Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym
16 lutego 2018
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.
Ogólnym celem tej techniki jest wykrycie i ilościowe określenie biomolekuł o niskiej zawartości w bardzo złożonych próbkach z wysoką czułością, prostotą, niskimi kosztami, szybkością i bez użycia jakiegokolwiek znakowania. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biotechnologii, biochemii i biomedycyny, takie jak monitorowanie środowiska, bezpieczeństwo żywności, jakość wody pitnej i diagnoza medyczna. Główne zalety tej techniki to jej nieodłączna szybkość, prostota, wysoka czułość, niski koszt, łatwa manipulacja i wykrywanie w czasie rzeczywistym bez użycia odczynników do etykietowania.
Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób ze względu na jej zdolność do ilościowego określania biomolekuł o niskiej liczebności. Na przykład różne biomarkery w czasie rzeczywistym. Aby wyczyścić szklane szkiełka nakrywkowe, zanurz je w 10 mililitrach 1,0 molowego HCl na 10 minut w myjce ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej.
Następnie zanurz je w wodzie dejonizowanej i 1,0 molowym wodorotlenku sodu w tych samych warunkach. Osuszyć szklane szkiełka nakrywkowe gazowym azotem. Następnie zanurz czyste i wysuszone szkiełka nakrywkowe w 10 mililitrach roztworu APTES na jedną godzinę, aby wprowadzić grupy aminowe na powierzchnię szkła nakrywkowego w temperaturze pokojowej.
Spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną przed ponownym wysuszeniem azotu. Zanurz zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe APTES w 10 mililitrowym roztworze aldehydu glutarowego na dwie godziny, aby aktywować grupy aminowe na powierzchni w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przepłukać szkiełka nakrywkowe 10-milimolowym buforem fosforanowym w celu usunięcia nadmiaru aldehydu glutarowego z powierzchni.
Osuszyć szkiełka nakrywkowe azotem gazowym. Następnie przygotuj 1,0 mililitra roztworu matrycy w 10-milimolowym buforze fosforanowym w stężeniu 0,1 miligrama na mililitr. Upuść 200 mikrolitrów tego roztworu szablonowego na zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Aby wyczyścić elektrody, najpierw zanurz elektrody w małej zlewce zawierającej pięć mililitrów 70% etanolu na 10 minut w myjce ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej. Następnie kolejno zanurz elektrody w wodzie dejonizowanej, acetonie, wodzie dejonizowanej, kwaśnym roztworze piranii i wodzie dejonizowanej w tych samych warunkach. Osuszyć elektrody gazowym azotem.
Aby przeprowadzić elektropolimeryzację tyraminy, należy przygotować osiem mililitrów 10-milimolowego roztworu tyraminy w 10-milimolowym buforze fosforanowym zawierającym dwa mililitry etanolu. Wykonaj 15 cykli cyklicznych skanów woltamperometrycznych w tym roztworze przy użyciu potencjostatu pokrywającego potencjalny zakres od zera do 1,5 V i szybkość skanowania 50 miliwoltów na sekundę. Następnie przepłucz elektrody wodą dejonizowaną przed wysuszeniem elektrod gazowym azotem.
Zanurzyć elektrody w roztworze zawierającym 30 milimolowy chlorek akryloylu i 30 milimolową trimetyloaminę w toluenie w temperaturze pokojowej przez noc przed ponownym wypłukaniem i wysuszeniem elektrod. Przed polimeryzacją należy przygotować roztwór monimeru zawierający monomery i środek sieciujący w 820 mikrolitrach ultraczystej wody. Następnie przygotuj 5% objętości do objętości TEMED w ultra czystej wodzie.
Dodać 20 mikrolitrów roztworu TEMED do roztworu monomeru i przemywać azotem gazowym przez pięć minut. Następnie dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego APS do roztworu monomeru. Odpipetować 1,5 mikrolitra roztworu monomeru na zmodyfikowaną powierzchnię złotej elektrody.
Teraz rozpocznij polimeryzację, doprowadzając stempel szablonowy do kontaktu z powierzchnią traktowaną monomerem i pozostaw go na pięć godzin w temperaturze pokojowej. Po polimeryzacji należy ostrożnie usunąć stempel wzorcowy z powierzchni za pomocą kleszczy. Następnie przepłucz elektrodę wodą dejonizowaną i osusz gazowym azotem.
