Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
2 marca 2017
Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.
Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie ludzkich komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu rekombinowanych matryc lamininy w określonych warunkach. Ta metoda pozwala użytkownikowi na niestandardowe wykonanie funkcjonalnych ludzkich hepatocytów w celu zbadania biologii wątroby w naczyniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jej zdefiniowany charakter pozwala na masową produkcję hepatocytów o wysokim stopniu odtwarzalności eksperymentalnej. Aby rozpocząć eksperyment, rozmrozić 100 mikrogramów na mililitr rekombinowanej lamininy-521 lub LN-521 w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rozcieńczyć rozmrożony LN-521 w lodowatym 1xDBPS z wapniem i magnezem, aby uzyskać roztwór o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Dodaj jeden mililitr roztworu LN-521 o pięciu mikrogramach na mililitr, aby pokryć jedną studzienkę z sześciodołkowej płytki i kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić ją w studzience. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% przez co najmniej dwie godziny w celu pilnego użycia. Przenieść powlekaną płytkę z inkubatora do okapu do hodowli tkankowej. Ostrożnie zassać roztwór powłoki LN-521, nie uszkadzając powlekanej powierzchni. Następnie natychmiast dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego mTeSR
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę generowania ludzkich komórek hepatocyto-podobnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem rekombinowanych macierzy lamininy. Przedstawia on skalowalny i zgodny z zasadami GMP system produkcji funkcjonalnych hepatocytów do badań nad wątrobą.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Różnicowanie komórek
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad wątrobą
Wstęp
- Ludzkie komórki przypominające hepatocyty są kluczowe dla badania biologii wątroby.
- Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Rekombinowane macierze lamininy wspierają adhezję i wzrost komórek.
- Znormalizowane metody zwiększają powtarzalność badań.
Cel badania
- Opracowanie kosztowo efektywnej metody wytwarzania komórek hepatocytopodobnych.
- Umożliwienie masowej produkcji funkcjonalnych hepatocytów.
- Ułatwienie badań nad biologią wątroby i modelowaniem chorób.
Zastosowane metody
- rozmrażanie i rozcieńczanie rekombinacyjnej lamininy-521.
- powlekanie płytek hodowlanych roztworem lamininy.
- inkubacja płytek w celu wspomagania adhezji komórek.
- dodawanie uprzednio ogrzanego medium mTeSR do hodowli komórkowej.
Główne wyniki
- Pomyślna generacja ludzkich komórek hepatocytopodobnych.
- Wysoka powtarzalność produkcji komórek.
- Potwierdzenie charakterystyki funkcjonalnej komórek hepatocytopodobnych.
- Skalowalny system odpowiedni do różnorodnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodny sposób otrzymywania hepatocytów.
- Wspiera ona zarówno podstawowe, jak i stosowane badania nad wątrobą.
- W przyszłych badaniach system ten może zostać wykorzystany do testowania leków oraz modelowania chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zdefiniowane systemy różnicowania ograniczają zmienność między partiami w produkcji komórek przypominających hepatocyty, co zwiększa powtarzalność w przypadku przedklinicznych modeli wątroby. Skalowalne procesy zgodne z GMP zapewniają spójne dostawy do badań nad metabolizmem leków i toksycznością. Rozwiązuje to kluczowy problem w przekształcaniu hepatocytów pochodzenia komórek macierzystych w zastosowania przemysłowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków wątrobowych z wykorzystaniem fizjologicznie istotnych, skalowalnych modeli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowane macierze lamininy minimalizują zmienność, zwiększając spójność analiz w różnych eksperymentach.
- Wartość prognostyczna: Wysoka powtarzalność wspiera wiarygodne badania oddziaływania na cel oraz mechanizmu działania.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie komórek przypominających hepatocyty o stabilnej funkcji metabolicznej do badań przesiewowych związków.
- Wartość operacyjna: Warunki bezsurowicze i zdefiniowane umożliwiają standaryzację w różnych laboratoriach i miejscach produkcji.
- Skalowalność: Zgodność z liniami hPSC stosowanymi w badaniach oraz w standardzie GMP zapewnia skalowalną podaż komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Komórki wykazują fenotyp i funkcje podobne do pierwotnych hepatocytów, co zwiększa wiarygodność modelu choroby.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowany system redukuje zmienność między partiami, co wspiera badania umożliwiające złożenie wniosku IND.
- Ciągłość translacyjna: Łączy różnicowanie komórek macierzystych z przedkliniczną walidacją terapeutyków celowanych w wątrobę.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając skalowalne źródło funkcjonalnych hepatocytów do dalszych zastosowań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez w biologii wątroby przy użyciu powtarzalnego, zdefiniowanego różnicowania.
- Przesiewy: Umożliwia standaryzowaną produkcję komórek przypominających hepatocyty w celu spójnej oceny związków.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty funkcjonalne (np. albuminy, mocznika) do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od etapu różnicowania do przedklinicznych modeli chorób wątroby i odpowiedzi na leki.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Zdefiniowana, skalowalna platforma wspiera ponowne wykorzystanie w różnych projektach i ośrodkach, redukując obciążenie związane z ponowną optymalizacją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie funkcji hepatocytów zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w testach związanych z wątrobą.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowane składniki oraz proces bez udziału surowicy zwiększają powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję zmienności biologicznej w danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Dostosowana do ryzyka priorytetyzacja kandydatów celowanych w wątrobę dzięki niezawodnym systemom modelowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w protokołach hodowli i różnicowania komórek macierzystych.
- Dostęp do macierzy rekombinowanych laminin oraz zdefiniowanych mediów do różnicowania.
- Standaryzacja procedur powlekania i inkubacji pomiędzy zespołami.
- Uwagi dotyczące adaptacji dla różnych linii hPSC oraz formatów skalowania.
- Ograniczenia obejmują dojrzałość funkcjonalną w porównaniu z hepatocytami pierwotnymi, zgodnie z treścią źródłową.
