Name: Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Odkryj mikrofluidyczne podejście do badania mechaniki polimerów mikrotubul in vitro. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę dynamiki cytoszkieletu z kontrolą przepływu bufora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie i zasoby dostarczone przez Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE), gdzie przeprowadzono część tych badań. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NIH NIGMS dla M. Zanica (R35 GM1192552) i grantu NSF ID 2018661 dla M. Zanicia. M. Rogers otrzymał wsparcie z grantu NIH T32 GM08320 oraz nagrody pilotażowej VINSE. L. Richardson jest wspierany przez grant NSF GRFP nr 1937963. Autorzy chcieliby również podziękować dr Alice Leach, Davidowi Schafferowi, dr Christinie McGahan i całemu laboratorium Zanic za ich pomoc i wsparcie.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Autorzy ujawniają wykorzystanie ChatGPT-4o OpenAI do korekty i korekty tekstu.

Głównym celem tego protokołu było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Projekt został oparty na chęci wykorzystania nieodłącznych zalet urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS, a jednocześnie obejmuje kombinację funkcji, które umożliwiłyby solidne i konfigurowalne eksperymenty o wysokiej przepustowości.
Cel ten został pomyślnie osiągnięty, co zaowocowało protokołami produkcyjnymi i ogólnymi wytycznymi, które mogą służyć jako podstawa dla przyszłych użytkowników tego systemu. Włączenie do urządzenia nadmiarowych pułapek bąbelkowych zmniejsza prawdopodobieństwo denaturacji białek z powodu obecności pęcherzyków powietrza. Chociaż nadal mamy do czynienia z odłączaniem i ponownym podłączaniem przewodów w urządzeniu, te pułapki bąbelkowe zmniejszają prawdopodobieństwo niepowodzenia eksperymentu. Przyszłe ulepszenia układu mikroprzepływowego mogą jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę ręcznych manipulacji rurkami dokonywanych podczas eksperymentu. Co więcej, integracja urządzenia mikroprzepływowego ze zautomatyzowanym oprogramowaniem do sterowania przepływem pozwala na znaczne dostosowanie warunków eksperymentalnych przy jednoczesnym zmniejszeniu możliwości błędu ręcznego. Wykazaliśmy pomyślne działanie urządzenia, wytwarzając urządzenie, a następnie hodując, stabilizując i zginając przedłużenia mikrotubul w urządzeniu przy użyciu automatycznego, regulowanego przez kontroler przepływu. Ponadto, ustalając gradient odrębnych znakowanych fluorescencyjnie roztworów tubuliny w tym samym urządzeniu, wykazaliśmy, że wiele warunków może być uruchamianych jednocześnie w jednym urządzeniu. Wspomagany technikami modelowania i analizy obliczeniowej, nasz system może badać i określać właściwości biomechaniczne mikrotubul, takie jak sztywność zginania 52,56,57,58,59.
Potencjalne przyszłe ulepszenia ułatwiłyby opracowanie jeszcze bardziej niezawodnego systemu i związanej z nim analizy eksperymentalnej. Po pierwsze, osadzanie fotorezystu, ekspozycja i wypalanie były kluczowymi parametrami, które wykazały pewną zmienność. Stosunkowo duże rozmiary elementów fotorezystu SPR wymagały bardzo stopniowego nagrzewania i chłodzenia, aby zapobiec pękaniu termicznemu, które mogłoby zniszczyć urządzenia. Chociaż próbowano użyć cieńszych urządzeń, znaleźliśmy problemy z manipulowaniem tymi mniejszymi rozmiarami funkcji. Dbałość o szczegóły i cierpliwość są kluczowe przy replikowaniu urządzeń o tej grubości za pomocą fotorezystu SPR. Do rozwiązania tego problemu można użyć różnych fotorezystorów, w zależności od dostępności.
