Name: Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Naucz się techniki infiltracji i wirowania do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści Phaseolus vulgaris. Ta metoda minimalizuje zanieczyszczenie cytoplazmatyczne i wspiera badania z zakresu fizjologii roślin oraz interakcji roślin z mikroorganizmami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty BB/J016012/1 i BB/E007872/1 od Brytyjskiej Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC) dla Gail Preston.

UWAGA: Wybór materiału wyjściowego liści i standaryzacja warunków wzrostu roślin jest kluczowa, ponieważ te czynniki mogą znacznie wpłynąć na jakość, zmienność i plon AWF (Rysunek 1). Parametry, które należy wziąć pod uwagę, przedstawiono w tabeli 1 i omówiono bardziej szczegółowo w dyskusji.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>parametr</td>
			<td colspan="3">Przykładowe standaryzacje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phaseolus vulgaris (Phaseolus vulgaris)</td>
			<td>Solanum lycopersicum</td>
			<td>Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodzaj skrzydła</td>
			<td>Pierwsze prawdziwe liście, w pełni rozwinięte, zdrowe</td>
			<td>2i 3 liście zaczynając od dołu, 4 największe listki pobrane Ulotka wierzchołkowa nie używana do ekstrakcji apoplastu</td>
			<td>W pełni rozwinięte skrzydła rozety</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wiek rośliny</td>
			<td>21 dni</td>
			<td>7 - 9 tygodni</td>
			<td>7 tygodni </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pora dnia</td>
			<td>Okres w środku światła (12:00)</td>
			<td>Okres w środku światła (12:00)</td>
			<td>Okres w środku światła (12:00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nawilżenie</td>
			<td>Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami</td>
			<td>Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami</td>
			<td>Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>światło</td>
			<td>16 godzin światła, 400 μmol M-2 sec-1</td>
			<td>16 godzin światła, 400 μmol M-2 sec-1</td>
			<td>10 godzin światła (dzień krótki) od 2 tygodnia, 400 μmol m-2 sek-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wilgotność</td>
			<td>70%</td>
			<td>70%</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperatura</td>
			<td>22 °C jasny, 18 °C ciemny</td>
			<td>22 °C jasny, 18 °C ciemny</td>
			<td>21 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przykłady znormalizowanych parametrów dla liści stosowanych w ekstrakcjach AWF.
1. Wytwarzanie płynu do prania Apoplast
UWAGA: Podczas tego protokołu niebezpieczne materiały zawierające patogeny mikrobiologiczne z zakażonych liści nie powinny być spłukiwane do kanalizacji; raczej powinny być stosowane odpowiednie procedury usuwania.
<ol>
	<li>Wybierz aparaturę na podstawie rozmiaru liścia:
	<ol>
		<li>Naciekać mniejsze liście (np. Arabidopsis, fasola) za pomocą strzykawki bezigłowej. Użyj kolby próżniowej, aby nacieknąć liście, które są zbyt duże, aby zmieścić się w strzykawce. Użyj metody kolby próżniowej, aby infiltrować wiele liści jednocześnie.</li>
		<li>Liście, które są zbyt duże dla dostępnej metody infiltracji, podziel na mniejsze sekcje za pomocą żyletki. Przed infiltracją dokładnie opłucz odcięte odcinki liści w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia cytoplazmatyczne, które wydzielają się z uszkodzonych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciek z liści za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml:
	<ol>
		<li>Odłącz liść od rośliny na ogonku za pomocą żyletki. W przypadku liści złożonych, takich jak pomidor, oderwij ulotki od ogonka.</li>
		<li>Opłucz świeżo wycięty liść przez zanurzenie w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Osusz liść, delikatnie osuszając go chłonną chusteczką lub papierem.</li>
		<li>Zmierz masę liścia przed infiltracją.</li>
		<li>Ostrożnie zwinąć i/lub złożyć liść do strzykawki o pojemności 60 ml i napełnić strzykawkę wodą destylowaną (można użyć innych płynów infiltracyjnych, patrz dyskusja). Usunąć powietrze ze strzykawki, jednocześnie opuszczając tłok do oznaczenia około 40 ml.</li>
		<li>Przykryć końcówkę strzykawki palcem w rękawiczce lub kawałkiem Parafilm, a następnie wytworzyć podciśnienie wewnątrz strzykawki, pociągając tłok na zewnątrz do oznaczenia 60 ml. Powoli zwolnić tłok. 
		UWAGA: Szybkie uwolnienie ciśnienia może spowodować lizę komórek i zanieczyszczenie cytoplazmatyczne.</li>
		<li>Odłączyć końcówkę strzykawki i wypuścić powietrze, a następnie ponownie podłączyć końcówkę i nacisnąć tłok dalej w dół, aby wytworzyć umiarkowane nadciśnienie.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.2.5 - 1.2.6 aż do całkowitego naciekania liścia, co widać po ciemnym kolorze infiltrowanych obszarów.</li>
		<li>Usunąć liść ze strzykawki. Delikatnie, ale dokładnie osusz liść chłonnym papierem, aby usunąć płyn z powierzchni.</li>
		<li>Zmierz wagę infiltrowanego liścia. Oblicz różnicę w masie przed i po infiltracji, która jest bardzo zbliżona do objętości infiltracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infiltracja liści przez kolbę próżniową:
	<ol>
		<li>Odłącz liść od rośliny na ogonku za pomocą żyletki.</li>
		<li>Opłucz świeżo wycięty liść przez zanurzenie w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Osusz liść, delikatnie osuszając go chłonnym papierem.</li>
		<li>Zmierz masę liścia przed infiltracją.</li>
		<li>Umieść liść (lub liście, jeśli naciekają wiele liści) w kolbie bocznej o pojemności 250 ml lub większej zawierającej wodę destylowaną (można użyć innych płynów infiltracyjnych, patrz Dyskusja). Całkowicie przykryj liście płynem.</li>
		<li>Zastosować podciśnienie w kolbie. Delikatnie zamieszaj, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z liści. Ostrożnie i powoli zwolnij odkurzacz. 
		UWAGA: Szybkie uwolnienie próżni może spowodować lizę komórek i zanieczyszczenie cytoplazmatyczne.</li>
		<li>Powtarzać krok 1.3.5 aż do całkowitego naciekania liścia, co widać po ciemnym kolorze naciekanych obszarów.</li>
		<li>Usunąć liść z kolby. Delikatnie, ale dokładnie osusz liść chłonnym papierem, aby usunąć płyn z powierzchni.</li>
		<li>Zmierz wagę infiltrowanego liścia. Oblicz różnicę w masie przed i po infiltracji, która jest bardzo zbliżona do objętości infiltracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzysk AWF przez odwirowanie:
	<ol>
