Name: Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji progenitorów neuronalnych z rozwijającego się móżdżku myszy neonatalnej. Technika mikrodysekcji i sortowania komórek fluorescencyjnych pozwala uzyskać żywe komórki do dalszych badań nad rozwojem układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jamesowi Oesterlingowi za pomoc w cytometrii przepływowej. Badania te były wspierane przez grant z US National Cancer Institute (R01-CA178380, Z.Y.) oraz grant szkoleniowy US National Institutes Postdoctoral (5T32CA009035-37, L.W.Y.).

Wykorzystanie zwierząt w tym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Fox Chase Cancer Center.
1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Wyczyść dwa zestawy drobnych kleszczyków #5, jeden zestaw cienkich zakrzywionych kleszczy #7, jedne duże nożyczki chirurgiczne, jedne nożyczki do mikropreparacji, jedną szpatułkę i jedną perforowaną łyżkę. Umieść narzędzia w samouszczelniającej się torbie sterylizacyjnej i autoklawie. Przechowuj instrumenty w woreczku, aż będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Przygotuj 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
	<ol>
		<li>Dodaj 1,5 g agarozy do 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS), a następnie umieść w kuchence mikrofalowej i podgrzewaj, aż pojawią się bąbelki. Zamieszaj kolbą i podgrzewaj ponownie, aż cała agaroza się rozpuści. Wymieszaj roztwór z mieszadłem przed podgrzaniem, jeśli pojawią się grudki.</li>
		<li>Przechowywać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
		<li>W przypadku długotrwałego przechowywania roztwór agarozy do wykorzystania w przyszłości należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy. Podgrzej w kuchence mikrofalowej do upłynnienia. W celu wielokrotnego podgrzewania roztworu agarozy, zważyć kolbę przed podgrzaniem, aby utrzymać jej początkową wagę ciepłą, sterylną wodą destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory do dysocjacji komórek na bazie papainy, jak opisano wcześniej2:
	<ol>
		<li>Roztwór papainy z papainą (100 j./ml), cysteiną (0,2 mg/ml) i DNazą (250 j./ml) w sterylnym DPBS zawierającym czerwień fenolową.</li>
		<li>Roztwór jajomkoidów z albuminą surowicy bydlęcej (BSA; 8 mg/ml), inhibitorem trypsyny sojowej (8 mg/ml)) i DNazą (250 U/ml) w sterylnym DPBS zawierającym czerwień fenolową. 
		Przefiltruj, wysterylizuj oba roztwory i dostosuj pH, aby przywrócić oryginalny kolor DPBS zawierającego czerwień fenolową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (NB/B27): uzupełnić podłoże podstawowe 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) i suplementu B27. Filtruj, sterylizuj i chroń przed światłem. Przed użyciem wyrównać media w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotować bufor FACS: 5% płodowa surowica bydlęca (FBS) w DPBS. Dodaj 2,5 ml FBS do 47,5 ml DPBS.</li>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL).
	<ol>
		<li>Autoklaw nowe szklane szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Pokryć szkiełka nakrywkowe PDL (100 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub pokojowej przez noc.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe umyć sterylną wodą destylowaną. Umyć raz mediami NB/B27. Przed użyciem pozostaw szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja i przygotowanie wycinków tkanek
<ol>
	<li>W dniu sekcji należy przetrzeć obszar sekcji 70% etanolem i przykryć wkładką chłonną.</li>
	<li>Wyjmij narzędzia preparacyjne z woreczka do sterylizacji. Dodaj lodowaty, sterylny DPBS/1% P/S do małej szalki Petriego i umieść na lodzie.</li>
	<li>Ścięć głowę szczeniąt myszy P4 Math1-GFP / Nestin-CFP dużymi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie przytrzymać głowę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy. Usuń skórę i delikatnie oderwij czaszkę za pomocą #5 cienkich kleszczy, a następnie wyjmij mózg z czaszki za pomocą szpatułki i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą DPBS/1% P/S.
