Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty
7 grudnia 2014
Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie Galvan Axxis, testu do oceny kierunkowej migracji komórek w przyłożonym polu elektrycznym. Osiąga się to poprzez najpierw zmontowanie, a następnie zasianie w komorze Galvan axxis interesujących nas komórek. W drugim etapie komora jest uszczelniana i przykładane jest pole elektryczne do obrazowania poklatkowego.
W ostatnim kroku śledzona jest prędkość migracji poszczególnych komórek oraz kąt nachylenia względem pola elektrycznego. Ostatecznie podpisz się. Można go użyć do pokazania, jak ogniwa reagują na pole elektryczne i czy migrują kierunkowo do katody.
Główną zaletą tej techniki jest łatwe pobieranie komórek po podaniu Teksasu do analizy wtórnej oraz łatwość, z jaką migracja może być filmowana w dużym powiększeniu i z komórkami znakowanymi fluorescencyjnie. Wizualizacja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy montażu komory są trudne do nauczenia się bez demonstracji Aby zmontować dolne komory. Zacznij od przetarcia plastikowej komory galvana axxis dwoma propanolem.
Następnie za pomocą strzykawki nałożyć uszczelniacz silikonowy klasy morskiej wokół okrągłych otworów w dolnej części komory. Ułóż dużą szklankę nakrywkową na szczeliwie i dociśnij ją na miejsce końcem bawełnianego aplikatora, wycierając nadmiar kleju wacikiem. Następnie użyj markera diamentowego, aby wyciąć małą szklankę nakrywkową, aby uzyskać odstępy o wymiarach sześć na 25 milimetrów i odwróć komorę.
Następnie za pomocą strzykawki nałóż dwa paski silikonu, tworząc powierzchnię kanału o wymiarach 10 na 25 milimetrów do mocowania komórek między dwoma okrągłymi otworami w dolnej szybie. Następnie przyklej dwie szklane przestrzenie między okrągłymi otworami, dociskając je nowym bawełnianym aplikatorem i wycierając nadmiar kleju, jak pokazano powyżej. Wypróbuj komorę przez 24 godziny, aż klej silikonowy się utwardzi.
Następnego dnia namocz komorę w wodzie destylowanej na noc, aby usunąć pozostałości kwasu octowego z kleju przed wysiewem komórek do komory. Osuszyć i wytrzeć komory dwoma propanolami, jak właśnie pokazano. Umyj je sterylnym PB S3 razy, a następnie sprawdź przepływ cieczy między dwoma okrągłymi otworami w komorach.
Po upewnieniu się, że komory są w dobrym stanie technicznym, zamknij je w sterylnych naczyniach hodowlanych i umieść komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Podczas gdy komory są w równowadze, odłącz komórki prostaty od ich naczynia hodowlanego za pomocą pięciu mililitrów trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach zneutralizuj reakcję pięcioma mililitrami 10% FBS.
W PBS przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowych probówek, a następnie odwiruj przez pięć minut. Przy 200 razy, G, odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki. Następnie po policzeniu komórek dostosuj stężenie komórek do ośmiu na 10 do czterech komórek na mililitr za pomocą pożywki hodowlanej i nasion.
350 mikrolitrów zawiesiny komórek na każdą komorę. Inkubuj komórki w komorze przez noc w naczyniu hodowlanym z mokrą chusteczką Kim o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozpocznij montaż górnych komór, najpierw podgrzewając 10 mililitrów kultury, średnio do 37 stopni Celsjusza dla każdej komory galwanowej AXS.
Podczas nagrzewania się pożywki przenieś komorę Galvan axxis z inkubatora na płytkę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłucz komorę pożywką hodowlaną. Aby usunąć nieprzyłączone komórki, pozostaw 400 mikrolitrów pożywki w komorze, a następnie użyj strzykawki, aby nałożyć smar wysokopróżniowy na obie szklane przestrzenie. Uszczelnij komorę szkłem nakrywkowym i bawełnianym aplikatorem, a następnie osusz powierzchnię szkła.
Następnie nałóż smar wysokopróżniowy za pomocą strzykawki, aby uszczelnić szczelinę między szkłem nakrywkowym a komorą. A następnie dodaj pożywkę hodowlaną do wewnętrznych zbiorników. Usuń bąbelki i sprawdź przepływ cieczy między zbiornikami.
Aby mostki agarowe przecięły parę dwucalowych rurek PVC, odwróć je, a następnie umieść kawałki w 100-mililitrowej zlewce. Następnie dodaj 200 miligramów agaru Bact Toe do 50-mililitrowej kolby z 10 mililitrami pożywki hodowlanej, aby uzyskać 2% żel agarowy. Po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund użyj pipety transferowej, aby załadować żel agarowy do plastikowej rurki i pozostaw mostki agarowe w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby zestalić agar.
