Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Mikrotubule to polimery cytoszkieletu, które odgrywają istotną rolę w podziale komórek i transporcie wewnątrzkomórkowym. W tym badaniu wykorzystujemy mikrofluidykę do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Prace te dotyczą dwóch konkretnych ograniczeń w badaniu mikrotubul w urządzeniach mikroprzepływowych: możliwości powstawania pęcherzyków powietrza, które mogą denaturować białka, oraz braku stosowania testów o wysokiej przepustowości. Nasze urządzenie i protokół mikroprzepływowy pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych możliwościach testowania o wysokiej przepustowości niż nasze poprzednie testy z komórkami przepływowymi.

[Instruktor] Na początek wyczyść plazmowo trzycalową płytkę krzemową pod próżnią przez pięć minut, używając tlenu lub czystej plazmy z suchym powietrzem. Upewnij się, że podciśnienie jest poniżej pięć razy dziesięć do potęgi minus pięć torów. Wyśrodkuj czystą płytkę krzemową na koderze spinowym w celu osadzania fotorezystu i umieść od jednego do dwóch mililitrów fotorezystu SPR 227.0 na środku płytki krzemowej. Wiruj fotorezyst, aby uzyskać warstwę o grubości 13 mikrometrów przy 1000 obrotach na minutę przez 30 sekund. Minimalizując kontakt z powlekaną powierzchnią, przenieś wafel krzemowy na płytę grzejną ustawioną na 70 stopni Celsjusza. Inkubuj wafel krzemowy na gorącej płycie, zwiększając temperaturę o 10 stopni Celsjusza co trzy do pięciu minut, aż temperatura osiągnie 115 stopni Celsjusza. Następnie wyłącz płytę grzejną i pozwól płytce krzemowej ostygnąć, aż jej temperatura spadnie poniżej 65 stopni Celsjusza. Za pomocą kleszczy przenieś schłodzoną wafel do nakładki maski. Załaduj zarówno wafel silikonowy, jak i odpowiednią maskę fotograficzną do nakładki zgodnie z protokołami producenta lub specyficznymi dla danego miejsca, teraz wystaw wafel na działanie promieniowania ultrafioletowego o energii około 400 milidżuli na centymetr kwadratowy. Oblicz wymagany czas naświetlania, korzystając ze wzoru. Po ponownym uwodnieniu i obróbce cieplnej zanurz wafel w odpowiednim wywoływaczu. Następnie delikatnie płucz obie strony wafla wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Po wysuszeniu wytworzonej płytki za pomocą gazowego azotu należy przenieść ją do eksykatora. Umieść mały aluminiowy pojemnik w eksykatorze i dodaj jedną kroplę silanu do aluminiowego pojemnika. Po wysuszeniu wlej zmieszany i odgazowany polidimetylosiloksan na formę wzorcową wewnątrz szalki Petriego. Inkubuj naczynie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc, aby PDMS mógł się w pełni utwardzić. Wokół funkcji urządzenia użyj skalpela lub żyletki, aby wyciąć prostokątne kawałki PDMS z warstwy głównej. Upewnij się, że każdy element ma odpowiednią przestrzeń boczną, aby umożliwić prawidłowy kontakt z klejeniem i pasuje do szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry. Umieść PDMS na zapasowej warstwie protektorowej PDMS, unikając twardych powierzchni. Następnie za pomocą czystego dziurkacza o średnicy 1,5 milimetra wykonaj otwory wlotowe i wylotowe w każdym elemencie PDMS. Teraz wyjmij szklaną szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i wyczyść ją chusteczką nasączoną alkoholem izopropylowym. Następnie wyczyść plazmowo szkiełko pokrywy szkła pod próżnią przez pięć minut przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Przetrzyj zarówno szklaną szkiełko nakrywkowe, jak i stronę charakterystyczną PDMS chusteczkami nasączonymi alkoholem izopropylowym przed umieszczeniem ich w myjce plazmowej i jednocześnie czyść je plazmowo przez 30 sekund pod próżnią przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Po oczyszczeniu odwróć PDMS tak, aby jego strona funkcji była skierowana w dół. Umieść PDMS na szklanym szkiełku nakrywkowym i lekko dociśnij, aby zachęcić do klejenia. Ustabilizowane przedłużenia mikrotubul zostały wygięte przez przepływający roztwór buforowy prostopadły do ich kierunku wzrostu, wykazując zdolność do przyłożenia siły kierunkowej wewnątrz urządzenia. Prędkość przepływu zbliżona do powierzchniowego doświadczana przez mikrotubule została obliczona jako 92 mikrometry na sekundę przy użyciu symulacji i modelowania analitycznego opartego na równaniu Naviera-Stokesa. Symulacje obliczeniowe wykazały ustanowienie stabilnych gradientów w całym urządzeniu, potwierdzone eksperymentalnie przez barwnik fluorescencyjny wykazujący przewidywalne wzorce stężeń. Podwójnie znakowane rozszerzenia mikrotubul, potwierdzone partycjonowanie oparte na gradientie z różnymi białkami fluorescencyjnymi dominującymi w różnych strefach przestrzennych wzdłuż urządzenia.