Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu hepatologii i toksykologii oraz dać nam możliwość opracowania nowych modeli wątroby do kohodowli in vitro i inżynierii tkankowej. Zaletą tej nowej techniki jest wyizolowanie wszystkich populacji komórek wątroby od tego samego dawcy i tego samego małego fragmentu tkanki wątroby. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ świeżo wyciętą tkankę wątroby w warunkach poduszek i umieść próbkę tkanki wątroby w okapie z laminarnym przepływem powietrza.

Następnie oczyść krew z powierzchni próbki tkanki. Następnie przepłucz kaniule za pomocą 1X roztworu perfuzyjnego. Użyj kleju tkankowego, aby przymocować oliwki kaniul w większych naczyniach krwionośnych.

Następnie przetestuj perfuzję i sprawdź, czy nie ma wycieków z kaniul. Następnie zamknij wszystkie naczynia krwionośne, z których wycieka przezroczysty roztwór perfuzyjny 1X, za pomocą kleju tkankowego. Następnie umieść kaniulowaną próbkę tkanki wątroby w lejku Buchnera.

Następnie ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej w zakresie od 7,5 do 14,6 mililitrów na minutę, w zależności od liczby użytych kaniul i oporu tkanki wątroby. Ukrwić tkankę, aż pełna krew zostanie wypłukana przez co najmniej 20 minut, a maksymalnie przez 30 minut. W niektórych przypadkach może być konieczne zaciśnięcie jednej z kaniul za pomocą plastikowych klamer lub zwiększenie wewnętrznego ciśnienia obszaru poprzez miękkie dociśnięcie do torebki wątroby szpatułką w celu optymalizacji perfuzji.

Całkowita zmiana koloru z brązowawo-czerwonego na jasnobrązowy lub jasnożółty wskazuje na dobrą perfuzję. Następnie zmień płyn perfuzyjny na roztwór trawiący zawierający kolagenazę P. Następnie zmień konfigurację dla etapu trawienia. Następnie wykonuj okrężny przepływ roztworu wytrawiającego przez maksymalnie 15 minut.

Okresowo przerywaj perfuzję i sprawdzaj stopień trawienia. Istotne jest, aby perfuzja z roztworem wytrawiającym została natychmiast przerwana, gdy próbka tkanki wątroby zostanie wystarczająco strawiona. Wyjmij wątrobę z urządzenia, gdy będzie gotowa i włóż ją do szklanego naczynia.

Przepłukać zewnętrzną część próbki tkanki lodowatym roztworem Stop. Usuń kaniule z próbki tkanki wątroby. Następnie użyj skalpela, aby otworzyć próbkę tkanki wątroby, nacinając środek obszaru, w którym przymocowano kaniule i upewnij się, że kapsułka Glissona pozostaje nienaruszona.

Wypłucz wnętrze próbki tkanki, a następnie przykryj całą próbkę tkanki roztworem zatrzymującym. Następnie delikatnie potrząśnij tkanką, aby uwolnić z niej komórki. Następnie zbierz zawiesinę komórkową i przefiltruj ją przez lejek z gazy do 10 50-mililitrowych plastikowych probówek.

Dodaj więcej roztworu Stop do próbki tkanki wątroby, aż do zużycia końcowej objętości 500 mililitrów. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową, zbierz supernatant do późniejszej izolacji NPC i połącz granulki komórek w 250-mililitrowych plastikowych probówkach. Następnie umyj granulki komórek PBS.

W tym celu odwiruj zawiesinę komórek. Zebrać supernatant, zebrać osadki i ponownie zawiesić osad w pożywce do inkubacji hepatocytów. Następnie określ liczbę komórek i żywotność w powstałej zawiesinie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.

Aby wyizolować niemiąższowe komórki wątroby, należy odwirować pobrany supernatant w celu wyeliminowania pozostałych erytrocytów i hepatocytów. Zebrać supernatanty i odwirować je dwukrotnie, aby uzyskać osady komórek do sedymentacji HCS, LEC, częściowo KC i pozostałej KC. Następnie ponownie zawieś granulki w HBSS. Następnie przygotuj gradient gęstości 25% i 50%, mieszając roztwór gradientu gęstości i PBS do wirowania w gradiacji gęstości.

Ostrożnie umieść roztwór gradientu o gęstości 25% na warstwie roztworu o gradiencie o gęstości 50%. Następnie ostrożnie i powoli umieść zawiesinę NPC na warstwie roztworu gradientu o gęstości 25%, aby uzyskać wyraźną separację obu warstw. Odwirować zawiesinę komórek na gradieniu gęstości bez przerwy.

NPC znajdują się na przecięciu między warstwami gradientu gęstości 25% i 50%. Odessaj martwe komórki i resztki komórek z najwyższej warstwy i ostrożnie zbierz interfazę. Po podwójnym odwirowaniu wykonaj zliczanie komórek dla frakcji KC i MPC.

Następnie odwiruj frakcję NPC za pomocą wcześniej opisanego kroku podwójnego wirowania i ponownie zawieś NPC w pożywce do wysiewu Kupffer Cell. Wysiewać frakcję zawierającą KC na plastikowych naczyniach do hodowli komórkowych o gęstości od pięciu razy 10 do 5 KC na centymetr kwadratowy. Inkubuj kultury KC przez 20 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla.

Pierwotne KC powinno w krótkim czasie przylegać do tworzyw sztucznych z kultur komórkowych. Następnie zbierz supernatant zawierający nieprzylegającego NPC składającego się głównie z LEC i HSC. Aby oddzielić LEC od HSC, należy rozpocząć od odwirowania supernatantu.

Następnie umyj granulki PBS. Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w pożywce do separacji komórek śródbłonka komórek gwiaździstych i przeprowadzić zliczanie komórek dla wszystkich pozostałych komórek. Następnie ponownie zawieś 10 milionów komórek w jednym mililitrze podłoża do separacji komórek śródbłonka komórek gwiaździstych.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu blokującego z zestawu MAX i 20 mikrolitrów mikrogranulek CD31 do znakowania immunologicznego i inkubuj powstałą zawiesinę przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy oddzielić LEC od HSC zgodnie z opisem w protokole producenta dla magnetycznie aktywowanego systemu sortowania komórek max i zebrać frakcję HSC. Eluować magnetycznie zatrzymane CD31-dodatnie LEC i zawiesić je w pożywce do hodowli komórek śródbłonka z komórek gwiaździstych.

Tutaj obrazy te pokazują różne izolowane populacje komórek wątroby bezpośrednio po procesie izolacji w widoku mikroskopii z kontrastem fazowym. Ten zestaw zdjęć przedstawia wyizolowane i wyhodowane komórki po 24 godzinach hodowli. Przedstawiono tutaj charakterystykę różnych frakcji komórkowych opartą na immunofluorescencji.

PHH wykazał dodatnie sygnały dla markera hepatocytów CK18 24 godziny po izolacji, KC były dodatnie dla markera CD68 24 godziny po izolacji, LEC wykazały dodatnie sygnały dla wimentyny 72 godziny po izolacji, a HSC były dodatnie dla GFAP 72 godziny po izolacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że udana izolacja zależy od optymalnego trawienia próbki tkanki wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kontrolować trawienie i jak przeprowadzić separację gradientu gęstości, które są krytycznymi etapami tej procedury.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami medycznymi do badania funkcji i chorób wątroby w nowo utworzonych hodowlach komórkowych in vitro i modelach wątroby opartych na inżynierii tkankowej.