Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Ogólnym celem tej procedury jest optymalizacja powierzchni pokrytych polimerem w celu zachowania długotrwałej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę poliuretanu 1 3 4 lub PU 1 3 4. Drugim krokiem jest wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozpuszczania PU 1 34.

Następnie optymalizuje się proces powlekania wirowego za pomocą PU 1 3 4 na szkiełku nakrywkowym. Ostatnim krokiem jest optymalizacja procedury sterylizacji szkiełek nakrywkowych powlekanego polimerem P 1 34, docelowo skaningowa mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych i metabolizm leków. Testy służą do wykazania wpływu powłoki polimerowej PU 1 34 na funkcję hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie al Metrices w hodowli w utrzymaniu silnych komórek macierzystych URI, które mają hepatocyty, jest to, że te syntetyczne materiały można precyzyjnie dostosować do celu i skali do standardów gwarantowanej jakości. Ponadto wyświetlają spójność dwóch szyn wsadowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób wątroby, ponieważ stanowi ona przykład tego, jak powierzchnia syntetycznego polimeru może być zoptymalizowana w celu zachowania fenotypu komórki.

Procedurę zademonstruje dr Jeffrey Walton, doktor habilitowany z mojego laboratorium Przed rozpoczęciem tej procedury. Zastosuj obróbkę cieplną do jednego sześciosześciosześciokrotnego pokrętła glikolu etylenowego i glikolu neo PenTile w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 48 godzin w piecu próżniowym. Aby usunąć resztki wody, dodaj 22 milimole każdego monomeru i 55 milimoli kwasu dpicowego do kolby z okrągłym dnem z dwiema szyjkami podłączonej do aparatu Deana Starka i wyposażonej w mieszadło magnetyczne.

Następnie umieść cały zespół w próżni i delikatnie podgrzewaj szkło w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez sześć godzin, aby uniknąć wchłaniania wilgoci podczas dodawania substancji chemicznej do kolby. Po wyjęciu zespołu z pieca i umieszczeniu układu pod azotem, dodać 0,0055 mola katalizatora tytanu czterech, ale tlenek kroplami za pomocą strzykawki do kolby. Mieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez 24 godziny, zbierając resztki wody w pułapce Dean Stark.

Pozostaw produkt do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie zmieszać 3,2 milimola lub jeden równoważnik poliolu P-H-N-G-A-G z 6,4 milimola lub dwoma równoważnikami czterech, czterech izocyjanianów metylu i bisfenolu. W 12 mililitrach bezwodnego DML do dwuszyjkowej kolby okrągłodennej podłączonej do aparatu Dean Stark i wyposażonej w magnetyczny pręt gwiaździsty.

Wymieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 70 stopni Celsjusza w atmosferze azotu. Następnie dodaj katalizator czterotlenek tytanu kroplami za pomocą strzykawki do końcowego stężenia 0,8%Po godzinie dodaj jeden odpowiednik przedłużacza łańcucha jedną tarczę z czterema butanami, aby uzyskać produkt kopolimerowy. Zwiększ temperaturę do 90 stopni Celsjusza i głodź przez 24 godziny w atmosferze azotu.

Gdy mieszanina reakcyjna zostanie wywołana do temperatury pokojowej, eter dal stopniowo do mieszaniny reakcyjnej, aż do zaobserwowania wytrącania się produktu poliuretanowego. Po przeniesieniu mieszaniny reakcyjnej do probówki wirówkowej odwirować roztwór o temperaturze 5, 300 razy G przez pięć minut. Po dekantacji supinat wysycha w temperaturze pokojowej, aż rozpuszczalnik odparuje.

Działa następnie: Zważ 200 miligramów PU 1 34 do szklanej butelki. Rozcieńczyć próbkę do końcowego stężenia 2% w chloroformie lub chloroformie i toluenie w stosunku jeden do jednego lub tetra roranu lub kombinacji tetra roranu anty chlorometanu. W stosunku jeden do jednego energicznie wstrząsać roztworem przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki z prędkością 200 ruchów na minutę, aż roztwór stanie się jednorodny i nie zaobserwuje się osadu.

Po zakończeniu umieść około 15 milimetrów kwadratowych szklanego szkiełka nakrywkowego na wirówce. Nanieść 50 mikrolitrów roztworu PU od jednego do czterech na szkiełko nakrywkowe za pomocą pipety, obracać każde szkiełko nakrywkowe przez siedem sekund w temperaturze 23 razy G. Następnie wysuszyć szkiełko nakrywkowe na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed sterylizacją. W tym momencie naświetlanie promieniami gamma każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego polimerem poprzez nałożenie dawki 10 grejów za pomocą grzejnika laboratoryjnego przez 12 minut.

Alternatywnie, każde szkiełko nakrywkowe pokryte polimerem należy naświetlić promieniami UV za pomocą 30-watowej żarówki UV przez 16 minut z każdej strony. Po zakończeniu umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte polimerem na odpowiedniej płytce do hodowli tkankowej zgodnie z rozmiarem szkiełka nakrywkowego. Po wyhodowaniu i zróżnicowaniu linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych odłącz komórki za pomocą odczynnika dysocjacyjnego i odtwórz je ponownie na powlekanych szkiełkach nakrywkowych PU 1 34 w dziewiątym dniu procesu różnicowania w obecności skaningowej mikroskopii elektronowej wolnej od surowicy.

Obrazy różnych szkiełek nakrywkowych ze szkła powlekanego pokazują, że powłoka toluenem lub chloroformem nie była jednorodna, co świadczy o nierównomiernym pokryciu z wytrącaniem PE 1 34. W przeciwieństwie do tego, czworościan pozwolił na pokrycie wirowe znacznie bardziej jednolitej powierzchni. Dodatkowo, analiza mikroskopowa sił atomowych różnych powłok polimerowych wykazuje 40% zmniejszenie chropowatości P 1 34 rozpuszczonego w tetra hydrofurynie w porównaniu z innymi rozpuszczalnikami, wykazując bardziej jednolitą powłokę PU 1 34 zastosowanie biologiczne, indukowano różnicowanie endodermy wątroby, a w dziewiątym dniu widoczne były komórki podobne do blastów wątroby, przy czym większość komórek wyrażała cytokeratynę 19 białka alfa feta i czynnik jądrowy hepatocytów dla alfa i niski poziom albuminy jako miara funkcji metabolicznej.

Funkcję cytochromu P four 50 oceniano cztery dni po ponownym posadzeniu na różnych powierzchniach pokrytych polimerem. Zaobserwowano dwukrotny wzrost aktywności metabolicznej w komórkach pokrytych powierzchniami pokrytymi tetra hydro fure mpu 1, 3, 4. Wyniki te pokazują, że aktywność metaboliczna hepatocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ulega poprawie dzięki bardziej jednolitej powierzchni powlekającej P 1 34 Obrazowanie kontrastowe nie wykazało żadnych istotnych różnic po napromieniowaniu UV lub gamma, co zostało dodatkowo potwierdzone analizą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Hepatocyty pochodzące z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ponownie posiane na szkiełkach nakrywkowych powlekanych promieniowaniem gamma PU 1 34 wykazały trzykrotny wzrost aktywności CYP three a w porównaniu z komórkami podanymi na szkiełkach nakrywkowych powlekanych promieniowaniem UV PU 1 34. Obserwacje te pokazują, że promieniowanie gamma jest optymalną techniką sterylizacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu jednorodności powłoki między różnymi CLO powłok wirowych i nie zapominać, że praca z oprzyrządowaniem do rozpuszczalników chemicznych może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze wykonywać takie czynności, jak noszenie okularów ochronnych.