Name: Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Odkryj optymalizację powierzchni polimerowych do długoterminowej hodowli hepatocytów pochodzenia macierzystego. Metoda obejmuje syntezę poliuretanu PU 1 3 4, dobór rozpuszczalnika oraz proces spin coatingu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.C.H., M.B. i F.K. były wspierane przez EPSRC Follow on Fund. B.L-V i D.S. byli wspierani przez stypendia doktoranckie MRC. Projekt K.C. otrzymał dofinansowanie z UK Instrumentative Medicine Platform.

1. Synteza PHNGAD (poli[1,6-heksanodiol/neopentyloglikol/di(etylenoglikol)-alt-kwas adipinowy]diol)
<img alt="Schemat syntezy poliestru; zawiera struktury chemiczne, warunki reakcji oraz zastosowanie katalizatora." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Schemat 1">
Schemat 1: Synteza PHNAGD. Schematyczne przedstawienie syntezy PHNAGD. PHNAGD otrzymano w wyniku reakcji 1,6-heksanodiolu, glikolu dietylenowego, glikolu neopentylowego i kwasu adypinowego. PHNAGD, Poly[1,6-hexanodiol/neopentyl glycol/di(ethylene glycol)-alt-adipic acid]diol.
<ol>
	<li>Monomery 1,6-heksandiol, glikol di(etylenowy) oraz neopentyloglikol poddać obróbce termicznej w temperaturze 40 °C przez 48 hr w piecu próżniowym w celu usunięcia pozostałości wody. Pozostawić do ochłodzenia do RT w warunkach próżni.</li>
	<li>Do dwuszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne i połączonej z aparatem Dean-Starka dodać po 22 mmol każdego monomeru oraz kwas adypinowy (55 mmol).</li>
	<li>Cały układ umieścić w próżni i delikatnie ogrzewać szklane elementy w temperaturze 40 °C przez 6 hr, aby uniknąć pochłaniania wilgoci podczas dodawania substancji chemicznych do kolby.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki dodać kroplami 0,0055 mol katalizatora, którym jest butylek tytanu(IV).</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 180 °C w atmosferze N2 przez 24 hr, zbierając pozostałą wodę w pułapce Dean-Starka. Pozostawić produkt do ochłodzenia do RT.</li>
</ol>
2. Synteza PU134

<img alt="Schemat syntezy poliuretanu; proces reakcji chemicznej z detalami dotyczącymi katalizatora i przedłużacza łańcucha." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Schemat 2">
Schemat 2: Synteza PU134. Schematyczne przedstawienie syntezy poliuretanu 134. PU134 przygotowano poprzez reakcję 1,0 ekwiwalentu PHNGAD z 2,0 ekwiwalentami 4,4′-metylenobis(izocyjanianu fenylu), a następnie dodanie 1,0 ekwiwalentu 1,4-butanodiolu jako przedłużacza łańcucha.

