Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja egzocytozy nielitycznej cryptococcus neoformans z pierwotnych makrofagów neuronów szpiku kostnego. Osiąga się to poprzez pierwsze posiew i zakażenie aktywowanych makrofagów neurofagów komórkami grzybów, aby umożliwić fagocytozę i internalizację Xeomin. Drugim krokiem jest usunięcie zewnątrzkomórkowych komórek grzybów, aby zapewnić przezroczystą monowarstwę zakażonych i niezakażonych makrofagów.

Następnie makrofagi są inkubowane w komorze z kontrolowaną temperaturą dwutlenku węgla i rejestrowane przez 24 godziny w celu wychwycenia przypadków egzocytozy nielitycznej i innych interakcji. Ostatnim krokiem jest stworzenie filmu poprzez skompresowanie wszystkich klatek wykonanych w ciągu 24 godzin. Ostatecznie wizualizacja makrofagów za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej służy do obserwacji różnorodności typów egzocytozy nielitycznej, którym makrofagi podlegają w ciągu 24-godzinnej infekcji.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów gospodarza, takie jak czas i kwantyfikacja zdarzeń komórkowych W dniu poprzedzającym eksperyment wybierz jedną indywidualną kolonię starszego brygadzisty, która była hodowana na płytce agarowej sbarro i zaszczep. 10 mililitrów bulionu sbarro. Pozwól kulturze rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min po eutanazji myszy, jak opisano w pisemnym protokole.

Wysterylizuj całe ciało 70% alkoholem etylowym. Usuń zarówno kości udowe, jak i piszczelowe i umieść kości w sterylnym pożywce duo, zmodyfikowanym podłożu orła lub DMEM. Następnie usuń nadmiar tkanki i mięśni za pomocą delikatnych chusteczek, aż kości będą całkowicie czyste.

Umieść tylko nienaruszone kości na szalce Petriego zawierającej 70% alkoholu etylowego i inkubuj przez trzy minuty w celu zabicia powiązanych mikroorganizmów. Usuń kości i umieść na szalce Petriego ze sterylnym DMEM. Następnie ostrożnie odetnij końce kości.

Przytrzymaj kość nad stożkową rurką MT o pojemności 50 mililitrów umieszczoną na lodzie i użyj igły o rozmiarze 25, aby ostrożnie przepłukać 10 mililitrów zimnego DMEM przez każdą kość. Następnie odwiruj pobraną zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 650 razy G. Podczas tego wirowania przygotuj i przefiltruj pożywkę do karmienia makrofagami szpiku kostnego, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie ponownie zasmów powstałą paletę za pomocą 10 mililitrów pożywki.

Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, aby rozbić grudki komórek i usunąć duże zanieczyszczenia. Następnie umieść jeden mililitr zawiesiny komórek szczepowych w 10 mililitrach pożywki odżywczej, szalki Petriego, które są przeznaczone do użytku w kulturach tkankowych. Pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla przez siedem dni.

Zmiana pożywki zgodnie z opisem w protokole tekstowym na dzień przed eksperymentem. Odłącz makrofagi od płytki, usuwając pożywkę pokarmową i dodaj pięć mililitrów delikatnego odczynnika do usuwania komórek do płytki po inkubacji komórek przez pięć do 10 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza usuń makrofagi delikatnym pipetowaniem.

Osadzaj komórki przez wirowanie w temperaturze 650 razy G przez 10 minut przed ponownym zgięciem granulki w jednym mililitrze pożywki. Używając rozcieńczenia od jednego do 20, oblicz stężenie makrofagów, pipetując 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do hemocytometru przy użyciu 14-milimetrowego szkła z dnem. Szalki Petriego umieszczają stężenie od jednego razy 10 do piątego makrofagów bezpośrednio w wewnętrznej studzience, która mieści maksymalnie 200 mikrolitrów.

Uważaj, aby nie przekroczyć tej objętości. Pozwól komórkom przylgnąć do szklanej szalki Petriego, umieszczając szalki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki uzupełnionej lipopolisacharydem w ilości jednego miligrama na mililitr i interferonem gamma.