		<li>Umieść liść na kawałku parafilmu o szerokości 4 cali (10 cm). Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 5 ml (lub przedmiotu o podobnej wielkości) zwiń liść w Parafilm.</li>
		<li>Włożyć zwinięty liść z końcówką pipety do strzykawki o pojemności 20 ml. Ustaw wszystkie przycięte krawędzie liści skierowane do góry. Włożyć strzykawkę do czystej probówki z polietylenu lub poliwęglanu o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować strzykawkę w probówce przez 10 minut przy 1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Oględziny liści po odwirowaniu powinny wykazać, że większość płynu infiltracyjnego została usunięta. Ciemniejsze zielone plamy wskazują, że wymagany jest dodatkowy czas wirowania.</li>
		<li>Odpipetować odzyskany AWF do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Objętość AWF powinna w przybliżeniu odpowiadać objętości infiltracji tego liścia; Jeśli objętość jest mniejsza, wymagany jest dodatkowy czas wirowania lub prędkość wirowania.</li>
		<li>Odwirować próbki AWF o masie 15 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia wszelkich komórek lub cząstek stałych. Alternatywnie przepuść AWF przez filtr 0,22 μm, aby usunąć komórki i cząstki stałe.</li>
		<li>Odpipetować supernatant do świeżej probówki. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu przechowywania.</li>
		<li>Przechowywać próbki AWF w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy na skażenie cytoplazmatyczne
<ol>
	<li>Próbki AWF należy przechowywać na lodzie, aby zminimalizować reakcje enzymatyczne (np. proteolizę) i wykonywać testy natychmiast po zakończeniu etapów wirowania. 
	UWAGA: W przypadku oznaczania metabolitów próbki można natychmiast zamrozić po ekstrakcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Protokół testu dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) znajduje się w punkcie 15; w przeciwnym razie należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oznaczania MDH.</li>
	<li>Standardowy protokół testu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH) znajduje się w punkcie 16; w przeciwnym razie należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oznaczania G6PDH.</li>
	<li>Do ilościowego oznaczania metabolitów cytoplazmatycznych, takich jak glukozo-6-fosforan (G-6-P), należy użyć GC-MS, jak opisano w kroku 5. W przeciwnym razie użyj dostępnego w handlu zestawu do bezpośredniego oznaczania G-6-P.</li>
</ol>
3. Obliczanie współczynnika rozcieńczenia apoplastu
<ol>
	<li>Przygotować dwie objętości płynu infiltracyjnego użytego powyżej w kroku 1.2.4 lub 1.3.4 (np. woda destylowana). Do jednego roztworu dodać proszek indygotyny do końcowego stężenia 50 μM, do drugiego nic nie dodawać.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję 200 μl roztworu infiltracji indygotyny przy 610 nm (OD610) roztworu infiltracji indygotyny za pomocą czytnika płytek. Skorygować tę wartość, odejmując OD610 z 200 μl roztworu infiltracyjnego bez indygokarminu. Zastąp tę skorygowaną wartość jakoinfiltrację OD 610 do poniższego równania.</li>
	<li>Wykonać co najmniej trzy powtórzone infiltracje liści, jak powyżej (krok 1.2 lub 1.3) z obydwoma roztworami infiltracyjnymi (z indygotyną i bez niej).</li>
	<li>Po infiltracji opłucz liście w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie pozostałości indygo karminu obecne na zewnętrznych powierzchniach.</li>
	<li>Kontynuuj wirowanie jak powyżej (krok 1.4).</li>
	<li>Określić średni OD610 z 200 μl ekstrakcji AWF indygotyny. Skoryguj tę wartość, odejmując średnią wartość OD610 wynoszącą 200 μl AWF wolnego od indygotyny. Zastąp tę skorygowaną wartość jako OD610AWF w poniższym równaniu.</li>
	<li>Obliczyć współczynnik rozcieńczenia (tj. rozcieńczenie krotne) na podstawie skorygowanych wartości absorbancji jako: 
	Współczynnik rozcieńczenia apoplast = OD610infiltrat / (OD610infiltrat - OD610AWF)</li>
	<li>Pomnóż wartości stężenia lub aktywności z AWF przez współczynnik rozcieńczenia, aby oszacować stężenie/aktywność w płynie apoplastycznym w planta.</li>
</ol>
4. Koncentracja AWF do pełnej wytrzymałości przez liofilizację
<ol>
	<li>Włącz liofilizator i pozwól mu ustabilizować się przy temperaturze i ciśnieniu roboczym.</li>
	<li>Zbierz żądaną ilość świeżych lub przechowywanych próbek AWF.</li>
	<li>Rozprowadzić próbki równomiernie w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Określ objętość rozpuszczonej rekonstytucji: 
	Objętość rozpuszczenia = objętość przed liofilizacją / współczynnik rozcieńczenia apoplastu</li>
	<li>Przy zamkniętych pokrywkach zamroź probówki w ciekłym azocie.</li>
	<li>Przenieść zamrożone probówki do jednego lub więcej schłodzonych naczyń do liofilizacji. Podczas przenoszenia rurek załóż pokrywę na taką, która została przebita ostrym przedmiotem, aby umożliwić wymianę gazową.</li>
	<li>Podłączyć naczynia do liofilizatora i całkowicie liofilizować próbki.</li>
	<li>Wyjąć próbki z maszyny i rozpuść AWF, dodając obliczoną ilość wody destylowanej.</li>
	<li>Założyć nieprzewierconą pokrywę i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Analiza metabolitów metodą chromatografii gazowej Spektrometria mas17
<ol>
	<li>Odpipetować 200 μl AWF do probówki o pojemności 1,5 ml</li>
	<li>Dodać 700 μl metanolu zawierającego 10 μg/ml rybitolu jako wzorzec wewnętrzny.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 11 000 x g.</li>
	<li>Przenieść 700 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 375 μl zimnego chloroformu i wirować przez 10 sekund.</li>
	<li>Dodać 500 μl dH2O i wirować przez 10 sekund.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 2 200 x g.</li>
	<li>Przenieść 150 μl górnej warstwy wodnej do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie całkowicie wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.</li>
	<li>Rozpuścić próbki w 30 μl pirydyny zawierającej 20 mg/ml chlorowodorku metoksyaminy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 70 °C, energicznie wstrząsając przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodać 50 μl MSTFA (N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamidu).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść próbki do szklanych fiolek zgodnych z GC-MS.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę GC-MS próbek. Patrz Lisec et al. 200917, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji i wydajności sprzętu GC-MS.</li>
</ol>