Podsumowując, urządzenie mikroprzepływowe i protokół pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych, wysokowydajnych możliwościach testowych niż poprzednie testy z komórkami przepływowymi47. Co więcej, eksperymenty można zautomatyzować za pomocą regulatorów przepływu w celu utrzymania precyzyjnych profili przepływu lub gradientów stężeń w urządzeniu, zmniejszając zmienność nieodłącznie związaną z użytkownikami ręcznymi. Przyszłe potencjalne zastosowania tego układu obejmują badanie wpływu białek związanych z mikrotubulami na sztywność zginania mikrotubul, dynamikę, uszkodzenie i naprawę sieci, a także biomechaniczne interakcje mikrotubul i włókien aktynowych 54,60,61,62,63,64,65,66,67, 68,69,70. Integracja mikrofabrykacji, zautomatyzowanej kontroli przepływu oraz technik modelowania i analizy obliczeniowej tworzy wszechstronny system odpowiedni do badania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Mikrofluidyka umożliwia precyzyjną kontrolę minimalnych objętości cieczy, często mniejszych niż jeden mikrolitr, dzięki skomplikowanej konstrukcji i wykonaniu kanałów przepływu płynów1,2. Mała skala urządzeń mikrofluidycznych prowadzi do wystąpienia unikalnych zjawisk inżynieryjnych. Mianowicie liczba Reynoldsa – bezwymiarowa miara stosunku sił bezwładności do sił lepkości w przepływie płynu – jest mała, zazwyczaj rzędu O(10) lub niższa w mikrofluidyce, co podkreśla znaczenie sił lepkości w tych urządzeniach. Dodatkowo liczba Pécleta, która porównuje transport konwekcyjny do dyfuzyjnego, wykazuje, że transport konwekcyjny w mikrofluidyce jest zazwyczaj pomijalny3,4,5. Taki reżim przepływu laminarnego, sterowany dyfuzją, jest w mikrofluidyce korzystny, ponieważ umożliwia prowadzenie równoległych eksperymentów na jednym urządzeniu poprzez utrzymanie precyzyjnych gradientów płynów.
Fotolitografia pozostaje główną metodą wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych6,7,8. W skrócie proces ten polega na stworzeniu wytrawionego szablonu „matrycy” projektu mikroprzepływowego (Rysunek 1). Przygotowywany jest podłoże światłoczułe, a fotomaska projektu mikroprzepływowego selektywnie naświetla obszary fotorezystu promieniowaniem ultrafioletowym. Następnie stosuje się metody trawienia w celu wywołania podłoża, co pozwala uzyskać relief projektu. Polidimetylosiloksan (PDMS) jest często odlewany i utwardzany na matrycy. Utwardzony PDMS, który przyjmuje negatywowe cechy projektu, jest następnie oddzielany od matrycy i przywiązany do szkiełka nakrywki. Cały ten proces wytwarzania trwa zazwyczaj 1-2 dni, co umożliwia szybkie iteracje projektowe i produkcję wielu urządzeń. Szczegółowe przeglądy procesów soft litografii i mikrofabrykacji znajdują się w innych referencjach1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Schemat procesu fotolitografii: naświetlanie UV, wywoływanie fotorezystu, etapy wytwarzania formy z PDMS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd tradycyjnego procesu fotolitografii oraz procesu mikrowytwarzania. (A) Tradycyjny proces fotolitografii oraz (B) proces mikrowytwarzania. W zależności od zastosowania i pożądanych właściwości fotorezystu można użyć fotorezystu negatywowego lub pozytywowego, mimo że oba pozwolą na uzyskanie tego samego wzorca projektowego. O wyborze odpowiedniego typu fotorezystu decydują takie parametry jak pożądana wysokość struktur lub temperatura topnienia fotorezystu. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Rogersa (2022)14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zastosowanie mikroprzepływów rozszerzyło możliwości w wielu dziedzinach badawczych, a ich najnowszy wpływ odnotowano w naukach biologicznych. Ze względu na niewielką skalę, mikroprzepływy umożliwiają precyzyjne zarządzanie ograniczonymi, cennymi zasobami, takimi jak komórki lub białka. Jeszcze większy wpływ ma możliwość dostosowania systemów mikroprzepływowych do naśladowania warunków fizjologicznych, takich jak modyfikacje sztywności podłoża, wywieranie siły na próbkę, a nawet integracja prądu elektrycznego. Ponadto zastosowanie mikroprzepływów oferuje możliwość równoległego manipulowania wieloma odczynnikami oraz szybkiego tworzenia prototypów i iteracyjnego udoskonalania konstrukcji systemów. Cechy te umożliwiają miniaturyzację całych laboratoriów na jednym urządzeniu, powszechnie nazywanym „laboratorium na chipie” (lab-on-a-chip)1,6,9,15,16,17,18,19.
