Demonstracje sprzętu o zmniejszonej grawitacji prototypu zminiaturyzowanego cytometru przepływowego i towarzyszącej technologii mieszania mikroprzepływowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obsługa zminiaturyzowanego cytometru przepływowego na pokładzie samolotu wykonującego loty paraboliczne w warunkach zredukowanej grawitacji, z wykorzystaniem przygotowania komponentów i procedur pokładowych, które mogą być potencjalnie adaptowalne do innych konfiguracji. Cel ten zostaje osiągnięty najpierw poprzez staranny dobór gotowych i specjalnie wykonanych komponentów, aby zapewnić łatwość obsługi i bezpieczeństwo w warunkach zredukowanej grawitacji. Drugim krokiem jest montaż komponentów w platformie testowej do lotów parabolicznych, zawierającej dodatkowe elementy służące do zabezpieczenia próbki, automatyzacji obserwacji oraz ułatwienia przeprowadzenia wielu demonstracji.

Następnie zespół przygotowuje się do pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów w locie poprzez staranne planowanie, opracowanie protokołów oraz szkolenia. Ostatnim etapem są wielokomponentowe demonstracje w locie. Ostatecznie testy w locie parabolicznym służą do zaprezentowania potencjalnych zastosowań technologii w kosmosie oraz do zidentyfikowania wpływu stanu nieważkości, zmian grawitacji i wibracji na wydajność.

Chociaż metodę tę można zastosować w cytometrii przepływowej i technologiach pokrewnych, może ona zostać częściowo wykorzystana również w innych rodzajach indywidualnych testów diagnostycznych w warunkach zmniejszonej grawitacji, zwłaszcza w przypadku procedur wymagających wielokrotnych demonstracji lub wyzwalaczy. Zdecydowaliśmy się zatem przygotować ten film dla JoVE na temat testów w lotach parabolicznych, ponieważ podczas przygotowań do lotów parabolicznych z NASA nie znaleźliśmy wielu filmów ani nawet literatury opisującej, jak najlepiej przygotować się do takich eksperymentów. Musieliśmy włożyć wiele wysiłku w rozmowy z odpowiednimi osobami w różnych jednostkach NASA, aby pozyskać te informacje.

W tym przypadku chcemy udostępnić te informacje czytelnikom JoVE, aby mogli oni również odpowiednio przygotować się do takich lotów. Budowa prostego systemu cytometrii przepływowej do zastosowania w warunkach zmniejszonej grawitacji wymaga wielu prototypowych komponentów hydraulicznych, optycznych i elektronicznych. Rozpocznij od przygotowania systemu ciśnieniowego o minimalnej masie i zapotrzebowaniu na energię, który będzie napędzał cały układ.

Układ płynowy łączy zminiaturyzowaną pompę powietrzną z czujnikiem różnicy ciśnień. Następnie należy przygotować pojemnik z medium, który można napełnić bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Jest to sztywna plastikowa fiolka z elastyczną gumową membraną, szczelnie zamykaną zakrętką oraz rurką doprowadzającą powietrze u podstawy fiolki.

Uszczelnij połączenie rurki doprowadzającej powietrze za pomocą kleju optycznego. Na rurce wylotowej nakrętki umieść tymczasowy zacisk do szkiełek przedmiotowych, aby zapobiec wypłynięciu cieczy podczas i po włożeniu nakrętki. Aby napełnić fiolkę, rozszerz membranę za pomocą strzykawki podłączonej do wlotu powietrza.

Nalej płynu do pełna i włóż zatyczkę pod kątem, aby pod nią nie uwięzło powietrze. Na krótko zdejmij zacisk rurki, aby zaprząsować rurkę wylotową i zwolnić ciśnienie zapadania wywierane przez membranę. Upewnij się, że pompa wytwarza ciśnienie w fiolce bez wycieków powietrza lub płynu.

Ściskanie membrany w celu wymuszenia wypływu cieczy przez rurkę wylotową zakrętki. Trzecim niezbędnym elementem jest pojemnik na odpady płynne, który zbierze odpady bez wytwarzania przeciwciśnienia mogącego zakłócić przepływ. Należy użyć fiolki wklejonej do drugiej fiolki, zaprojektowanej jako podwójne zabezpieczenie.

