Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

Celem tej procedury jest zademonstrowanie ekstrakcji płynu aplastycznego z liści roślin przy użyciu techniki wirowania infiltracyjnego. Osiąga się to poprzez najpierw zanurzenie liścia w płynie infiltracyjnym i wykorzystanie różnic w ciśnieniu generowanych za pomocą strzykawki lub pompy próżniowej do jego pełnej infiltracji. Drugim krokiem jest przygotowanie liścia do odwirowania za pomocą aparatu wspomagającego.

Następnie liść jest delikatnie odwirowywany w celu uzyskania płynu myjącego APO plast. Ostatnim krokiem jest określenie współczynnika rozcieńczenia APO plast i oznaczenie jakości płynu do płukania alast. Ostatecznie test wirowania infiltracyjnego służy do uzyskania reprezentatywnych próbek APO plast, które można wykorzystać do różnych analiz końcowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest to, że można ją łatwo zoptymalizować dla różnych typów liści w celu uzyskania próbek górnych i górnych, które mają minimalne zanieczyszczenie związkami cytoplazmatycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach takich jak fizjologia roślin i interakcje mikroorganizmów roślinnych, gdzie ważne jest zrozumienie, w jaki sposób skład APL różni się między roślinami i zmienia się w różnych warunkach fizjologicznych lub stresach. Pierwszym krokiem jest podjęcie środków ostrożności, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle.

Następnie przygotuj objętość wody destylowanej, w której zanurzysz próbkę liści. Przygotuj żyletkę, aby pobrać próbkę w tym przypadku, liść odmiany fasoli o delikatnej zieleni. Przyłóż żyletkę do zwierzęcia liścia i przymocuj liść do rośliny.

Po zebraniu zanurz świeżo wycięty liść w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Następnie użyj chłonnej chusteczki lub papieru, aby delikatnie zablokować wysuszenie liścia. Zmierz masę liścia przed przystąpieniem do infiltracji.

Pomoże to później w przybliżeniu objętości infiltracji. Rozpocznij proces infiltracji za pomocą strzykawki o pojemności 60 mililitrów. Po wyjęciu tłoka ostrożnie zwinąć i/lub złożyć liść do strzykawki.

Następnie napełnić strzykawkę płynem infiltracyjnym. Tutaj używana jest woda destylowana. Włożyć tłok i odwrócić strzykawkę, aby usunąć powietrze z jej wnętrza.

Zwróć uwagę na kolor liści dla późniejszego porównania. Przesunąć tłok do oznaczenia 40 mililitrów za pomocą małego kawałka para param. Zakryć końcówkę strzykawki.

Następnie pociągnij tłok do znaku 60 mililitrów, aby wytworzyć podciśnienie. Odwrócić strzykawkę, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z powierzchni liścia. Powoli ustawić tłok w pozycji wyjściowej przez około dwie sekundy.

Odsłonić końcówkę strzykawki i wysunąć powietrze. Następnie ponownie zakryj końcówkę i naciśnij tłok, aby wytworzyć umiarkowane nadciśnienie. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, wyrzucając powietrze i stosując nadciśnienie, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany.

Dowodem pełnej infiltracji jest przyciemniony kolor infiltrowanych obszarów. Po stwierdzeniu tego faktu należy wyjąć liść ze strzykawki. Delikatnie zablokuj liść papierem chłonnym, aby usunąć płyn z powierzchni.

Następnie zmierz wagę naciekanego liścia, a alternatywna metoda infiltracji wykorzystuje kolbę próżniową. Ponownie zbierz liść i opłucz go w wodzie destylowanej. Po wydmuchaniu do sucha zmierz masę liścia.

Zaopatrz się w butelkę na broń boczną o minimalnej pojemności 250 mililitrów. Umieść liść w kolbie i zalej go wodą destylowaną. Następnie umieść korek w kolbie i przymocuj pompę próżniową do broni bocznej.

Zastosować podciśnienie w kolbie wystarczająco długo, aby osiągnąć ciśnienie. Około 650 milimetrów słupa rtęci. Delikatnie poruszyć kolbą, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z liścia pod zmniejszonym ciśnieniem.

Następnie ostrożnie i powoli uwalniaj próżnię w ciągu około 10 sekund. Powtórz proces stosowania próżni, mieszania kolby i uwalniania podciśnienia, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany. Dowodem pełnej infiltracji jest przyciemniony kolor infiltrowanych obszarów.

Usunąć całkowicie naciekający liść z kolby i delikatnie osuszyć liść chłonnym papierem. Aby usunąć płyn powierzchniowy, zmierz masę naciekanego liścia, aby umożliwić określenie przybliżonej objętości nacieku. Po pełnej infiltracji liścia przygotuj go do odwirowania.

