Name: Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby z jednego fragmentu tkanki. Technika zapewnia wysoką żywotność i wydajność komórek, umożliwiając tworzenie zaawansowanych modeli in vitro do badań hepatologicznych i toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jia Li Liu za wsparcie w tworzeniu Rysunku 1. Badanie to było wspierane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) w ramach projektu Virtual Liver: 0315741.

Uwaga: Wszystkie komórki wyizolowano z wyciętej, nietumorowej tkanki wątroby człowieka, która pozostała po częściowej resekcji wątroby z pierwotnymi lub wtórnymi guzami wątroby. Świadoma zgoda pacjentów została uzyskana zgodnie z wytycznymi etycznymi Charité - Universitätsmedizin Berlin.
1. Przygotowanie materiałów i roztworów
<ol>
	<li>Wcześniej wysterylizuj wszystkie instrumenty i materiały, aby uniknąć kontaminacji bakteryjnej podczas procesu izolacji.</li>
	<li>Przygotuj roztwory niezbędne do perfuzji próbki tkanki wątroby, procesu izolacji hepatocytów i nieparenchymalnych komórek wątroby oraz hodowli pierwotnych ludzkich komórek wątroby zgodnie z Tabelami 1 i 2, z wyjątkiem roztworu do trawienia (Digestion-Solution), który należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Wszystkie roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C i zaleca się ich zużycie w ciągu 4 tygodni od przygotowania.</li>
	<li>Wszystkie roztwory wysterylizuj za pomocą filtra nakrętkowego 0,22 µm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sprzętu do perfuzji
<ol>
	<li>Przygotować sprzęt do perfuzji i trawienia próbki tkanki wątroby, zgodnie z Rysunkiem 1A.</li>
	<li>Ustawić temperaturę kąpieli wodnej na 39 °C, aby zapewnić optymalną aktywność kolagenazy P podczas perfuzji i trawienia.</li>
</ol>
3. Perfuzja i trawienie próbki tkanki wątroby (1,5 godz.)
<ol>
	<li>Z wyciętego fragmentu wątroby wybierz próbkę tkanki z nienaruszoną torebką Glissona. Podczas wycinania próbki tkanki staraj się uzyskać małą powierzchnię cięcia z dobrze widocznymi naczyniami. Aby uniknąć niedokrwienia na ciepło, transportuj i przechowuj próbkę tkanki wątroby w lodzie do momentu perfuzji.</li>
	<li>Zważ tkankę w warunkach sterylnych i umieść próbkę tkanki wątroby w szalce Petriego w laminarnym przepływie powietrza. Oczyść powierzchnię próbki tkanki sterylnym gazikiem z pozostałości krwi i przepłucz zestaw kaniul za pomocą 1x Perfusion-Solution I, aby upewnić się, że wszystkie kaniule są drożne.</li>
	<li>Użyj kleju tkankowego, aby przymocować oliwki kaniul w większych naczyniach krwionośnych. W zależności od wielkości próbki tkanki wątroby i liczby naczyń na powierzchni, użyj zestawu od 3 do 8 kaniul. Przetestuj perfuzję i sprawdź, czy nie ma wycieków. Wszystkie naczynia krwionośne, z których wycieka bezbarwny 1x Perfusion-Solution I, zamknij za pomocą kleju tkankowego.</li>
	<li>Umieść kaniulowaną próbkę tkanki wątroby w lejku Büchnera na perforowanej tarczy filtrującej (Rysunek 1A).</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej w zakresie od 7,5 ml/min do 14,6 ml/min, w zależności od liczby użytych kaniul i oporu tkanki wątroby. Każdorazowo dostosowuj natężenie przepływu, aby zapewnić stałą, lecz powolną perfuzję. Perfunduj tkankę aż do całkowitego wypłukania krwi, ale nie krócej niż przez 20 min. Obserwuj jaśnienie tkanki w obszarach z dobrą perfuzją. 
