Name: Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej. Technika ta umożliwia obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym przez 24 godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez nagrody NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytutu Badań nad Zwierzętami w Albert Einstein College of Medicine.
1. Warunki wzrostu C. neoformans H99 (Serotyp A)
<ol>
	<li>Hoduj pojedyncze kolonie C. neoformans (Cn) na płytkach agarowych Sabouraud.</li>
	<li>Dzień przed eksperymentem wybierz jedną rodzinę i zaszczep 10 ml bulionu Sabouraud.</li>
	<li>Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.</li>
</ol>
2. Izolacja i przygotowanie pierwotnych makrofagów kostnych od myszy C57/Bl6
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji, umieszczając zwierzę w komorze CO2 do momentu, aż przestanie oddychać. Jako drugi środek, zwichnąć szyję szyjki macicy przed rozpoczęciem rozwarstwienia. Wysterylizuj całe ciało 70% alkoholem etylowym.</li>
	<li>Usuń obie kości udowe i piszczelowe, a następnie umieść kości w sterylnym DMEM.</li>
	<li>Usuń nadmiar tkanki i mięśni za pomocą delikatnych chusteczek, aż kości będą całkowicie czyste.</li>
	<li>Umieść tylko nienaruszone kości na szalce Petriego zawierającej 70% alkoholu etylowego i inkubuj przez 3 minuty w celu zabicia powiązanych mikroorganizmów. Usunąć kości i umieścić na szalce Petriego ze sterylnym DMEM.</li>
	<li>Ostrożnie odetnij końce kości. Trzymać kość nad pustą stożkową probówką o pojemności 50 ml umieszczoną na lodzie i ostrożnie przepłukać 10 ml zimnego DMEM za pomocą igły 25 G przez każdą kość. 
	UWAGA: Każda mysz da 4 kości (2 kości udowe, 2 piszczelowe). Dlatego jedna mysz powinna dać około 40 ml zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 650 x g.</li>
	<li>Podczas tego wirowania przygotuj i przefiltruj pożywkę do karmienia makrofagów szpiku kostnego, która składa się z DMEM uzupełnionego 20% L929, 10% płodowej surowicy cielęcej, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 0,1% 2-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Zawiesić powstały osad za pomocą 10 ml pożywki. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby rozbić grudki komórek i usunąć duże zanieczyszczenia.</li>
	<li>Płytka 1 ml zawiesiny komórkowej w 10 ml pożywki na szalkach Petriego, które są przeznaczone do hodowli tkankowych (w sumie 10 płytek).</li>
	<li>Pozostawić komórki do przylegania w temperaturze 37 °C z 10% CO2 . Dodać 5 ml świeżej pożywki w dniu 3. W 7 dniu całkowicie wymień pożywkę pokarmową, a makrofagi są gotowe do użycia.</li>
	<li>Dzień przed eksperymentem oderwij makrofagi od płytki, usuwając pożywkę i dodaj 5 ml delikatnego odczynnika do usuwania komórek na płytkę.</li>
	<li>Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i usunąć makrofagi za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie przy 650 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml pożywki. Stosując rozcieńczenie 1:20, obliczyć stężenie makrofagów, odmierzając 10 μl zawiesiny komórkowej na hemocytometr.</li>
	<li>Używając 14-milimetrowych szalek Petriego ze szklanym dnem, nanieś stężenie 1 x10-5 makrofagów bezpośrednio na wewnętrzną studzienkę, która zawiera maksymalnie 200 μl, dlatego należy uważać, aby nie przekroczyć tej objętości, jak pokazano na rysunku 4.</li>