Rozłóż kawałek folii parafilmowej o szerokości czterech cali. Umieść liść na folii para. Następnie za pomocą pięciomililitrowej końcówki pipety zwiń liść w folię para.

Weź korpus strzykawki o pojemności 20 mililitrów z usuniętym tłokiem i włóż zwinięty liść z końcówką pipety. Ustawić wszelkie przycięte krawędzie skrzydła i skierować je w stronę końca tłoka. Zaopatrz się w rurkę z polietylenu lub poliwęglanu o pojemności 50 mililitrów i włóż do niej strzykawkę.

Zastosuj wirówkę z wahliwym wirnikiem kubełkowym. Załadować probówkę zawierającą naciekany liść i odwirować do temperatury czterech stopni Celsjusza i 1000 G przez 10 minut. Po odwirowaniu należy zbadać liść, aby ustalić, czy większość płynu infiltracyjnego została usunięta.

Probówka wirówkowa zawiera teraz odzyskany płyn myjący APO plast, kontynuuj pipetowanie odzyskanego płynu do mycia końcowego do świeżych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Umieścić próbki płynu myjącego APO plast w wirówce i wirować pod ciśnieniem 15 000 G przez pięć minut w celu usunięcia wszelkich komórek lub cząstek stałych. Po odwirowaniu odpipetować supinat do świeżych probówek.

Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie można je przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jedną z metod oceny jakości płynu do mycia płyt APO jest obliczenie współczynnika rozcieńczenia płyty APO. Aby to zrobić, przygotuj dwie objętości wody destylowanej płynu infiltracyjnego, w tym przypadku każda wystarczająca na kilka infiltracji do jednej objętości.

Dodaj indygotyna w proszku do końcowego stężenia 50 mikromolów. Nie dodawaj nic do drugiego. Uzyskać mikropłytkę z 96 dołkami, wypełnić trzy dołki 200 mikrolitrami roztworu infiltracyjnego.

Indygokarminem napełnij kolejne trzy 200 mikrolitrami nieskażonego roztworu infiltracyjnego na mikropłytce w czytniku, aby zmierzyć absorbancję każdego płynu. Przy 610 nanometrach średnia absorbancja płynu z indygotyną minus średni absorbent dla płynu bez daje skorygowaną absorbancję nacieku. Następnie powtórz protokół infiltracji liści trzy razy dla każdego z roztworów infiltracji.

Zanurz próbkę liści w wodzie. Stosując podciśnienie i nadciśnienie podczas stosowania roztworu infiltracji indygo karminu, po infiltracji opłucz liście w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie pozostałe indygo karminy z powierzchni liści. Odzyskaj ostatni płyn myjący za pomocą wirowania.

Po odzyskaniu płynu do płukania końcowego należy powrócić do czytnika płytek w dołkach mikropłytki. Umieszczono 200 mikrolitrów każdej z ekstrakcji bez indygokarminu, a także 200 mikrolitrów każdej ekstrakcji płynem myjącym indygotyny. Zmierzyć absorbancję próbek przy 610 nanometrach, aby uzyskać skorygowaną absorbancję.

Uśrednij każdy zestaw liczb i weź różnicę. Użyć skorygowanej absorbancji nacieku i skorygowanej absorbancji aplastycznego płynu płuczącego w celu wyznaczenia współczynnika rozcieńczenia APL w celu uzyskania oszacowania stężeń lub aktywności w płynie aplastycznym. Implanter pomnożyć wartości stężenia lub aktywności z płynu do płukania alast przez współczynnik rozcieńczenia wyekstrahowany z ostatniego płynu do płukania z odmiany fasi vulgaris.

Do produkcji tej chromatografii gazowej użyto delikatnej zieleni kwasów organicznych o widmie masowym. Cukry proste i aminokwasy stanowią większość możliwych do zidentyfikowania metabolitów. Oto porównanie strony SDS, Kumasi bejce żele fasi vulgarus alast płyn do mycia ekstrakty z liści

Ekstrakcje różnią się stopniem zanieczyszczenia cytoplazmatycznego. Obserwuje się to jako różne ilości enzymu rubinu w gipsie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby być tak delikatnym, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia tkanek lub zanieczyszczenia cytoplazmatycznego Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak spektrometria mas białek lub metabolitów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące składu płynu aplastycznego. Aplastyczny płyn myjący może być również używany jako medium brutto do badania wpływu aplastycznych chemikaliów na mikroorganizmy kolonizujące tkanki roślinne.