	Uwaga: W niektórych przypadkach, w celu optymalizacji perfuzji, może być konieczne zaklemowanie jednej z kaniul plastikowymi klamrami lub zwiększenie ciśnienia wewnętrznego w danym obszarze poprzez delikatne naciskanie szpatułką na torebkę wątroby. Całkowita zmiana koloru na jasny żółty lub jasnobrązowy świadczy o prawidłowej perfuzji.</li>
	<li>Zmień płyn do perfuzji na Digestion-Solution zawierający kolagenazę P (Tabela 1).</li>
	<li>Przebuduj układ (Rysunek 1A) na potrzeby etapu trawienia. W tym celu przeprowadź przepływ obiegowy Digestion-Solution zgodnie z Rysunkiem 1B przez maksymalnie 15 min. 
	Uwaga: Krytyczne jest natychmiastowe przerwanie perfuzji, gdy próbka tkanki wątroby zostanie dostatecznie strawiona. Prawidłowe trawienie można rozpoznać po tym, że tkanka nie wykazuje oznak elastyczności, co ocenia się poprzez brak powrotu do pierwotnego kształtu po odkształceniu torebki nacisniętej szpatułką.</li>
</ol>
4. Izolacja hepatocytów (1 godz.)
<ol>
	<li>Wyłącz pompę perystaltyczną i umieść próbkę tkanki wątroby w szklanym naczyniu. Przepłucz zewnętrzną stronę próbki tkanki lodowatym roztworem Stop-Solution (Tabela 1). Usuń kaniule z próbki tkanki wątroby. Za pomocą skalpela otwórz próbkę tkanki wątroby, wykonując nacięcie w środku obszaru, w którym przymocowane były kaniule. Należy zadbać o to, aby torebka Glissona pozostała nienaruszona.</li>
	<li>Przepłucz wnętrze próbki tkanki, a następnie pokryj całą próbkę lodowatym roztworem Stop-Solution. Delikatnie potrząśnij tkanką, aby uwolnić komórki z tkanki.</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórkową i przefiltruj ją przez lejek z gazą (lejek plastikowy wyłożony kompresem gazowym) do plastikowych probówek o pojemności 50 ml. Dodawaj roztwór Stop-Solution do próbki tkanki wątroby, aż zostanie zużyta końcowa objętość 500 ml.</li>
	<li>Odwiruj zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zbierz nadsącz do późniejszej izolacji komórek nieparenchymalnych. Przemyj osad komórkowy roztworem PBS (Rysunek 2A).</li>
	<li>Ponownie odwiruj zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zbierz nadsącz i resuspenduj osad w pożywce do inkubacji hepatocytów (Hepatocyte Incubation medium) (Tabela 2, Rysunek 2B).</li>
	<li>Określ liczbę i żywotność komórek w otrzymanej zawiesinie komórkowej za pomocą barwienia błękitem trypanu. Policz żywe i martwe komórki w komorze licznikowej Neubauera. Oblicz liczbę komórek, żywotność i wydajność PHH, korzystając z poniższych wzorów. 
	 
	wydajność (policzone komórki) = policzone komórki x czynnik rozcieńczenia x objętość zawiesiny komórkowej (ml) x 10 000 
	 
	wydajność (hepatocyty/(g próbki tkanki wątroby)) = (wydajność (hepatocyty/(ml pożywki)) x Objętość zawiesiny komórkowej (ml))/(masa próbki tkanki wątroby (g)) 
	 
	żywotność (%) = 100% x (liczba żywych komórek)/(całkowita liczba komórek)</li>
</ol>
5. Oczyszczanie hepatocytów (1 godz.)
Uwaga: Ten etap oczyszczania jest zalecany, jeśli żywotność jest niższa niż 70%.
<ol>
	<li>Wszystkie etapy należy przeprowadzać w lodzie. W celu przygotowania do wirowania w gradiencie gęstości, sporządzić gradient o gęstości 25%, mieszając 5 ml roztworu do gradientu gęstości i 15 ml PBS.</li>
	<li>Z zawiesiny komórkowej bogatej w hepatocyty ostrożnie i powoli nanieść na wierzch warstwy gradientu gęstości 25% maksymalnie 50 Mio komórek łącznie, aby zapewnić wyraźne rozdzielenie obu warstw (Ryc. 2C). Probówki należy ostrożnie umieścić w wirówce i wirować przy 1,250 x g przez 20 min w 4 °C bez hamowania (Ryc. 2D).</li>
	<li>Odssać pozostałą zawiesinę komórkową oraz martwe komórki z interfazy. W zależności od zawartości tłuszczu można również odessać roztwór gradientu gęstości. 
