Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji
21 września 2014
Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie określonych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie móżdżku od nowonarodzonych myszy przenoszących białka fluorescencyjne. Drugim etapem zabiegu jest pobranie żywych skrawków tkanek za pomocą vibrato.
Trzecim krokiem jest mikrodysekcja zewnętrznej warstwy rozrodczej móżdżku pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Ostatnim etapem jest dysocjacja tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i zebranie komórek poprzez fluorescencyjne sortowanie komórek. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, że określone populacje komórek można wyizolować z móżdżku.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wychwytywanie laserowe, mikropreparacja, jest to, że komórki są żywe i można je hodować. W celu dalszych eksperymentów W celu przeprowadzenia tej procedury wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Uzyskaj świeże lub podgrzane 3% niskotopliwe aros gotowe do użycia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przygotuj wymagane roztwory do dysocjacji komórek na bazie papai. Przygotować świeże pożywki hodowlane NBB 27. Następnie przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w inkubatorze.
Przygotować bufor faksu i przygotować szkiełka nakrywkowe z poli litykiny. Pierwsza warstwa szkiełek nakrywkowych autoklawu zawiera 100 mikrogramów poli de lyciny na mililitr sterylnej wody. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.
Później umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, a następnie mediami NBB 27 przed użyciem szkiełek nakrywkowych. Wysusz je całkowicie. Zajmie to co najmniej godzinę przed rozpoczęciem.
Najpierw przygotuj obszar sekcji. Wytrzyj go do czysta 70% etanolem. Następnie przykryj go chłonnym wkładem.
Po drugie, wyjmij narzędzia z woreczka sterylizacyjnego i umieść je do użycia. Po trzecie, załaduj naczynie lodowatym sterylnym DPBS z 1% paskiem do wstrzykiwacza i połóż je na lodzie. Wypreparuj mózg szczeniaka P czterech, który wyraża markery fluorescencyjne.
Następnie przenieś go do przygotowanego naczynia DPBS. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Te móżdżek wyraża markery math jeden, GFP i gniazduje w CFP, w którym EGL wyraża GFP, a warstwa molekularna jest dodatnia dla CFP.
Następnie wypełnij dwucentymetrową sześcienną formę do osadzania roztworem agro. Upewnij się, że nie jest cieplejszy niż 37 stopni Celsjusza. Podnieś móżdżek perforowaną łyżką i osusz go, delikatnie przecierając tkankę.
Następnie za pomocą kleszczy umieść go w formie. Użyj igły, aby ustawić móżdżek w orientacji pionowej. Raz około czterech jest ładowanych do formy.
Umieść formę na lodzie, aby szybko stwardniała Za pomocą żyletki. Przytnij blok, aby skrócić czas cięcia. Następnie przyklej blok do płytki zorientowanej tak, aby móżdżek był pionowy.
Załaduj tackę do napełniania lodowatym DPBS z 1% taśmą i umieść lód pod tacą, aby pozostał zimny. Teraz pokrój klocki za pomocą wibratora. Wytnij i zbierz odcinki o grubości 600 mikronów.
Wyjmij je z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki i przenieś do naczynia napełnionego A-D-P-B-S na lodzie. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj plastry tak szybko, jak to możliwe.
Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku. Użyj cienkich kleszczy, aby wypreparować warstwę molekularną CFP dodatnią a GFP dodatnią EGL. Zachowaj ostrożność podczas mikrosekcji, aby uniknąć zanieczyszczenia z sąsiednich regionów.
Przenieść tkankę EGL z dodatnim wynikiem GFP do nowego naczynia wypełnionego DPBS na lodzie. Unikaj dołączania jakiejkolwiek tkanki warstwy molekularnej, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie kultury gniazdem wyrażającym glej Bergmana. Następnie usuń agros otaczający izolowaną tkankę EGL.
EGL można teraz zdysocjować za pomocą protokołu opartego na paan dla zawieszenia pojedynczej komórki. Po zakończeniu tego procesu ponownie zawiesić komórki w buforze faksu. Kontynuuj zbieranie komórek CFP za pomocą faksu.
Posortuj je za pomocą cytometru o dużej szybkości i filtra CFP, a następnie wciągnij je do lodowatego bufora faksu. Na móżdżek P four należy uzyskać około 100 000 NPS. Następnie odwirować połączone komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut.
Natychmiast wykorzystaj komórki do hodowli ich resus. Zawieś je w rozgrzanych mediach NBB 27. Następnie załaduj je na szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną z poliD i lizyną.
Plastry belli komórkowej przygotowano z gniazda P four math one GFP u myszy CFP. Móżdżek EGL zawierał głównie GFP eksprymujący GMP i mógł być łatwo oddzielony od warstwy molekularnej wzbogaconej w CFP wyrażający glej Analiza faktów wykazała, że ponad 85% komórek w EGL było konwencjonalnymi PNB. NEP wyizolowano z głębokich części EGL za pomocą mikrodysekcji, a następnie faktów.
Komórki te stanowiły około 5% komórek w EGL po czterech dniach hodowli. Fakty, wyizolowane NPS dały początek neuronom wyrażającym beta tubulinę. Jest to charakterystyczne dla neuronalnych komórek progenitorowych ograniczonych do linii.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymaniu tkanki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji progenitorów wykazujących ekspresję nestyny z rozwijającego się móżdżku noworodków myszy. Technika ta łączy mikrodysekcję z sortowaniem komórek fluorescencyjnie aktywowanym w celu oczyszczenia tych progenitorów do dalszych badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Wstęp
- Progenitory komórki wykazujące ekspresję nestyny stanowią nowo zidentyfikowaną populację w móżdżku.
- Zrozumienie tych komórek progenitorowych może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju neuronów.