	<li>Pozostawić komórki do przylegania do szklanej płytki Petriego, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 1-2 ml pożywki uzupełnionej LPS w stężeniu 1 mg/ml i IFNg w stężeniu 500 u/ml i pozostawić komórki do inkubacji przez noc.</li>
</ol>
3. Współinkubacja pierwotnych mysich makrofagów i C. neoformans
<ol>
	<li>W dniu doświadczenia usunąć 1 ml zaszczepionej przez noc kultury i osadów drożdży przez odwirowanie przez 5 minut przy 420 x g.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć pożywkę i zewnątrzkomórkowe produkty kryptokokowe, takie jak polisacharyd glukuronoksylomannan (GXM) z prędkością i czasem wymienionym powyżej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego PBS i rozcieńczyć w stosunku 1:100. Pobrać pipetę 10 μl rozcieńczenia na hemocytometr i policzyć komórki. Dodaj komórki drożdży w MOI 1:5. Na przykład, jeśli jest 1 x 105 makrofagów/studzienkę, należy wykonać zawiesinę komórkową 5 x 106 / ml Cn i dodać 100 μl tego roztworu, aby uzyskać całkowitą ilość 5 x 105 Cn.</li>
	<li>Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek kryptokokowych do 1 ml pożywki z przeciwciałem mAb 18B7 o stężeniu 10 μg/ml. Zawiesinę komórek inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć pożywkę ze szklanego dna z szalki Petriego i umyć 1x sterylnym PBS. Dodaj 100 μl opsonizowanego Cn bezpośrednio do studzienki.</li>
	<li>Pozostawić komórki do inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy stężeniu 10% CO2 .</li>
	<li>Po koinkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy makrofagi zinternalizowały Cn. Aby można je było uznać za zinternalizowane, komórki kryptokokowe powinny być wyraźnie widoczne w granicach makrofagów.</li>
	<li>Umyj szalkę Petriego 3x sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe Cn.</li>
	<li>Dodać 1-2 ml pożywki bez dodatku mAb 18B7 i ustawić mikroskop.</li>
</ol>
4. Wizualizacja egzocytozy nielitycznej w czasie rzeczywistym za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej
UWAGA: Do przeprowadzenia tych eksperymentów wymagany jest mikroskop z dołączoną komorą inkubacyjną, która zawiera dostarczanie CO2 i urządzenie grzewcze.
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy wstępnie ogrzać komorę inkubacyjną przez co najmniej 30 minut do temperatury 37 °C. Upewnij się, że jednostka CO2 wskazuje 5% na początku eksperymentu.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem na platformie mikroskopu, przykryj pokrywką CO2 i zamknij wszystkie drzwiczki, aby upewnić się, że ciepło nie ucieka.</li>
	<li>Używając obiektywu 10X z mikroskopem w kontraście fazowym, skup się na czystym polu zakażonych makrofagów. Na podstawie eksperymentu określ cel używany przez liczbę makrofagów, które należy zbadać.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu, aby robić zdjęcie co 4 minuty przez okres 24 godzin.</li>
	<li>Po 24 godzinach eksperyment zostanie zakończony i w sumie zostanie zebranych 361 obrazów. Wyeksportuj te obrazy jako .jpeg z kompresją 5%. Korzystając z oprogramowania Image J, wyświetlaj obrazy jako stos wizualny z szybkością 5 klatek na sekundę. Jeśli film musi zostać wyświetlony do publikacji lub prezentacji, zapisz go jako plik .avi lub .mov, w zależności od tego, który format jest najlepszy dla widza.</li>
</ol>