	Uwaga: PHH o niskiej zawartości lipidów tworzą gęsty osad, a gradient gęstości można odessać całkowicie. PHH o wysokiej zawartości lipidów tworzą bardziej rozproszony osad i wiele żywych komórek może pozostać w roztworze gradientu gęstości powyżej osadu.</li>
	<li>Osady hepatocytów ponownie zawiesić w PBS i ponownie wirować przy 50 x g przez 5 min w 4 °C. Połączyć osady, ponownie przemyć PBS i zawiesić oczyszczone PHH w pożywce do inkubacji hepatocytów. Przeprowadzić liczenie komórek zgodnie z opisem w kroku 4.6.</li>
</ol>
6. Hodowla hepatocytów
<ol>
	<li>Przygotować naczynia hodowlane do wysiewu PHH poprzez pokrycie ich macierzą zewnątrzkomórkową, na przykład kolagenem z ogona szczura (kolagen typu I). Przygotować kolagen z ogona szczura zgodnie z protokołem opracowanym przez Rajan et al.17</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy kolagenu z ogona szczura w PBS w stosunku 1:200. Przenieść 100 µl/cm2 roztworu kolagenu z ogona szczura do naczyń hodowlanych, dbając o pokrycie całej powierzchni. Inkubować naczynia z tworzywa sztucznego przez 20 min w temperaturze pokojowej. Odessać pozostały roztwór kolagenu z ogona szczura.</li>
	<li>Wysiać 15 x 104 hepatocytów/cm2 w pożywce do inkubacji hepatocytów na naczynia hodowlane pokryte kolagenem z ogona szczura. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 4 hr. Po 4 hr hepatocyty powinny przywrzeć do podłoża, po czym można wymienić pożywkę.</li>
	<li>Przeprowadzić badania zgodnie z zaplanowanym układem eksperymentalnym. Zaleca się 48-godzinny czas hodowli, aby umożliwić komórkom regenerację po procesie izolacji.</li>
</ol>
7. Izolacja nieparenchymalnych komórek wątroby (1,5-2 godz.)
<ol>
	<li>Zebrany nadosad (krok 4.5 i 4.6) wirować przy 72 x g przez 5 min w 4 °C, aby usunąć pozostałe erytrocyty i hepatocyty. Połączyć nadosady i odwirować je dwukrotnie w celu uzyskania dwóch osadów komórkowych: 300 x g przez 5 min w 4 °C dla sedymentacji HSC, LEC i częściowo KC oraz 650 x g przez 7 min w 4 °C dla sedymentacji pozostałych KC.</li>
	<li>Połączyć oba osady i zawiesić je ponownie w HBSS. Przygotować gradienty gęstości 25% i 50% poprzez zmieszanie roztworu gradientu gęstości z PBS w celu przeprowadzenia wirowania gradientowego (roztwór gradientu gęstości 25%: 5 ml roztworu gradientu gęstości i 15 ml PBS; roztwór gradientu gęstości 50%: 10 ml roztworu gradientu gęstości i 10 ml PBS, patrz Rycina 2). Ostrożnie nałożyć 25% roztwór gradientu gęstości na warstwę 50% roztworu gradientu gęstości.</li>
	<li>Zawiesinę NPC ostrożnie i powoli nałożyć na warstwę 25% roztworu gradientu gęstości w taki sposób, aby uzyskać wyraźne rozdzielenie obu warstw.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową na gradiencie gęstości wirować przy 1 800 x g przez 20 min w 4 °C bez hamowania (Rycina 2.2).</li>
	<li>Odssać martwe komórki i debris komórkowy z najwyższej warstwy. Komórki NPC znajdują się w interfazie między warstwą gradientu gęstości 25% a 50% (Rycina 2). Zebrać NPC, przemyć je HBSS i odwirować zawiesinę komórkową, stosując opisany powyżej etap podwójnego wirowania (krok 7.2.).</li>
