane roztwory z pierwszymi nadsączami. Aby przygotować domowe końcówki C 18 do odsolenia próbek, wytnij igłą strzykawki dwa krążki z materiału emcor C 18 i włóż je do końcówki pipety o pojemności 200 µL. Następnie wykonaj otwory w nakrętkach czterech probówek einor o pojemności 2 mL i umieść w nich końcówki; przygotuj końcówki C 18, dodając 50 µL roztworu B, a następnie wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C.

Następnie należy przeprowadzić equilibrację końcówek StageTip C 18 za pomocą 100 µL roztworu, wirując przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C. Powtórz ten etap equilibracji jeszcze raz. Następnie nałóż 100 µL nadnadkładów z próbek po trawieniu tryptykowym na końcówki StageTip C 18 i wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C.

Powtarzaj nakładanie na kolumnę do czasu całkowitego zastosowania nadnadkładów z próbek. Po przemyciu końcówek z fazą C 18, eluuj peptydy trypsynowe do nowej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, używając 50 µL roztworu B; wiruj przez trzy minuty przy 800 G i 25 °C. Powtórz etap elucji raz, a następnie całkowicie osusz peptydy w koncentratorze próżniowym SpeedVac.

Zawiesić wysuszone peptydy w 20 µL roztworu A i inkubować przez co najmniej jedną godzinę na lodzie, przerywając ten proces dwiema 15-minutowymi inkubacjami w kąpieli sonikacyjnej i wirowaniem przez 20 minut przy 16 100 ×g i temperaturze 4 °C, a następnie zastosować Senna do nano C-M-S-M-S HSP 70. Wiadomo, że białka szoku cieplnego oddziałują ze specyficznymi coszaeperonami i substratami wyłącznie w obecności ATP; w tych ekstraktach komórkowych znakowanych azotem 14 hs P 70 B i CGE one są zlokalizowane niemal wyłącznie w frakcji rozpuszczalnej, niezależnie od stanu ATP. W przeciwieństwie do tego, CF 1 beta jest zlokalizowana zarówno w frakcji rozpuszczalnej, jak i w frakcjach wzbogaconych w błony.

Ponieważ sonikacja odrywa część CF one beta z błony zlokalizowanej w A TP Synthes, służy ona jako kontrola ładowania dla obu frakcji. Podobne ilości H HSP 70 B zostały wytrącone za pomocą przeciwciał anty-HSP 70 B z ekstraktów rozpuszczalnych znakowanych azotem 14 i azotem 15, niezależnie od stanu A TP. W przeciwieństwie do tego, niskie poziomy białka HS P 70 B wytrąciły się z frakcji błonowych, przy czym nieco większe ilości pochodziły z frakcji błonowych z ubytkiem a TP w porównaniu do frakcji nasyconych a TP, zgodnie z oczekiwanym powinowactwem CGE E one do hs.

Wiązanie białka HSP70B jest zależne od kontekstu. Żadne białko CGE1 nie współwytrąciło się z HSP70B w frakcjach rozpuszczalnych lub błonowych przy obecności TP. Ilości białka CGE1 współwytrąconego z HSP70B z frakcji rozpuszczalnych pozbawionych TP oraz frakcji błonowych pozbawionych TP korelują ilościowo z ilością wytrąconego HSP70B. Interakcja CGE1 z HSP70B wyłącznie w stanie ADP została również zaobserwowana w analizie spektrometrią mas.

W tym doświadczeniu przygotowano osady z mieszanin ekstraktów znakowanych azotem 14 pozbawionych A TP oraz ekstraktów znakowanych azotem 15 zawierających A TP. Podczas gdy ciężka i lekka formy znakowane peptydy HS P 70 B wykryto z taką samą intensywnością, w ekstraktach pozbawionych A TP wykryto jedynie lekką formę znakowaną peptydu CGE one. Przedstawiono tutaj te same peptydy z osadu anti HS P 70 D DB pochodzącego z mieszanin wzajemnie znakowanych rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. Odpowiednio, w ekstraktach pozbawionych A TP wykryto jedynie ciężką formę znakowaną peptydu CGE one, a także obie formy znakowane (lekką i ciężką) peptydów HSP 70 B.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić eksperyment z wytrącaniem białek wraz z przygotowaniem próbek do analizy spektrometrią mas. Należy pamiętać, że zanieczyszczenia białkami ludzkimi, a zwłaszcza keratyną, zakłócą pomiary w spektrometrze mas, dlatego podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak stosowanie rękawiczek, praca w czystym środowisku oraz wykorzystanie odczynników klasy LCMS.