Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty
December 7th, 2014
Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie Galvan Axxis, testu do oceny kierunkowej migracji komórek w przyłożonym polu elektrycznym. Osiąga się to poprzez najpierw zmontowanie, a następnie zasianie w komorze Galvan axxis interesujących nas komórek. W drugim etapie komora jest uszczelniana i przykładane jest pole elektryczne do obrazowania poklatkowego.
W ostatnim kroku śledzona jest prędkość migracji poszczególnych komórek oraz kąt nachylenia względem pola elektrycznego. Ostatecznie podpisz się. Można go użyć do pokazania, jak ogniwa reagują na pole elektryczne i czy migrują kierunkowo do katody.
Główną zaletą tej techniki jest łatwe pobieranie komórek po podaniu Teksasu do analizy wtórnej oraz łatwość, z jaką migracja może być filmowana w dużym powiększeniu i z komórkami znakowanymi fluorescencyjnie. Wizualizacja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy montażu komory są trudne do nauczenia się bez demonstracji Aby zmontować dolne komory. Zacznij od przetarcia plastikowej komory galvana axxis dwoma propanolem.
Następnie za pomocą strzykawki nałożyć uszczelniacz silikonowy klasy morskiej wokół okrągłych otworów w dolnej części komory. Ułóż dużą szklankę nakrywkową na szczeliwie i dociśnij ją na miejsce końcem bawełnianego aplikatora, wycierając nadmiar kleju wacikiem. Następnie użyj markera diamentowego, aby wyciąć małą szklankę nakrywkową, aby uzyskać odstępy o wymiarach sześć na 25 milimetrów i odwróć komorę.
Następnie za pomocą strzykawki nałóż dwa paski silikonu, tworząc powierzchnię kanału o wymiarach 10 na 25 milimetrów do mocowania komórek między dwoma okrągłymi otworami w dolnej szybie. Następnie przyklej dwie szklane przestrzenie między okrągłymi otworami, dociskając je nowym bawełnianym aplikatorem i wycierając nadmiar kleju, jak pokazano powyżej. Wypróbuj komorę przez 24 godziny, aż klej silikonowy się utwardzi.
Następnego dnia namocz komorę w wodzie destylowanej na noc, aby usunąć pozostałości kwasu octowego z kleju przed wysiewem komórek do komory. Osuszyć i wytrzeć komory dwoma propanolami, jak właśnie pokazano. Umyj je sterylnym PB S3 razy, a następnie sprawdź przepływ cieczy między dwoma okrągłymi otworami w komorach.
Po upewnieniu się, że komory są w dobrym stanie technicznym, zamknij je w sterylnych naczyniach hodowlanych i umieść komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Podczas gdy komory są w równowadze, odłącz komórki prostaty od ich naczynia hodowlanego za pomocą pięciu mililitrów trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach zneutralizuj reakcję pięcioma mililitrami 10% FBS.
W PBS przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowych probówek, a następnie odwiruj przez pięć minut. Przy 200 razy, G, odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki. Następnie po policzeniu komórek dostosuj stężenie komórek do ośmiu na 10 do czterech komórek na mililitr za pomocą pożywki hodowlanej i nasion.
350 mikrolitrów zawiesiny komórek na każdą komorę. Inkubuj komórki w komorze przez noc w naczyniu hodowlanym z mokrą chusteczką Kim o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozpocznij montaż górnych komór, najpierw podgrzewając 10 mililitrów kultury, średnio do 37 stopni Celsjusza dla każdej komory galwanowej AXS.
Podczas nagrzewania się pożywki przenieś komorę Galvan axxis z inkubatora na płytkę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłucz komorę pożywką hodowlaną. Aby usunąć nieprzyłączone komórki, pozostaw 400 mikrolitrów pożywki w komorze, a następnie użyj strzykawki, aby nałożyć smar wysokopróżniowy na obie szklane przestrzenie. Uszczelnij komorę szkłem nakrywkowym i bawełnianym aplikatorem, a następnie osusz powierzchnię szkła.
Następnie nałóż smar wysokopróżniowy za pomocą strzykawki, aby uszczelnić szczelinę między szkłem nakrywkowym a komorą. A następnie dodaj pożywkę hodowlaną do wewnętrznych zbiorników. Usuń bąbelki i sprawdź przepływ cieczy między zbiornikami.
Aby mostki agarowe przecięły parę dwucalowych rurek PVC, odwróć je, a następnie umieść kawałki w 100-mililitrowej zlewce. Następnie dodaj 200 miligramów agaru Bact Toe do 50-mililitrowej kolby z 10 mililitrami pożywki hodowlanej, aby uzyskać 2% żel agarowy. Po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund użyj pipety transferowej, aby załadować żel agarowy do plastikowej rurki i pozostaw mostki agarowe w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby zestalić agar.
Następnie dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do zewnętrznych zbiorników komory gal i włóż mostki agarowe do wewnętrznych i zewnętrznych zbiorników pożywki, aby przewodzić prąd w celu wykonania poklatkowego obrazowania migracji. Zacznij od przeniesienia komory Galvana do komory środowiskowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na stoliku mikroskopu, zabezpieczając komorę taśmą i skupiając się na komórkach pod obiektywem 10x. Następnie włóż elektrody Galvan Axxis do zewnętrznych zbiorników z katodą po prawej stronie, zabezpieczając drut i elektrody taśmą.
Następnie włącz skrzynkę zasilającą, aby przyłożyć pole elektryczne do komory i użyj miernika napięcia do pomiaru napięcia wyjściowego w komorze, aby osiągnąć 2,5 V dla komory o długości 25 milimetrów. Teraz wybierz 10 punktów w komorze, aby wygenerować 10 filmów poklatkowych i ustaw warunki akwizycji na 10-minutowe interwały przez dwie godziny. Następnie rozpocznij filmowanie i dostosuj prąd wyjściowy zgodnie z potrzebami, aby utrzymać natężenie pola podczas eksperymentu.
Pod koniec eksperymentu wyjmij komorę ze sceny i utrwal komórki w 95% alkoholu. Następnie otwórz komorę. Szkiełko nakrywkowe można zachować na później.
Barwienie i obrazowanie. Oczyść komorę na przyszłe lata. Aby określić ilościowo Galvan Axxis, obróć filmy poklatkowe, aby zorientować katodę na górze obrazów.
Eksportuj filmy do oprogramowania do śledzenia komórek i ręcznie śledź pozycję XY od 10 do 20 komórek w każdym punkcie czasowym z każdego filmu, odległości migracji i kąty względem kierunku północ-południe, ta sama orientacja pola elektrycznego zostanie obliczona w oprogramowaniu do śledzenia komórek. Na koniec zapisz pomiary i zaimportuj dane do aplikacji bazy danych, aby obliczyć połączone wyniki. W tym reprezentatywnym eksperymencie Galvan Axxis do linii komórek prostaty określono migrację z podobnymi prędkościami w ciągu dwóch godzin.
Jednak kierunkowość pola elektrycznego wynosiła 0,7 plus minus 0,3 dla PRNS jednej jednej linii i 0,2 plus minus 0,8 dla dwóch linii PNT, co wskazuje na istotną różnicę w osi Galvana tych dwóch linii komórkowych, co sugeruje, że ich mechanizmy sygnalizacji komórkowej kierują zróżnicowane odpowiedzi migracyjne na pole elektryczne Po opracowaniu metody Govan Texas. Technika ta pomaga naukowcom w badaniu mechanizmów kierunkowej migracji komórek w polu elektromagnetycznym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę stosowania fizjologicznego pola elektrycznego na migrująće, unieszkodliwione komórki prostaty za pomocą specjalnie skonstruowanej komory galvanotaksji. Wyniki wskazują, że dwie linie nienowotworzących komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w odpowiedzi na pole elektryczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Migracja komórek
- Elektrofizjologia
- Badania nad rakiem prostaty
Tło
- Galvanotaksja to kierowany ruch komórek w odpowiedzi na pole elektryczne.
- Ta metoda może pomóc zrozumieć zachowanie komórek w badaniach nad rakiem.
- Unieszkodliwione komórki prostaty służą jako model do badania zachowania komórek nienowotworzących.
- Różne linie komórek mogą reagować różnie na pola elektryczne.
Cel badania
- Ocenić kierunkową migrację komórek prostaty w polu elektrycznym.
- Porównać zachowanie migracji różnych nienowotworzących linii komórek prostaty.
- Ustalić niezawodną metodę badania galvanotaksji in vitro.
Zastosowane metody
- Złożenie specjalnej komory galvanotaksji.
- Zasiewanie komory unieszkodliwionymi komórkami prostaty.
- Zastosowanie pola elektrycznego podczas zdjęć time-lapse.
- Śledzenie prędkości i kierunku migracji pojedynczych komórek względem pola elektrycznego.
Główne wyniki
- Dwie linie nienowotworzących komórek prostaty wykazały różne stopnie kierunkowości migracji.
- Komórki migrowały w kierunku katody, co wskazuje na reakcję na pole elektryczne.
- Przeprowadzono ilościową analizę prędkości migracji i kątów.
- Metoda dostarcza informacji na temat zachowania komórek prostaty w polach elektrycznych.
Wnioski
- Komora galvanotaksji jest skutecznym narzędziem do badania migracji komórek.
- Różne linie komórek prostaty wykazują różne wzorce migracji w odpowiedzi na pola elektryczne.
- To badanie przyczynia się do zrozumienia roli pól elektrycznych w zachowaniu komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing differential intrinsic features governing directional migratory responses between prostate cell lines.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative measurement of migration speed and angle relative to cathode-directed galvanotaxis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell line-specific signaling mechanisms that modulate electrotaxis, informing target confidence assessments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using low-cytotoxicity, reusable PVC chambers and platinum electrodes for standardized electrotaxis screening.
- Quantitative Outputs: Generates migration speed and directional persistence metrics via time-lapse imaging and cell tracking software, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Facilitates platform reuse through agar bridge-mediated current conduction and motorized stage imaging, supporting assay standardization across runs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses SV40-immortalized prostate cell lines (pRNS-1-1 and PNT2) as a disease-relevant system to model non-tumorigenic cell behavior under electrophysiological cues.
- Translational Continuity: Links discovery-stage galvanotaxis measurements to preclinical risk-adjusted advancement by revealing differential electrotaxis that may reflect underlying pathway activity.
- Mechanistic De-risking: Highlights how cellular signaling mechanisms direct differential migration responses to electric fields, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how prostate cell lines directionally migrate in applied electric fields, clarifying pathway-dependent migratory phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber assembly, sterile equilibration, and time-lapse imaging under controlled field strength (2.5 V across 25 mm chamber).
- Analytics: Enables comparative analysis via exported time-lapse movies, manual XY tracking, and calculation of migration angles relative to the electric field north-south orientation.
- Translational Research: Connects galvanotaxis outcomes to preclinical continuity by identifying intrinsic migratory differences that may predict differential responses in complex microenvironments.
- Enterprise Reuse: Positions the chamber as a reusable capability due to affordable, autoclavable components and modular design allowing glass surface modifications and cell treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative galvanotaxis metrics that reduce mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via sealed chambers, agar bridges, and motorized stage imaging, minimizing variability in electrotaxis measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by revealing cell line-specific electrotaxis profiles that inform capital allocation in early-stage target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through differential directionality measurements (e.g., 0.7±0.3 vs 0.2±0.8) that reflect intrinsic migratory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidic chamber assembly, and time-lapse microscopy for reliable galvanotaxis execution.
- Dependent on instrumentation including motorized microscope stages, voltage meters, and cell tracking software for quantitative directional analysis.
- Necessitates cross-team standardization of chamber sealing protocols (silicone application, agar bridge preparation) to ensure consistent current conduction.
- Involves adaptation considerations when modifying glass surfaces or testing extracellular matrix coatings on chamber substrates for cell attachment studies.
- Includes practical limitations such as the 24-hour silicone curing time and overnight chamber soaking to remove acetic acid residue before cell seeding.