Następnie dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do zewnętrznych zbiorników komory gal i włóż mostki agarowe do wewnętrznych i zewnętrznych zbiorników pożywki, aby przewodzić prąd w celu wykonania poklatkowego obrazowania migracji. Zacznij od przeniesienia komory Galvana do komory środowiskowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na stoliku mikroskopu, zabezpieczając komorę taśmą i skupiając się na komórkach pod obiektywem 10x. Następnie włóż elektrody Galvan Axxis do zewnętrznych zbiorników z katodą po prawej stronie, zabezpieczając drut i elektrody taśmą.
Następnie włącz skrzynkę zasilającą, aby przyłożyć pole elektryczne do komory i użyj miernika napięcia do pomiaru napięcia wyjściowego w komorze, aby osiągnąć 2,5 V dla komory o długości 25 milimetrów. Teraz wybierz 10 punktów w komorze, aby wygenerować 10 filmów poklatkowych i ustaw warunki akwizycji na 10-minutowe interwały przez dwie godziny. Następnie rozpocznij filmowanie i dostosuj prąd wyjściowy zgodnie z potrzebami, aby utrzymać natężenie pola podczas eksperymentu.
Pod koniec eksperymentu wyjmij komorę ze sceny i utrwal komórki w 95% alkoholu. Następnie otwórz komorę. Szkiełko nakrywkowe można zachować na później.
Barwienie i obrazowanie. Oczyść komorę na przyszłe lata. Aby określić ilościowo Galvan Axxis, obróć filmy poklatkowe, aby zorientować katodę na górze obrazów.
Eksportuj filmy do oprogramowania do śledzenia komórek i ręcznie śledź pozycję XY od 10 do 20 komórek w każdym punkcie czasowym z każdego filmu, odległości migracji i kąty względem kierunku północ-południe, ta sama orientacja pola elektrycznego zostanie obliczona w oprogramowaniu do śledzenia komórek. Na koniec zapisz pomiary i zaimportuj dane do aplikacji bazy danych, aby obliczyć połączone wyniki. W tym reprezentatywnym eksperymencie Galvan Axxis do linii komórek prostaty określono migrację z podobnymi prędkościami w ciągu dwóch godzin.
Jednak kierunkowość pola elektrycznego wynosiła 0,7 plus minus 0,3 dla PRNS jednej jednej linii i 0,2 plus minus 0,8 dla dwóch linii PNT, co wskazuje na istotną różnicę w osi Galvana tych dwóch linii komórkowych, co sugeruje, że ich mechanizmy sygnalizacji komórkowej kierują zróżnicowane odpowiedzi migracyjne na pole elektryczne Po opracowaniu metody Govan Texas. Technika ta pomaga naukowcom w badaniu mechanizmów kierunkowej migracji komórek w polu elektromagnetycznym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę przykładania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmielonych komórek prostaty przy użyciu specjalnie skonstruowanej komory do galwanotaksji. Wyniki wskazują, że dwie linie nietwórczych nowotworowo komórek prostaty wykazują różny stopień kierunkowości migracji w odpowiedzi na pole elektryczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Migracja komórek
- Elektrofizjologia
- Badania nad rakiem prostaty
Wprowadzenie
- Galwanotaksja to ukierunkowany ruch komórek w odpowiedzi na pole elektryczne.
- Metoda ta może pomóc w zrozumieniu zachowania komórek w badaniach nad rakiem.
- Unieruchomione komórki prostaty służą jako model do badania zachowania komórek nietumorigennych.
- Różne linie komórkowe mogą wykazywać zróżnicowaną odpowiedź na pola elektryczne.
Cel badania
- Ocena migracji kierunkowej komórek prostaty w polu elektrycznym.
- Porównanie zachowania migracyjnego różnych nietumorogennych linii komórkowych prostaty.
- Opracowanie niezawodnej metody badania galwanotaksji in vitro.
Zastosowane metody
- Montaż specjalistycznej komory do badań galwanotaksji.
- Zasiewanie komory unieśmiertelnionymi komórkami prostaty.
- Przyłożenie pola elektrycznego podczas obrazowania poklatkowego.
- Śledzenie prędkości i kierunku migracji pojedynczych komórek względem pola elektrycznego.
Główne wyniki
- Dwie linie nietumorogennych komórek prostaty wykazały różny stopień migracji kierunkowej.
- Komórki migrowały w kierunku katody, co wskazuje na reakcję na pole elektryczne.
- Przeprowadzono analizę ilościową prędkości i kątów migracji.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o zachowaniu komórek prostaty w polach elektrycznych.
Wnioski
- Komora do galwanotaksji jest skutecznym narzędziem do badania migracji komórek.