	<ol>
		<li>Używając cienkich kleszczy #5, ostrożnie oddziel móżdżek od reszty mózgu. Pamiętaj, aby jak najszybciej przeciąć jedno szczenię na raz.</li>
		<li>Zbierz co najmniej 8 móżdżku, aby uzyskać wystarczającą ilość NEP-ów do analiz molekularnych i funkcjonalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij formę do zatapiania o wymiarach 2 x 2 x 2 cm 3% roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Upewnij się, że temperatura agarozy nie przekracza 37 °C.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu z móżdżku, delikatnie wklepując w tkankę laboratoryjną. Umieść móżdżek w formie w pozycji pionowej. Umieść formę na lodzie, aby szybko się zestaliła. Użyj ~4 móżdżku na blok.</li>
	<li>Uzyskaj żywe skrawki tkanek za pomocą wibrującego wibratomu ostrza. Przytnij blok agarozy zawierający mkreetellę żyletką. Przyklej blok agarozy do płytki wibratomu z móżdżkiem ustawionym w pozycji pionowej.</li>
	<li>Napełnij tackę wibratomu lodowatym sterylnym DPBS/1% P/S i umieść pod spodem lód.
	<ol>
		<li>Wytnij odcinki 600 μm na całej długości móżdżku. Zbierz kawałki z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki. Umieść skrawki na szalce Petriego wypełnionej DPBS/1% P/S na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikrodysekcja i dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą wycinki tkanek pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.
	<ol>
		<li>Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku za pomocą cienkich kleszczy, preparując między warstwą molekularną CFP+ a GFP+ EGL (patrz linia przerywana na rysunku 1). Należy uważać, aby nie uwzględnić żadnej części warstwy molekularnej, co spowoduje zanieczyszczenie gleju Bergmanna wykazującego ekspresję Nestyny.</li>
		<li>Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe i utrzymuj tkankę na lodzie, aby uniknąć śmierci komórki.</li>
		<li>Usuń agarozę otaczającą tkankę przed przejściem do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strawić mikrowypreparowaną tkankę EGL przy użyciu protokołu opartego na papainie, jak opisanowcześniej 2, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
	<ol>
		<li>Ponownie zawieś komórki w buforze FACS w celu zebrania komórek CFP-dodatnich za pośrednictwem FACS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sortowanie i powlekanie komórek
<ol>
	<li>Posortuj komórki pod kątem fluorescencji CFP za pomocą sterylnego, szybkiego cytometru przepływowego zawierającego odpowiedni filtr CFP i zbierz komórki w buforze FACS na lodzie. Uzyskaj około 100 000 NEP-ów z każdego móżdżku P4.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Natychmiast użyć komórek do analizy molekularnej lub hodowli do dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Aby wyhodować komórki, ponownie zawiesić komórki we wstępnie ogrzanym podłożu NB/B27 i płytkę na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL, jak opisano wcześniej2.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li>
<li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li>
<li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+developmental+mechanisms+out+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li>
<li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li>
<li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda mikrodysekcji jest pierwszą procedurą zdolną do wyizolowania czystej populacji żywych komórek do wykorzystania w analizach molekularnych i funkcjonalnych. Jak wykazano przez Li i wsp.9, NEP uzyskane tą metodą mogą być hodowane i włączane do różnych eksperymentów, a ze względu na ich wysoką czystość mogą być również wykorzystywane do analizy mikromacierzy.
Bardzo ważne jest, aby poświęcić trochę czasu, aby nabrać biegłości w tej technic...

Móżdżek składa się z wielu warstw komórek, z których każda zawiera różne typy komórek. Podczas rozwoju EGL zawiera proliferujące prekursory neuronów ziarnistych (GNP), podczas gdy warstwa molekularna i warstwa Purkinjego zawierają odpowiednio neurony glejowe Bergmanna i neurony Purkinjego. Głęboko w móżdżku znajduje się istota biała, która zawiera nerwowe komórki macierzyste (NSC) i oligodendrocyty1.
Sonic hedgehog (Shh) odgrywa kluczową rolę w regulacji rozwoju móżdżku, a w szczególności promuje proliferację GNP poprzez wiązanie się ze swoim receptorem Patched (Ptc), negatywnym regulatorem sygnalizacji Shh2-4. Nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji Shh generuje rdzeniaka zarodkowego (MB), najczęstszy złośliwy nowotwór mózgu u dzieci5,6.