<ol><li>Felle, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+pH+during+low-oxygen+stress+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley.</a> Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).</li>
<li>Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+arbuscular+mycorrhization+by+apoplastic+invertases%3A+enhanced+invertase+activity+in+the+leaf+apoplast+affects+the+symbiotic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction.</a> The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).</li>
<li>Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpiration+rate.+An+important+factor+controlling+the+sucrose+content+of+the+guard+cell+apoplast+of+broad+bean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean.</a> Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).</li>
<li>Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+the+plant+apoplast+by+plant+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathogenic+Bacteria%22%5BJournal%5D)">Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria.</a> Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).</li>
<li>Rico, A., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+uses+constitutive+and+apoplast-induced+nutrient+assimilation+pathways+to+catabolize+nutrients+that+are+abundant+in+the+tomato+apoplast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).</li>
<li>Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nutrient+supply+of+pathogenic+fungi%3B+a+fertile+field+for+study%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study.</a> Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).</li>
<li>Brunner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+plants+and+animals%3A+emerging+parallels+between+the+recognition+of+general+elicitors+and+pathogen-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).</li>
<li>Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+leaf+scald+%28Xanthomonas+albilineans%29+on+polyamine+and+phenolic+acid+metabolism+of+two+sugarcane+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars.</a> European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).</li>
<li>Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+iron+deficiency+on+the+composition+of+the+leaf+apoplastic+fluid+and+xylem+sap+in+sugar+beet.+Implications+for+iron+and+carbon+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport.</a> Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).</li>
<li>Dragišić Maksimović, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter+strip+as+a+method+of+choice+for+apoplastic+fluid+extraction+from+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots.</a> Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).</li>
<li>Baker, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+standard+technique+for+improved+quantitative+analysis+of+apoplastic+metabolites+in+tomato+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).</li>
<li>Nouchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+difficulties+in+collecting+apoplastic+fluid+from+rice+leaves+by+the+infiltration-centrifugation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method.</a> Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).</li>
<li>Boudart, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+proteins+in+apoplastic+fluids+of+Arabidopsis+thaliana+rosettes%3A+identification+by+mass+spectrometry+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics.</a> Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).</li>
<li>Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+infiltration-centrifugation+technique+appropriate+for+the+isolation+of+apoplastic+fluid%3F+A+critical+evaluation+with+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species.</a> Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).</li>
<li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malate+Dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymatic+Analysis%22%5BJournal%5D)">Malate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614(1974).</li>
<li>Lohr, G. W., Waller, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+Dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymatic+Analysis%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).</li>
<li>Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatography+mass+spectrometry-based+metabolite+profiling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants.</a> Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).</li>
<li>Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+and+bound+apoplastic+activity+for+peroxidase%2C+beta-d-glucosidase%2C+malate+dehydrogenase%2C+and+nonspecific+arylesterase%2C+in+barley+%28Hordeum+vulgare+L.%29+and+oat+%28Avena+sativa+L.%29+primary+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves.</a> Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).</li>
<li>Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+tobacco+leaf+apoplast+proteome+in+response+to+salt+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress.</a> Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).</li>
<li>Shabab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+effector+protein+AVR2+targets+diversifying+defense-related+Cys+proteases+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato.</a> Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).</li>
<li>Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+in+the+free+space+of+growing+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Solutes in the free space of growing stem tissues.</a> Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).</li>
<li>Husted, S., Schjoerring, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+pH+and+ammonium+concentration+in+leaves+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus.</a> L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).</li>
<li>Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+converts+indigo+carmine+to+isatin+sulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).</li>
<li>Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+superoxide+in+plant+leaves+using+a+modified+NBT+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method.</a> Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).</li>
<li>Speer, M., Kaiser, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+relations+of+symplastic+and+apoplastic+space+in+leaves+from+Spinacia+oleracea+L.+and+Pisum+sativum+L.+under+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity.</a> Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Optymalizacja źródła tkanek roślinnych
Różnice biologiczne i techniczne mogą być duże podczas wykonywania ekstrakcji apoplastem, dlatego wysoce ustandaryzowany przepływ pracy jest pomocny w zwiększaniu ciągłości między eksperymentami (ryc. 1). Co ważne, źródło tkanki roślinnej musi być znormalizowane, w tym rodzaj liści, wiek liści, warunki wzrostu/środowiska i pora dnia (tabela 1). Istnieją duże różnice w łatwości, z jaką różne liście są infiltrowane, a następnie odzyskiwany przez odwirowanie; Różnice te są skorelowane z liczbą aparatów szparkowych, wielkością otworu i odpornością mezofilu12,14. Nawet wśród różnych odmian P. vulgaris istnieją duże różnice w łatwości i wydajności procedury ekstrakcji AWF; na przykład liście użytej tutaj odmiany Tendergreen są bardziej podatne na ekstrakcję AWF tą metodą niż odmiana Canadian Wonder. W obrębie P. vulgaris pierwsze prawdziwe liście są największe i najłatwiejsze do infiltracji, co czyni je oczywistym wyborem do ekstrakcji apoplastycznej. Wykazano, że objętość powietrza i wody apoplastycznej zmienia się wraz z wiekiem liści u kilku gatunków, co prowadzi do różnic w zdolności ekstrakcji AWF12,14. U P. vulgaris starsze liście stają się znacznie trudniejsze do infiltracji i dają mniej AWF po odwirowaniu; Dlatego liście zbierano po osiągnięciu pełnej ekspansji. Liście, które są trudne do infiltracji, wymagają następnie większych prędkości wirowania, aby odzyskać AWF. Dlatego należy dokładnie przesiać kilka różnych typów i odmian liści przed podjęciem decyzji o źródle tkanek do ekstrakcji AWF na dużą skalę.
Warunki wzrostu roślin muszą być również w jak największym stopniu ustandaryzowane w kontekście eksperymentu. Preferowane jest stosowanie szaf wzrostowych, ponieważ pozwalają one na utrzymanie stałej wilgotności, temperatury i natężenia światła. Zbiór liści powinien zawsze odbywać się o tej samej porze dnia, ponieważ stężenia metabolitów, enzymów itp. zmieniają się w ciągu całego cyklu dobowego14. Wreszcie, aby upewnić się, że wszystkie liście rośliny mają podobny nacisk turgoru, rośliny należy podlać na krótko przed (~1 godziną) zbiorami.
Optymalizacja infiltracji i wirowania liści
Niepożądane zanieczyszczenie cytoplazmatyczne AWF spowodowane częściową lizą komórek nastąpi, jeśli naprężenia mechaniczne napotykane przez komórki są zbyt wysokie podczas etapów infiltracji lub wirowania. Dlatego procedura dla danego typu liścia powinna być zoptymalizowanym kompromisem między maksymalizacją plonu a minimalizacją zanieczyszczenia cytoplazmatycznego AWF. We wszystkich przypadkach należy stosować najniższą prędkość wirowania, przy której można odzyskać AWF, aby uniknąć ewentualnego mechanicznego uszkodzenia komórek liścia. Optymalizacja prędkości wirowania powinna być określona empirycznie dla każdego typu liścia poprzez monitorowanie odzyskanej objętości i zanieczyszczenia apoplastem w zakresie prędkości wirowania. Zaobserwowano, że aktywność enzymów markerowych, takich jak MDH, G6PDH i izomeraza glukozowo-fosforanowa, pozostaje niska do momentu przekroczenia progowej siły odśrodkowej, powyżej której aktywność ta gwałtownie wzrasta, prawdopodobnie z powodu wycieku cytoplazmatycznego9,12,14. Zastosowanie Parafilmu jako podparcia na etapie wirowania, jak zauważyli Baker i in. 201211, może poprawić skuteczność ekstrakcji AWF i może zminimalizować mechaniczne uszkodzenia blaszki liściowej spowodowane nadmiernym fałdowaniem i ściskaniem. Ponadto zastosowanie Parafilmu poprawia wizualizację liścia po odwirowaniu, kiedy należy zbadać liść pod kątem uszkodzeń i kompletności ekstrakcji AWF.
Nouchi12 opisuje optymalizację odzyskiwania AWF z ciętych odcinków liści ryżu, które są trudne do infiltracji i wymagają większych prędkości wirowania w celu zebrania AWF ze względu na ich małe otwory szparkowe. Lepsze zwilżanie powierzchni liści ryżu, poprzez wstępne namoczenie liści w wodzie destylowanej lub dodanie środka powierzchniowo czynnego do płynu infiltracyjnego, ułatwiło proces infiltracji. Wyższą prędkość wirowania (6 000 x g) zastosowano również podczas monitorowania zanieczyszczenia apoplastycznego12. W przypadku stosowania wyciętych odcinków liści zawsze istnieje ryzyko, że zanieczyszczenie cytoplazmatyczne będzie bardziej rozpowszechnione, nawet przy intensywnym myciu miejsc rany; Dlatego ścięte liście powinny być używane tylko wtedy, gdy jest to konieczne.
W wielu badaniach jako płyn infiltracyjny stosuje się wodę destylowaną11. Jednak do płynu infiltracyjnego można dodawać związki, takie jak sole lub, w celu poprawy ekstrakcji niektórych związków apoplastycznych, zwłaszcza białek13. Lohaus14 ocenił wpływ siły jonowej i osmotycznej na skład odzyskanego AWF i stwierdził, że jest on nieistotny. Zmiany pH pożywki infiltracyjnej mogą jednak wpływać na skład AWF14.
Ważne jest właściwe obchodzenie się z wyekstrahowanym płynem apoplastycznym i jego przechowywanie. Wykazano, że AWF zawiera obfitość proteaz i innych enzymów13,20, a także lotnych związków organicznych. Dlatego, aby ograniczyć zmiany w składzie AWF po odzysku, zaleca się przechowywanie próbek na lodzie lub w inny sposób w temperaturze -80 °C. Ponadto testy enzymatyczne AWF należy wykonać jak najszybciej po ekstrakcji, aby ograniczyć inaktywację enzymów w wyniku proteolizy, przedłużonego rozcieńczania lub zamrażania i rozmrażania.
Proces infiltracji rozcieńcza płyn apoplastyczny i często konieczne jest określenie zakresu tego rozcieńczenia. Etap wirowania może również rozcieńczyć AWF wodą z przedziałów wewnątrzkomórkowych. Współczynnik rozcieńczenia jest potrzebny do oszacowania stężeń chemicznych apoplastów in vivo , gdy pomiary są wykonywane na AWF. Czynnik rozcieńczający jest również potrzebny do skoncentrowania AWF z powrotem do pełnej mocy, gdy jest on stosowany jako pożywka naśladująca apoplast dla drobnoustrojów - dopasowując w ten sposób stężenia metabolitów in vivo tak dokładnie, jak to możliwe. Istnieje kilka wariantów metody opisanej w kroku 4 do oznaczania współczynnika rozcieńczenia AWF poprzez pomiar rozcieńczenia związku znacznikowego dodanego do płynu infiltracyjnego. Dla wszystkich metod obliczenie rozcieńczenia AWF zakłada, że płyn infiltracyjny nie jest w znacznym stopniu wchłaniany lub rozcieńczany przez komórki liści podczas procesu odzyskiwania AWF. Założenie to zostało wcześniej zweryfikowane dla etapu infiltracji14 , ale nie zostało zweryfikowane dla etapu wirowania. Związek znacznikowy nie może być również wchłaniany, transportowany ani modyfikowany w apoplastach. Indygotyna jest najczęściej stosowanym i najdokładniej przebadanym barwnikiem używanym do obliczeń rozcieńczania AWF. Indygotyna wykazuje niską absorbancję żywicy kationowymiennej i izolowanych ścian komórkowych i wykazano, że nadaje się do obliczeń AWF w Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum i Glycine max11,21,22. Jednak w przypadku niektórych rodzajów liści, np. ryżu i ogórka, indygotyna nie wydaje się być w pełni odzyskana po naciekaniu, co prowadziłoby do niedoszacowania współczynnika rozcieńczenia AWF12,21. Brak odzysku indygotyny może wynikać z jego podatności na rozszczepienie w sulfonian izatyny przez ponadtlenek23, o którym wiadomo, że jest wytwarzany w apoplastach, zwłaszcza pod wpływem stresu24. Rozszczepienie indygotyny na sulfonian izatyny spowoduje utratę absorbancji przy 610 nm i wzrost przy 245 nm. Do tej pory nie zbadano, czy reakcja ta zachodzi w znacznym stopniu w apoplastach, czy też reakcja ta może zostać zahamowana przez dodanie zmiataczy ponadtlenkowych do płynu infiltracyjnego. Niebieski dekstran został użyty zamiast indygokarminy do ilościowego określenia czynnika rozcieńczenia AWF w liściach ryżu12, chociaż nie zgłoszono jego stabilności i odzysku w AWF. Alternatywnie, zamiast barwników można użyć związków znakowanych radioizotopem, takich jak sorbitol [14C] lub inne mierzalne wzorce wewnętrzne, a spadek radioaktywności lub stężenia mierzyć i wykorzystywać do obliczania współczynnika rozcieńczenia w analogiczny sposób11,14,25.
Ograniczenia techniki
Istnieje kilka zastrzeżeń dotyczących metody izolacji AWF metodą infiltracji i odwirowania. Po pierwsze, rozcieńczenie apoplastu podczas infiltracji może wywołać reakcję rośliny. Jeśli otaczające komórki liści wykryją zmniejszone stężenie niektórych składników płynu apoplastycznego, mogą zareagować wydalaniem dalszych metabolitów, zniekształcając interpretację stężeń metabolitów. W ocenie tego problemu zaobserwowano, że ani czas między infiltracją a odwirowaniem, ani umiarkowane różnice w sile jonowej płynu infiltracyjnego nie wpłynęły na skład wyekstrahowanego AWF14,22. Dlatego uważa się, że wszelkie artefakty powstałe w wyniku rozcieńczenia apoplastu są minimalne.
Drugą potencjalną wadą jest to, że elucja AWF przez wirowanie nie wychwytuje wszystkich cząsteczek obecnych w apoplastach z kilku powodów. Niektóre związki, w szczególności kationy i białka, mogą być ściśle związane z ujemnie naładowaną ścianą komórkową i nie eluować za pomocą AWF13. Inne cząsteczki, takie jak białka, mogą być zbyt duże, aby skutecznie wymywać się z apoplastu przy stosowanych prędkościach wirowania14. Reaktywne formy tlenu są ważną klasą związków wytwarzanych w apoplastach, ale ze względu na krótkotrwały charakter tych związków i nieokreślone wymagania dotyczące ich produkcji, ich obecność nie jest dobrze wychwytywana przez ekstrakcję AWF. Nie wiadomo, jak dokładnie AWF odzwierciedla skład in vivo płynu apoplastowego i może się on różnić w zależności od gatunku.
Istnieje kilka testów określających zanieczyszczenie cytoplazmatyczne, ale żadne z nich nie jest powszechnie akceptowane. Testy głównie enzymów cytoplazmatycznych (np. G6PDH, izomerazy fosforanu heksozy, MDH) mają tę zaletę, że są łatwe do wykonania, ale mogą nie korelować dobrze z przeciekiem cytoplazmatycznym14,18. Ocena metabolitów cytoplazmatycznych (np. fosforanów heksozy, chlorofilu) jest być może bardziej orientacyjna, ale jest mniej dobrze ugruntowana11. Niemniej jednak każdy rodzaj testu może być przydatny do względnego oznaczania ilościowego zanieczyszczenia apoplastycznego między próbkami. Idealnie byłoby, gdyby w celu walidacji integralności próbki AWF zastosowano wiele niezależnych pomiarów.
Uznając swoje ograniczenia, opisana tutaj technika infiltracji-wirowania pozostaje prostą i solidną techniką w badaniu białek apoplastycznych, metabolitów pierwotnych i wtórnych oraz jonów nieorganicznych.

