Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul
30 maja 2025
Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.
Mikrotubule to polimery cytoszkieletu, które odgrywają istotną rolę w podziale komórek i transporcie wewnątrzkomórkowym. W tym badaniu wykorzystujemy mikrofluidykę do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Prace te dotyczą dwóch konkretnych ograniczeń w badaniu mikrotubul w urządzeniach mikroprzepływowych: możliwości powstawania pęcherzyków powietrza, które mogą denaturować białka, oraz braku stosowania testów o wysokiej przepustowości. Nasze urządzenie i protokół mikroprzepływowy pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych możliwościach testowania o wysokiej przepustowości niż nasze poprzednie testy z komórkami przepływowymi.
[Instruktor] Na początek wyczyść plazmowo trzycalową płytkę krzemową pod próżnią przez pięć minut, używając tlenu lub czystej plazmy z suchym powietrzem. Upewnij się, że podciśnienie jest poniżej pięć razy dziesięć do potęgi minus pięć torów. Wyśrodkuj czystą płytkę krzemową na koderze spinowym w celu osadzania fotorezystu i umieść od jednego do dwóch mililitrów fotorezystu SPR 227.0 na środku płytki krzemowej. Wiruj fotorezyst, aby uzyskać warstwę o grubości 13 mikrometrów przy 1000 obrotach na minutę przez 30 sekund. Minimalizując kontakt z powlekaną powierzchnią, przenieś wafel krzemowy na płytę grzejną ustawioną na 70 stopni Celsjusza. Inkubuj wafel krzemowy na gorącej płycie, zwiększając temperaturę o 10 stopni Celsjusza co trzy do pięciu minut, aż temperatura osiągnie 115 stopni Celsjusza. Następnie wyłącz płytę grzejną i pozwól płytce krzemowej ostygnąć, aż jej temperatura spadnie poniżej 65 stopni Celsjusza. Za pomocą kleszczy przenieś schłodzoną wafel do nakładki maski. Załaduj zarówno wafel silikonowy, jak i odpowiednią maskę fotograficzną do nakładki zgodnie z protokołami producenta lub specyficznymi dla danego miejsca, teraz wystaw wafel na działanie promieniowania ultrafioletowego o energii około 400 milidżuli na centymetr kwadratowy. Oblicz wymagany czas naświetlania, korzystając ze wzoru. Po ponownym uwodnieniu i obróbce cieplnej zanurz wafel w odpowiednim wywoływaczu. Następnie delikatnie płucz obie strony wafla wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Po wysuszeniu wytworzonej płytki za pomocą gazowego azotu należy przenieść ją do eksykatora. Umieść mały aluminiowy pojemnik w eksykatorze i dodaj jedną kroplę silanu do aluminiowego pojemnika. Po wysuszeniu wlej zmieszany i odgazowany polidimetylosiloksan na formę wzorcową wewnątrz szalki Petriego. Inkubuj naczynie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc, aby PDMS mógł się w pełni utwardzić. Wokół funkcji urządzenia użyj skalpela lub żyletki, aby wyciąć prostokątne kawałki PDMS z warstwy głównej. Upewnij się, że każdy element ma odpowiednią przestrzeń boczną, aby umożliwić prawidłowy kontakt z klejeniem i pasuje do szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry. Umieść PDMS na zapasowej warstwie protektorowej PDMS, unikając twardych powierzchni. Następnie za pomocą czystego dziurkacza o średnicy 1,5 milimetra wykonaj otwory wlotowe i wylotowe w każdym elemencie PDMS. Teraz wyjmij szklaną szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i wyczyść ją chusteczką nasączoną alkoholem izopropylowym. Następnie wyczyść plazmowo szkiełko pokrywy szkła pod próżnią przez pięć minut przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Przetrzyj zarówno szklaną szkiełko nakrywkowe, jak i stronę charakterystyczną PDMS chusteczkami nasączonymi alkoholem izopropylowym przed umieszczeniem ich w myjce plazmowej i jednocześnie czyść je plazmowo przez 30 sekund pod próżnią przy użyciu czystej, suchej plazmy powietrznej. Po oczyszczeniu odwróć PDMS tak, aby jego strona funkcji była skierowana w dół. Umieść PDMS na szklanym szkiełku nakrywkowym i lekko dociśnij, aby zachęcić do klejenia. Ustabilizowane przedłużenia mikrotubul zostały wygięte przez przepływający roztwór buforowy prostopadły do ich kierunku wzrostu, wykazując zdolność do przyłożenia siły kierunkowej wewnątrz urządzenia. Prędkość przepływu zbliżona do powierzchniowego doświadczana przez mikrotubule została obliczona jako 92 mikrometry na sekundę przy użyciu symulacji i modelowania analitycznego opartego na równaniu Naviera-Stokesa. Symulacje obliczeniowe wykazały ustanowienie stabilnych gradientów w całym urządzeniu, potwierdzone eksperymentalnie przez barwnik fluorescencyjny wykazujący przewidywalne wzorce stężeń. Podwójnie znakowane rozszerzenia mikrotubul, potwierdzone partycjonowanie oparte na gradientie z różnymi białkami fluorescencyjnymi dominującymi w różnych strefach przestrzennych wzdłuż urządzenia.