Modele transgenicznych myszy MB z mutacją Ptc są potężnymi narzędziami do badania MB i rozwoju nowotworów przypominających ludzki MB7,8. Korzystając z tych myszy, odkryto, że GNP są komórką pochodzenia MB7 typu jeżowego. Ponadto, oprócz PNB, niedawno zidentyfikowaliśmy unikalną populację neuronalnych komórek progenitorowych w obrębie EGL rozwijającego się móżdżku, które również mogą powodować MB. Komórki te wyrażają wysokie poziomy pośredniego białka filamentowego typu VI, Nestin, i są określane jako NEPs9. NEP są zlokalizowane w głębokiej części EGL i występują przejściowo tylko podczas rozwoju móżdżku noworodka. Są one zaangażowane w linię komórek ziarnistych jako GNP, ale różnią się, ponieważ są w stanie spoczynku i nie wyrażają Math1, dobrze ugruntowanego markera dla konwencjonalnych GNP10. Ponadto NEP powodują powstawanie MB skuteczniej niż GNP po aktywacji szlaku sygnałowego Shh9, co czyni je nowym źródłem nowotworzenia MB.
Wcześniej wyizolowaliśmy NEPy z EGL móżdżku w 4 dniu po urodzeniu (P4) za pomocą techniki mikrodysekcji opisanej tutaj9. Mikrodysekcja poprzez bezpośrednią wizualizację mikroskopową tkanki pozwala na specyficzne wypreparowanie móżdżku EGL. Jest to konieczne, ponieważ nestyna jest również wyrażana przez NSC w istocie białej móżdżku i przez glej Bergmanna w warstwie molekularnej1,7,11,12 i ważne było, aby komórki te nie zostały uwzględnione, ponieważ zakłóciłoby to analizę. Komórki wyizolowane z mikrowypreparowanej tkanki mogą być natychmiast wykorzystane do analizy molekularnej lub mogą być hodowane do dalszych zastosowań.
Aby pomóc w szczegółowym mikrorosekcji EGL i dalszym oczyszczaniu NEP, myszy Math1-GFP (zielone białko fluorescencyjne) skrzyżowano z myszami Nestin-CFP (cyjan fluorescencyjne białko). Czynnik transkrypcyjny Math1 jest specyficznie wyrażany przez GNP, a ekspresja GFP jest wyraźnie widoczna w EGL9,13. Myszy Nestin-CFP wyrażają jądrową formę CFP i można je łatwo uwidocznić w warstwie molekularnej9,14. Ekspresja GFP i CFP razem tworzą granice dla mikrodysekcji EGL (patrz rysunek 1). CFP-dodatnie NEP-y zostały następnie wyizolowane przez FACS, po enzymatycznej dysocjacji rozpreparowanych EGL.
Obecnie, najczęściej stosowaną metodą izolowania komórek z EGL jest wirowanie w gradiorze Percoll całej tkanki móżdżku15,16. Metoda ta nie jest jednak w stanie całkowicie wykluczyć populacji komórek Nestin+ z warstwy molekularnej i istoty białej, a zatem nie może być stosowana do badania NEP. Mikrodysekcja wychwytywania laserowego, która wykorzystuje transfer energii lasera do usuwania komórek będących przedmiotem zainteresowania, jest inną metodą stosowaną do izolowania określonych komórek w niejednorodnej tkance17,18, ale przechwycone komórki mogą być używane tylko do odzyskiwania DNA, RNA i białka i nie mogą być hodowane.
