Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR
September 20th, 2022
Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.
Protokół ten umożliwia jakościową i ilościową analizę nieukierunkowanego metabolomu w oparciu o kontrolę jakości FDR, co skutecznie zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji metabolitów. Ten przepływ pracy integruje XY-Meta, który wykorzystuje strategię celu-wabika do dokładniejszej oceny FDR w celu identyfikacji metabolomu w module analizy jakościowej. Środek ten może skutecznie filtrować fałszywie dodatnie wyniki nieukierunkowanej identyfikacji metabolomu, co zwiększa niezawodność odkrywania biomarkerów lub kluczowych cząsteczek.
Oczekujemy, że badacze będą w stanie zrozumieć i opanować strategię celu-wabika do kontroli FDR i powinni spróbować ściśle uruchomić ten potok kilka razy z domyślnymi parametrami protokołu. Zacznij od przejścia do strony internetowej bazy danych GNPS i kliknij przeglądaj zestawy danych. Wyszukaj słowo kluczowe w kolumnie tytułu, a następnie kliknij numer identyfikacyjny zestawu danych.
Pobierz zestaw danych za pomocą FTP i zapisz nieprzetworzone dane w odpowiednim folderze. Aby przekonwertować format surowych danych, najpierw zainstaluj oprogramowanie ProteoWizard. W ścieżce instalacji ProteoWizard wpisz msconvert.
exe, a następnie określone parametry, aby przekonwertować format danych pierwotnych na format mzXML. Ponownie, przy użyciu msconvert. exe konwertuje te dane do formatu MGF i przechowuje je w folderze MGF.
Aby przygotować referencyjną bibliotekę spektralną dla metabolitów, należy przejść do strony internetowej GNPS. Wyszukaj słowo kluczowe NIST, kliknij przycisk Widok, aby uzyskać szczegółowe informacje i pobierz bibliotekę. Zapisz bibliotekę w folderze bazy danych.
Pobierz program XY-Meta. Znajdź plik konfiguracyjny parametrów w folderze config i zmień jego zawartość zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ustaw typ przyduktów jako listę w folderze przyduktów.
Przeprowadź identyfikację metabolitów i kontrolę szybkości fałszywych wykryć za pomocą polecenia XY-Meta.exe. Pobierz i zainstaluj pakiet oprogramowania metaX. Następnie edytuj listę próbek.
txt, aby określić próbkę i odpowiadające jej dane spektrometrii mas zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj pliku R dostarczonego z protokołem tekstowym, aby uruchomić skrypt do kwantyfikacji grup makiet i dzikich przy użyciu oprogramowania metaX. Sprawdź folder wyjściowy, w którym przechowywane są wyniki analizy ilościowej, taki jak wykres PCA.
Następnie zmodyfikuj parametry w skrypcie R, aby dodać adnotacje do pików w analizie jakościowej i ilościowej przy użyciu identyfikacji metabolitów w celu zintegrowania zarówno wyników, jak i uruchomienia skryptu R. Wykresy pudełkowe ilościowo oznaczonych metabolitów wykazały, że ogólny rozkład próbek zdrowych i chorobowych był podobny z niewielkimi wahaniami średnich wartości. Tylko w 3,39% metabolitów brakowało więcej niż 30% wartości.
Wykres analizy głównych składowych próbek z obu grup wykazał, że metaX znacznie zwiększył odsetek metabolitów z CV mniejszym niż 0,3. Diagram Venna przedstawiający metabolity wykryte w różny sposób za pomocą trzech metod badań statystycznych ujawnił 119 powszechnych metabolitów. Czas retencji i rozkład masy według ładunku wszystkich opisanych metabolitów wykreślono ze wskaźnikiem fałszywych odkryć mniejszym niż 0,01, wykazując sześć istotnych i różnie wykrytych metabolitów.