<ol>
	<li>Zmieszać jeden ekwiwalent poliolu PHNGAD (Mn ~1,800 Da, 3,2 mmol) z dwoma ekwiwalentami 4’4-metylenobis(fenyloizocyjanianku) (6,4 mmol) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (12 ml).</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 70 °C w atmosferze N2.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki dodać kroplami katalizator: butylek tytanu(IV) (0,8% masowo).</li>
	<li>Po 1 h dodać jeden ekwiwalent przedłużacza łańcucha 1,4-butanodiolu (3,2 mmol). Zwiększyć temperaturę do 90 °C i mieszać przez 24 h w atmosferze N2.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji odzyskać poliuretan poprzez precypitację, dodając kroplami eter dietylowy (można również zastosować heksan lub wodę) do roztworu reakcyjnego aż do wystąpienia wytrącenia.</li>
	<li>Odwirować roztwór przy 5,300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odlać nadfiltr i suszyć w 40 °C w suszarce próżniowej do odparowania rozpuszczalnika. 
	Uwaga: Aby upewnić się, że końcowy produkt reakcji posiada prawidłowe parametry w zakresie rozkładu masy cząsteczkowej, grup funkcyjnych polimeru oraz temperatur topnienia i przejścia szklistego, można zastosować różne techniki i metody analityczne, takie jak chromatografia żelowa lub spektroskopia FTIR.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów PU134
<ol>
	<li>Odważ 200 mg PU134 do szklanej butelki.</li>
	<li>Rozcieńcz PU134 do stężenia końcowego 2% w kilku rozpuszczalnikach: chloroformie, mieszaninie chloroformu i toluenu w stosunku 1:1, tetrahydrofuranie oraz mieszaninie tetrahydrofuranu i dichlorometanu w stosunku 1:1. 
	Uwaga: Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika zależy od użytego polimeru. Różne rozpuszczalniki mają różne temperatury wrzenia, co może wpływać na solubilizację polimeru.</li>
	<li>Wstrząśnij roztworem intensywnie przez 20 min w RT za pomocą wytrząsarki z prędkością 200 mot/min, aż roztwór stanie się jednorodny i nie będzie widoczny osad.</li>
</ol>
4. Powlekanie szkiełek przedmiotowych PU134
<ol>
	<li>Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o powierzchni 15 mm2 na wirówce do nanoszenia warstw (spin coater).</li>
	<li>Nanieś za pomocą pipety 50 μl roztworu PU134 na każde szkiełko. Dostosuj objętość roztworu PU134 do wymaganego rozmiaru szkiełka nakrywkowego, zachowując proporcjonalny stosunek objętości do powierzchni.</li>
	<li>Wirować każde szkiełko przez 7 sec przy 23 x g.</li>
	<li>Suszyć szkiełka na powietrzu w RT przez co najmniej 24 hr przed sterylizacją.</li>
</ol>
5. Naświetlanie szkiełka nakrywki
<ol>
	<li>Poddać szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem napromieniowaniu gamma, stosując dawkę 10 Grays za pomocą irradiatora laboratoryjnego przez 12 min.</li>
	<li>Poddać szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem napromieniowaniu UV, używając żarówki UV o mocy 30 W przez 16 min z każdej strony.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem w odpowiedniej płytce do hodowli tkanek, dopasowanej do rozmiaru szkiełka.</li>
</ol>
6. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Pokryć polimerowe szkiełko dekrywacyjne warstwą złota metodą rozpylania przez 200 s w atmosferze o ciśnieniu 5 x 10-1 millibars.</li>
	<li>Wykonać mikrofotografie pokrytego polimerem szkiełka dekrywacyjnego przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego przy napięciu przyspieszającym 20 kV w trybie obrazowania elektronów wtórnych.</li>
</ol>
7. Obserwacje z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych
<ol>
	<li>Zeskanuj obszar 20 x 20 μm powierzchni polimeru.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość skanowania w zakresie od 1.32 Hz do 1.60 Hz.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość 512 x 512 pikseli w skanowanym obszarze.</li>
	<li>Oblicz średnią kwadratową (RMS lub Rq) powłoki, korzystając ze średniej odchyleń wysokości od średniej płaszczyzny danych obrazu, wyrażoną jako: 
	<img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" alt="Szorstkość powierzchni, wzór na Rq, przedstawiający obliczanie średniej kwadratowej wysokości." data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Gdzie Zi jest aktualną wartością Z, a N to liczba punktów w danym obszarze.</li>
	<li>7.5 Oblicz odchylenie lub średnią szorstkość powierzchni (Ra) obrazu, korzystając z wzoru: 
	<img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" alt="Wzór na arytmetyczną średnią szorstkość, Ra=∫|Z(x)|dx, formuła stosowana w analizie powierzchni." data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Gdzie Z (x) jest funkcją opisującą analizowany profil powierzchni pod kątem wysokości (Z) i pozycji (x) próbki wzdłuż długości pomiarowej „L”. Ra reprezentuje średnią wartość powierzchni względem płaszczyzny środkowej.</li>
</ol>
8. Hodowla i różnicowanie komórek
<ol>
	<li>Hodować i różnicować linię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) H9 zgodnie z opisem w publikacji Hay 17.</li>
	<li>Odłączyć komórki przy użyciu odczynnika dysocjującego i ponownym wysiać je na szkiełka pokryte PU134 w 9. dniu procesu różnicowania, w obecności medium bezsurowiczego, zgodnie z opisem w publikacji Szkolnicka 18,19. 
	Uwaga: Preferowane jest zastosowanie enzymatycznej dysocjacji komórek zamiast fizycznego odłączania.</li>
</ol>
9. Analiza funkcjonalna cytochromu p450
<ol>
	<li>Zmierz aktywność CYP3A zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubuj hepatocyty pochodzące z hESC w 13. lub 19. dniu, a także medium bez komórek – jako kontrolę negatywną – z odpowiednim substratem przez 5 hr w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz nadsączki z komórek i medium, a następnie przeprowadź analizę zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmierz poziom aktywności CYP i znormalizuj go względem powierzchni (cm2).</li>
</ol>
10. Immunobarwienie
<ol>
	<li>Przemyć hepatocyty pochodzące z hESC buforem PBS przez 1 min; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Dodać lodowaty 100% metanol w celu utrwalenia komórek, a następnie pozostawić w temperaturze -20 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przemyć komórki buforem PBS przez 5 min; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Inkubować komórki w roztworze PBS/T (0,1% tween)/10% BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odssać roztwór PBST i dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA; inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w warunkach łagodnego mieszania.</li>
