Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji
21 września 2014
Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie określonych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie móżdżku od nowonarodzonych myszy przenoszących białka fluorescencyjne. Drugim etapem zabiegu jest pobranie żywych skrawków tkanek za pomocą vibrato.
Trzecim krokiem jest mikrodysekcja zewnętrznej warstwy rozrodczej móżdżku pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Ostatnim etapem jest dysocjacja tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i zebranie komórek poprzez fluorescencyjne sortowanie komórek. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, że określone populacje komórek można wyizolować z móżdżku.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wychwytywanie laserowe, mikropreparacja, jest to, że komórki są żywe i można je hodować. W celu dalszych eksperymentów W celu przeprowadzenia tej procedury wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Uzyskaj świeże lub podgrzane 3% niskotopliwe aros gotowe do użycia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przygotuj wymagane roztwory do dysocjacji komórek na bazie papai. Przygotować świeże pożywki hodowlane NBB 27. Następnie przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w inkubatorze.
Przygotować bufor faksu i przygotować szkiełka nakrywkowe z poli litykiny. Pierwsza warstwa szkiełek nakrywkowych autoklawu zawiera 100 mikrogramów poli de lyciny na mililitr sterylnej wody. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.
Później umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, a następnie mediami NBB 27 przed użyciem szkiełek nakrywkowych. Wysusz je całkowicie. Zajmie to co najmniej godzinę przed rozpoczęciem.
Najpierw przygotuj obszar sekcji. Wytrzyj go do czysta 70% etanolem. Następnie przykryj go chłonnym wkładem.
Po drugie, wyjmij narzędzia z woreczka sterylizacyjnego i umieść je do użycia. Po trzecie, załaduj naczynie lodowatym sterylnym DPBS z 1% paskiem do wstrzykiwacza i połóż je na lodzie. Wypreparuj mózg szczeniaka P czterech, który wyraża markery fluorescencyjne.
Następnie przenieś go do przygotowanego naczynia DPBS. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Te móżdżek wyraża markery math jeden, GFP i gniazduje w CFP, w którym EGL wyraża GFP, a warstwa molekularna jest dodatnia dla CFP.
Następnie wypełnij dwucentymetrową sześcienną formę do osadzania roztworem agro. Upewnij się, że nie jest cieplejszy niż 37 stopni Celsjusza. Podnieś móżdżek perforowaną łyżką i osusz go, delikatnie przecierając tkankę.
Następnie za pomocą kleszczy umieść go w formie. Użyj igły, aby ustawić móżdżek w orientacji pionowej. Raz około czterech jest ładowanych do formy.
Umieść formę na lodzie, aby szybko stwardniała Za pomocą żyletki. Przytnij blok, aby skrócić czas cięcia. Następnie przyklej blok do płytki zorientowanej tak, aby móżdżek był pionowy.
Załaduj tackę do napełniania lodowatym DPBS z 1% taśmą i umieść lód pod tacą, aby pozostał zimny. Teraz pokrój klocki za pomocą wibratora. Wytnij i zbierz odcinki o grubości 600 mikronów.
Wyjmij je z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki i przenieś do naczynia napełnionego A-D-P-B-S na lodzie. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj plastry tak szybko, jak to możliwe.
Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku. Użyj cienkich kleszczy, aby wypreparować warstwę molekularną CFP dodatnią a GFP dodatnią EGL. Zachowaj ostrożność podczas mikrosekcji, aby uniknąć zanieczyszczenia z sąsiednich regionów.
Przenieść tkankę EGL z dodatnim wynikiem GFP do nowego naczynia wypełnionego DPBS na lodzie. Unikaj dołączania jakiejkolwiek tkanki warstwy molekularnej, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie kultury gniazdem wyrażającym glej Bergmana. Następnie usuń agros otaczający izolowaną tkankę EGL.
EGL można teraz zdysocjować za pomocą protokołu opartego na paan dla zawieszenia pojedynczej komórki. Po zakończeniu tego procesu ponownie zawiesić komórki w buforze faksu. Kontynuuj zbieranie komórek CFP za pomocą faksu.
Posortuj je za pomocą cytometru o dużej szybkości i filtra CFP, a następnie wciągnij je do lodowatego bufora faksu. Na móżdżek P four należy uzyskać około 100 000 NPS. Następnie odwirować połączone komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut.
Natychmiast wykorzystaj komórki do hodowli ich resus. Zawieś je w rozgrzanych mediach NBB 27. Następnie załaduj je na szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną z poliD i lizyną.
Plastry belli komórkowej przygotowano z gniazda P four math one GFP u myszy CFP. Móżdżek EGL zawierał głównie GFP eksprymujący GMP i mógł być łatwo oddzielony od warstwy molekularnej wzbogaconej w CFP wyrażający glej Analiza faktów wykazała, że ponad 85% komórek w EGL było konwencjonalnymi PNB. NEP wyizolowano z głębokich części EGL za pomocą mikrodysekcji, a następnie faktów.
Komórki te stanowiły około 5% komórek w EGL po czterech dniach hodowli. Fakty, wyizolowane NPS dały początek neuronom wyrażającym beta tubulinę. Jest to charakterystyczne dla neuronalnych komórek progenitorowych ograniczonych do linii.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymaniu tkanki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę izolowania progenitoów ekspresujących nestin z rozwijającej się móżdżku noworodków myszy. Technika łączy mikrodyseksję i fluorescynowo-aktywację sortowania komórek w celu oczyszczenia tych progenitoów do dalszych badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Progenitory ekspresujące nestin to nowo zidentyfikowana populacja w móżdżku.
- Rozumienie tych progenitoów może dać wgląd w rozwój neuronów.
- Istniejące metody izolacją komórek często powodują skażenie.
- Celem tego badania jest poprawa czystości izolowanych populacji komórek.
Cel badania
- Izolowanie określonych populacji progenitoów neuronowych z móżdżku.
- Umożliwienie dalszych eksperymentów i analizy tych komórek.
- Wykazanie techniki, która utrzymuje żywotność komórek do kultury.
Stosowane metody
- Pozbawianie móżdżków noworodków myszy z fluorescencyjnymi markerami.
- Mikrodyseksja warstwy zewnętrznej germinatywnej pod mikroskopem fluorescencyjnym.
- Dysocjacja tkanki do pojedynczej zawiesiny komórkowej.
- Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie w celu zebrania określonych populacji komórek.
Główne wyniki
- Określone populacje komórek zostały pomyślnie izolowane z móżdżku.
- Powyżej 85% izolowanych komórek zostało potwierdzonych jako konwencjonalne GNP.
- NEP zostały izolowane i stanowiły około 5% komórek EGL.
- Izolowani progenitorowie dali początek neuronom ekspresującym beta tubulinę.
Wnioski
- Metoda pozwala na izolację żywych progenitoów neuronowych.
- Ta technika może poprawić badania nad rozwojem móżdżku.
- Utrzymanie żywotności tkanki jest kluczowe dla udanej kultury komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
