Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
March 2nd, 2017
Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.
Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie ludzkich komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu rekombinowanych matryc lamininy w określonych warunkach. Ta metoda pozwala użytkownikowi na niestandardowe wykonanie funkcjonalnych ludzkich hepatocytów w celu zbadania biologii wątroby w naczyniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jej zdefiniowany charakter pozwala na masową produkcję hepatocytów o wysokim stopniu odtwarzalności eksperymentalnej. Aby rozpocząć eksperyment, rozmrozić 100 mikrogramów na mililitr rekombinowanej lamininy-521 lub LN-521 w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rozcieńczyć rozmrożony LN-521 w lodowatym 1xDBPS z wapniem i magnezem, aby uzyskać roztwór o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Dodaj jeden mililitr roztworu LN-521 o pięciu mikrogramach na mililitr, aby pokryć jedną studzienkę z sześciodołkowej płytki i kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić ją w studzience. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% przez co najmniej dwie godziny w celu pilnego użycia. Przenieść powlekaną płytkę z inkubatora do okapu do hodowli tkankowej. Ostrożnie zassać roztwór powłoki LN-521, nie uszkadzając powlekanej powierzchni. Następnie natychmiast dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego mTeSR
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wytwarzania ludzkich komórek wątrobowopodoobnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rekombinowanych macierzy lamininy. Zapewnia skalowalny i przystosowany do GMP system do produkcji funkcjonalnych hepatocytów do badań nad wątrobą.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Różnicowanie komórek
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad wątrobą
Tło
- Ludzkie komórki wątrobowopodobne są niezbędne do badań nad biologią wątroby.
- Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Rekombinowane macierze lamininy wspomagają adhezję i wzrost komórek.
- Standaryzowane metody poprawiają powtarzalność badań.
Cel badania
- Opracowanie opłacalnej metody produkcji komórek wątrobowopodoobnych.
- Możliwość masowej produkcji funkcjonalnych hepatocytów.
- Ułatwienie badań nad biologią wątroby i modelowanie chorób.
Zastosowane metody
- Roztapianie i rozcieńczanie rekombinowanego lamininu-521.
- Pokrywanie płytek hodowlany komórek roztworem lamininy.
- Inkubacja płytek w celu promowania adhezji komórek.
- Dodawanie podgrzanego mTeSR do kultury komórek.
Główne wyniki
- Udana generacja ludzkich komórek wątrobowopodoobnych.
- Wysoka powtarzalność produkcji komórek.
- Potwierdzono funkcjonalne cechy komórek wątrobowopodoobnych.
- Skalowalny system nadający się do różnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodne podejście do produkcji hepatocytów.
- Wspiera zarówno podstawowe, jak i zastosowane badania nad wątrobą.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać ten system do testowania leków i modelowania chorób.
