Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest specyficzne znakowanie DNA i białek za pomocą transferaz metylowych, które w naturalny sposób przenoszą aktywowaną grupę metylową i kofaktor Sile l metioninę zwaną aome do D-N-A-R-N-A. Białka lub małe biomolekuły. Jednoetapowe znakowanie uzyskuje się poprzez zastąpienie naturalnego pominięcia kofaktora syntetycznymi kofaktorami aine, które zmieniają przebieg reakcji, prowadząc do enzymatycznego sprzężenia całego kofaktora, a tym samym kowalencyjnego znakowania sekwencji substratu Specyficzne znakowanie DNA wywołane metylotransferazą wykazano za pomocą metylotransferazy DNA specyficznej dla adyny, M-B-S-E-C jeden, który łączy biotynylowany kofaktor Aine sześć BAZ z sekwencją rozpoznawania A-G-C-G-A-T prowadzącą do sekwencji, w szczególności biotynylowanej, metylotransferazy DNA skierowanej do aktywowanych grup jest użyciem białka etykietowego i jest demonstrowany przy użyciu MTA zestaw siedem dziewięć, który przenosi grupę pro pargo z C ósemki do lizyny czterej histonu H trzy.

Alkilowana reszta lizyny jest znakowana chemicznie przez modyfikowany azydycznie fluor przy użyciu katalizowanej miedzią chemii kliknięć, co prowadzi do specyficznie znakowanego białka. Zaletą stosowania metamfetaminy do etykietowania jest to, że mogą one być bezpośrednio ukierunkowane na rodzime substraty. Zademonstruję to poprzez specyficzną sekwencję bioTE eralacji plazmidu, metatransferazy DNA, katalizowaną modyfikację białka za pomocą kofaktora analogowego zin i umożliwi wprowadzenie szerokiej gamy grup reporterowych w dwóch etapach.

Zademonstruję to poprzez znakowanie fluorescencyjne białka hisonu H 3 i pokazanie wyników znakowania H 3 biotyną. Dodatkowo, podwójnie aktywowane analogi kofaktora można łatwo zsyntetyzować, ładując S ail, el homocysteinę, produkt kofaktora po przeniesieniu grupy metylowej różnymi aktywowanymi alkoholami. Syntetyczne analogi kofaktorów są oczyszczane przez HPLC z odwróconą fazą, aw niektórych przypadkach możliwe jest nawet oddzielenie epi Marsa w siarce.

Uśmiechnięte DNA to specyficzne sekwencyjnie etykietowanie DNA wywołane metylotransferazą. Tutaj koncepcja jest demonstrowana poprzez znakowanie plazmidowego DNA PB 3 22 za pomocą sześciu kofaktorów BAZ Aine i metylotransferazy DNA specyficznej dla adyny. M-B-S-E-C zaczynamy od nagrzania sześciu baz do temperatury 20 stopni Celsjusza.

Raz pomyślałeś, napraw mieszaninę reakcyjną na lodzie. Zawiera mikrogram plazmidu, 60 mikromolów sześciu Baz i 10 odpowiedników M-B-S-E-C jeden. Sekwencja rozpoznawania HER w buforze modyfikacji DNA.

Pamiętaj, aby dodać sześć BAZ i M-B-S-E-C na końcu. Upewnij się, że nie ma AME związanego z metamfetaminą, której używasz, ponieważ naturalny kofaktor zablokuje etykietowanie. Reaguj na kontrolki.

Zastąp MTA wodą, aby uwidocznić wszelkie niespecyficzne modyfikacje kofaktora i dodaj wodę zamiast kofaktora, aby przetestować naturalny kofaktor w koncentracie enzymu. Teraz delikatnie wymieszaj reakcje pipetą i inkubuj je w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Pod koniec inkubacji napraw mieszaninę endonukleazy na lodzie, dodając 10 mikrolitrów 10 x rekombinowanego tachografu, jeden bufor do 80 mikrolitrów wody, a następnie dodając 3,3 mikrolitra rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej.

Po inkubacji przeciągnij reakcje szybkim wirowaniem, a następnie zweryfikuj modyfikację DNA do każdej z nich. Dodaj dwa mikrolitry 10 x tak, jeden bufor i 28 mikrolitrów mieszaniny endonukleazy. Wymieszać reakcje, delikatnie pipetując.

Teraz inkubuj reakcje w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pół godziny. Po zakończeniu reakcji pociągnij roztwór szybkim wirowaniem i zbierz 25 mikrolitrów reakcji do nowych probówek. Do tych podwielokrotności dodać 2,4 mikrolitra paciorkowca TTR w buforze po jednym milimolu na monomer paciorkowca adin.

Teraz inkubuj tę reakcję przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać pięć mikrolitrów sześciokrotnego buforu ładującego do zakończonych reakcji i wylać 10 mikrolitrów na 1% żelu agros o napięciu 80 woltów przez około godzinę. Następnie wizualizuj pasma mt A to skrót od metylotransferazy skierowanej do aktywowanych grup.

W tej demonstracji metylotransferaza ustawiła siedem, dziewięć i podwójnie aktywowany kofaktor C osiem. Oin są używane do oznaczania lizyny cztery z jego histonu H trzy. Po rozmrożeniu składników na 20 mikrolitrowych mieszaninach reakcyjnych do naprawy lodu, roztwór testowy zawiera bufor modyfikujący 10 mikromoli histonu H trzy i dodany ostatni 10 mikromolowy transferaz metylowych plus 600 mikromolowych kofaktora.