Ważne jest, aby ograniczyć czas na testowanie przepływu pracy. Pamiętaj, aby nie wybierać zbyt wielu próbek do analizy i zachować co najmniej dwie próbki w każdej grupie. Technika ta umożliwia kontrolę jakości identyfikacji metabolizowanej na podstawie danych akwizycji niezależnych od danych, tworząc bardziej niezawodną bibliotekę widma referencyjnego przy użyciu wyników dopasowania widma w oparciu o kontrolę FDR.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia jakościową i ilościową analizę niecelowego metabolomu z wykorzystaniem kontroli jakości FDR w celu zmniejszenia fałszywych dodatnich wyników w identyfikacji metabolitów. Przepływ pracy integruje XY-Meta dla bardziej dokładnej oceny FDR poprzez strategię target-decoy.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Metabolomika
- Analiza biochemiczna
- Kontrola stopnia fałszywych odkryć
Tło
- Niecelowa metabolomika jest kluczowa dla odkrywania biomarkerów.
- Kontrola FDR jest niezbędna dla dokładnej identyfikacji metabolitów.
- XY-Meta wykorzystuje strategię target-decoy dla poprawionej analizy.
- MetaX jest stosowany do ilościowego oznaczania metabolitów po ich identyfikacji.
Cel badania
- Rozwój solidnego przepływu pracy dla niecelowej analizy metabolomiki.
- Poprawa dokładności identyfikacji metabolitów.
- Dostarczenie protokołu, który może być replikowany przez badaczy.
Stosowane metody
- Integracja XY-Meta i metaX do analizy metabolomiki.
- Generowanie biblioteki spektralnej decoy z otwartych dostępów spektrów.
- Zastosowanie kontroli FDR do filtrowania fałszywych dodatnich wyników.
- Ilościowe oznaczanie metabolitów za pomocą metaX po ich identyfikacji.
Główne wyniki
- Przepływ pracy skutecznie zmniejsza fałszywe dodatnie wyniki w identyfikacji metabolitów.
- Badaczom umożliwia niezawodne odkrywanie biomarkerów przy użyciu tej metody.
- Strategia target-decoy poprawia solidność analizy.
- Zalecany jest wielokrotny przebieg potoku z parametrami domyślnymi.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia kompleksowe podejście do analizy metabolomiki.
- Poprawia niezawodność identyfikacji metabolitów.
- Zachęca się badaczy do wykorzystania tego przepływu pracy w ich badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput untargeted metabolomics generates vast spectral datasets, challenging data quality and increasing the risk of false positives in metabolite identification. Integrating FDR control via a target-decoy strategy enhances predictive confidence and supports robust biomarker discovery at critical early discovery and lead identification stages. This workflow enables scalable, reproducible metabolome analysis, directly impacting portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of metabolic pathways through FDR-controlled identification.
- Reduces mechanistic ambiguity by filtering false positives in untargeted datasets.
- Supports functional target validation and prioritization of candidate biomarkers.
Screening & Assay Development
- Prepares validated metabolite panels for downstream screening workflows.
- Standardizes quantitative outputs for reproducible compound evaluation.
- Facilitates scalable assay development with robust quality control metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolite annotation with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by integrating qualitative and quantitative data.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-confidence metabolite profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated workflow spans early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and robust biomarker identification.
- Discovery Biology: Provides FDR-controlled metabolite identification to clarify biological mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolite data for assay readiness.
- Analytics: Outputs statistical measures such as PCA plots and CV distributions for condition comparison.
- Translational Research: Connects annotated metabolite profiles to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, cloud-accessible platform for repeated, scalable analyses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces false discovery in metabolite identification.
- Operational Value: Standardizes workflows and enables reproducibility across large datasets.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry data handling and statistical analysis.
- Needs access to spectral libraries, cloud-based analysis platforms, and compatible software (XY-Meta, metaX).
- Demands cross-team standardization of data formats and parameter settings.
- Adaptable to various sample types and model systems with appropriate configuration.
- Analysis throughput and sample size should be managed to ensure workflow efficiency and data quality.