Jednym z zastosowań mikrofluidyki w biologii komórki jest badanie polimerów mikrotubul. Mikrotubule stanowią istotny element cytoszkieletu komórkowego, odgrywając kluczową rolę w procesach takich jak podział komórki i wewnątrzkomórkowy transport ładunków20,21. Jako najsztywniejszy element cytoszkieletu, mikrotubule wykazują moduł sprężystości porównywalny z modułem Plexiglassu22,23. Ich silne właściwości mechaniczne są niezbędne dla różnych funkcji komórkowych, na przykład dla skurczu kardiomiocytów, w którym mikrotubule cyklicznie wyginają się i rozluźniają podczas fazy skurczowej i rozkurczowej serca24. Urządzenia mikrofluidyczne były wcześniej wykorzystywane do badania właściwości mikrotubul i ich struktur wyższego rzędu in vitro. Rzeczywiście, mikrofluidyka była stosowana do analizy dynamiki polimeryzacji mikrotubul, oddziaływań między mikrotubulami oraz wpływu białek związanych z mikrotubulami na ich właściwości mechaniczne25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.
Choć wprowadzenie mikrofluidyki do dziedziny badań nad mikrotubulami przyniosło wiele ekscytujących odkryć, wciąż istnieje przestrzeń do ulepszeń w zakresie adaptacji tych urządzeń do badań nad mikrotubulami. W niniejszej pracy odnosimy się do dwóch konkretnych ograniczeń, które nadal występują podczas badania mikrotubul w urządzeniach mikrofluidycznych: ryzyka powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz urządzenia, zazwyczaj wprowadzanych podczas ręcznej manipulacji urządzeniami mikrofluidycznymi, oraz niedostatecznego wykorzystania analiz wysokoprzepustowych. Po pierwsze, manipulacje ręczne, takie jak podłączanie i odłączanie rurek, mogą prowadzić do powstania pęcherzyków w kanałach. Powstanie pęcherzyków powietrza w komorze przepływowej jest katastrofalne, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą denaturować białka, ścinać polimery mikrotubularne i negatywnie wpływać na hodowle komórkowe42,43. Ponadto ostre narożniki i skośne kąty w urządzeniu powodują nierównomierne zwilżanie powierzchni, co zwiększa możliwość wciągania powietrza. Opracowano liczne techniki mające na celu ograniczenie powstawania, trwałości i wpływu pęcherzyków powietrza; jednak stosowanie metod łagodzenia skutków powstawania pęcherzyków nie jest powszechne42,43,44,45,46. Co więcej, mimo że jedną z głównych zalet stosowania mikrofluidyki jest możliwość prowadzenia eksperymentów wysokoprzepustowych, mikrofluidyka nie została jeszcze wykorzystana do skalowania badań nad mikrotubulami. Urządzenia mikrofluidyczne mogą być projektowane w taki sposób, aby testować wiele warunków eksperymentalnych równolegle w tym samym urządzeniu. Na przykład gradienty płynów mogą być wykorzystywane do kierowania przepływu różnych białek związanych z mikrotubulami lub leków, umożliwiając ich celowaną dostawę do określonych obszarów podzielonych mikrotubul w obrębie jednego urządzenia.
