Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Weźmy komórki wyizolowane z móżdżku nowonarodzonej myszy, zawierające komórki macierzyste, neurony i komórki glejowe.

Dodaj mikrokulki magnetyczne pokryte przeciwciałem, które wiążą się z glikoproteiną powierzchniową specyficzną dla komórek macierzystych.

Odwirować, usunąć niezwiązane kulki i ponownie zawiesić komórki w buforze.

Załaduj komórki do kolumny separacyjnej umieszczonej w separatorze magnetycznym, który zatrzymuje komórki macierzyste związane z mikrokulkami, podczas gdy inne komórki przepływają.

Dodaj pożywkę neurosferyczną, aby wymyć komórki i przenieś je do mikropłytki. Inkubacja w celu wywołania tworzenia pierwotnych neurosfer, samoodnawiających się kolonii komórek macierzystych.

Odwirować i wyrzucić pożywkę. Ponownie zawiesić neurosfery w pożywce zawierającej enzymy, aby strawić białka adhezyjne komórkowe.

Odwirować i usunąć enzymy. Dodaj pożywkę neurosfery i mechanicznie dysocjuj komórki.

Inkubuj, aby umożliwić proliferację komórek macierzystych i wtórne tworzenie neurosfery, podczas gdy zróżnicowane komórki pozbawione cech komórek macierzystych nie proliferują.

Przenieś neurosfery do pożywki różnicującej i inkubuj, promując różnicowanie w neurony i glej.

Umieść probówki wirówkowe na lodzie, a następnie przecedź zdysocjowane komórki przez 40-mikrometrowe sitko do komórek do 50-mililitrowej probówki. Napełnij filtr 10 mililitrami lodowatego roztworu HBSS, aby upewnić się, że komórki przechodzą przez siatkę.

Przefiltrowane komórki przenieść do świeżej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować zawiesinę o stężeniu 300 razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie użyj aspiratora próżniowego, aby całkowicie usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w 160 mikrolitrach lodowatego bufora kolumny magnetycznej. Dodaj 40 mikrolitrów mikrogranulek anty-promininy-1 do zawiesiny komórek. Następnie inkubuj probówki w lodówce przez 15 minut, aby przeciwciało mogło związać się z komórkami wykazującymi ekspresję promininy-1.

Przemyć komórki 1 do 2 mililitrów buforu kolumnowego X i odwirować je w temperaturze 300 razy g przez 10 minut. Zassać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu kolumnowego X. Umieścić kolumny magnetyczne na stojaku magnetycznym i przepłukać je raz 500 mikrolitrami buforu X. Nałóż oznakowaną zawiesinę komórek na kolumnę i zbierz przepływ w świeżych 15-mililitrowych probówkach.

Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu X. Następnie usuń kolumny z pola magnetycznego i umieść je w 1,5-mililitrowych rurkach. Dodaj 1 mililitr pożywki hodowlanej i wepchnij tłok do kolumny, aby wypłukać komórki oznaczone kulkami promininy-1.

Aby przejść przez neurosfery, przenieś je wraz z pożywką hodowlaną do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Granulować neurosfery przez odwirowanie 300 razy g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.

Zawiesić osad w 5 mililitrach pożywki dysocjacyjnej z papainą lub 0,05% roztworem trypsyny i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową. Następnie ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach pożywki neurosferycznej i rozdziel je, powoli pipetując je w górę iw dół 10 razy za pomocą pipety pastwiskowej. Umieść komórki w pożywkach neurosferycznych zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wzbogać je o neurosfery wtórne po 7 do 10 dniach w hodowli, jak opisano wcześniej.