Roślinny apoplast to przestrzeń międzykomórkowa, która otacza komórki roślinne. Jest to dynamiczne środowisko, w którym zachodzi wiele procesów metabolicznych i transportowych. Głównym składnikiem strukturalnym apoplastu jest ściana komórkowa, która jest składana i modyfikowana przez enzymy, białka strukturalne i metabolity znajdujące się w apoplastach. W zdrowych komórkach roślinnych apoplast jest na ogół utrzymywany w stanie kwaśnym, co pozwala na import aminokwasów, cukrów i innych składników odżywczych z apoplastu do cytoplazmy za pomocą symportu H+ 1. Podczas transportu sacharozy sacharoza przemieszcza się ze źródeł fotosyntetycznych przez apoplast do naczynia krwionośnego; Sacharoza jest następnie transportowana przez potencjał osmotyczny utrzymywany przez inwertazy apoplastyczne rozszczepiające sacharozę w narządach zlewu2. Cukry i inne składniki odżywcze mogą być również transportowane w górę i gromadzić się w jamach szparkowych poprzez strumień transpiracji3.
Apoplast reprezentuje również niszę środowiskową, gdzie wiele patogenów prowadzi swój pasożytniczy tryb życia. Bakteryjne patogeny roślinne mają zdolność namnażania się do dużych zagęszczeń w apoplastach, do których uzyskują dostęp przez naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe lub przez rany4. Wykazano, że stężenie aminokwasów i innych związków azotu w apoplastach pomidora jest wystarczające do zaspokojenia potrzeb żywieniowych patogenów bakteryjnych i grzybiczych5,6. Pierwotne reakcje obronne wobec patogenów drobnoustrojów występują również w apoplastach, a mianowicie wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez zewnątrzkomórkowe peroksydazy i oksydazy oraz wzmacnianie ściany komórkowej poprzez sieciowanie i odkładanie kalozy7. Ściana komórkowa rośliny jest bogata w metabolity wtórne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym; Charakter biochemiczny tych metabolitów wtórnych różni się w zależności od gatunku8.
W wyniku wyżej wymienionych i innych procesów, płyn apoplastyczny z liści zawiera różnorodne białka, cukry, kwasy organiczne, aminokwasy, metabolity wtórne, metale i inne kationy (np. Mg2+, K+, Na+, Ca2+, Fe2/3+). Stężenia substancji rozpuszczonej w apoplaście pędów są kontrolowane w dużej mierze przez równowagę procesów transportowych zachodzących między apoplastem a ksylemem, łykiem i cytoplazmą9. Jednak reakcje metaboliczne i rozwój drobnoustrojów również zużywają lub wytwarzają substancje rozpuszczone apoplastyczne. Wiadomo, że skład apoplastu różni się w zależności od gatunku rośliny i genotypu oraz w odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiskowe, w tym światło, odżywianie oraz stresy biotyczne i abiotyczne9. Badając skład apoplastu i jego zmiany, w tym takie właściwości, jak potencjał redoks i osmotyczny, pH, dostępność składników odżywczych/metabolitów i aktywność enzymatyczną, można uzyskać nowy wgląd w to, jak rośliny reagują na środowisko. Zrozumienie lub scharakteryzowanie zmian molekularnych zachodzących w roztworze apoplastu jest skomplikowane, ponieważ jest to przestrzennie ustrukturyzowany i dynamiczny przedział, w którym metabolity i / lub jony mogą być lotne, przejściowe lub związane ze ścianą komórkową i błoną plazmatyczną. Ponadto wymagane są różne techniki analityczne, aby objąć zakres różnych typów chemicznych.
Aby zbadać skład rozpuszczalnego apoplastu, zazwyczaj konieczne jest pobranie płynu z tkanki. Istnieje kilka metod ekstrakcji płynu apoplastowego z różnych tkanek, w tym nowo zaproponowana metoda pasków filtracyjnych10, ale najbardziej uznaną metodą ekstrakcji liści jest infiltracja-wirowanie. Technika ta została oceniona wcześniej11-13 oraz Lohaus i wsp. 200114 dostarczają dokładnej analizy wielu parametrów technicznych metody. Jak sugeruje nazwa, technika infiltracji i wirowania jest dwuetapową metodą, która zasadniczo polega na zastąpieniu apoplastycznej przestrzeni powietrznej wodnym płynem infiltracyjnym, który miesza się z natywnym płynem apoplastycznym, a następnie odzyskaniu mieszaniny infiltracji / płynu apoplastycznego poprzez delikatne odwirowanie liści. Ponieważ odzyskany płyn jest rozcieńczony i nie zawiera wszystkich związków obecnych w apoplastach (patrz poniżej), płyn ten jest powszechnie znany jako płyn do płukania apoplastów (AWF) lub czasami płyn do płukania międzykomórkowego, a nie płyn apoplastyczny. Technika infiltracji-wirowania jest łatwo skalowalna, co pozwala na generowanie pojedynczych lub zbiorczych próbek AWF o odpowiedniej objętości i poddawanie ich szerokiej gamie dalszych technik biochemicznych i analitycznych (np. elektroforeza białek, pomiar aktywności enzymów, NMR, wiele rodzajów chromatografii i spektrometria mas). Leaf AWF jest również przydatny jako pożywka naśladująca apoplast do badania interakcji mikroorganizmów kolonizujących rośliny z ich środowiskiem 5.
W poniższych protokołach opisujemy, jak przeprowadzić technikę infiltracji-wirowania przy użyciu Phaseolus vulgaris odmiany Tendergreen, oraz podajemy kilka przykładów dalszych analiz z naciskiem na metabolomikę. Co ważne, przedstawiono metody oceny jakości AWF wraz z poradami dotyczącymi optymalizacji procedury dla różnych typów liści.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>żyletka</td><td>Fisher</td><td>12-640&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>4 calowa parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>kolba boczna</td><td>SciLabware</td><td>12972831</td><td></td></tr><tr><td>źródło</td><td></td><td></td><td></td>próżni</tr><tr><td>Końcówki do pipet 5 ml</td><td>Fisher</td><td>50-813-28&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>indygo karmin</td><td>Sigma</td><td>I8130</td><td></td></tr><tr><td>czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe</td> Liofilizator <td>353072</td><td></td><td>Becton Dickinson</td></tr><tr><td></td><td>SciQuip</td><td>Chrystus Mikrowirówka Alpha 2-4 LD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>biorad</td><td>166-0612EDU</td><td></td></tr><tr><td>Kwas szczawiooctowy</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>D-glukozo-6-fosforan</td><td>Sigma</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td></td> Zestaw testowy Roche <td>10128023001</td><td></td></tr><tr><td>MDH</td><td>Biovision</td><td>K654-100</td><td></td></tr><tr><td>G6PDH</td><td>Sigma</td><td>MAK015-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy G-6-P</td><td>Biovision</td><td>K657-100</td><td></td></tr><tr><td>rybitol</td><td>Sigma</td><td>A5502</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma</td><td>472476</td><td></td></tr><tr><td>koncentrator próżniowy</td><td>Thermor Scientific</td><td>SC250EXP</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek metoksyaminy</td><td>Sigma</td><td>226904</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid</td><td>Sigma</td><td>394866</td><td></td></tr></tbody></table>

technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie phaseolus vulgaris

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Apoplast to odrębny zewnątrzkomórkowy przedział w tkankach roślinnych, który znajduje się poza błoną plazmatyczną i obejmuje ścianę komórkową. Komora apoplastyczna liści roślin jest miejscem kilku ważnych procesów biologicznych, w tym tworzenia ścian komórkowych, pobierania i eksportu składników odżywczych i wody przez komórki, interakcji między roślinami a endofitami oraz odpowiedzi obronnych na patogeny. Metoda infiltracji-odwirowania jest dobrze znana jako solidna technika analizy rozpuszczalnego składu apoplastów różnych gatunków roślin. Płyn otrzymywany tą metodą jest potocznie znany jako płyn do płukania apoplastów (AWF). Poniższy protokół opisuje zoptymalizowaną metodę infiltracji próżniowej i odwirowania do ekstrakcji AWF z Phaseolus vulgaris (fasola francuska) odmiany Tendergreen. Omówiono ograniczenia tej metody oraz optymalizację protokołu dla innych gatunków roślin. Odzyskany AWF może być wykorzystany w szerokim zakresie dalszych eksperymentów, które mają na celu scharakteryzowanie składu apoplastu i jego zmian w odpowiedzi na gatunki roślin i genotyp, rozwój roślin i warunki środowiskowe, lub określenie, w jaki sposób mikroorganizmy rosną w płynie apoplastowym i reagują na zmiany w jego składzie.

Typowe wyniki ekstrakcji AWF przeprowadzonych u zdrowych 3-tygodniowych osobników P. vulgaris cv. Tendergreenliście, wykorzystanie wody destylowanej jako płynu do infiltracji przedstawiono w Tabela 2Młody P. vulgaris liście nadają się do infiltracji, a przy zastosowanej tutaj prędkości wirowania (1 000 x g) usunięcie większości płynu infiltracyjnego w drodze wirowania można zaobserwować bezpośrednio, gdy liście powracają do swojego pierwotnego zielonego koloru. P. vulgaris Świeża masa liści wynosiła średnio 1,1 g przed infiltracją, co pozwoliło na uzyskanie 0,5 ml AWF na gram świeżej masy. Stężenie białka w AWF, wyznaczone za pomocą standardowego testu Bradforda, wyniosło 0,18 ± 0,08 mg/ml. Współczynnik rozcieńczenia dla tych liści, obliczony poprzez pomiar rozcieńczenia karminu indygo, wyniósł 2,3 ± 0,3. Powyższe wartości mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku, dlatego niezbędne są eksperymenty pilotażowe w celu określenia wydajności AWF na gram świeżej masy liścia, a także przewidywanego stężenia białka w AWF i współczynnika rozcieńczenia dla danego typu liścia.
Uszkodzenie integralności komórek może wystąpić zarówno podczas etapu infiltracji, jeśli zmiany ciśnienia są zbyt gwałtowne, jak i podczas etapu wirowania, jeśli siła odśrodkowa jest zbyt wysoka. Konieczne jest zatem badanie próbek AWF pod kątem markerów kontaminacji cytoplazmatycznej; w idealnym przypadku wykonuje się kilka niezależnych analiz. Tutaj wyniki trzech możliwych analiz przedstawiono w Tabeli 2. W prawidłowo przeprowadzonych ekstrakcjach AWF z P. vulgaris aktywność G6PDH była niewykrywalna w standardowym teście enzymatycznym. Jest to zgodne z innymi doniesieniami, według których aktywność G6PDH staje się wykrywalna dopiero powyżej pewnego progu siły odśrodkowej12. W przeciwieństwie do tego, we wszystkich próbkach AWF z P. vulgaris za pomocą standardowego testu metabolicznego wykryto podstawowy poziom aktywności dehydrogenazy jabłczanowej (2,5 U/ml). Zwiększenie siły odśrodkowej powyżej progu 1 000 ×g doprowadziło do wzrostu aktywności MDH (wyniki nie pokazane). Ponieważ wiadomo, że apoplast innych gatunków zawiera endogenną aktywność MDH18, ilość wykryta w tym przypadku uznaje się za rzeczywistą aktywność apoplastyczną, a znaczące wzrosty powyżej tego poziomu bazowego świadczą o kontaminacji. Do oceny kontaminacji AWF można również wykorzystać metabolity uważane za głównie cytoplazmatyczne, takie jak heksozo-6-fosforany. W tym przypadku analiza GC-MS wykazała zerowy lub śladowy poziom G-6-P w ekstrakcjach AWF. Dla kontrastu, w przeciętych sekcjach korzenia kukurydzy G-6-P wykryto po ekstrakcji AWF przy wszystkich prędkościach wirowania, a jego stężenie wzrastało przy wyższych prędkościach, co wskazywało na kontaminację cytoplazmatyczną10.
Analiza metabolomów AWF z liści P. vulgaris metodą GC-MS zazwyczaj pozwala na zidentyfikowanie od 40 do 60 metabolitów oraz podobnej liczby związków nieidentyfikowalnych (Rysunek 2). Kwasy organiczne, cukry proste i aminokwasy stanowią większość identyfikowalnych metabolitów, jednak w AWF wykryto i oznaczono ilościowo również wtórne metabolity roślinne11. W Rysunku 2 naniesiono etykiety dla kilku przykładowych pików z tych różnych klas cząsteczek. Do tych próbek AWF można zastosować dalsze techniki analityczne w celu ilościowego oznaczenia różnych cząsteczek, na przykład: ICP-MS, NMR, HPLC, spektroskopię absorpcji atomowej oraz spektrometrię mas białek.
Składnik białkowy apoplastu jest również reprezentowany w AWF, co pokazano na żelu SDS-PAGE barwionym Coomassie Brilliant Blue na Ryc. 3. Enzymy apoplastyczne, poza innymi funkcjami, odpowiadają za syntezę ściany komórkowej i tworzenie pozakomórkowych reaktywnych form tlenu. Badania proteomiczne AWF z różnych gatunków zidentyfikowały dziesiątki pojedynczych białek i wykazały, że składnik białkowy apoplastu reaguje na stres środowiskowy13,19. Idealnie ekstrakt AWF powinien być wolny od zanieczyszczeń białkami cytoplazmatycznymi, takimi jak Rubisco; jednak w praktyce jest to trudne do osiągnięcia. Obecność prążka białka Rubisco przy ~53 kDa po elektroforezie SDS-PAGE stanowi dodatkowy test jakościowy spójności próbek AWF. Na przykład próbka naniesiona w ścieżce 2 na Ryc. 3 zawiera większą ilość zanieczyszczenia Rubisco niż próbka w ścieżce 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td>AWF z Phaseolus vulgaris</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Objętość AWF (ml g-1 świeżej masy liścia)</td>
			<td>0.49 ± 0.09 </td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Stężenie białka (mg ml-1)</td>
			<td>0.18 ± 0.08 </td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Współczynnik rozcieńczenia</td>
			<td>2.3 ± 0.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Aktywność G6PDH (U ml-1)</td>
			<td>nie wykryto</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Glc-6-P (mg ml-1)</td>
			<td>nie wykryto</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Aktywność MDH (U ml-1)</td>
			<td>2.5 ± 0.9 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Typowe wyniki ekstrakcji AWF z liści P. vulgaris odm. Tendergreen.
<img alt="Proces standaryzacji materiału roślinnego; ekstrakcja AWF, analizy cytozolowe; schemat blokowy przechowywania i analizy." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Standardowy schemat ekstrakcji apoplastu. Numery odnoszą się do poszczególnych kroków protokołu.
<img alt="Chromatografia; piki elucji w czasie; wykres analityczny; identyfikacja rozdziału związków." src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przykładowy chromatogram GC-MS P. vulgaris cv. Tendergreen AWF. Ponumerowane przykładowe piki metabolitów to: 1-malonian, 2-fosforan, 3-bursztynian, 4-nieznany, 5-jabłczan, 6-asparagina, 7-rybitol (wzorzec wewnętrzny), 8-cytrynian, 9-glukoza, 10-inozytol, 11-kwas kawowy, 12-sacharoza.
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej SDS-PAGE przedstawiający rozdział białek na podstawie porównania masy cząsteczkowej." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykład żelu SDS-PAGE barwionego Coomassie z ekstraktami liści AWF P. vulgaris. Żel ten stanowi porównanie składników białkowych dwóch ekstrakcji AWF, które różnią się stopniem zanieczyszczenia cytoplazmatycznego obfitym enzymem plastydialnym Rubisco. Po ekstrakcji AWF obie próbki poddano wytrącaniu białek acetonem w 4-krotnym nadmiarze (v/v) zimnego acetonu, a następnie ponownie rozpuszczono w wodzie w objętości stanowiącej jedną dziesiątą objętości pierwotnej. Ścieżki 1 i 2 zawierają 40 µg białka. Prążek odpowiadający dużemu łańcuchowi Rubisco (~53 kDa) został zaznaczony strzałką. Mr: markery masy cząsteczkowej białek.