W niniejszej pracy opracowaliśmy w sposób iteracyjny urządzenie mikroprzepływowe, które eliminuje te ograniczenia. Przedstawiamy szczegółowy protokół wykonania urządzenia, umożliwiając tym samym szerszemu gronu badaczy wykorzystanie technologii mikroprzepływowej w badaniach nad mikrotubulami. Projekt tego urządzenia zawiera elementy służące do wychwytywania pęcherzyków powietrza i wykorzystuje zautomatyzowany system kontroli przepływu w celu zredukowania manualnej interwencji, umożliwiając jednocześnie tworzenie gradientów roztworów w urządzeniu do analiz wysokoprzepustowych. Podsumowując, opracowanie tej konstrukcji mikroprzepływowej może ułatwić szersze badania i zrozumienie mechaniki mikrotubul, oferując jednocześnie cenne usprawnienia w projektowaniu eksperymentów w całej dziedzinie badań nad mikrotubulami.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 0,6 ml (przezroczyste)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Preferowany typ o niskiej retencji</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml (przezroczyste)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Preferowany typ niskiej retencji</td></tr><tr><td>Standardowy dziurkacz do biopsji 1,5 mm</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1,49 apertura numeryczna Obiektyw TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm szkło Szkiełka nakrywkowe</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3" jednostronnie polerowane wafle silikonowe</td><td>University Wafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4" szalka Petriego</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 i mikro; L, Otwarta cienkościenna, ultraprzezroczysta rurka Beckman</td><td>Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>Określany jako "rurka powietrzna" w protokole</td></tr><tr><td>Lasery półprzewodnikowe 488, 561 i 640 nm</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 Rotor o stałym kącie</td><td>nachylenia Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Aceton</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka pneumatyczna Airfuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Określany jako "airfuge" w protokole</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Wersje ogólne może być używany</td></tr><tr><td>Mózg bydlęcy nieoznakowana tubulina (oczyszczona)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Wyprodukowany we własnym zakresie, ale można go kupić</td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>MiliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>MiliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Czyste suche powietrze (CDA) (gaz pod ciśnieniem)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilanie sprężonym powietrzem</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Łączy się z mikroprzepływowym regulator przepływu</td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics oprogramowanie</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy mosiężny adapter sceniczny</td><td>N/A</td><td></td><td>Wyprodukowany we własnym zakresie, aby pasował do naszych szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm na mikroskopie</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Dowolna marka</td> Eksykator Dowolna marka <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>MiliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MiliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Oprogramowanie MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI)</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezkołnierzowe złączki PFA z ETFE i frac14; "od -28 do 1/16" Średnica zewnętrzna okuć&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Służy do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik</td></tr><tr><td>Fluiwell 4-kanałowy 2 mL niskociśnieniowy</td><td>fluigent</td><td>14002001</td><td>Służy do podłączenia systemu kontroli przepływu do rur micrew. Określany również jako "ciśnieniowy stojak na zbiornik</td></tr>"<tr><td>Okap</td> wyciągowy <td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforan guanozyny (GTP)</td><td>MiliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 o dużej prędkości koło filtra emisyjnego</td><td>Oprzyrządowanie</td><td></td><td></td>Finger Lakes</tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td> z otwartym dostępem <td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 nakładka do maski</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorezystor</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złączki mikroprzepływowe 6-40 do 1/4"-28 Zestaw adapterów</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Służy do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik (stojak Fluiwell)</td></tr><tr><td>Złączki mikroprzepływowe żeńskie Zestaw adapterów Luer Lock</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-04</td><td>Służy do podłączenia strzykawki do rurki</td></tr><tr><td>Mikroprzepływowy regulator</td> <td>przepływuElveflow</td><td>OB1 MK3 +</td><td></td></tr> <tr><td>mikroprzepływowy