- Różne linie komórkowe prostaty wykazują odmienne wzorce migracji w odpowiedzi na pola elektryczne.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia roli pól elektrycznych w zachowaniu komórkowym.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w analizie fenotypów migracji komórek prostaty poprzez ilościowe określanie odpowiedzi kierunkowych na fizjologiczne pola elektryczne, co wspiera walidację celów w wczesnej fazie odkrywania leków. Specjalistyczna komora do galwanotaksji zapewnia powtarzalny, istotny chorobowo system oceny wewnętrznego zachowania migracyjnego, który może wspomagać strategie identyfikacji związków wiodących poprzez podkreślenie różnic funkcjonalnych między modelami komórkowymi. Takie profilowanie elektrofizjologiczne zwiększa pewność prognostyczną modeli przedklinicznych, łącząc mechanizmy sygnalizacji komórkowej z wynikiem funkcjonalnym pod wpływem kontrolowanych bodźców.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ujawnienie różnic w cechach wewnętrznych, które determinują kierunkowe odpowiedzi migracyjne między liniami komórkowymi prostaty.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowy pomiar prędkości i kąta migracji w odniesieniu do galwanotaksji skierowanej ku katodzie.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację specyficznych dla linii komórkowej mechanizmów sygnalizacyjnych modulujących elektrotaksję, co pozwala na ocenę pewności w odniesieniu do wybranych celów.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych z wykorzystaniem wielorazowych komór z PVC o niskiej cytotoksyczności oraz elektrod platynowych w celu zestandaryzowanego przesiewu elektrotaksji.
- Dane ilościowe: Generowanie wskaźników prędkości migracji i trwałości kierunkowej za pomocą obrazowania time-lapse i oprogramowania do śledzenia komórek, co umożliwia niezawodną ocenę związków.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy dzięki przewodzeniu prądu za pomocą mostków agarowych oraz obrazowaniu na zmotoryzowanym stoliku, co wspiera standaryzację analizy pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykorzystuje uniezwiązane przez SV40 linie komórkowe prostaty (pRNS-1-1 i PNT2) jako system istotny z punktu widzenia choroby do modelowania zachowania komórek nietwórczych pod wpływem bodźców elektrofizjologicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary galwanotaksji na etapie odkryć z przedklinicznym postępem skorygowanym o ryzyko, ujawniając różnicową elektrotaksję, która może odzwierciedlać aktywność leżących u podstaw szlaków sygnałowych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wskazuje, w jaki sposób komórkowe mechanizmy sygnalizacyjne kierują różnicowymi odpowiedziami migracyjnymi na pola elektryczne, co zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test galwanotaksji integruje się z kontinuum badawczym – od weryfikacji hipotez po identyfikację związków wiodących – dostarczając odczytów elektrofizjologicznych, które uzupełniają biochemiczne oraz obrazowe kaskady przesiewowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określenie kierunkowej migracji linii komórkowych prostaty w przyłożonych polach elektrycznych, co pozwala wyjaśnić fenotypy migracyjne zależne od konkretnych szlaków.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu montażowi komory, sterylnej ekwilibracji oraz obrazowaniu poklatkowemu przy kontrolowanej natężeniu pola (2,5 V w komorze o szerokości 25 mm).
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą za pomocą wyeksportowanych filmów poklatkowych, ręcznego śledzenia współrzędnych XY oraz obliczania kątów migracji względem orientacji północ-południe pola elektrycznego.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki galwanotaksji z ciągłością przedkliniczną poprzez identyfikację wewnętrznych różnic migracyjnych, które mogą przewidywać zróżnicowane odpowiedzi w złożonych mikrośrodowiskach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje komorę jako narzędzie wielokrotnego użytku dzięki przystępnym cenowo, autoklawowalnym komponentom oraz modułowej konstrukcji umożliwiającej modyfikacje powierzchni szklanej i traktowanie komórek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalność i pewność w walidacji punktów uchwytu dzięki ilościowym pomiarom galwanotaksji, które redukują niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad migracją komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zastosowaniu szczelnych komór, mostków agarowych oraz obrazowania z wykorzystaniem zmotoryzowanego stołu, co minimalizuje zmienność pomiarów elektrotaksji.
- Wartość strategiczna: Skuteczniejsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez ujawnienie specyficznych dla linii komórkowych profili elektrotaksji, co pozwala na optymalną alokację kapitału w programach wczesnego etapu poszukiwania punktów uchwytu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja z uwzględnieniem ryzyka dzięki pomiarom różnicowej kierunkowości (np. 0.7±0.3 vs 0.2±0.8), które odzwierciedlają wewnętrzne fenotypy migracyjne.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, montażu komór mikroprzepływowych oraz mikroskopii poklatkowej w celu niezawodnego przeprowadzenia galwanotaksji.
- Zależne od instrumentarium obejmującego zmotoryzowane stoliki mikroskopowe, woltomierze oraz oprogramowanie do śledzenia komórek w celu ilościowej analizy kierunkowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów uszczelniania komór między zespołami (nakładanie silikonu, przygotowanie mostka agarozy), aby zapewnić spójne przewodzenie prądu.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów podczas modyfikowania powierzchni szklanych lub testowania powłok z macierzy pozakomórkowej na podłożach komór w badaniach nad adhezją komórek.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak 24-godzinny czas utwardzania silikonu oraz nocne moczenie komór w celu usunięcia pozostałości kwasu octowego przed wysiewaniem komórek.