Ten protokół umożliwia specyficzne odizolowanie żywej, czystej populacji NEP-ów od EGL. Technika ta może być również stosowana do różnych typów tkanek, które mają rozpoznawalną architekturę anatomiczną lub fluorescencyjnie znakowane komórki/regiony. Dlatego główną zaletą włączenia tej nowatorskiej techniki mikrodysekcji do protokołów izolacji komórek jest to, że komórki można izolować z określonych regionów tkanek w celu wyeliminowania zanieczyszczenia sąsiednich tkanek, a komórki można natychmiast pobrać do analizy lub hodować do innych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Mikrodysekcja to nowatorska technika, która pozwala izolować określone obszary tkanki i eliminować zanieczyszczenia ze źródeł komórkowych w sąsiednich obszarach. Metoda ta została po raz pierwszy wykorzystana w badaniu progenitorów eksprymujących nestynę (NEP), nowo zidentyfikowanej populacji komórek w móżdżku zewnętrznym liście rozrodczym (EGL). Stosując mikrodysekcję w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), pobrano czystą populację NEP-ów oddzielnie od konwencjonalnych prekursorów neuronów ziarnistych w EGL oraz od innych zanieczyszczających komórek wykazujących ekspresję nestyny w móżdżku. Bez mikrodysekcji analizy funkcjonalne NEP-ów nie byłyby możliwe przy użyciu obecnie dostępnych metod, takich jak wirowanie w gradiacji Percollu i mikrodysekcja z wychwytem laserowym. Technika ta może być również stosowana do stosowania z różnymi tkankami, które zawierają rozpoznawalne regiony lub komórki znakowane fluorescencyjnie. Co najważniejsze, główną zaletą tej techniki mikrodysekcji jest to, że izolowane komórki są żywe i mogą być hodowane do dalszych eksperymentów, co obecnie nie jest możliwe przy użyciu innych opisanych metod.

Jak pokazano na Rysunku 1A, skrawki móżdżku przygotowano z myszy P4 Math1-GFP/Nestin-CFP, w których w zewnętrznej warstwie ziarnistej (EGL) móżdżku dominowały GNPs wykazujące ekspresję GFP, a warstwa molekularna była wzbogacona o CFP-dodatnie komórki glejowe. Aby wyizolować NEPs zlokalizowane w głębokiej części EGL, wykonano mikrodysekcję skrawków pomiędzy EGL a warstwą molekularną (wzdłuż przerywanej linii; Rysunek 1A). Wypreparowane EGLs (Rysunek 1B) ...

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie określonych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie móżdżku od nowonarodzonych myszy przenoszących białka fluorescencyjne. Drugim etapem zabiegu jest pobranie żywych skrawków tkanek za pomocą vibrato.Trzecim krokiem jest mikrodysekcja zewnętrznej warstwy rozrodczej móżdżku pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Ostatnim etapem jest dysocjacja tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i zebranie komórek poprzez fluorescencyjne sortowanie komórek. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, że określone populacje komórek można wyizolować z móżdżku.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wychwytywanie laserowe, mikropreparacja, jest to, że komórki są żywe i można je hodować. W celu dalszych eksperymentów W celu przeprowadzenia tej procedury wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Uzyskaj świeże lub podgrzane 3% niskotopliwe aros gotowe do użycia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Przygotuj wymagane roztwory do dysocjacji komórek na bazie papai. Przygotować świeże pożywki hodowlane NBB 27. Następnie przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w inkubatorze.Przygotować bufor faksu i przygotować szkiełka nakrywkowe z poli litykiny. Pierwsza warstwa szkiełek nakrywkowych autoklawu zawiera 100 mikrogramów poli de lyciny na mililitr sterylnej wody. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.Później umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, a następnie mediami NBB 27 przed użyciem szkiełek nakrywkowych. Wysusz je całkowicie. Zajmie to co najmniej godzinę przed rozpoczęciem.Najpierw przygotuj obszar sekcji. Wytrzyj go do czysta 70% etanolem. Następnie przykryj go chłonnym wkładem.Po drugie, wyjmij narzędzia z woreczka sterylizacyjnego i umieść je do użycia. Po trzecie, załaduj naczynie lodowatym sterylnym DPBS z 1% paskiem do wstrzykiwacza i połóż je na lodzie. Wypreparuj mózg szczeniaka P czterech, który wyraża markery fluorescencyjne.Następnie przenieś go do przygotowanego naczynia DPBS. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Te móżdżek wyraża markery math jeden, GFP i gniazduje w CFP, w którym EGL wyraża GFP, a warstwa molekularna jest dodatnia dla CFP.Następnie wypełnij dwucentymetrową sześcienną formę do osadzania roztworem agro. Upewnij się, że nie jest cieplejszy niż 37 stopni Celsjusza. Podnieś móżdżek perforowaną łyżką i osusz go, delikatnie przecierając tkankę.Następnie za pomocą kleszczy umieść go w formie. Użyj igły, aby ustawić móżdżek w orientacji pionowej. Raz około czterech jest ładowanych do formy.Umieść formę na lodzie, aby szybko stwardniała Za pomocą żyletki. Przytnij blok, aby skrócić czas cięcia. Następnie przyklej blok do płytki zorientowanej tak, aby móżdżek był pionowy.Załaduj tackę do napełniania lodowatym DPBS z 1% taśmą i umieść lód pod tacą, aby pozostał zimny. Teraz pokrój klocki za pomocą wibratora. Wytnij i zbierz odcinki o grubości 600 mikronów.Wyjmij je z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki i przenieś do naczynia napełnionego A-D-P-B-S na lodzie. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj plastry tak szybko, jak to możliwe.Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku. Użyj cienkich kleszczy, aby wypreparować warstwę molekularną CFP dodatnią a GFP dodatnią EGL. Zachowaj ostrożność podczas mikrosekcji, aby uniknąć zanieczyszczenia z sąsiednich regionów.Przenieść tkankę EGL z dodatnim wynikiem GFP do nowego naczynia wypełnionego DPBS na lodzie. Unikaj dołączania jakiejkolwiek tkanki warstwy molekularnej, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie kultury gniazdem wyrażającym glej Bergmana. Następnie usuń agros otaczający izolowaną tkankę EGL.EGL można teraz zdysocjować za pomocą protokołu opartego na paan dla zawieszenia pojedynczej komórki. Po zakończeniu tego procesu ponownie zawiesić komórki w buforze faksu. Kontynuuj zbieranie komórek CFP za pomocą faksu.Posortuj je za pomocą cytometru o dużej szybkości i filtra CFP, a następnie wciągnij je do lodowatego bufora faksu. Na móżdżek P four należy uzyskać około 100 000 NPS. Następnie odwirować połączone komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut.Natychmiast wykorzystaj komórki do hodowli ich resus. Zawieś je w rozgrzanych mediach NBB 27. Następnie załaduj je na szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną z poliD i lizyną.Plastry belli komórkowej przygotowano z gniazda P four math one GFP u myszy CFP. Móżdżek EGL zawierał głównie GFP eksprymujący GMP i mógł być łatwo oddzielony od warstwy molekularnej wzbogaconej w CFP wyrażający glej Analiza faktów wykazała, że ponad 85% komórek w EGL było konwencjonalnymi PNB. NEP wyizolowano z głębokich części EGL za pomocą mikrodysekcji, a następnie faktów.Komórki te stanowiły około 5% komórek w EGL po czterech dniach hodowli. Fakty, wyizolowane NPS dały początek neuronom wyrażającym beta tubulinę. Jest to charakterystyczne dla neuronalnych komórek progenitorowych ograniczonych do linii.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymaniu tkanki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Ten film opisuje metodę generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy. Wycinki móżdżku mogą być używane do hodowli organotypowej, która zapewnia wgląd w mechanizmy neurorozwojowe, w tym dynamikę mielinizacji.

Rozwarstwienie móżdżku i przygotowanie plastrów: metoda generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek macierzystych z móżdżku myszy po urodzeniu i różnicowania ich w komórki nerwowe. Komórki macierzyste z izolowanej zawiesiny komórkowej są oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami i są hodowane w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery są następnie utrzymywane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia komórek nerwowych.

Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Poznaj metodę izolacji progenitorów neuronalnych z rozwijającego się móżdżku myszy neonatalnej. Technika mikrodysekcji i sortowania komórek fluorescencyjnych pozwala uzyskać żywe komórki do dalszych badań nad rozwojem układu nerwowego.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Przeglądaj więcej filmów