czujnik przepływu</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Ten zakres czujników przepływu wynosi 0-80 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Deweloper MICROPOSIT MF-319</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azot (gaz pod ciśnieniem)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik obiektywowy</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednoczęściowa dokręcana na palce 10-32 Złączka stożkowa do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16"&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>Służy do podłączenia strzykawki do rurki</td></tr><tr><td>Paklitaksol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Maski fotolitograficzne</td><td>N/A</td><td></td><td>Wykonane przez podmiot zewnętrzny przy użyciu naszych projektów</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>System przepływomierza plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>Integruje się z myjką plazmową, aby umożliwić kontrolę przepływu gazu pod ciśnieniem</td></tr><tr><td>Pipeta z plastikową bańką</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Określany jako "poloksomer 407" w protokole</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td> Research <td>Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics&nbsp; Rurka Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Określane jako "rurka 1,5 mm" i "rurka" w protokole</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>Ten model może zostać wycofany</td></tr><tr><td>ze sprzedaży Standardowe pipety i zestawy końcówek</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowa plastikowa strzykawka</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Użyliśmy 10 ml strzykawki Luer-slip</td></tr><tr><td>Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Określany jako "PDMS" i "utwardzacz" w protokole</td></tr><tr><td>T339 Micrewtube z uszczelką wargową i płaską nakrętką</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Określany w protokole jako "fiolka źródłowa". Użyliśmy zarówno rozmiarów 0,5 ml, jak i 1,5 ml</td></tr><tr><td>TAMRA, SE; 5-(i-6)-karboksytetrametylorodamina, ester sukcynimidylu</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Określany jako "TTR" w protokole</td></tr><tr><td>Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silan</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>Trion Technology, Inc.</td><td></td><td>Ten odkurzacz plazmowy jest używany tylko w kroku 1.1 protokołu. Zamiast tego można użyć innego środka do czyszczenia plazmowego, takiego jak ten używany do klejenia PDMS; po prostu preferujemy znacznie niższą próżnię, jaką można osiągnąć dzięki temu systemowi do czyszczenia płytki krzemowej</td></tr><tr><td>TRITC Przeciwciało poliklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Określane jako "przeciwciało anty-rodaminowe" w protokole</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

W tym protokole opisujemy projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego opracowanego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Projekt wykorzystuje nieodłączne zalety urządzeń mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) i wprowadza kilka funkcji, które umożliwiają solidne i konfigurowalne podejście eksperymentalne o wysokiej przepustowości. Opracowane urządzenie zawiera redundantne funkcje wychwytywania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec występowaniu szkodliwych pęcherzyków powietrza. Ponadto urządzenie łączy się ze zautomatyzowanym systemem sterowania przepływem, aby ograniczyć ręczną interwencję i umożliwić analizy o wysokiej przepustowości. Komercyjne oprogramowanie symulacyjne jest wykorzystywane do lepszego rozwoju i zrozumienia transportu płynów za pomocą tego systemu. Na koniec demonstrujemy zdolność do przeprowadzania wielu eksperymentów jednocześnie w jednym urządzeniu poprzez hodowanie przedłużeń mikrotubul z odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi w różnych sekcjach urządzenia. Ogólnie rzecz biorąc, ten mikroprzepływowy system przepływu może być używany do badania mechaniki polimerów mikrotubul i zapewnia ulepszenia w projektowaniu eksperymentalnym dla szerszych badań mikrotubul in vitro. Synteza metod mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania komputerowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