Przy 500 jednostkach na mililitr pozwól komórkom inkubować przez noc w dniu eksperymentu. Usunąć jeden mililitr zaszczepionej przez noc hodowli komórek G i rozdrobnić komórki drożdży przez odwirowanie przez pięć minut po 420 razy G.To usunąć pożywkę i zewnątrzkomórkowe produkty kryptokokowe, przemyć komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, a następnie odwirować jak poprzednio. Po resusie zawiesić osad komórek drożdży w jednym mililitrze sterylnego PBS i wykonać pipetę rozcieńczenia od jednego do 100, 10 mikrolitrów rozcieńczenia do hemocytometru i policzyć komórki.

Oblicz stężenie komórek drożdży potrzebnych do wielokrotności infekcji od jednej do pięciu. Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek kryptokokowych do jednego mililitra pożywki odżywczej z przeciwciałem monoklonalnym, 18 B siedem w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie wyjmij pożywkę ze szklanej szalki Petriego i umyj makrofagi raz sterylnym PBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów opsonize cmin bezpośrednio do studzienki, a następnie inkubuj z drożdżami przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla. Po wspólnej inkubacji sprawdzonej pod mikroskopem, czy makrofagi mają zinternalizowane c eFormy, które można uznać za zinternalizowane komórki kryptokokowe, powinny być wyraźnie widoczne w granicach makrofagów, jak wskazuje duży grot strzały.

Mniejszy grot strzałki wskazuje na niezainfekowane makrofagi bez komórek grzyba. Umyć szalkę Petriego trzykrotnie sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe c neoformany. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki bez przeciwciała monoklonalnego, aby przeprowadzić te eksperymenty.

Przed eksperymentem wymagany jest mikroskop wyposażony w dołączoną komorę inkubacyjną, która obejmuje dostarczanie dwutlenku węgla i urządzenie grzewcze. Podgrzej komorę inkubacyjną przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że jednostka dwutlenku węgla wskazuje 5% na początku eksperymentu.

Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem na pokrywie platformy mikroskopu z zapalonym dwutlenkiem węgla i zamknij wszystkie drzwiczki, aby upewnić się, że nie ma ucieczki ciepła za pomocą obiektywu 10 x z mikroskopem w kontraście fazowym, skup się na czystym polu zainfekowanych makrofagów Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu tak, aby wykonywało obraz co cztery minuty przez okres 24 godzin. Po 24 godzinach eksperyment zostanie zakończony i zostanie zebranych łącznie 361 obrazów. Eksportuj te obrazy jako pliki JPEG z kompresją 5%.

Korzystając z oprogramowania Image J, wyświetlaj obrazy jako stos wizualny z prędkością pięciu klatek na sekundę. Początkowa klatka filmu pokazuje wiele makrofagów na całym polu, z których niektóre są niezainfekowane, a niektóre mają różną wielkość komórek kryptokokowych. W miarę postępu filmu, wszystkie komórki są mo i można je zobaczyć poruszające się po polu w tym filmie, jasne jest, że komórki kryptokokowe znajdują się w granicach zainfekowanego makrofaga.

Makrofagi stają się wzburzone i można zobaczyć komórkę drożdży, ale w strefie FGA komórki kryptokokowe są następnie szybko usuwane do otaczającego środowiska. Drugi zakażony makrofag ulega egzocytozie nielitycznej, a więcej komórek drożdży jest uwalnianych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Komórki gospodarza pozostają żywotne po egzocytozie kryptokokowej, na co wskazuje ich zdolność do dalszego ruchu.

Czasami makrofagi będą oddziaływać w taki sposób, że ułatwi transfer komórek kryptokokowych między komórkami gospodarza. Komórki drożdży nie są wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego, a komórki gospodarza pozostają żywotne. W tym filmie dwa zainfekowane makrofagi tworzą mosty międzykomórkowe przy dwóch różnych okazjach, aby przetransportować komórki kryptokokowe z jednego makrofaga do drugiego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać cyfrową mikroskopię świetlną do wizualizacji makrofagów przechodzących egzocytozę nielityczną i inne interakcje patogenów gospodarza.