Wykonaj kontrolę enzymatyczną, zastępując wodę dejonizowaną C 8 ON. Wykonaj również kontrolę kofaktora, aby zwizualizować niespecyficzne modyfikacje, uwzględniając 60 milimoli ADO spełnionych, aby konkurować z syntetycznymi kofaktorami. Teraz wymieszaj reakcje z powolnym zatruwaniem rur i sprawdź ich pH za pomocą pasków testowych. Podwójnie aktywowane analogi kofaktora są przechowywane w warunkach C.

Dlatego pH roztworu reakcyjnego może się zmienić poprzez dodanie współczynnika, jeśli to konieczne, w niewielkich ilościach 50-milimolowego wodorotlenku sodu w celu dostosowania pH. Teraz inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny podczas naprawy inkubacji. Żel z poliakrylamidu 12% SDS tuż przed zakończeniem inkubacji przygotuj 20 mikrolitrów pięciokrotnej mieszanki zawierającej trzy milimolowe siarczany miedzi, trzy milimolowe ligandy T-H-P-T-A o średnicy 250 milimolów, przynętę ACO sodu i sześciomilimolowy azydek Tamara.

Pod koniec inkubacji dodaj pięć mikrolitrów mieszanki kliknięć do każdej reakcji i powoli mieszaj reakcje, zgodnie z pieszczotami. Chroń reakcje przed światłem za pomocą folii i inkubuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę. Po godzinie usuń nadmiar chloroformu, wytrącając białka.

Dodaj 75 mikrolitrów metanolu, 18,7 mikrolitrów chloroformu i 50 mikrolitrów wody do każdej reakcji i krótko je zwiruj po każdym dodaniu. Po przygotowaniu każdej probówki odwirowuj je z prędkością 16 000 G przez pięć minut. Usuń górną fazę separacji bez naruszania warstwy interfejsu, która zawiera białka.

Teraz dodaj 56,3 mikrolitrów metanolu, dolną fazę i wir. Następnie odkręć to, aby granulować białko i odrzucić supinat. Następnie dodaj 56,3 mikrolitrów metanolu.

Znowu wir. Powtórz wirowanie i odzyskaj granulki. Pozostaw granulki do wyschnięcia w probówkach, niezakorkowane i przykryte niestrzępiącym się papierem.

Następnie rozpuść białka w 20 mikrolitrach buforu ładującego SDS z barwnikiem ładującym. Przepłucz ścianki rurki buforem, aby zebrać osad. Następnie inkubuj probówki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Gdy probówki osiągną temperaturę pokojową, poświęć je na chwilę, aby wyciągnąć ich zawartość i zobrazować białka za pomocą strony SDS. Uruchom pod napięciem 120 woltów przez około 90 minut. Reakcję uśmiechania się przeprowadzono za pomocą metylotransferazy DNA M-B-S-E-C jeden, który modyfikuje drugą resztę adeninową w dwuniciowej sekwencji A-T-C-G-A-T i ma jedno miejsce rozpoznawania na plazmidzie PBR 3 2 2, które jest oznaczone na czerwono w celu przetestowania znakowania plazmidu.

PB 3 2 2 poddano prowokacji rekombinowanej restrykcji ENDONUKLEAZY T jeden, która ma siedem miejsc na PB 3 22 oznaczonych na zielono, z których jedno znajduje się w jednym miejscu M-B-S-E-C. Podczas znakowania miejsce to należy zabezpieczyć przed rozszczepieniem w żelu. Zostało to potwierdzone.

Pojawił się nowy fragment z 683 parami zasad, co pokazuje, że w jednym miejscu M-B-S-E-C było znakowanie. Jest to widoczne tylko na torze testowym, który jest pasem trzecim. Swoistość reakcji znakowania wykazano na przykładzie zmiany elektromobilności.

Po dodaniu paciorkowca adyna elektroruchliwość fragmentu 683 pary zasad znakowanego biotyną była opóźniona. Podczas gdy ruchliwość fragmentów bez M-B-S-E-C jedno miejsce pozostało niezmienione, czyli dwuetapowe znakowanie substratów metylotransferazy podwójnie aktywowanymi ośmioma analogami oh met. Zastosowano histon H, trzy, lizynę, cztery, metylotransferazę, zestaw siedem, dziewięć, oraz mały kofaktor C-osiem, ON.

Elektroforezę żelową zastosowano do detekcji fluorescencji tylko na torze testowym. Pas pierwszy pokazał pasmo fluorescencyjne odpowiadające histonowi H trzy, co wskazuje, że łańcuch boczny kofaktora został specyficznie przeniesiony, a zmodyfikowane białko zostało znakowane Tamara Flora.Four. Bejca ESI służy jako kontrola obciążenia.

Wszystkie pasy wykazały taką samą ilość białka. Substraty metylotransferazy mogą być również znakowane reakcjami biotyny z biotyną pochodzącą z azi. Zamiast fluoru przeprowadzono test Western blot z peroksydazą chrzanową.

Udane i specyficzne etykietowanie sprzężonego Adenu zaobserwowano po obejrzeniu tego filmu. Powinieneś dobrze rozumieć, jak oznaczać sekwencję DNA i białka, w szczególności za pomocą tekstu powinowactwa, siły fluoru lub innych etykiet. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że inne met i jego analogi są wrażliwe na temperaturę.

Zawsze obchodź się z nimi na lodzie i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zsyntetyzowałem podwójnie aktywowany. Inne analogi MET z grupą reporterową były już wbudowane w łańcuch boczny i wykorzystywały je do specyficznego znakowania DNA w jednym kroku.

Szczególnie ekscytuje mnie perspektywa łączenia różnych enzymów i grup raportów do mapowania DNA przy użyciu technik pojedynczych cząsteczek. Smiling i NEC są bardzo elastyczne, a prawie każda grupa chemiczna może być przenoszona nie tylko do DNA i białek, ale także do RNA i małych za pomocą odpowiednich transferów metamfetaminy.