<ol><li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+interactions+with+macrophages%3A+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Future+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li>
<li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+%E2%80%94+a+case+of+convergent+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li>
<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16(2007).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+immunology%22%5BJournal%5D)">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15(2007).</li>
<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2%2F3+complex-mediated+actin+polymerisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li>
<li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li>
<li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li>
<li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+genetics+and+biology%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mamy konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Tutaj opisaliśmy metodę, za pomocą której interakcje grzyb-makrofag mogą być rejestrowane i analizowane w czasie rzeczywistym przez okres 24 godzin. Nasze laboratorium wykorzystało ten protokół do zbadania wielu czasowych aspektów egzocytozy nielitycznej i będzie nadal używać mikroskopii w czasie rzeczywistym w celu ustalenia składników morfologicznych otaczających ten proces.
Aby ta technika przyniosła idealne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na niektóre kroki w protokole. Gęstość komó...

Etapy infekcji grzybiczej między komórkami kryptokokowymi a makrofagami są dobrze udokumentowane 1-3. Po spożyciu komórek drożdży przez makrofagi mogą wystąpić różne interakcje: makrofagi mogą lizować, uwalniając ładunek grzybów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub mogą kontrolować infekcję, utrzymując komórki drożdży w granicach błony komórkowej 4. Jednak kilka lat temu nowy wynik został opisany niezależnie przez dwie grupy: egzocytoza nielityczna, proces, w którym makrofag usunął niektóre lub wszystkie komórki kryptokokowe do otaczającego środowiska lub sąsiedniej komórki, a zarówno gospodarz, jak i patogen pozostają żywotne 5-8. W kilku badaniach próbowano zrozumieć mechanizmy molekularne stojące za tą interakcją, ale nadal nie mamy pełnego zrozumienia, co napędza to zjawisko.
Możliwość przechwytywania obrazów w czasie rzeczywistym, a następnie analizowania wielu zainfekowanych makrofagów, pozwala odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących właściwości fizycznych otaczających egzocytozę nielityczną w odniesieniu do czasu, pojemności przestrzennej, zmiany morfologii, a nawet stresu makrofagów podczas infekcji grzybiczej. Pozwalając komórkom przebywać w środowisku porównywalnym do środowiska w inkubatorze, możemy dostrzec dynamiczną naturę interakcji makrofagów z komórkami grzybów. Naukowcy wykorzystali tę technikę do zbadania różnych elementów tego procesu. Rola fagosomu w tym procesie została uwidoczniona przy użyciu barwienia fluorescencyjnego i środków blokujących aktynę 9, podczas gdy inna grupa wykorzystała tę metodę, aby pokazać, że egzocytoza nielityczna została zablokowana w komórkach, w których usunięto domeny białkowe zarodkujące WASH 10. Wpływ sygnalizacji cytokin został również ustalony za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym 11. Proces ten nie ogranicza się do C. neoformans, ponieważ zaobserwowano go również w przypadku Candida albicans, innego patogenu grzybowego, który ma zdolność infekowania makrofagów 12. Odkrycia te są przykładami tego, jak ta metoda może dostarczyć bogactwa informacji w obszarze, o którym wiemy tak niewiele.

<table><tbody><tr><td>Sabouraud Dekstroza Agar</td><td>BD</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Bulion dekstrozowy</td><td>BD</td><td>DF0382-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 109</td><td>Invitrogen</td><td>21340-039</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>3003 Kultura tkankowa Szalki Petriego&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-CL</td><td></td></tr><tr><td>Mat-tek Naczynia do hodowli ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L3137</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IFN-g</td><td>Roche</td><td>NC 9222016</td><td></td></tr><tr><td>mAb 18B7</td><td>Niekomercyjne przeciwciało produkowane w naszym laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Mikroskop z komorą inkubacyjną</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja egzocytozy nielitycznej cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Wiele aspektów infekcji makrofagów przez Cryptococcus neoformans zostało dokładnie zbadanych i dobrze zdefiniowanych. Jednak jedną szczególną interakcją, która nie jest jasno poznana, jest egzocytoza nielityczna. W tym procesie komórki drożdży są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez słabo poznany mechanizm, który pozostawia przy życiu zarówno makrofagi, jak i Cn. Tutaj opisujemy, jak obserwować dużą liczbę indywidualnie zakażonych makrofagów przez 24-godzinny okres infekcji za pomocą mikroskopii poklatkowej. Zakażone makrofagi są umieszczane w komorze grzewczej z atmosferą CO2 podłączoną do mikroskopu, który zapewnia takie same warunki jak inkubator do hodowli komórkowych. Mikroskopia cyfrowa na żywo może dostarczyć informacji o dynamicznych interakcjach między gospodarzem a patogenem, które nie są dostępne na obrazach statycznych. Możliwość wizualizacji każdej zainfekowanej komórki może dostarczyć wskazówek na temat tego, jak makrofagi radzą sobie z infekcjami grzybiczymi i odwrotnie. Technika ta jest potężnym narzędziem w badaniu dynamiki, która stoi za złożonym zjawiskiem.

Obrazy generowane za pomocą tej techniki można analizować na różne sposoby, aby zebrać informacje o tym, co dzieje się po fagocytozie C. neoformans przez komórki. Jak widać na Rysunku 1, znajduje się tam około 100 makrofagów, zakażonych lub niezakażonych. Każdy z tych makrofagów daje obserwatorowi możliwość badania interakcji gospodarz-patogen na poziomie mikroskopowym. Jak pokazują Rysunki 2 i 3, między makrofagiem a komórką drożdżaka, a nawet między makrofagam...

Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.

Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja egzocytozy nielitycznej cryptococcus neoformans z pierwotnych makrofagów neuronów szpiku kostnego. Osiąga się to poprzez pierwsze posiew i zakażenie aktywowanych makrofagów neurofagów komórkami grzybów, aby umożliwić fagocytozę i internalizację Xeomin. Drugim krokiem jest usunięcie zewnątrzkomórkowych komórek grzybów, aby zapewnić przezroczystą monowarstwę zakażonych i niezakażonych makrofagów.Następnie makrofagi są inkubowane w komorze z kontrolowaną temperaturą dwutlenku węgla i rejestrowane przez 24 godziny w celu wychwycenia przypadków egzocytozy nielitycznej i innych interakcji. Ostatnim krokiem jest stworzenie filmu poprzez skompresowanie wszystkich klatek wykonanych w ciągu 24 godzin. Ostatecznie wizualizacja makrofagów za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej służy do obserwacji różnorodności typów egzocytozy nielitycznej, którym makrofagi podlegają w ciągu 24-godzinnej infekcji.Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów gospodarza, takie jak czas i kwantyfikacja zdarzeń komórkowych W dniu poprzedzającym eksperyment wybierz jedną indywidualną kolonię starszego brygadzisty, która była hodowana na płytce agarowej sbarro i zaszczep. 10 mililitrów bulionu sbarro. Pozwól kulturze rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min po eutanazji myszy, jak opisano w pisemnym protokole.Wysterylizuj całe ciało 70% alkoholem etylowym. Usuń zarówno kości udowe, jak i piszczelowe i umieść kości w sterylnym pożywce duo, zmodyfikowanym podłożu orła lub DMEM. Następnie usuń nadmiar tkanki i mięśni za pomocą delikatnych chusteczek, aż kości będą całkowicie czyste.Umieść tylko nienaruszone kości na szalce Petriego zawierającej 70% alkoholu etylowego i inkubuj przez trzy minuty w celu zabicia powiązanych mikroorganizmów. Usuń kości i umieść na szalce Petriego ze sterylnym DMEM. Następnie ostrożnie odetnij końce kości.Przytrzymaj kość nad stożkową rurką MT o pojemności 50 mililitrów umieszczoną na lodzie i użyj igły o rozmiarze 25, aby ostrożnie przepłukać 10 mililitrów zimnego DMEM przez każdą kość. Następnie odwiruj pobraną zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 650 razy G. Podczas tego wirowania przygotuj i przefiltruj pożywkę do karmienia makrofagami szpiku kostnego, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie ponownie zasmów powstałą paletę za pomocą 10 mililitrów pożywki.Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, aby rozbić grudki komórek i usunąć duże zanieczyszczenia. Następnie umieść jeden mililitr zawiesiny komórek szczepowych w 10 mililitrach pożywki odżywczej, szalki Petriego, które są przeznaczone do użytku w kulturach tkankowych. Pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla przez siedem dni.Zmiana pożywki zgodnie z opisem w protokole tekstowym na dzień przed eksperymentem. Odłącz makrofagi od płytki, usuwając pożywkę pokarmową i dodaj pięć mililitrów delikatnego odczynnika do usuwania komórek do płytki po inkubacji komórek przez pięć do 10 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza usuń makrofagi delikatnym pipetowaniem.Osadzaj komórki przez wirowanie w temperaturze 650 razy G przez 10 minut przed ponownym zgięciem granulki w jednym mililitrze pożywki. Używając rozcieńczenia od jednego do 20, oblicz stężenie makrofagów, pipetując 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do hemocytometru przy użyciu 14-milimetrowego szkła z dnem. Szalki Petriego umieszczają stężenie od jednego razy 10 do piątego makrofagów bezpośrednio w wewnętrznej studzience, która mieści maksymalnie 200 mikrolitrów.Uważaj, aby nie przekroczyć tej objętości. Pozwól komórkom przylgnąć do szklanej szalki Petriego, umieszczając szalki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki uzupełnionej lipopolisacharydem w ilości jednego miligrama na mililitr i interferonem gamma.Przy 500 jednostkach na mililitr pozwól komórkom inkubować przez noc w dniu eksperymentu. Usunąć jeden mililitr zaszczepionej przez noc hodowli komórek G i rozdrobnić komórki drożdży przez odwirowanie przez pięć minut po 420 razy G.To usunąć pożywkę i zewnątrzkomórkowe produkty kryptokokowe, przemyć komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, a następnie odwirować jak poprzednio. Po resusie zawiesić osad komórek drożdży w jednym mililitrze sterylnego PBS i wykonać pipetę rozcieńczenia od jednego do 100, 10 mikrolitrów rozcieńczenia do hemocytometru i policzyć komórki.Oblicz stężenie komórek drożdży potrzebnych do wielokrotności infekcji od jednej do pięciu. Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek kryptokokowych do jednego mililitra pożywki odżywczej z przeciwciałem monoklonalnym, 18 B siedem w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie wyjmij pożywkę ze szklanej szalki Petriego i umyj makrofagi raz sterylnym PBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów opsonize cmin bezpośrednio do studzienki, a następnie inkubuj z drożdżami przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla. Po wspólnej inkubacji sprawdzonej pod mikroskopem, czy makrofagi mają zinternalizowane c eFormy, które można uznać za zinternalizowane komórki kryptokokowe, powinny być wyraźnie widoczne w granicach makrofagów, jak wskazuje duży grot strzały.Mniejszy grot strzałki wskazuje na niezainfekowane makrofagi bez komórek grzyba. Umyć szalkę Petriego trzykrotnie sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe c neoformany. Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki bez przeciwciała monoklonalnego, aby przeprowadzić te eksperymenty.Przed eksperymentem wymagany jest mikroskop wyposażony w dołączoną komorę inkubacyjną, która obejmuje dostarczanie dwutlenku węgla i urządzenie grzewcze. Podgrzej komorę inkubacyjną przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że jednostka dwutlenku węgla wskazuje 5% na początku eksperymentu.Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem na pokrywie platformy mikroskopu z zapalonym dwutlenkiem węgla i zamknij wszystkie drzwiczki, aby upewnić się, że nie ma ucieczki ciepła za pomocą obiektywu 10 x z mikroskopem w kontraście fazowym, skup się na czystym polu zainfekowanych makrofagów Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu tak, aby wykonywało obraz co cztery minuty przez okres 24 godzin. Po 24 godzinach eksperyment zostanie zakończony i zostanie zebranych łącznie 361 obrazów. Eksportuj te obrazy jako pliki JPEG z kompresją 5%.Korzystając z oprogramowania Image J, wyświetlaj obrazy jako stos wizualny z prędkością pięciu klatek na sekundę. Początkowa klatka filmu pokazuje wiele makrofagów na całym polu, z których niektóre są niezainfekowane, a niektóre mają różną wielkość komórek kryptokokowych. W miarę postępu filmu, wszystkie komórki są mo i można je zobaczyć poruszające się po polu w tym filmie, jasne jest, że komórki kryptokokowe znajdują się w granicach zainfekowanego makrofaga.Makrofagi stają się wzburzone i można zobaczyć komórkę drożdży, ale w strefie FGA komórki kryptokokowe są następnie szybko usuwane do otaczającego środowiska. Drugi zakażony makrofag ulega egzocytozie nielitycznej, a więcej komórek drożdży jest uwalnianych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Komórki gospodarza pozostają żywotne po egzocytozie kryptokokowej, na co wskazuje ich zdolność do dalszego ruchu.Czasami makrofagi będą oddziaływać w taki sposób, że ułatwi transfer komórek kryptokokowych między komórkami gospodarza. Komórki drożdży nie są wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego, a komórki gospodarza pozostają żywotne. W tym filmie dwa zainfekowane makrofagi tworzą mosty międzykomórkowe przy dwóch różnych okazjach, aby przetransportować komórki kryptokokowe z jednego makrofaga do drugiego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać cyfrową mikroskopię świetlną do wizualizacji makrofagów przechodzących egzocytozę nielityczną i inne interakcje patogenów gospodarza.

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

W tym filmie demonstrujemy test cytotoksyczności do oceny infekcji Cryptococcus neoformans, grzyba chorobotwórczego, u makrofagów. Cytotoksyczność jest określana przez uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej w wyniku lizy makrofagów spowodowanej zakażeniem Cryptococcus neoformans.

Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia infekcji Cryptococcus neoformans w makrofagach

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym artykule opisany jest protokół infekcji makrofagów Cryptococcus neoformans. Wyjaśniono również metodę usuwania steroli z makrofagów. Protokoły te stanowią przewodnik do badania zakażeń grzybiczych in vitro i badania roli steroli w takich infekcjach.

Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Poznaj metodę wizualizacji egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej. Technika ta umożliwia obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym przez 24 godziny.

Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów