Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hepatologii i toksykologii oraz daje możliwość opracowania nowych in vitro modeli kokultur oraz tkankowo inżynieryjnych modeli wątroby. Zaletą tej nowej techniki jest możliwość wyizolowania wszystkich populacji komórek wątroby od tego samego dawcy i z tego samego niewielkiego fragmentu tkanki wątroby. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ świeżo pobraną tkankę wątroby w warunkach sterylnych, a następnie umieść próbkę tkanki wątroby w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Następnie oczyść powierzchnię próbki tkanki z krwi. W dalszej kolejności przemyj kaniule, używając 1X roztworu perfuzyjnego jeden. Użyj kleju tkankowego, aby przymocować oliwki kaniul w większych naczyniach krwionośnych.

Następnie należy przetestować perfuzję i sprawdzić, czy kaniule nie przeciekają. W dalszej kolejności wszystkie naczynia krwionośne, z których wycieka przejrzysty 1X roztwór perfuzyjny, należy zamknąć za pomocą kleju tkankowego. Po tym kroku kaniulowaną próbkę tkanki wątroby należy umieścić w lejku Büchnera.

Następnie ustaw prędkość przepływu pompy perystaltycznej w zakresie od 7,5 do 14,6 ml/min, w zależności od liczby użytych kaniul i oporu tkanki wątroby. Perfunduj tkankę aż do całkowitego wypłukania krwi przez co najmniej 20 minut, maksymalnie przez 30 minut. W niektórych przypadkach może być konieczne zakleszczowanie jednej z kaniul za pomocą plastikowych zacisków lub zwiększenie ciśnienia wewnętrznego w danym obszarze poprzez delikatny nacisk szpatułką na torebkę wątroby w celu optymalizacji perfuzji.

Całkowita zmiana barwy z brązowo-czerwonej na jasnobrązową lub jasnożółtą świadczy o prawidłowej perfuzji. Następnie należy wymienić płyn perfuzyjny na roztwór trawienny zawierający kolagenazę P. Potem należy odpowiednio przekonfigurować układ do etapu trawienia. Następnie przeprowadza się cyrkulację roztworu trawiennego przez maksymalnie 15 minut.

Okresowo przerywaj perfuzję i sprawdzaj stopień trawienia. Niezbędne jest natychmiastowe zaprzestanie perfuzji roztworem trawiennym, gdy próbka tkanki wątroby zostanie trawiona w stopniu wystarczającym. Po zakończeniu procesu wyjmij wątrobę z urządzenia i umieść ją w szklanym naczyniu.

Opłucz zewnętrzną powierzchnię próbki tkanki lodowatym roztworem zatrzymującym (Stop Solution). Usuń kaniule z próbki tkanki wątroby. Następnie, za pomocą skalpela, otwórz próbkę tkanki wątroby, wykonując nacięcie w środkowej części obszaru, w którym przymocowane były kaniule, dbając o to, aby torebka Glissona pozostała nienaruszona.

Opłucz wnętrze próbki tkanki, a następnie pokryj całą próbkę Roztworem Stop. Następnie delikatnie potrząśnij tkanką, aby uwolnić z niej komórki. Po tym czasie zbierz zawiesinę komórkową i przefiltruj ją przez lejek z gazą do 10 plastikowych probówek o pojemności 50 ml.

Dodaj więcej roztworu stopującego (Stop Solution) do próbki tkanki wątroby, aż do uzyskania końcowej objętości 500 mililitrów. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową, zbierz nadsącz do późniejszej izolacji NPC i przenieś osady komórkowe do plastikowych probówek o pojemności 250 mililitrów. Następnie przemyj osady komórkowe buforem PBS.

W tym celu odwiruj zawiesinę komórkową. Zbierz nadsącz, połącz osady i resuspenduj osad w pożywce do inkubacji hepatocytów. Następnie określ liczbę i żywotność komórek w otrzymanej zawiesinie komórkowej, wykorzystując barwienie błęknitem trypanowym.

Aby wyizolować nieparenchymalne komórki wątroby, odwiruj zebrany nadsącz, aby usunąć pozostałe erytrocyty i hepatocyty. Zbierz nadsącze i odwiruj je dwukrotnie, aby uzyskać osady komórkowe do sedymentacji HCS, LEC, częściowo KC oraz pozostałych KC. Następnie resuspenderuj osady w HBSS. Potem przygotuj gradient gęstości 25% i 50%, mieszając roztwór do gradientu gęstości z PBS w celu przeprowadzenia wirowania w gradiencie gęstości.

Ostrożnie nanieś roztwór gradientu gęstości 25% na warstwę roztworu gradientu gęstości 50%. Następnie, ostrożnie i powoli nanieś zawiesinę NPC na warstwę roztworu gradientu gęstości 25%, aby uzyskać wyraźny rozdział obu warstw. Odwiruj zawiesinę komórkową w gradiencie gęstości bez hamowania.

Komórki NPC znajdują się na granicy faz między warstwami gradientu gęstości 25% a 50%. Odessaj martwe komórki i debris komórkowy z najwyższej warstwy, a następnie ostrożnie pobierz frakcję z granicy faz. Po podwójnym wirowaniu przeprowadź zliczenie komórek KC oraz frakcji MPC.

Następnie frakcję NPC poddaj wirowaniu za pomocą wcześniej opisanego podwójnego etapu centryfugacji i resuspenduj NPC w medium do wysiewu komórek Kupffera. Wysiej frakcję zawierającą KC na plastikowe naczynia do hodowli komórkowej w gęstości 5 × 10⁵ KC na centymetr kwadratowy. Inkubuj hodowle KC przez 20 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Pierwotne KC powinny przywrzeć do tworzywa sztucznego w naczyniu do hodowli komórkowej w krótkim czasie. Następnie należy zebrać nadsącz zawierający nieprzylegające NPC, składające się głównie z LEC i HSC. Aby oddzielić LEC od HSC, należy rozpocząć od wirowania nadsączu.

Następnie przemyj osad PBS. Po drugiej wirowaniu resuspenduj komórki w medium do separacji komórek endotelialnych i gwiazdzkowatych, a następnie wykonaj obliczanie liczby wszystkich pozostałych komórek. W kolejnym kroku resuspenduj 10 milionów komórek w jednym mililitrze medium do separacji komórek endotelialnych i gwiazdzkowatych.

Następnie dodaj 20 µL roztworu blokującego z zestawu MAX oraz 20 µL mikrokulek CD31 do immunoznakowania i inkubuj otrzymaną zawiesinę przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie oddziel LEC od HSC zgodnie z protokołem producenta dla systemu magnetycznego sortowania komórek Max i zbierz frakcję HSC. Eluuj magnetycznie zatrzymane LEC CD31-dodatnie i zawieś je w pożywce do hodowli komórek śródbłonka komórek gwiaździstych.

Poniższe obrazy przedstawiają różne populacje izolowanych komórek wątroby bezpośrednio po procesie izolacji w widoku mikroskopii kontrastowej. Ten zestaw obrazów prezentuje izolowane i hodowane komórki po 24 godzinach hodowli. Tutaj pokazano charakterystykę różnych frakcji komórkowych opartą na immunofluorescencji.

PHH wykazały pozytywne sygnały dla markera hepatocytów CK18 24 godziny po izolacji, KC były pozytywne dla markera CD68 24 godziny po izolacji, LEC wykazały pozytywne sygnały dla vimentyny 72 godziny po izolacji, a HSC były pozytywne dla GFAP 72 godziny po izolacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie, że sukces izolacji zależy od optymalnego trawienia próbki tkanki wątrobowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak kontrolować proces trawienia oraz jak przeprowadzać separację w gradiencie gęstości, które są krytycznymi etapami tej procedury.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny do zgłębiania funkcji i chorób wątroby w nowo stworzonych hodowlach komórkowych in vitro oraz inżynieryjnych modelach tkanki wątroby.