Przegląd
To badanie przedstawia urządzenie mikrofluidyczne zaprojektowane do badania mechaniki polimerów mikrotubul in vitro. Urządzenie radzi sobie z wyzwaniami takimi jak tworzenie pęcherzyków powietrza i zwiększa zdolności testowania o wysokiej wydajności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrofluidyka
- Mechanika cytoszkieletu
Tło
- Mikrotubule są niezbędne do podziału komórki i transportu wewnątrzkomórkowego.
- Mikrofluidyka oferuje platformę do badania mechaniki mikrotubul.
- Poprzednie metody napotykały na ograniczenia takie jak pęcherzyki powietrza i niska wydajność.
- To badanie ma na celu ulepszenie ustawień eksperymentalnych do badań nad mikrotubulami.
Cel badania
- Rozwój urządzenia mikrofluidycznego do badania mechaniki mikrotubul.
- Ulepszenie wytrzymałości testów o wysokiej wydajności.
- Zmniejszenie problemów powodowanych przez pęcherzyki powietrza w systemach mikrofluidycznych.
Stosowane metody
- Mikrofabrykacja płytki krzemu do stworzenia urządzenia.
- Nadawanie fotooporów i ekspozycja na promieniowanie UV do kreślenia wzoru.
- Formowanie z polidimetyloksylani (PDMS) do składania urządzenia.
- Kontrola przepływu i modelowanie komputerowe do analizy zachowania mikrotubul.
Główne wyniki
- Udało się osiągnąć stabilne wydłużenia mikrotubul w urządzeniu.
- Kierunkowe siły były nakładane na mikrotubule za pomocą przepływu buforu.
- Symulacje wskazały prędkość przepływu blisko powierzchni na poziomie 92 mikrometrów na sekundę.
- Fluorescencyjny barwnik potwierdził stabilne gradienty stężenia w całym urządzeniu.
Wnioski
- Urządzenie mikrofluidyczne skutecznie bada mechanikę mikrotubul.
- Zdolności o wysokiej wydajności zostały pomyślnie zintegrowane.
- To podejście może poszerzyć zrozumienie dynamiki cytoszkieletu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microfluidics-based investigation of microtubule polymer mechanics enables high-throughput, quantitative analysis of cytoskeletal dynamics, addressing key bottlenecks in early discovery and mechanistic de-risking. The integration of automated flow control and computational modeling supports robust, reproducible workflows for biopharma R&D teams focused on target validation and predictive confidence. This platform advances the ability to interrogate cellular mechanics in vitro, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microtubule mechanics relevant to cellular function and disease pathways.
- Supports biological de-risking by providing quantitative, reproducible data on cytoskeletal behavior.
- Facilitates functional target validation through controlled application of directional forces and gradient conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microtubule systems for downstream compound screening and mechanistic assays.
- Standardizes assay conditions using automated flow control and bubble-trapping features for reproducibility.
- Enables high-throughput, multiplexed experiments with distinct fluorescent labeling for comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Provides a flexible in vitro platform for probing cytoskeletal responses under physiologically relevant flow and gradient conditions.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling robust, scalable experimentation.
- Delivers predictive mechanistic insights that inform translational biomarker strategies when aligned with disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system fits within the early discovery to lead identification continuum, supporting hypothesis testing and assay readiness for cytoskeletal targets.
- Discovery Biology: Quantitative analysis of microtubule mechanics clarifies pathway function and de-risks target selection.
- Screening: Automated, reproducible flow conditions enable reliable assay development and compound evaluation.
- Analytics: Computational modeling and fluorescent readouts provide robust, quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: In vitro mechanical probing aligns with preclinical model requirements for cytoskeletal targets.
- Enterprise Reuse: The platform's modularity and scalability support broad application across R&D programs investigating cellular mechanics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automated flow control and robust device design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-content, multiplexed experimentation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cytoskeletal targets in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, microfluidics, and quantitative fluorescence imaging.
- Needs access to automated flow control systems and computational modeling tools for simulation and analysis.
- Demands cross-team standardization of device preparation and assay protocols for reproducibility.
- Adaptation across different cytoskeletal or cellular systems may require protocol optimization.
- Bubble-trapping and flow stability features are critical for maintaining protein integrity and assay reliability.