</ol>
8. Separacja komórek Kupffera (etap separacji przez adhezję) (1 godz.)
<ol>
	<li>Wykonać zliczanie komórek KC we frakcji NPC zgodnie z opisem w kroku 4.6. (Wygląd KC w zawiesinie przedstawiono na Ryc. 3B). Odwirować frakcję NPC, stosując opisany powyżej etap podwójnego wirowania (krok 7.2), a następnie zawiesić NPC ponownie w medium do wysiewu komórek Kupffera (Tabela 2).</li>
	<li>Wysiać frakcję zawierającą KC na plastikowe naczynia do hodowli komórkowej z gęstością 5 x 105 KC/cm2. Inkubować kultury KC przez 20 min w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Pierwotne KC przylegają do plastiku hodowlanego w krótkim czasie (Ryc. 2.3).</li>
	<li>Zebrać nadsącz zawierający nieprzyległe NPC, składający się głównie z LEC i HSC. Połączyć nadsącze w celu późniejszej separacji LEC (patrz sekcja 9) i HSC (patrz sekcja 10). Przemyć przylegające KC za pomocą HBSS i hodować je w medium do hodowli komórek Kupffera (Tabela 2) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
</ol>
9. Separacja komórek śródbłonka (1,5 godz.)
<ol>
	<li>Zebrany nadsącz (krok 8.5.) wirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Osad przemyć PBS. Po wirowaniu przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C ponownie zawiesić komórki w medium do separacji komórek gwiaździstych i śródbłonka, a następnie przeprowadzić zliczenie wszystkich pozostałych komórek zgodnie z opisem w kroku 4.6.</li>
	<li>Zawiesić 1 x 107 komórek Mio w 1 ml medium do separacji komórek gwiaździstych i śródbłonka, dodać 20 µl roztworu blokującego (Blocking Solution) z zestawu MACS-KIT oraz 20 µl mikro kulek CD31 (CD31 Micro Beads) do immunoznakowania i inkubować otrzymaną zawiesinę przez 15 min w temperaturze 4 °C (Rysunek 2.4).</li>
	<li>Oddzielić LEC od HSC zgodnie z protokołem producenta dla systemu magnetycznej separacji komórek MACS (Rysunek 2.5). Eluować magnetycznie zatrzymane CD31-dodatnie LEC i zawiesić je w medium hodowlanym dla komórek gwiaździstych i śródbłonka (Tabela 2).</li>
	<li>Przeprowadzić zliczenie komórek LEC zgodnie z opisem w kroku 4.6. Wysiać LEC w gęstości 1.25 x 105 komórek/cm2 do naczyń hodowlanych pokrytych kolagenem z ogona szczura (patrz krok 6.1). Hodować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem.</li>
</ol>
10. Separacja komórek gwiaździstych (0,5 h)
<ol>
	<li>Nieoznaczone HSC przechodzą przez kolumnę separacyjną podczas procedury MACS. Zbierz frakcję HSC (patrz krok 9.5, Rycina 2.5). Przeprowadź zliczanie komórek zgodnie z opisem w kroku 4.6.</li>
	<li>Wysiej HSC z gęstością 5 x 104 cells/cm2 w naczyniach hodowlanych pokrytych kolagenem z ogona szczura (patrz krok 6.1) w pożywce do hodowli komórek gwiaździstych/śródbłonka (Tabela 2) i inkubuj je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem.</li>
</ol>
<img alt="Tabela roztworów perfuzyjnych, stężenia, wartości pH, etapy przygotowania do eksperymentów." src="/files/ftp_upload/53069/53069table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Roztwór do perfuzji i izolacji.
<img alt="Tabela składników pożywek do hodowli komórkowych: stężenia dla hodowli hepatocytów, komórek Kupffera i komórek gwiaździstych." src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Pożywki do hodowli i izolacji.

<ol><li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , Maywood. (2014).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li>
<li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li>
<li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes%2C+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity%2C+cell+signaling+and+ADME%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man%3A+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li>
<li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li>
<li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li>
<li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li>
<li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li>
<li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussler%2C+AK+%22Strategies+in+Regenerative+Medicine%22">Strategies in Regenerative Medicine</a>. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).</li>
<li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes%2C+Kupffer+cells%2C+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li>
<li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li>
<li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li>
<li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver%3A+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li>
<li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li>
<li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832(2013).</li>
<li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li>
<li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis%3A+results+of+a+2-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opublikowany protokół opisuje technikę izolowania jednocześnie czystych PHH i NPC, a mianowicie KC, HSC i LEC, w wysokiej jakości i czystości z tej samej próbki ludzkiej tkanki wątroby. Większość publikacji dotyczących izolacji komórek wątroby obejmuje tylko jedną z tych populacji komórek18-20, a procedury izolacji wykonywane na tkankach ludzkich są rzadkie (przegląd Damm i wsp.)21. Adaptacja metod ustalonych na tkankach zwierzęcych (np. wątrobie szczura) do wątroby ludzkiej ujawni...

