Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Protokół ten zapewnia system różnicowania wątroby pochodzący z komórek macierzystych, który oferuje powtarzalne narzędzie do badania biologii wątroby zarówno w badaniach podstawowych, jak i klinicznych. Łącząc ustandaryzowany i łatwy do przestrzegania protokół z gotowymi odczynnikami do hodowli, system ten pozwala na produkcję komórek progenitorowych wątroby i komórek podobnych do hepatocytów na dużą skalę. Utrzymuj ludzkie komórki pluripotencjalne w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w 10-centymetrowym naczyniu na lamininie-531, karmiąc je codziennie 10 mililitrami pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na miskę.

Aby przygotować płytki z lamininą 521, rozcieńczyć rozmrożoną lamininę 521 w lodowatym DPBS z wapniem i magnezem do końcowego stężenia ośmiu mikrogramów na mililitr. Dodać 250 mikrolitrów roztworu lamininy do każdego dołka płytki 24-dołkowej lub 50 mikrolitrów do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Delikatnie kołysz płytką z boku na bok, aby równomiernie pokryć dołki, a następnie uszczelnij płytki półprzezroczystą elastyczną folią i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W dniu wysiewu komórek należy ogrzać wstępnie powlekane płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 do 60 minut. Odessać roztwór lamininy 521 i dodać do każdej studzienki pożywkę podtrzymującą komórki macierzyste uzupełnioną 10 mikromolowym inhibitorem ROCK, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Gdy płynność liczby komórek osiągnie 70 do 80%, odessaj zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego i umyj każdą szalkę hodowlaną pięcioma mililitrami DPBS bez wapnia i magnezu w temperaturze pokojowej.

Odessać płyn DPBS z naczynia hodowlanego, a następnie dodać pięć mililitrów bezenzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego do naczynia i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem do 10 minut, aż komórki w widoczny sposób oderwą się od naczynia. Delikatnie odłączyć komórki od naczynia hodowlanego za pomocą skrobaka do komórek, a następnie pipetować zawartość każdej studzienki w górę iw dół za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Dla każdej linii komórkowej połącz komórki ze wszystkich studzienek konserwacyjnych w sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Umyj każde opróżnione naczynie hodowlane pięcioma mililitrami pożywki podtrzymującej komórki macierzyste i dodaj popłuczyny do odpowiedniej probówki z zebranymi komórkami. Wykonaj trzy żywotne zliczenia komórek w każdej próbce zbiorczej. Odwirować próbki zbiorcze o masie 250 x g przez pięć minut.

Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze pokojowej o temperaturze od jednego do trzech mililitrów jako pożywkę podtrzymującą komórki macierzyste uzupełnioną 10-mikromolowym inhibitorem ROCK Y27632. Po obliczeniu wymaganej liczby komórek potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości wysiewu, należy ponownie zawiesić komórki do odpowiedniego stężenia i dozować je do wstępnie powlekanych płytek. Całkowita objętość na dołek powinna wynosić jeden mililitr dla płytki 24-dołkowej i 0,1 mililitra dla płytki 96-dołkowej.

Delikatnie kołysz płytkami z boku na bok oraz w przód iw tył, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek, i umieść płytki z nasionami w inkubatorze, kołysząc nimi w przód iw tył oraz z boku na bok. Przygotować pożywkę do ostatecznej indukcji endodermy i do późniejszego różnicowania specyfikacji komórek progenitorowych wątroby, jak opisano w manuskrypcie tekstu. W pierwszym dniu różnicowania należy usunąć zużytą pożywkę ze studzienek i zastąpić ją pożywką pierwszego stopnia.

W dniu drugim, trzecim i czwartym usuń zużyte podłoże i nakarm każdą studzienkę pożywką pierwszego etapu, drugą. W piątym dniu napraw studzienki przeznaczone do ostatecznej analizy różnicowania endodermy. W przypadku pozostałych studzienek usuń zużyte podłoże i nakarm każdą studzienkę pożywką progenitorową wątroby z różnicą łodyg

W 10 dniu zbierz komórki do analizy różnicowania progenitorów wątroby lub przystąp do dalszego różnicowania komórek podobnych do hepatocytów. Aby scharakteryzować kultury różnicowania progenitorów wątroby, użyj barwienia immunologicznego w celu wykrycia ekspresji ostatecznych markerów specyficznych dla endodermy w piątym dniu i markerów specyficznych dla progenitorów wątroby w dniu 10 oraz określ ilościowo procent komórek alfa-dodatnich HNF4. W 10 dniu należy również zmierzyć wydzielanie alfa fetoproteiny i albuminy za pomocą testu ELISA.

Protokół ten został wykorzystany do różnicowania komórek progenitorowych wątroby zarówno od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. W piątym dniu protokołu różnicowania ostateczną specyfikację endodermy oceniono za pomocą ekspresji Sox 17. W obu liniach komórkowych Sox 17 wykazywał wysoką ekspresję z 80 i 87,8% komórek Sox 17 dodatnich odpowiednio dla H9 i P106.

W 10 dniu przodkowie wątroby wykazywali morfologię podobną do bruku. Ponadto oceniono specyfikację progenitora wątroby pod kątem ekspresji HNF4 alfa, AFP, albuminy i cytokeratyny 19. Obie hodowle progenitorów wątroby wykazywały ekspresję płodowych markerów wątrobowych, takich jak HNF4 alfa, AFP i CK 19.

Wydzielanie alfa fetoproteiny wykryto w 10 dniu w obu liniach komórkowych, podczas gdy wydzielanie albuminy nie zostało wykryte w teście ELISA. Zmienność liczby komórek i skuteczność różnicowania progenitorów wątroby oceniano poprzez ilościowe określenie ekspresji HNF4 alfa. W dniu 10 przodkowie wątroby nie wykazywali znaczącej zmienności między rzędami z ponad 95 i 97% komórek alfa-dodatnich HNF4 na studzienkę odpowiednio dla H9 i P106.

Równomierne rozmieszczenie komórek przed rozpoczęciem różnicowania ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jednorodnej populacji komórek progenitorowych wątroby. Aby to osiągnąć, delikatnie kołysz płytkami na boki oraz w przód iw tył, aby zapewnić równomierną dyspersję komórek. Komórki progenitorowe wątroby wytwarzane przez ten protokół mogą być dalej różnicowane do komórek podobnych do hepatocytów do innych testów, oferując powtarzalne i ustandaryzowane narzędzie do modelowania chorób lub badań przesiewowych leków.