Ten protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną ekstrakcję płynu do mycia apoplast z liści roślin, używając francuskiej fasoli (Phaseolus vulgaris) jako przykładu modelu.

Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Celem tej procedury jest zademonstrowanie ekstrakcji płynu aplastycznego z liści roślin przy użyciu techniki wirowania infiltracyjnego. Osiąga się to poprzez najpierw zanurzenie liścia w płynie infiltracyjnym i wykorzystanie różnic w ciśnieniu generowanych za pomocą strzykawki lub pompy próżniowej do jego pełnej infiltracji. Drugim krokiem jest przygotowanie liścia do odwirowania za pomocą aparatu wspomagającego.Następnie liść jest delikatnie odwirowywany w celu uzyskania płynu myjącego APO plast. Ostatnim krokiem jest określenie współczynnika rozcieńczenia APO plast i oznaczenie jakości płynu do płukania alast. Ostatecznie test wirowania infiltracyjnego służy do uzyskania reprezentatywnych próbek APO plast, które można wykorzystać do różnych analiz końcowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest to, że można ją łatwo zoptymalizować dla różnych typów liści w celu uzyskania próbek górnych i górnych, które mają minimalne zanieczyszczenie związkami cytoplazmatycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach takich jak fizjologia roślin i interakcje mikroorganizmów roślinnych, gdzie ważne jest zrozumienie, w jaki sposób skład APL różni się między roślinami i zmienia się w różnych warunkach fizjologicznych lub stresach. Pierwszym krokiem jest podjęcie środków ostrożności, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle.Następnie przygotuj objętość wody destylowanej, w której zanurzysz próbkę liści. Przygotuj żyletkę, aby pobrać próbkę w tym przypadku, liść odmiany fasoli o delikatnej zieleni. Przyłóż żyletkę do zwierzęcia liścia i przymocuj liść do rośliny.Po zebraniu zanurz świeżo wycięty liść w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Następnie użyj chłonnej chusteczki lub papieru, aby delikatnie zablokować wysuszenie liścia. Zmierz masę liścia przed przystąpieniem do infiltracji.Pomoże to później w przybliżeniu objętości infiltracji. Rozpocznij proces infiltracji za pomocą strzykawki o pojemności 60 mililitrów. Po wyjęciu tłoka ostrożnie zwinąć i/lub złożyć liść do strzykawki.Następnie napełnić strzykawkę płynem infiltracyjnym. Tutaj używana jest woda destylowana. Włożyć tłok i odwrócić strzykawkę, aby usunąć powietrze z jej wnętrza.Zwróć uwagę na kolor liści dla późniejszego porównania. Przesunąć tłok do oznaczenia 40 mililitrów za pomocą małego kawałka para param. Zakryć końcówkę strzykawki.Następnie pociągnij tłok do znaku 60 mililitrów, aby wytworzyć podciśnienie. Odwrócić strzykawkę, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z powierzchni liścia. Powoli ustawić tłok w pozycji wyjściowej przez około dwie sekundy.Odsłonić końcówkę strzykawki i wysunąć powietrze. Następnie ponownie zakryj końcówkę i naciśnij tłok, aby wytworzyć umiarkowane nadciśnienie. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, wyrzucając powietrze i stosując nadciśnienie, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany.Dowodem pełnej infiltracji jest przyciemniony kolor infiltrowanych obszarów. Po stwierdzeniu tego faktu należy wyjąć liść ze strzykawki. Delikatnie zablokuj liść papierem chłonnym, aby usunąć płyn z powierzchni.Następnie zmierz wagę naciekanego liścia, a alternatywna metoda infiltracji wykorzystuje kolbę próżniową. Ponownie zbierz liść i opłucz go w wodzie destylowanej. Po wydmuchaniu do sucha zmierz masę liścia.Zaopatrz się w butelkę na broń boczną o minimalnej pojemności 250 mililitrów. Umieść liść w kolbie i zalej go wodą destylowaną. Następnie umieść korek w kolbie i przymocuj pompę próżniową do broni bocznej.Zastosować podciśnienie w kolbie wystarczająco długo, aby osiągnąć ciśnienie. Około 650 milimetrów słupa rtęci. Delikatnie poruszyć kolbą, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z liścia pod zmniejszonym ciśnieniem.Następnie ostrożnie i powoli uwalniaj próżnię w ciągu około 10 sekund. Powtórz proces stosowania próżni, mieszania kolby i uwalniania podciśnienia, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany. Dowodem pełnej infiltracji jest przyciemniony kolor infiltrowanych obszarów.Usunąć całkowicie naciekający liść z kolby i delikatnie osuszyć liść chłonnym papierem. Aby usunąć płyn powierzchniowy, zmierz masę naciekanego liścia, aby umożliwić określenie przybliżonej objętości nacieku. Po pełnej infiltracji liścia przygotuj go do odwirowania.Rozłóż kawałek folii parafilmowej o szerokości czterech cali. Umieść liść na folii para. Następnie za pomocą pięciomililitrowej końcówki pipety zwiń liść w folię para.Weź korpus strzykawki o pojemności 20 mililitrów z usuniętym tłokiem i włóż zwinięty liść z końcówką pipety. Ustawić wszelkie przycięte krawędzie skrzydła i skierować je w stronę końca tłoka. Zaopatrz się w rurkę z polietylenu lub poliwęglanu o pojemności 50 mililitrów i włóż do niej strzykawkę.Zastosuj wirówkę z wahliwym wirnikiem kubełkowym. Załadować probówkę zawierającą naciekany liść i odwirować do temperatury czterech stopni Celsjusza i 1000 G przez 10 minut. Po odwirowaniu należy zbadać liść, aby ustalić, czy większość płynu infiltracyjnego została usunięta.Probówka wirówkowa zawiera teraz odzyskany płyn myjący APO plast, kontynuuj pipetowanie odzyskanego płynu do mycia końcowego do świeżych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Umieścić próbki płynu myjącego APO plast w wirówce i wirować pod ciśnieniem 15 000 G przez pięć minut w celu usunięcia wszelkich komórek lub cząstek stałych. Po odwirowaniu odpipetować supinat do świeżych probówek.Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie można je przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jedną z metod oceny jakości płynu do mycia płyt APO jest obliczenie współczynnika rozcieńczenia płyty APO. Aby to zrobić, przygotuj dwie objętości wody destylowanej płynu infiltracyjnego, w tym przypadku każda wystarczająca na kilka infiltracji do jednej objętości.Dodaj indygotyna w proszku do końcowego stężenia 50 mikromolów. Nie dodawaj nic do drugiego. Uzyskać mikropłytkę z 96 dołkami, wypełnić trzy dołki 200 mikrolitrami roztworu infiltracyjnego.Indygokarminem napełnij kolejne trzy 200 mikrolitrami nieskażonego roztworu infiltracyjnego na mikropłytce w czytniku, aby zmierzyć absorbancję każdego płynu. Przy 610 nanometrach średnia absorbancja płynu z indygotyną minus średni absorbent dla płynu bez daje skorygowaną absorbancję nacieku. Następnie powtórz protokół infiltracji liści trzy razy dla każdego z roztworów infiltracji.Zanurz próbkę liści w wodzie. Stosując podciśnienie i nadciśnienie podczas stosowania roztworu infiltracji indygo karminu, po infiltracji opłucz liście w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie pozostałe indygo karminy z powierzchni liści. Odzyskaj ostatni płyn myjący za pomocą wirowania.Po odzyskaniu płynu do płukania końcowego należy powrócić do czytnika płytek w dołkach mikropłytki. Umieszczono 200 mikrolitrów każdej z ekstrakcji bez indygokarminu, a także 200 mikrolitrów każdej ekstrakcji płynem myjącym indygotyny. Zmierzyć absorbancję próbek przy 610 nanometrach, aby uzyskać skorygowaną absorbancję.Uśrednij każdy zestaw liczb i weź różnicę. Użyć skorygowanej absorbancji nacieku i skorygowanej absorbancji aplastycznego płynu płuczącego w celu wyznaczenia współczynnika rozcieńczenia APL w celu uzyskania oszacowania stężeń lub aktywności w płynie aplastycznym. Implanter pomnożyć wartości stężenia lub aktywności z płynu do płukania alast przez współczynnik rozcieńczenia wyekstrahowany z ostatniego płynu do płukania z odmiany fasi vulgaris.Do produkcji tej chromatografii gazowej użyto delikatnej zieleni kwasów organicznych o widmie masowym. Cukry proste i aminokwasy stanowią większość możliwych do zidentyfikowania metabolitów. Oto porównanie strony SDS, Kumasi bejce żele fasi vulgarus alast płyn do mycia ekstrakty z liści.Ekstrakcje różnią się stopniem zanieczyszczenia cytoplazmatycznego. Obserwuje się to jako różne ilości enzymu rubinu w gipsie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby być tak delikatnym, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia tkanek lub zanieczyszczenia cytoplazmatycznego Po tej procedurze.Inne metody, takie jak spektrometria mas białek lub metabolitów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące składu płynu aplastycznego. Aplastyczny płyn myjący może być również używany jako medium brutto do badania wpływu aplastycznych chemikaliów na mikroorganizmy kolonizujące tkanki roślinne.

the-infiltration-centrifugation-technique-for-extraction-apoplastic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Rufián, J. S. i in., Analiza pojedynczych komórek ekspresji genów Pseudomonas Syringae w tkance roślinnej. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje metodę ciśnienia opartą na strzykawkach do ekstrakcji bakterii apoplastycznych, które rozmnażają się i tworzą mikrokolonie w apoplastyce, czyli przestrzeni międzykomórkowej między komórkami roślinnymi. Metoda ta daje próbki bakteryjne wolne od zanieczynków odpowiednie do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie.

Ekstrakcja bakterii apoplastycznych za pomocą metody ciśnieniowej opartej na strzykawkach

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół do analizy składu białkowego dużych natywnych kompleksów białko:białko i białko:kwasy nukleinowe z łyka rzepakowego (B. napus) przy użyciu metody elektroforezy 3D w żelu poliakrylamidowym (PAGE) łączącej niebieski natywny (BN) z dwoma denaturującymi PAGE, a następnie identyfikacją spektrometryczną mas.

Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.

Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku

Oczyszczanie białek rekombinowanych z systemów roślinnych jest zwykle kwestionowane przez białka roślinne. Praca ta zapewnia metodę skutecznej ekstrakcji i oczyszczania wydzielanego rekombinowanego białka z apoplastu Nicotiana benthamiana.

Metoda oparta na ekstrakcji apoplastów w celu poprawy czystości rekombinowanego białka wytwarzanego przez rośliny

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z liści Arabidopsis thaliana , wspierającą dalsze analizy molekularne i funkcjonalne.

Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów

Naucz się techniki infiltracji i wirowania do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści Phaseolus vulgaris. Ta metoda minimalizuje zanieczyszczenie cytoplazmatyczne i wspiera badania z zakresu fizjologii roślin oraz interakcji roślin z mikroorganizmami.

Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

Przeglądaj więcej filmów