Ludzka tkanka wątroby jest bardzo złożona i składa się z dwóch różnych jednostek komórkowych, komórek miąższowych i komórek niemiąższowych (NPC). Miąższowe komórki wątroby obejmują hepatocyty i cholangiocyty. Hepatocyty stanowią od 60 do 70% wszystkich komórek wątroby i odpowiadają za większość funkcji metabolicznych wątroby, np. syntezę kwasów żółciowych i czynnika dopełniacza, biotransformację i metabolizm energetyczny2,3.
Mniejsza frakcja NPC stanowi 30-40% wszystkich komórek wątroby. NPC obejmują różne populacje komórek, a mianowicie komórki Kupffera (KC), komórki śródbłonka wątroby (LEC) i komórki gwiaździste wątroby (HSC). Ta heterogeniczna frakcja komórkowa odgrywa kluczową rolę w procesach fizjologicznych wątroby. Ponadto NPC uczestniczą w pośredniczeniu w ostrym uszkodzeniu wątroby, np. polekowym uszkodzeniu wątroby (DILI), a także w przewlekłych uszkodzeniach wątroby, takich jak marskość wątroby4.
W ostatnich latach ludzkie komórki wątroby stają się coraz bardziej niezbędne w badaniach i rozwoju testów leków, opracowywaniu leków i identyfikacji nowych szlaków biochemicznych w chorobach wątroby. W przypadku badań in vitro monokultury PHH są nadal uważane za "złoty standard"5. Głównym ograniczeniem obecnych homotypowych modeli wątroby jest odróżnicowanie i utrata funkcji hepatocytów w ciągu kilku dni4. Opracowanie technik hodowli trójwymiarowej (3D) wykazało, że ograniczenia te można skompensować4,6. Jednak nawet nowoczesne techniki hodowli 3D nie są w stanie wyświetlić wszystkich hepatotoksycznych sposobów działania7. Brakujące populacje NPC w istniejących modelach in vitro są omawiane jako możliwa przyczyna tej rozbieżności w stosunku do sytuacji in vivo. Wykazano, że komunikacja komórka-komórka między różnymi populacjami komórek wątroby odgrywa kluczową rolę w homeostazie fizjologicznej, ale także w procesach patofizjologicznych8. Dlatego uwaga naukowców skupia się coraz bardziej na NPC i ich interakcjach międzykomórkowych. Ich celowe zastosowanie w systemach kohodowli i inżynierii tkankowej może stanowić rozwiązanie problemu wysokiego zapotrzebowania na modele wątroby in vitro 8,9, które są jak najbardziej zbliżone do tych stosowanych in vivo.