	<li>Przemyć komórki roztworem PBS/T (0,1% tween)/1% BSA przez 5 min; powtórzyć trzykrotnie.</li>
	<li>Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciało w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA, dodać do komórek i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 h w warunkach łagodnego mieszania.</li>
	<li>Przemyć komórki buforem PBS przez 5 min; powtórzyć trzykrotnie.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać MOWIOL 488 (zawierający DAPI w stosunku 1:1 000), a następnie ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywki, aby zminimalizować liczbę pęcherzyków powietrza. Utrwalone komórki przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Obserwować barwienie za pomocą mikroskopu z odpowiednim filtrem i lampą fluorescencyjną. Zoptymalizowane przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe wymieniono w Tabeli 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Shanbhag, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Progenitor+Cells+Grown+on+Hydrogel+Surfaces+Respond+to+the+Product+of+the+Transgene+of+Encapsulated+Genetically+Engineered+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts.</a> Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).</li>
<li>Battista, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+composition+of+3D+constructs+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).</li>
<li>Tian, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+hydrogel+as+Nogo-66+receptor+antibody+delivery+system+for+the+repairing+of+injured+rat+brain%3A+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro.</a> Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).</li>
<li>Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenic+growth+factors+from+cells+encapsulated+in+alginate+beads+with+bioactive+glass%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass.</a> Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).</li>
<li>Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+hepatocytes+in+2D+and+3D+culture+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro.</a> The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).</li>
<li>Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+on+silicate+substituted+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3 (3), 034112(2008).</li>
<li>Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+cardiosphere-derived+cells+into+a+mature+cardiac+lineage+using+biodegradable+poly%28N-isopropylacrylamide%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).</li>
<li>Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+approach+to+the+identification+of+polyurethanes+for+the+isolation+of+human+skeletal+progenitor+cells+and+augmentation+of+skeletal+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth.</a> Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).</li>
<li>Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cell+manipulation+and+skeletal+tissue+engineering+using+high-throughput+polymer+blend+formulation+and+microarray+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques.</a> Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermoresponsive+and+chemically+defined+hydrogel+for+long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 4 (1335), (2013).</li>
<li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+hepatic+stem+cell+gene+expression+on+biological+and+synthetic+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata.</a> BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li>
<li>Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell%E2%80%93Derived+Hepatocytes%3A+Potential+and+Challenges+in+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmecol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology.</a> Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).</li>
<li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li>
<li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).</li>
<li>Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+organized+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Culture of organized cell communities.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Vitronectin+Is+a+Functionally+Defined+Substrate+That+Supports+Human+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+via+%CE%B1V%CE%B25+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5 (3195), (2014).</li>
<li>Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communication%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).</li>
<li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Sensing+and+Response+to+Micro-+and+Nanostructured+Surfaces+Produced+by+Chemical+and+Topographic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning.</a> Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li>
<li>Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+contact+guidance+on+well-defined+micro-+and+nanostructured+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates.</a> Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).</li>
<li>Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+interactions+with+topographical+structures%3A+a+novel+method+for+immuno-SEM+labelling+of+focal+adhesions+in+S-phase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).</li>
<li>Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-+and+microscale+holes+modulate+cell-substrate+adhesion%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+-beta1+integrin+localization+in+SV40+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).</li>
<li>Hamilton, D. W., Brunette, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+substratum+topography+on+osteoblast+adhesion+mediated+signal+transduction+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation.</a> Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Dang, J. M., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Induction+of+Aligned+Mesenchymal+Stem+Cell+Sheets+by+Culture+on+Thermally+Responsive+Electrospun+Nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers.</a> Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).</li>
<li>Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+and+gamma+irradiation+effects+on+surface+properties+of+polyurethane+derivate+from+castor+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Pol%C3%ADmeros%22%5BJournal%5D)">UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil.</a> Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).</li>
<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