Zamknąć fiolki za pomocą zabezpieczonego okna z gąbki piankowej, które zatrzymuje unoszące się ciecze, ale pozwala na wyrównanie ciśnienia powietrza z otoczeniem w kabinie, aby stworzyć załadowywacz próbek do użytku w maszynie do redukcji grawitacji, oraz złożyć zacisk sprężynowy z prowadnicami w taki sposób, aby niezawodnie zaciskał kapilarę z dopasowaną osłoną pomiędzy dwoma pierścieniami O-ring w linii cieczy. Należy upewnić się, że w przypadku braku kapilary sprężyny dociskają pierścienie O-ring do siebie, aby zamknąć linię cieczy i umożliwić odpowietrzanie bez wycieków. Zaprojektować mikromieszacz, który do funkcjonowania nie wymaga zasilanych mechanicznych podzespołów.

Zastosowano metodę szybkiego prototypowania z użyciem polimetakrylanu metylu, wybierając i wykonując spiralny mikromieszacz wirowy z dwoma wlotami w celu wykrywania poszczególnych przepływających cząstek. Przy użyciu dostępnych komercyjnie komponentów optomechanicznych zamontowano wykonany na zamówienie miniaturowy blok optyczny wielkości dłoni na płytce chlebowej mikroskopu. Ostatnim etapem montażu prototypu jest zaprojektowanie elektroniki i oprogramowania do sterowania urządzeniem oraz akwizycji danych.

Dla wygody i w celu szybkiego prototypowania należy wykorzystać lutowane ręcznie elementy podłączone do dostępnych w handlu kart akwizycji danych, napisać kod i program oraz stworzyć dedykowane oprogramowanie do obsługi urządzeń aparatury i synchronizacji wszystkich danych. Należy wyjąć baterię z laptopa i ustawić go tak, aby pracował wyłącznie za pomocą kabla zasilającego. Ze względów bezpieczeństwa podczas lotów w warunkach zredukowanej grawitacji, schemat zasilania elektrycznego wszystkich urządzeń musi obejmować mechanizm szybkiego i całkowitego wyłączenia elektronicznego.

W trakcie lotu. Pojedynczy przedłużacz z jednym przełącznikiem włącz/wyłącz jest podłączony do panelu rozdzielczego zasilania statku powietrznego; aby zapewnić prawidłowe działanie w locie, należy wziąć pod uwagę całkowitą dostępną przestrzeń oraz sposób jej podziału pomiędzy miejsce na zestaw eksperymentalny a przestrzeń użytkownika wokół zestawu. Całkowita dostępna przestrzeń jest ograniczona do obszaru mniejszego niż ten przewidziany dla podobnej demonstracji na ziemi.

Należy określić, do których komponentów wygodniej jest uzyskać dostęp, klęcząc na podłodze lub stojąc. Ważne jest również rozważenie, które elementy odniosą największe korzyści z ochrony zapewnianej przez strukturę wsporczą. Strukturą wsporczą zestawu w tym przypadku jest pionowa szafa sprzętowa, która jest odporna na przeciążenia podczas lotu i może zostać bezpiecznie zamocowana do wyznaczonego statku powietrznego.

Komponenty podłogi kabiny przypisano do poziomów wewnątrz regału: poziom górny przeznaczony na laptopa, poziom środkowy na prototypowe podzespoły oraz poziom dolny na zapasowe chusteczki, rękawiczki i pojemnik na odpady mieszane. Aby zabezpieczyć i pomieścić prototyp oraz umożliwić oglądanie próbek, konieczne było wykonanie lub adaptacja różnych komponentów niebędących częścią prototypu. Obejmują one specjalnie wykonane pudełko akrylowe do przechowywania elektroniki oraz specjalnie wykonaną akrylową komorę rękawicową z otworami dostępu dla ramion, zapewniającą przestrzeń sześcienną do przeprowadzenia demonstracji ładowarki bez ryzyka zanieczyszczenia kabiny lotniczej.

Aby zarejestrować demonstrację mikromieszalnika, należy ustawić stereomikroskop nad płytką stykową wyposażoną w niestandardowy akrylowy uchwyt na chip oraz kamerę CCD. W celu bezpiecznej prezentacji bloku optycznego należy użyć specjalnie wykonanego, nieprzezroczystego akrylowego pudełka, aby zablokować światło otoczenia i kontrolować zagrożenia związane z laserem. Zastosowanie prostych strategii projektowych może wyeliminować konieczność ręcznego prowadzenia rurek, dokonywania regulacji w trakcie pracy lub innych czynności wymagających dużej zręczności.

