Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Metoda ta wytwarza wysoce powtarzalne komórki podobne do hepatocytów w formacie 96 dołków przy użyciu półautomatycznych platform. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, opłacalna, ze zmniejszoną zmiennością i pozwala na masową produkcję 96-dołkowych płytek komórek podobnych do hepatocytów. Przygotuj roztwór o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr rozmrożonej lamininy 521, rozcieńczając ją jednorazowo w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS z wapniem i magnezem.

Użyj automatycznego dozownika do obsługi cieczy ze standardową kasetą dozującą rurkę, aby dodać 50 mikrolitrów roztworu lamininy 521 na dołek na płytkę 96-dołkową. Inkubować płytki pokryte lamininą 521. Po inkubacji odessać roztwór lamininy 521 z powlekanej powierzchni za pomocą ośmiokanałowego adaptera do aspiracji i unikać kontaktu z powlekaną powierzchnią.

Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 mikromolami kinazy związanej z Rho lub inhibitorem ROCK Y27632. Trzymaj płytkę w inkubatorze do momentu wysiewu komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Od zawiesiny komórek trzy razy 10 do piątej komórki na mililitr w pożywce mTeSR1 uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK Y27632.

Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytkę. Po wysianiu umieść płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, na 24 godziny, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Po wyjęciu płytki z inkubatora zbadaj płytkę następnego dnia i sprawdź, czy kontakt między komórkami został nawiązany, a zbieg osiąga 40%Następnie przełącz się na pożywkę różnicującą.

Zbieg komórek odwołuje się do początku różnicowania. Jest to klucz do uzyskania dobrej jakości komórek podobnych do hepatocytów. Początek różnicowania, gdy konfluencja osiągnie 40%Jeśli konfluencja jest wyższa, płytki nie nadają się dobrze do różnicowania.

24 godziny po wysiewie ostrożnie usuń podłoże za pomocą automatycznej, ręcznej elektronicznej pipety kanałowej. I dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki gruntującej endodermę uzupełnioną 100 nanogramami na mililitr aktywiny A i 50 nanogramami na mililitr Wnt3a. Po ostatecznej indukcji endodermy, zmień na pożywkę KSR DMSO w celu specyfikacji hepatoblastów.

I zmieniaj podłoże co dwa dni przez pięć dni. Po różnicowaniu hepatoblastów należy usunąć pożywkę KSR DMSO i przemyć komórki raz pożywką HepatoZYME bez suplementu. Po umyciu dodaj 100 mikrolitrów pożywki do dojrzewania HepatoZYME uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu hepatocytów i 20 nanogramów na mililitr Oncostatin M. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin przez siedem do dziesięciu dni.

W 18 dniu różnicowania utrwal komórki i przeprowadź immunocytochemię, korzystając z obsługi płynów i automatycznej myjki płytki. Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do czasu obrazowania. Następnie wykonaj obrazowanie i kwantyfikację.

W dniu 18 zbadano zmienność i liczbę komórek między studzienkami po barwieniu DAPI. Po uchwyceniu siedmiu pól widzenia dla każdego dołka i ilościowym określeniu liczby jąder nie stwierdzono żadnych różnic statystycznych. Barwienie ludzkich komórek podobnych do hepatocytów lub HLC w dniu 18 wykazało ekspresję markerów hepatocytów HNF4 alfa, albuminy i AFP.

HLC wykazywały również ekspresję białek CYP P450, CYP2D6 i CYP3A4 wykazywały aktywność metaboliczną CYP P450. HLC wykazywały również wyraźny wielokątny wygląd, pokazany przez E-kadherynę. Pomimo standaryzacji tego protokołu, konfluencja komórek przed różnicowaniem ma kluczowe znaczenie dla różnicowania HRC.

Widzimy, że komórka jest niezależna. W związku z tym dla każdej linii komórkowej wymagany jest wysiew sprzedaży i optymalizacja gęstości. Po opanowaniu metodologia ta pozwala na szybkie generowanie wielu płytek ludzkich komórek wątroby do modelowania choroby, badań przesiewowych leków lub badań nad propozycjami leków.

System ten umożliwia generowanie wieloparametrycznych zestawów danych do analizy mechanistycznej dla biologii hepatocytów.