D.C.H. jest CSO, dyrektorem, założycielem i udziałowcem FibromEd Products Ltd. M.B. i J.P.I. są udziałowcami-założycielami FibromEd Products Ltd.

Wiele z obecnych metod stosowanych do generowania hepatocytów z komórek macierzystych opiera się na niezdefiniowanych matrycach pochodzenia zwierzęcego. Substraty te mogą być kosztowne i bardzo zmienne, wpływając na funkcję i stabilność komórek, stanowiąc istotną barierę w stosowaniu. W związku z tym przeprowadziliśmy badania przesiewowe dla materiałów syntetycznych, które wspomagają hodowlę hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), utworzony przez polimeryzację PHNGA...

Materiały biologiczne są szeroko stosowane w utrzymaniu i różnicowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych 1. Chociaż to możliwe, te biologiczne substraty często zawierają niezliczoną ilość niezdefiniowanych składników. Matrigel jest powszechnie stosowanym substratem do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Niestety, jego zmienny skład wpływa na funkcjonowanie komórki i fenotyp. Chociaż zastosowano wiele alternatywnych, bardziej zdefiniowanych matryc biologicznych 2-7, ich zwierzęce pochodzenie lub słaba skalowalność sprawiają, że nie są one odpowiednimi kandydatami do produkcji przemysłowej. Dlatego też identyfikacja syntetycznych alternatyw, o określonym składzie i niezawodnym działaniu, jest kluczowym celem w badaniach nad komórkami macierzystymi.
Próbując przezwyciężyć ograniczenia niezdefiniowanych substratów do hodowli komórkowych, interdyscyplinarna współpraca między chemią a biologią zidentyfikowała materiały syntetyczne, które mogą wspierać fenotyp komórki. Podłoża syntetyczne są skalowalne, opłacalne i mogą być wytwarzane w złożone struktury 3D, naśladując środowisko in vivo. Ze względu na te właściwości, syntetyczne substraty są szeroko stosowane do wspomagania i stymulowania różnicowania wielu typów komórek 8-10.
Zaawansowane i wysokoprzepustowe testy ułatwiły szybkie badania przesiewowe materiałów syntetycznych z dużych bibliotek i dostarczyły nowatorskich materiałów o elastycznych właściwościach o szerokich zastosowaniach w badaniach i rozwoju biomedycznym 11-13. Wykorzystując wysokowydajną technologię badań przesiewowych mikromacierzy polimerowych, szybko zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), odpowiedni do utrzymania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych. Stwierdzono, że polimer ten jest lepszy od substratów pochodzenia zwierzęcego pod względem różnicowania i funkcji hepatocytów 14-16. Następnie zoptymalizowaliśmy warunki powlekania, topografię i proces sterylizacji, aby uzyskać dostęp do wpływu na wydajność polimeru w stabilizacji funkcji i żywotności hepatocytów. Ma to istotne implikacje w odniesieniu do zrozumienia podstaw biologii hepatocytów w modelowaniu komórkowym i zastosowaniach medycyny regeneracyjnej.
Opisana tutaj technologia stanowi przykład tego, jak powierzchnia syntetycznego polimeru może być zoptymalizowana w celu zachowania fenotypu komórki. Wierzymy, że połączenie tej technologii z wydajnym protokołem różnicowania hepatocytów wolnych w surowicy może zapewnić skalowalną produkcję hepatocytów do wykorzystania w modelowaniu in vitro i medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Synteza, przygotowanie, powlekanie i charakterystyka szkiełek nakrywkowych pokrytych polimerem PU134</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml; HLER</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Naświetlacz</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Specjalistyczny system powlekania</td> <td>wirowego</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy&nbsp;</td><td>Mikroskop sił atomowych Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DimensionV Nanoscope, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Żarówka UV</td> Oprogramowanie do analizy <td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope</td><td>VEECO</td><td></td><td>wersja 1.20</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Użyj oprogramowania Volocity 4</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych</td><td>Corning, Wielka Brytania&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka</td><td>Materiały laboratoryjne MIC3308</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol dietylenowy</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-heksanodiol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Glikol neopentylowy</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Kwas adypinowy</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>butoksydan tytanu (IV)&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanodiol&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Piec próżniowy</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Metylenobis(izocyjanian fenylu)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka do natryskiwania</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate buffer sola fizjologiczna (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>PBST, PBS z 0,1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Zaopatrzenie laboratoriów naukowych Sp. z o.o</td><td>. EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, Wielka Brytania</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Składa się z Tris HCl i glicerolu zgodnie z instrukcjami</td></tr><tr> producenta<td colspan="4">Hodowla komórkowa i test funkcjonalny</td></tr><tr><td>CYP3A activity pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Obecnie jednym z głównych ograniczeń w biologii komórki jest utrzymanie zróżnicowanego fenotypu komórki. Matryce biologiczne są powszechnie stosowane do hodowli i utrzymywania pierwotnych i pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Chociaż matryce biologiczne są przydatne, pozwalają na krótkotrwałą hodowlę hepatocytów, co ogranicza ich powszechne zastosowanie. Podjęliśmy próbę pokonania tych ograniczeń za pomocą syntetycznej powłoki polimerowej. Polimery reprezentują jedną z najszerszych klas biomateriałów i posiadają szeroki zakres właściwości mechanicznych, fizycznych i chemicznych, które można dostosować do określonego celu. Co ważne, takie materiały mogą być skalowane do standardów gwarantowanej jakości i wykazywać spójność między partiami. Jest to niezbędne, jeśli komórki mają być namnażane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w przemyśle farmaceutycznym lub do terapii komórkowej. Poliuretany (PU) to jedna z grup materiałów, które okazały się obiecujące w hodowlach komórkowych. Przedstawiono i omówiono nasze ostatnie postępy w optymalizacji powierzchni pokrytej poliuretanem do długotrwałej hodowli ludzkich hepatocytów o stabilnym fenotypie.

