Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
2 marca 2017
Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.
Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie ludzkich komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu rekombinowanych matryc lamininy w określonych warunkach. Ta metoda pozwala użytkownikowi na niestandardowe wykonanie funkcjonalnych ludzkich hepatocytów w celu zbadania biologii wątroby w naczyniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jej zdefiniowany charakter pozwala na masową produkcję hepatocytów o wysokim stopniu odtwarzalności eksperymentalnej. Aby rozpocząć eksperyment, rozmrozić 100 mikrogramów na mililitr rekombinowanej lamininy-521 lub LN-521 w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rozcieńczyć rozmrożony LN-521 w lodowatym 1xDBPS z wapniem i magnezem, aby uzyskać roztwór o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Dodaj jeden mililitr roztworu LN-521 o pięciu mikrogramach na mililitr, aby pokryć jedną studzienkę z sześciodołkowej płytki i kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić ją w studzience. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% przez co najmniej dwie godziny w celu pilnego użycia. Przenieść powlekaną płytkę z inkubatora do okapu do hodowli tkankowej. Ostrożnie zassać roztwór powłoki LN-521, nie uszkadzając powlekanej powierzchni. Następnie natychmiast dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego mTeSR
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę generowania ludzkich komórek przypominających hepatocyty z pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem rekombinowanych macierzy lamininy. Przedstawia on skalowalny i zgodny z zasadami GMP system produkcji funkcjonalnych hepatocytów do badań nad wątrobą.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Różnicowanie komórek
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad wątrobą
Wstęp
- Ludzkie komórki hepatocytopodobne są kluczowe dla badania biologii wątroby.
- Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Rekombinowane macierze lamininowe wspierają adhezję i wzrost komórek.
- Znormalizowane metody zwiększają powtarzalność badań.
Cel badania
- Opracowanie kosztowo efektywnej metody produkcji komórek przypominających hepatocyty.
- Umożliwienie masowej produkcji funkcjonalnych hepatocytów.
- Ułatwienie badań nad biologią wątroby oraz modelowaniem chorób.
Zastosowane metody
- Rozmrażanie i rozcieńczanie rekombinowanej lamininy-521.
- Powlekanie płytek do hodowli komórkowej roztworem lamininy.
- Inkubowanie płytek w celu promowania adhezji komórek.
- Dodawanie uprzednio ogrzanego mTeSR do hodowli komórkowej.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie ludzkich komórek przypominających hepatocyty.
- Wysoka powtarzalność produkcji komórek.
- Potwierdzenie charakterystyki funkcjonalnej komórek przypominających hepatocyty.
- Skalowalny system odpowiedni dla różnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do produkcji hepatocytów.
- Wspiera ona zarówno podstawowe, jak i stosowane badania nad wątrobą.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten system do testowania leków i modelowania chorób.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zdefiniowane systemy różnicowania ograniczają zmienność między partiami w produkcji komórek przypominających hepatocyty, zwiększając powtarzalność dla przedklinicznych modeli wątroby. Skalowalne procesy zgodne z GMP zapewniają stałe dostawy do badań metabolizmu leków i toksyczności. Rozwiązuje to kluczowy problem w przenoszeniu zastosowań hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do praktyki przemysłowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków wątrobowych z wykorzystaniem fizjologicznie istotnych, skalowalnych modeli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowane macierze lamininy minimalizują zmienność, poprawiając spójność testów w różnych eksperymentach.
- Wartość prognostyczna: Wysoka powtarzalność wspiera wiarygodne badania angażowania celu oraz mechanizmów działania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie komórek przypominających hepatocyty o stabilnej funkcji metabolicznej do skriningu związków.
- Wartość operacyjna: Warunki zdefiniowane, wolne od surowicy, umożliwiają standaryzację pomiędzy laboratoriami a miejscami produkcji.
- Skalowalność: Kompatybilność z liniami hPSC stosowanymi w badaniach oraz w standardzie GMP umożliwia skalowalną podaż komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Komórki wykazują fenotyp i funkcje podobne do pierwotnych hepatocytów, co poprawia wierność modelu choroby.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowany system redukuje zmienność między partiami, wspierając badania umożliwiające złożenie wniosku o IND.
- Ciągłość translacyjna: Stanowi pomost między różnicowaniem komórek macierzystych a przedkliniczną walidacją terapeutyków celowanych w wątrobę.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, zapewniając skalowalne źródło funkcjonalnych hepatocytów do dalszych zastosowań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez w biologii wątroby przy użyciu powtarzalnego, zdefiniowanego różnicowania.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowaną produkcję komórek hepatocytopodobnych w celu spójnej oceny związków.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty funkcjonalne (np. albuminy, mocznika) do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od różnicowania do przedklinicznych modeli chorób wątroby i odpowiedzi na leki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zdefiniowana, skalowalna platforma umożliwia ponowne wykorzystanie w różnych projektach i ośrodkach, zmniejszając obciążenie związane z ponowną optymalizacją.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność co do funkcji hepatocytów zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach związanych z wątrobą.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowane komponenty oraz proces bez udziału surowicy zwiększają powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie zmienności biologicznej w danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów celowanych w wątrobę z uwzględnieniem ryzyka dzięki zastosowaniu wiarygodnych systemów modelowych.
Kwestie wdrożeniowe
- Doświadczenie w protokołach hodowli i różnicowania komórek macierzystych.
- Dostęp do rekombinowanych macierzy lamininy i zdefiniowanych mediów do różnicowania.
- Standaryzacja procedur powlekania i inkubacji pomiędzy zespołami.
- Uwzględnienie adaptacji dla różnych linii hPSC i formatów skalowania.
- Ograniczenia obejmują dojrzewanie funkcjonalne w porównaniu z pierwotnymi hepatocytami, zgodnie z treścią źródła.