Mikrotubule to polimery cytoszkieletu, które odgrywają istotną rolę w podziale komórek i transporcie wewnątrzkomórkowym. W tym badaniu wykorzystujemy mikrofluidykę do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Prace te dotyczą dwóch konkretnych ograniczeń w badaniu mikrotubul w urządzeniach mikroprzepływowych: możliwości powstawania pęcherzyków powietrza, które mogą denaturować białka, oraz braku stosowania testów o wysokiej przepustowości. Nasze urządzenie i protokół mikroprzepływowy pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych możliwościach testowania o wysokiej przepustowości niż nasze poprzednie testy z komórkami przepływowymi.[Instruktor] Na początek wyczyść plazmowo trzycalową płytkę krzemową pod próżnią przez pięć minut, używając tlenu lub czystej plazmy z suchym powietrzem. Upewnij się, że podciśnienie jest poniżej pięć razy dziesięć do potęgi minus pięć torów. Wyśrodkuj czystą płytkę krzemową na koderze spinowym w celu osadzania fotorezystu i umieść od jednego do dwóch mililitrów fotorezystu SPR 227.0 na środku płytki krzemowej. Wiruj fotorezyst, aby uzyskać warstwę o grubości 13 mikrometrów przy 1000 obrotach na minutę przez 30 sekund. Minimalizując kontakt z powlekaną powierzchnią, przenieś wafel krzemowy na płytę grzejną ustawioną na 70 stopni Celsjusza. Inkubuj wafel krzemowy na gorącej płycie, zwiększając temperaturę o 10 stopni Celsjusza co trzy do pięciu minut, aż temperatura osiągnie 115 stopni Celsjusza. Następnie wyłącz płytę grzejną i pozwól płytce krzemowej ostygnąć, aż jej temperatura spadnie poniżej 65 stopni Celsjusza. Za pomocą kleszczy przenieś schłodzoną wafel do nakładki maski. Załaduj zarówno wafel silikonowy, jak i odpowiednią maskę fotograficzną do nakładki zgodnie z protokołami producenta lub specyficznymi dla danego miejsca, teraz wystaw wafel na działanie promieniowania ultrafioletowego o energii około 400 milidżuli na centymetr kwadratowy. Oblicz wymagany czas naświetlania, korzystając ze wzoru. Po ponownym uwodnieniu i obróbce cieplnej zanurz wafel w odpowiednim wywoływaczu. Następnie delikatnie płucz obie strony wafla wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Po wysuszeniu wytworzonej płytki za pomocą gazowego azotu należy przenieść ją do eksykatora. Umieść mały aluminiowy pojemnik w eksykatorze i dodaj jedną kroplę silanu do aluminiowego pojemnika. Po wysuszeniu wlej zmieszany i odgazowany polidimetylosiloksan na formę wzorcową wewnątrz szalki Petriego. Inkubuj naczynie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc, aby PDMS mógł się w pełni utwardzić. Wokół funkcji urządzenia użyj skalpela lub żyletki, aby wyciąć prostokątne kawałki PDMS z warstwy głównej. Upewnij się, że każdy element ma odpowiednią przestrzeń boczną, aby umożliwić prawidłowy kontakt z klejeniem i pasuje do szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry. Umieść PDMS na zapasowej warstwie protektorowej PDMS, unikając twardych powierzchni. Następnie za pomocą czystego dziurkacza o średnicy 1,5 milimetra wykonaj otwory wlotowe i wylotowe w każdym elemencie PDMS. Teraz wyjmij szklaną szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i wyczyść ją chusteczką nasączoną alkoholem izopropylowym. Następnie wyczyść plazmowo szkiełko pokrywy szkła pod próżnią przez pięć minut przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Przetrzyj zarówno szklaną szkiełko nakrywkowe, jak i stronę charakterystyczną PDMS chusteczkami nasączonymi alkoholem izopropylowym przed umieszczeniem ich w myjce plazmowej i jednocześnie czyść je plazmowo przez 30 sekund pod próżnią przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Po oczyszczeniu odwróć PDMS tak, aby jego strona funkcji była skierowana w dół. Umieść PDMS na szklanym szkiełku nakrywkowym i lekko dociśnij, aby zachęcić do klejenia. Ustabilizowane przedłużenia mikrotubul zostały wygięte przez przepływający roztwór buforowy prostopadły do ich kierunku wzrostu, wykazując zdolność do przyłożenia siły kierunkowej wewnątrz urządzenia. Prędkość przepływu zbliżona do powierzchniowego doświadczana przez mikrotubule została obliczona jako 92 mikrometry na sekundę przy użyciu symulacji i modelowania analitycznego opartego na równaniu Naviera-Stokesa. Symulacje obliczeniowe wykazały ustanowienie stabilnych gradientów w całym urządzeniu, potwierdzone eksperymentalnie przez barwnik fluorescencyjny wykazujący przewidywalne wzorce stężeń. Podwójnie znakowane rozszerzenia mikrotubul, potwierdzone partycjonowanie oparte na gradientie z różnymi białkami fluorescencyjnymi dominującymi w różnych strefach przestrzennych wzdłuż urządzenia.

development-microfluidics-based-approach-for-investigating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy z poli(glikolu etylenowego) (PEG-SAM) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złotymi. Warstwa PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu oraz złota. Następnie wykorzystuje się elektroforezę do rozmieszczania biomolekuł w skali nanometrycznej.

Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł

Opisano metodę pomiaru trwałości lub sztywności zginania biopolimerów.  Metoda wykorzystuje test ślizgowy mikrotubul napędzany kinezyną do eksperymentalnego określenia długości trwałości poszczególnych mikrotubul i można ją dostosować do testów ślizgowych opartych na aktynie.

Pomiary sztywności na zginanie biopolimerów za pomocą testów ślizgowych

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Odkryj mikrofluidyczne podejście do badania mechaniki polimerów mikrotubul in vitro. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę dynamiki cytoszkieletu z kontrolą przepływu bufora.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Przeglądaj więcej filmów