Rozpuszczalnik polimeru wpływa na topografię powierzchni powleczonej polimerem
Poliuretan 134 rozpuszczono w chloroformie, samodzielnie lub w połączeniu z toluenem, tetrahydrofuranem lub dichlorometanem, a następnie na szkiełkach przedmiotowych naniesiono różne formulacje metodą spin-coatingu. Do charakterystyki właściwości fizycznych powłok polimerowych wykorzystano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) oraz mikroskopię sił atomowych (AFM) (Rycina 1). Powł...

Ten artykuł skupi się na rozwijaniu powierzchni pokrytych polimerem do długotrwałej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest optymalizacja powierzchni powlekanych polimerem w celu zachowania długoterminowej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez syntezę poliuretanu 1 3 4 lub PU 1 3 4. Drugim krokiem jest wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozpuszczenia PU 1 34.Następnie optymalizuje się proces powlekania wirówkowego szkiełka przedmiotowego polimerem PU 1 3 4. Ostatnim krokiem jest optymalizacja procedury sterylizacji szkiełek przedmiotowych powleczonych polimerem P 1 34, a następnie wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej, mikroskopii sił atomowych oraz testów metabolizmu leków. Badania te służą wykazaniu wpływu powłoki z polimeru PU 1 34 na funkcję hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie matryc w hodowli w celu utrzymania potencjału komórek macierzystych pochodzących z URI, które są hepatocytami, jest możliwość precyzyjnego dostosowania tych materiałów syntetycznych do konkretnych celów oraz skalowanie ich zgodnie ze standardami zapewnienia jakości. Ponadto wykazują one spójność między partiami.

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Stabilizowanie fenotypu hepatocytów za pomocą zoptymalizowanych syntetycznych powierzchni

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Ostatnie osiągnięcia techniczne umożliwiły skalowaną produkcję platformy in vitro do zastosowań związanych z metabolizmem leków i toksycznością. Całkowicie ludzki układ wątrobowy 2D+ (TV2D+) zapewnia fizjologicznie istotne wyniki przy użyciu tradycyjnych metod hodowli dwuwymiarowej. Protokół ten będzie wspierał użytkowników końcowych w konfiguracji, konserwacji i stosowaniu systemu.

Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

Odkryj optymalizację powierzchni polimerowych do długoterminowej hodowli hepatocytów pochodzenia macierzystego. Metoda obejmuje syntezę poliuretanu PU 1 3 4, dobór rozpuszczalnika oraz proces spin coatingu.

Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Przeglądaj więcej filmów