Obecnie głównym wyzwaniem jest opracowanie ustandaryzowanego modelu kokultury ludzkiej wątroby, który zawiera jasno zdefiniowane części PHH i NPC. W związku z tym potrzebne są techniki izolacji bardzo heterogenicznych komórek wątroby, które muszą być zoptymalizowane, aby uzyskać czyste populacje komórek. Chociaż istnieją ustandaryzowane protokoły izolacji PHH10, standaryzowana izolacja ludzkich NPC jest nadal w fazie rozwoju. Większość opublikowanych protokołów izolacji NPC opiera się na eksperymentach na komórkach innych niż ludzkie11,12. Tylko kilka publikacji opisuje proces izolacji ludzkich NPC, a większość obejmuje tylko metody izolacji pojedynczej komórkitypu 11-16. Najważniejszymi cechami komórek, które zostały wykorzystane do separacji komórek, są rozmiar, gęstość, zachowanie przyczepiania i ekspresja białek powierzchniowych. Na podstawie tych cech opracowaliśmy uproszczony protokół izolacji PHH, KC, LEC i HSC, który został opublikowany wcześniej w Experimental Biology and Medicine1. Ze względu na szerokie zainteresowanie tą techniką, celem tego artykułu było przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu procesu izolacji komórek wątroby, w tym filmu, który pozwoli na łatwiejsze odtworzenie tej techniki. Protokół zawiera również metody kontroli jakości w zakresie oceny plonu i żywotności, a także identyfikacji i oceny czystości przy użyciu specyficznych barwień immunologicznych.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Pipety Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-inkubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewka do moczu</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka z perfusorem 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Polipropylenowa probówka stożkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24-dołkowe</td></tr><tr><td>pipety serologiczne</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro; l, 200 i mikro; l, 1,000 &mikro; l</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt izolacyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kąpiel wodna</td><td>Pompa</td> perystaltyczna Lauda <td></td><td></td></tr><tr><td></td> cyrkulacja <td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td> termostat</td><td>pH-metr Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drobne skale</td><td></td> Schott Stojak Sartorius <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> B&uuml;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lejek chnera</td><td>Plastikowy</td> lejek Haldenwanger <td></td><td></td></tr> silikonowa <tr><td>rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kaniule z oliwkowymi końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklane kleszcze</td> do naczyń <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Pióro</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td></td> Komora licząca Neubauer <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Podnośnik komórek optycznych Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Charit i ostra; Universit&auml; tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>kompres</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Klej do tkanek</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>szklana butelka</td><td>Kolagenaza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Roztwór</td> <td>separującyBiochrom</td><td>L6145</td><td>Gęstość 1,124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>bez Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1 064 041 000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49 361 000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Niski poziom glukozy (1 g/L) (bez L-glutaminy)</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>bez L-glutaminy</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Rozwiązanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>z GlutaMAX&handel;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt do barwienia immunologicznego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>monoklonalny</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>poliklonalny</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoklonalny</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoklonalny</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoklonalny</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 4%</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Oprócz hepatocytów miąższowych, wątroba składa się z komórek niemiąższowych (NPC), a mianowicie komórek Kupffera (KC), komórek śródbłonka wątroby (LEC) i komórek gwiaździstych wątroby (HSC). Dwuwymiarowa (2D) hodowla pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) jest nadal uważana za "złoty standard" w testach in vitro metabolizmu leków i hepatotoksyczności. Powszechnie wiadomo, że monokultura 2D PHH cierpi na odróżnicowanie i utratę funkcji. Ostatnio wykazano, że wątrobowe NPC odgrywają kluczową rolę w fizjologii (pato-) wątroby i utrzymaniu funkcji PHH. Obecne badania koncentrują się na rekonstrukcji architektury tkanek in vivo za pomocą modeli 3D i kokultur w celu przezwyciężenia ograniczeń monokultur 2D. Wcześniej opublikowaliśmy metodę izolowania ludzkich komórek wątroby i badaliśmy przydatność tych komórek do stosowania w hodowlach komórkowych w Experimental Biology and Medicine1. Ze względu na szerokie zainteresowanie tą techniką, celem tego artykułu było przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu procesu izolacji komórek wątroby, w tym filmu, który pozwoli na łatwe odtworzenie tej techniki.
Ludzkie komórki wątroby zostały wyizolowane z próbek tkanek ludzkiej wątroby podczas zabiegów chirurgicznych za pomocą dwuetapowej techniki perfuzji EGTA/kolagenazy P. PHH oddzielono od NPC przez wstępne odwirowanie w dawce 50 x g. Do usunięcia martwych komórek zastosowano etapy wirowania w gradionym gradiencie gęstości. Poszczególne populacje komórek wątroby wyizolowano ze wzbogaconej frakcji NPC przy użyciu określonych właściwości komórek i procedur sortowania komórek. Oprócz izolacji PHH udało nam się wydzielić KC, LEC i HSC do dalszej uprawy.
Razem wzięte, prezentowany protokół pozwala na izolację PHH i NPC w wysokiej jakości i ilości z jednej próbki tkanki dawcy. Dostęp do oczyszczonych populacji komórek wątroby może pozwolić na tworzenie in vivo podobnych do modeli ludzkiej wątroby.

