Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie określonych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie móżdżku od nowonarodzonych myszy przenoszących białka fluorescencyjne. Drugim etapem zabiegu jest pobranie żywych skrawków tkanek za pomocą vibrato.

Trzecim krokiem jest mikrodysekcja zewnętrznej warstwy rozrodczej móżdżku pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Ostatnim etapem jest dysocjacja tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i zebranie komórek poprzez fluorescencyjne sortowanie komórek. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, że określone populacje komórek można wyizolować z móżdżku.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wychwytywanie laserowe, mikropreparacja, jest to, że komórki są żywe i można je hodować. W celu dalszych eksperymentów W celu przeprowadzenia tej procedury wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Uzyskaj świeże lub podgrzane 3% niskotopliwe aros gotowe do użycia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przygotuj wymagane roztwory do dysocjacji komórek na bazie papai. Przygotować świeże pożywki hodowlane NBB 27. Następnie przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w inkubatorze.

Przygotować bufor faksu i przygotować szkiełka nakrywkowe z poli litykiny. Pierwsza warstwa szkiełek nakrywkowych autoklawu zawiera 100 mikrogramów poli de lyciny na mililitr sterylnej wody. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.

Później umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, a następnie mediami NBB 27 przed użyciem szkiełek nakrywkowych. Wysusz je całkowicie. Zajmie to co najmniej godzinę przed rozpoczęciem.

Najpierw przygotuj obszar sekcji. Wytrzyj go do czysta 70% etanolem. Następnie przykryj go chłonnym wkładem.

Po drugie, wyjmij narzędzia z woreczka sterylizacyjnego i umieść je do użycia. Po trzecie, załaduj naczynie lodowatym sterylnym DPBS z 1% paskiem do wstrzykiwacza i połóż je na lodzie. Wypreparuj mózg szczeniaka P czterech, który wyraża markery fluorescencyjne.

Następnie przenieś go do przygotowanego naczynia DPBS. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Te móżdżek wyraża markery math jeden, GFP i gniazduje w CFP, w którym EGL wyraża GFP, a warstwa molekularna jest dodatnia dla CFP.

Następnie wypełnij dwucentymetrową sześcienną formę do osadzania roztworem agro. Upewnij się, że nie jest cieplejszy niż 37 stopni Celsjusza. Podnieś móżdżek perforowaną łyżką i osusz go, delikatnie przecierając tkankę.

Następnie za pomocą kleszczy umieść go w formie. Użyj igły, aby ustawić móżdżek w orientacji pionowej. Raz około czterech jest ładowanych do formy.

Umieść formę na lodzie, aby szybko stwardniała Za pomocą żyletki. Przytnij blok, aby skrócić czas cięcia. Następnie przyklej blok do płytki zorientowanej tak, aby móżdżek był pionowy.

Załaduj tackę do napełniania lodowatym DPBS z 1% taśmą i umieść lód pod tacą, aby pozostał zimny. Teraz pokrój klocki za pomocą wibratora. Wytnij i zbierz odcinki o grubości 600 mikronów.

Wyjmij je z tacki na lód za pomocą perforowanej łyżki i przenieś do naczynia napełnionego A-D-P-B-S na lodzie. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj plastry tak szybko, jak to możliwe.

Ostrożnie oddziel EGL od reszty odcinka móżdżku. Użyj cienkich kleszczy, aby wypreparować warstwę molekularną CFP dodatnią a GFP dodatnią EGL. Zachowaj ostrożność podczas mikrosekcji, aby uniknąć zanieczyszczenia z sąsiednich regionów.

Przenieść tkankę EGL z dodatnim wynikiem GFP do nowego naczynia wypełnionego DPBS na lodzie. Unikaj dołączania jakiejkolwiek tkanki warstwy molekularnej, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie kultury gniazdem wyrażającym glej Bergmana. Następnie usuń agros otaczający izolowaną tkankę EGL.

EGL można teraz zdysocjować za pomocą protokołu opartego na paan dla zawieszenia pojedynczej komórki. Po zakończeniu tego procesu ponownie zawiesić komórki w buforze faksu. Kontynuuj zbieranie komórek CFP za pomocą faksu.

Posortuj je za pomocą cytometru o dużej szybkości i filtra CFP, a następnie wciągnij je do lodowatego bufora faksu. Na móżdżek P four należy uzyskać około 100 000 NPS. Następnie odwirować połączone komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut.

Natychmiast wykorzystaj komórki do hodowli ich resus. Zawieś je w rozgrzanych mediach NBB 27. Następnie załaduj je na szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną z poliD i lizyną.

Plastry belli komórkowej przygotowano z gniazda P four math one GFP u myszy CFP. Móżdżek EGL zawierał głównie GFP eksprymujący GMP i mógł być łatwo oddzielony od warstwy molekularnej wzbogaconej w CFP wyrażający glej Analiza faktów wykazała, że ponad 85% komórek w EGL było konwencjonalnymi PNB. NEP wyizolowano z głębokich części EGL za pomocą mikrodysekcji, a następnie faktów.

Komórki te stanowiły około 5% komórek w EGL po czterech dniach hodowli. Fakty, wyizolowane NPS dały początek neuronom wyrażającym beta tubulinę. Jest to charakterystyczne dla neuronalnych komórek progenitorowych ograniczonych do linii.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymaniu tkanki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.