- Istniejące metody izolacji komórek często prowadzą do zanieczyszczenia próbek.
- Celem niniejszego badania jest zwiększenie czystości izolowanych populacji komórek.
Cel badania
- W celu wyizolowania specyficznych populacji prekursorów neuronów z móżdżku.
- W celu umożliwienia dalszych eksperymentów i analizy tych komórek.
- W celu zaprezentowania techniki pozwalającej na utrzymanie żywotności komórek do hodowli.
Zastosowane Metody
- Pobieranie móżdżków od noworodków myszy z markerami fluorescencyjnymi.
- Mikrodysekcja zewnętrznej warstwy ziarnistej pod mikroskopem fluorescencyjnym.
- Dysocjacja tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
- Sortowanie komórek metodą FACS w celu wyizolowania specyficznych populacji komórkowych.
Główne wyniki
- Z móżdżka pomyślnie wyizolowano specyficzne populacje komórek.
- Potwierdzono, że ponad 85% wyizolowanych komórek to konwencjonalne GNPs.
- Wyizolowano NEPs, które stanowiły około 5% komórek EGL.
- Wyizolowane komórki progenitorowe dały początek neuronom wykazującym ekspresję beta-tubuliny.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na izolację żywych progenitorów neuronalnych.
- Technika ta może usprawnić badanie rozwoju móżdżku.
- Utrzymanie żywotności tkanki jest kluczowe dla pomyślnej hodowli komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie specyficznych populacji komórek z heterogennych tkanek pozostaje krytycznym wyzwaniem w początkowej fazie walidacji celów terapeutycznych i opracowywania testów. Ten przepływ pracy obejmujący mikrodysekcję i FACS umożliwia odzyskanie żywych, wolnych od zanieczyszczeń komórek progenitorowych, co wspiera de-risking mechanistyczny i zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad liniami neuronalnymi. Zdolność do hodowania izolowanych komórek łączy biologię odkrywczą z translacyjną eksploracją biomarkerów w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie progenitorów wykazujących ekspresję Nestiny jako odrębnej hipotezy terapeutycznej w rozwoju móżdżku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia oczyszczoną populację komórek wolną od zanieczyszczeń w postaci prekursorów neuronów ziarnistych i glei Bergmana w celu oceny funkcjonalnej celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację progenitorów o ograniczonej linii komórkowej poprzez odczyty różnicowania neuronalnego beta-tubulin+.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie żywej zawiesiny pojedynczych komórek, odpowiedniej do późniejszej fluorescencyjnej aktywacji i sortowania oraz przesiewania fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanki poprzez cięcie w wibrotomie i mikrodysekcję pod kontrolą fluorescencji, co zapewnia powtarzalność izolacji EGL.
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie około 100 000 żywych komórek progenitorowych z jednego móżdżku P4, co umożliwia skalowalne testowanie związków w kulturze.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Izolowane progenitory wykazujące ekspresję Nestyny zachowują żywotność przez co najmniej cztery dni w hodowli, co umożliwia prekliniczną analizę fenotypową.
- Zgodność z biomarkerami: Ekspresja beta-tubuliny służy jako mierzalny wskaźnik różnicowania neuronalnego, co jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerowymi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Izolacja czystych progenitorów ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w procesie minimalizacji ryzyka w obrębie szlaków różnicowania neuronalnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając izolację rzadkich populacji komórek w oparciu o postawione hipotezy przed przeprowadzeniem przesiewu funkcjonalnego i walidacji mechanistycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących tożsamości progenitorów oraz ich lokalizacji przestrzennej w obrębie zewnętrznej warstwy ziarnistej.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie standaryzowanej zawiesiny żywych komórek, kompatybilnej z sortowaniem FACS oraz testami ekspozycji na związki chemiczne.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar częstości występowania progenitorów (~5% EGL) oraz ocenę wyników różnicowania poprzez ekspresję beta-tubuliny.
- Badania translacyjne: Łączy izolowane progenitory z walidacją przedkliniczną dzięki długotrwałym hodowlom i ekspresji markerów specyficznych dla danej linii komórkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Procedura mikrodysekcji i FACS jest możliwa do zaadaptowania do innych tkanek znakowanych fluorescencyjnie, co wspiera zastosowanie tej platformy w ramach różnych projektów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację żywych progenitorów wykazujących ekspresję Nestiny, wolnych od zanieczyszczeń sąsiednimi komórkami.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje zachowanie żywotności tkanek dzięki manipulacjom w temperaturze lodowej i szybkiemu przetwarzaniu, co umożliwia spójne inicjowanie hodowli.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji typu go/no-go w badaniach nad progenitorami neuronalnymi poprzez dostarczenie oczyszczonych, funkcjonalnych populacji komórek.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia dostosowaną do ryzyka priorytetyzację celów rozwoju móżdżku dzięki niezawodnym, wolnym od zanieczyszczeń modelom komórkowym.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie fluorescencyjnego wycinania i mikrodysekcji tkanek pod stereomikroskopem w celu zachowania precyzji przestrzennej.
- Metoda jest zależna od zastosowania mediów do zatapiania kompatybilnych z kriostatem (agarozy niskotopliwej) oraz cięcia w wibrotomie z grubością przekroju 600 µm.
- Konieczna jest standaryzacja ustawień FACS z filtrami CFP i GFP do równoległej izolacji populacji warstwy molekularnej oraz EGL.
- Wymagane jest powlekanie poli-D-lizyną oraz przygotowanie pożywki NBB 27 do hodowli przylegających progenitorów i testów różnicowania.
- Ograniczenie praktyczne: Tkanki muszą być przetwarzane szybko na lodzie, aby zapobiec utracie żywotności, co ogranicza wielkość partii materiału przy braku skoordynowanego procesu pracy.