Rozdział na frakcję miąższową i niemiąższową, z wykorzystaniem wirowania w gradiencie gęstości jako procedury oczyszczającej w połączeniu z wykorzystaniem właściwości adhezyjnych oraz systemu MACS, prowadzi do skutecznej izolacji PHH i NPC. PHH i NPC można wyizolować w wysokiej jakości i ilości. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny układ sprzętu do perfuzji i trawienia wątroby. Do roztworu Perfusion - Solution II zawierającego kolagenazę P dodano 10% FCS, aby zmniejszyć a...

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hepatologii i toksykologii oraz daje możliwość opracowania nowych in vitro modeli kokultur oraz tkankowo inżynieryjnych modeli wątroby. Zaletą tej nowej techniki jest możliwość wyizolowania wszystkich populacji komórek wątroby od tego samego dawcy i z tego samego niewielkiego fragmentu tkanki wątroby. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ świeżo pobraną tkankę wątroby w warunkach sterylnych, a następnie umieść próbkę tkanki wątroby w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Następnie oczyść powierzchnię próbki tkanki z krwi. W dalszej kolejności przemyj kaniule, używając 1X roztworu perfuzyjnego jeden. Użyj kleju tkankowego, aby przymocować oliwki kaniul w większych naczyniach krwionośnych.Następnie należy przetestować perfuzję i sprawdzić, czy kaniule nie przeciekają. W dalszej kolejności wszystkie naczynia krwionośne, z których wycieka przejrzysty 1X roztwór perfuzyjny, należy zamknąć za pomocą kleju tkankowego. Po tym kroku kaniulowaną próbkę tkanki wątroby należy umieścić w lejku Büchnera.Następnie ustaw prędkość przepływu pompy perystaltycznej w zakresie od 7,5 do 14,6 ml/min, w zależności od liczby użytych kaniul i oporu tkanki wątroby. Perfunduj tkankę aż do całkowitego wypłukania krwi przez co najmniej 20 minut, maksymalnie przez 30 minut. W niektórych przypadkach może być konieczne zakleszczowanie jednej z kaniul za pomocą plastikowych zacisków lub zwiększenie ciśnienia wewnętrznego w danym obszarze poprzez delikatny nacisk szpatułką na torebkę wątroby w celu optymalizacji perfuzji.Całkowita zmiana barwy z brązowo-czerwonej na jasnobrązową lub jasnożółtą świadczy o prawidłowej perfuzji. Następnie należy wymienić płyn perfuzyjny na roztwór trawienny zawierający kolagenazę P. Potem należy odpowiednio przekonfigurować układ do etapu trawienia. Następnie przeprowadza się cyrkulację roztworu trawiennego przez maksymalnie 15 minut.Okresowo przerywaj perfuzję i sprawdzaj stopień trawienia. Niezbędne jest natychmiastowe zaprzestanie perfuzji roztworem trawiennym, gdy próbka tkanki wątroby zostanie trawiona w stopniu wystarczającym. Po zakończeniu procesu wyjmij wątrobę z urządzenia i umieść ją w szklanym naczyniu.Opłucz zewnętrzną powierzchnię próbki tkanki lodowatym roztworem zatrzymującym (Stop Solution). Usuń kaniule z próbki tkanki wątroby. Następnie, za pomocą skalpela, otwórz próbkę tkanki wątroby, wykonując nacięcie w środkowej części obszaru, w którym przymocowane były kaniule, dbając o to, aby torebka Glissona pozostała nienaruszona.Opłucz wnętrze próbki tkanki, a następnie pokryj całą próbkę Roztworem Stop. Następnie delikatnie potrząśnij tkanką, aby uwolnić z niej komórki. Po tym czasie zbierz zawiesinę komórkową i przefiltruj ją przez lejek z gazą do 10 plastikowych probówek o pojemności 50 ml.Dodaj więcej roztworu stopującego (Stop Solution) do próbki tkanki wątroby, aż do uzyskania końcowej objętości 500 mililitrów. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową, zbierz nadsącz do późniejszej izolacji NPC i przenieś osady komórkowe do plastikowych probówek o pojemności 250 mililitrów. Następnie przemyj osady komórkowe buforem PBS.W tym celu odwiruj zawiesinę komórkową. Zbierz nadsącz, połącz osady i resuspenduj osad w pożywce do inkubacji hepatocytów. Następnie określ liczbę i żywotność komórek w otrzymanej zawiesinie komórkowej, wykorzystując barwienie błęknitem trypanowym.Aby wyizolować nieparenchymalne komórki wątroby, odwiruj zebrany nadsącz, aby usunąć pozostałe erytrocyty i hepatocyty. Zbierz nadsącze i odwiruj je dwukrotnie, aby uzyskać osady komórkowe do sedymentacji HCS, LEC, częściowo KC oraz pozostałych KC. Następnie resuspenderuj osady w HBSS. Potem przygotuj gradient gęstości 25% i 50%, mieszając roztwór do gradientu gęstości z PBS w celu przeprowadzenia wirowania w gradiencie gęstości.Ostrożnie nanieś roztwór gradientu gęstości 25% na warstwę roztworu gradientu gęstości 50%. Następnie, ostrożnie i powoli nanieś zawiesinę NPC na warstwę roztworu gradientu gęstości 25%, aby uzyskać wyraźny rozdział obu warstw. Odwiruj zawiesinę komórkową w gradiencie gęstości bez hamowania.Komórki NPC znajdują się na granicy faz między warstwami gradientu gęstości 25% a 50%. Odessaj martwe komórki i debris komórkowy z najwyższej warstwy, a następnie ostrożnie pobierz frakcję z granicy faz. Po podwójnym wirowaniu przeprowadź zliczenie komórek KC oraz frakcji MPC.Następnie frakcję NPC poddaj wirowaniu za pomocą wcześniej opisanego podwójnego etapu centryfugacji i resuspenduj NPC w medium do wysiewu komórek Kupffera. Wysiej frakcję zawierającą KC na plastikowe naczynia do hodowli komórkowej w gęstości 5 × 10⁵ KC na centymetr kwadratowy. Inkubuj hodowle KC przez 20 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Pierwotne KC powinny przywrzeć do tworzywa sztucznego w naczyniu do hodowli komórkowej w krótkim czasie. Następnie należy zebrać nadsącz zawierający nieprzylegające NPC, składające się głównie z LEC i HSC. Aby oddzielić LEC od HSC, należy rozpocząć od wirowania nadsączu.Następnie przemyj osad PBS. Po drugiej wirowaniu resuspenduj komórki w medium do separacji komórek endotelialnych i gwiazdzkowatych, a następnie wykonaj obliczanie liczby wszystkich pozostałych komórek. W kolejnym kroku resuspenduj 10 milionów komórek w jednym mililitrze medium do separacji komórek endotelialnych i gwiazdzkowatych.Następnie dodaj 20 µL roztworu blokującego z zestawu MAX oraz 20 µL mikrokulek CD31 do immunoznakowania i inkubuj otrzymaną zawiesinę przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie oddziel LEC od HSC zgodnie z protokołem producenta dla systemu magnetycznego sortowania komórek Max i zbierz frakcję HSC. Eluuj magnetycznie zatrzymane LEC CD31-dodatnie i zawieś je w pożywce do hodowli komórek śródbłonka komórek gwiaździstych.Poniższe obrazy przedstawiają różne populacje izolowanych komórek wątroby bezpośrednio po procesie izolacji w widoku mikroskopii kontrastowej. Ten zestaw obrazów prezentuje izolowane i hodowane komórki po 24 godzinach hodowli. Tutaj pokazano charakterystykę różnych frakcji komórkowych opartą na immunofluorescencji.PHH wykazały pozytywne sygnały dla markera hepatocytów CK18 24 godziny po izolacji, KC były pozytywne dla markera CD68 24 godziny po izolacji, LEC wykazały pozytywne sygnały dla vimentyny 72 godziny po izolacji, a HSC były pozytywne dla GFAP 72 godziny po izolacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie, że sukces izolacji zależy od optymalnego trawienia próbki tkanki wątrobowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak kontrolować proces trawienia oraz jak przeprowadzać separację w gradiencie gęstości, które są krytycznymi etapami tej procedury.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny do zgłębiania funkcji i chorób wątroby w nowo stworzonych hodowlach komórkowych in vitro oraz inżynieryjnych modelach tkanki wątroby.

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.

Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby z jednego fragmentu tkanki. Technika zapewnia wysoką żywotność i wydajność komórek, umożliwiając tworzenie zaawansowanych modeli in vitro do badań hepatologicznych i toksykologicznych.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Przeglądaj więcej filmów