Na przykład, aby jednocześnie naprzestrzenić wiele plików źródłowych, należy użyć niestandardowej maszyny do naprzestrzeniania z kolektorem ciśnieniowym składającym się z wydrążonego cylindra, przystosowanego do igły wlotowej i wielu przewodów wylotowych służących do kontrolowania kierunku przepływu cieczy. Za pomocą komputera należy złożyć panel trójdrożnych zaworów elektromagnetycznych, sterowanych przez kaskadowo połączone przełączniki MOSFET podłączone do karty DAQ.

Trójdrożne zawory elektromagnetyczne posiadają wspólny port, który jest stale połączony albo z domyślnym portem wyjściowym (stan wyłączony), albo z portem wejściowym (stan włączony). Przełączenie w stan włączony jest wyzwalane sygnałem pięciu woltów. Oprogramowanie zostało zaprogramowane tak, aby przeprowadzić demonstracje za pomocą pojedynczych interwencji przyciskiem, takich jak pojedyncze kliknięcie na laptopie w celu zmiany stanu zaworu lub zmiany ciśnienia roboczego pompy.

Pozwala to uniknąć konieczności ręcznej regulacji przewodów, co mogłoby doprowadzić do wycieków do środowiska oraz utraty czasu eksperymentu w chaotycznym otoczeniu. Demonstracja ładowarki próbek obejmuje załadowanie próbki i przetransportowanie jej do bloku optycznego (OB) w celu detekcji. Układ wykorzystuje dwa zawory: jeden przed ładowarką i jeden za nią.

Podczas załadunku oba zawory są ustawione w pozycji wyłączonej, co zapobiega przemieszczaniu się płynu podczas korzystania z urządzenia ładującego; włączenie zaworów otwiera ścieżkę płynu X prowadzącą od fiolki z solą fizjologiczną do fiolki z odpadami, co pozwala pompie na przetłoczenie próbki do analizy. Demonstracja bloku optycznego obejmuje sekwencyjne wykrywanie trzech różnych typów próbek bez konieczności ręcznej zmiany połączeń rurek, przy czym sól fizjologiczna służy do płukania układu pomiędzy próbkami. Demonstracja mikromieszacza obejmuje segmenty mieszania krwi z solą fizjologiczną oraz mieszania niebieskiego i żółtego barwnika.

Układ wykorzystuje dwa zawory do kierowania ciśnienia albo do fiolek z krwią i solą fizjologiczną, albo do fiolek z barwnikiem, tak aby w danym czasie aktywna była tylko jedna demonstracja mieszania. Dodatkowy zawór umożliwia wstrzykiwanie pęcherzyków powietrza do chipa do mieszania krwi z solą fizjologiczną. System musi być przygotowany na nagłe siły wstrząsowe, wibracje lub kolizje z pasażerami podczas lotu.

W celu stabilizacji ustawienia należy nałożyć szybkoutwardzającą żywicę epoksydową na wyrównane elementy, które łatwo ulegają rozregulowaniu, w szczególności na komponenty optyczne. Należy również nałożyć żywicę epoksydową klasy przemysłowej na warstwę żywicy szybkoutwardzającej, aby zabezpieczyć pozostałe komponenty w razie potrzeby, w tym mocowanie kamery CCD do elementu I mikroskopu, w celu przeprowadzenia testów odporności na zakłócenia fizyczne. Następnie należy potrząsnąć strukturą wsporczą urządzenia z zamontowanymi wszystkimi komponentami.

Po poddaniu aparatury zakłóceniom należy sprawdzić funkcjonalność poszczególnych komponentów, w szczególności wyrównanych elementów optycznych przygotowanych na nieprzewidziane zdarzenia w trakcie lotu, takie jak nagłe wyrównanie poziomu samolotu w trakcie eksperymentu lub gwałtowne siły działające na aparaturę. Aby chronić pasażerów w stanie nieważkości, należy wyłożyć stelaż materiałem amortyzującym. Wyznaczeni koordynatorzy szkolą kilka osób jako głównych operatorów, aby zapewnić biegłość w obsłudze urządzenia w warunkach lotu.

Nie można przewidzieć, kto zachoruje podczas parais, a dany użytkownik może pozostać zdrowy podczas jednego lotu i zachorować podczas kolejnego. Po transporcie do miejsca lotu należy sprawdzić zestaw, wprowadzić niezbędne poprawki i ustawić połączenia rurek przed załadunkiem na pokład samolotu. W każdym dniu lotu należy przygotować i podłączyć fiolki z próbkami odpowiadające demonstracjom zaplanowanym na dany dzień.

Należy przygotować się na możliwe długie odstępy czasowe między konfiguracją a eksperymentami, a także na wysokie temperatury otoczenia, w zależności od miejsca lotu. Aby uniknąć choroby lokomocyjnej podczas lotu, należy przyjąć dostarczone leki, takie jak skopolamina z amfetaminą, oraz wykorzystać kilka pierwszych parabol do adaptacji do zmian grawitacji poprzez powolne unoszenie się równolegle do podłogi i leżenie płasko podczas wysokiego przeciążenia. Po zajęciu pozycji lotniczej, operatorzy aparatury, zbliżając się do wyznaczonej przestrzeni powietrznej dla parabol, zapewniają wystarczającą przestrzeń, aby operatorzy mogli położyć się podczas interwałów wysokiej grawitacji oraz umożliwić dostęp do pasówz nóg po rozpoczęciu parabol.

Nie należy wywierać dużych sił na ciało podczas stanu zredukowanej grawitacji, ponieważ może to spowodować zbyt szybki i potencjalnie niebezpieczny ruch ciała w górę podczas demonstracji ładowania próbek. W momencie przejścia samolotu w stan zredukowanej grawitacji, należy za pomocą strzykawki nałożyć kroplę mieszaniny barwnika do kulek licznikowych na opuszkę palca. Aby zasymulować pobranie próbki z nakłucia palca, należy użyć kapilary do pobrania próbki z palca, a następnie załadować ją do ładowarki kapilarnej.

Wprowadź próbkę do układu optycznego w celu detekcji. Przeprowadź demonstrację mieszalnika mikroprzepływowego w konfiguracji pod mikroskopem. Wymieszaj krew i sól fizjologiczną w stosunku jeden do jednego przy ciśnieniu 1,52345 oraz sześciu PSI przez co najmniej dwie parabole dla każdego z nich.

Rejestracja danych wideo zsynchronizowanych z innymi odczytami. Przedstawiono tutaj rzeczywiste nagranie z lotu podczas demonstracji mieszalnika. Wprowadź powietrze do wlotu soli fizjologicznej, aby sprawdzić, czy architektura kanału zatrzyma pęcherzyk, który mógłby uniemożliwić optymalne mieszanie.Mieszaj.

Niebieski i żółty barwnik spożywczy w ilości 1,52345 i sześciu PSI przez co najmniej dwie parabole dla każdego z nich. Ponownie, przedstawione tutaj zsynchronizowane dane rejestracyjne są reprezentatywnymi wynikami dla dwóch demonstracji mikromiksera, obrazowanymi przez kamerę CCD zamontowaną w panelu mikroskopu stereoskopowego. Panel A przedstawia mieszanie niebieskiego i żółtego barwnika w warunkach mikrograwitacji, a panel B przedstawia mieszanie krwi i soli fizjologicznej w warunkach grawitacji księżycowej.

Mieszanie można oceniać wizualnie w dowolnym punkcie spirali, a także w kanale wylotowym podczas demonstracji optycznego wykrywania bloków fluorescencyjnie znakowanych białych krwinek w trakcie lotu w warunkach mikrograwitacji. Krytyczne wskaźniki wydajności dla danych z cytometrii przepływowej obejmują współczynnik zmienności intensywności szczytów, stosunki sygnału do szumu, częstotliwość zliczania szczytów oraz wydajność detekcji, jak pokazano tutaj. Wykrywanie optyczne bloków wydaje się stosunkowo niewrażliwe na przejście z poziomu około 1,5 G do niemal zero G i trwa nadal podczas powrotu do 1,5 g.

Wykrycie fluorescencyjnych kulek do zliczania, dodanych do załadowanej próbki po zademonstrowaniu działania ładowarki w grawitacji księżycowej, wskazuje, że próbka została pomyślnie załadowana i dotarła do bloku optycznego w celu detekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej rozumieć, jak przeprowadzać testy urządzenia i redukować grawitację podczas lotu parabolicznego, a w szczególności jakie rodzaje procedur są wykonalne; staranne planowanie, dobór części oraz wdrożenie testów pomagają zapewnić wysoką efektywność Twojego doświadczenia.