Zanurz elektrody w jednym mililitrze dziesięciu milionów jednego dodekanateolu przygotowanego w etanolu na dwadzieścia minut, aby zakryć dziurki na powierzchni elektrody. Na koniec przepłucz elektrody wodą dejonizowaną i osusz elektrody gazowym azotem przed scharakteryzowaniem ich powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Włóż nadrukowane pojemnościowe złote elektrody do elektrochemicznej komórki przepływowej zintegrowanej z pojemnościowym bioczujnikiem.
Przygotuj 100 mililitrów buforu regeneracyjnego i jeden litr buforu do biegania. Rozpocznij analizę od wstrzyknięcia bufora regeneracyjnego w celu regeneracji systemu i uruchomienia buforu w celu przywrócenia równowagi systemu przez 25 minut. Przygotować wzorcowe roztwory matrycowe w żądanym zakresie stężeń w działającym buforze.
Następnie w optymalnych warunkach należy kolejno wstrzyknąć 250 mikrolitrów tych roztworów wzorcowych do systemu. Charakterystyka powierzchni złotych elektrod odbywa się za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Pokazana jest goła złota powierzchnia.
Pokazano również bakteriofagi przylegające do powierzchni elektrody w różnych powiększeniach. Pokazano tutaj połączenie bakteriofaga w czasie rzeczywistym z nadrukowaną złotą elektrodą za pomocą sensogramu. Stabilną linię podstawową ustala się po regeneracji i ponownym zrównoważeniu układu przed wstrzyknięciem próbki.
Na elektrodzie znajdują się wgłębienia specyficzne dla fagów. Wstrzyknięcie bakteriofagów indukujących próbkę powoduje zmniejszenie pojemności, ze względu na wiązanie docelowych bakteriofagów z wdrukowanymi wgłębieniami na powierzchni złotych elektrod. Krzywe kalibracyjne pokazują zmieniającą się pojemność w funkcji wstrzykiwania białka w iniekcji bakteriofagów.
Na podstawie równań na tych wykresach można obliczyć stężenie bakteriofaga lub białka w próbce. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować ultraczuły, szybki i działający w czasie rzeczywistym system wykrywania. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin i trzydziestu minut, z wyłączeniem czasu oczekiwania pomiędzy nimi.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby przygotować wszystkie środki na świeżo, tego samego dnia. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne pomiary, takie jak mikroskopia sił atomowych, elektroniczna mikroskopia skaningowa, elipsomer i pomiary kąta kwantowego, aby określić, czy polimeryzacja lub wdrukowanie powiodły się, oraz wykryć wszelkie znaczące różnice między powierzchniami gołych i odciśniętych złotych elektrod. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biochemii, biotechnologii i biomedycyny do zbadania ultraczułego wykrywania biomolekuły w bezpieczeństwie żywności i diagnostyce medycznej.
Nie zapominaj, że praca z funkcjonalnymi monomerami, sieciownikami, inicjatorami i innymi czynnikami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tych eksperymentów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i przeprowadzanie eksperymentów polimeryzacji wewnątrz dygestorium.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykrywania i oznaczania ilościowego niskostężnych biomolekuł w złożonych roztworach z wykorzystaniem imprintingu molekularnego i pojemnościowego biosensora. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością, prostotą oraz efektywnością kosztową, co czyni ją odpowiednią do różnorodnych zastosowań w biotechnologii i biomedycynie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Biochemia
- Biomedycyna
Wstęp
- Wykrywanie biomolekuł występujących w niskich stężeniach ma kluczowe znaczenie w wielu dziedzinach.
- Obecne metody często wymagają znakowania, co może komplikować cały proces.
- Niniejsza technika oferuje podejście bezznakowe, umożliwiające detekcję w czasie rzeczywistym.
- Zastosowania obejmują monitorowanie środowiska oraz diagnostykę medyczną.
Cel badania
- Opracowanie czułej i prostej metody detekcji biomolekuł.
- Ułatwienie monitorowania biomarkerów w czasie rzeczywistym.
- Zapewnienie kosztowo efektywnego rozwiązania do analizy złożonych próbek.
Zastosowane metody
- Imprinting molekularny na elektrodach złotych.
- Elektropolimeryzacja tyraminy w celu przygotowania czujnika.
- Pomiar pojemności do ilościowego oznaczania biomolekuł.
- Charakterystyka powierzchni z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia detekcję docelowych biomolekuł w czasie rzeczywistym.
- Krzywe kalibracyjne obrazują zależność między pojemnością a stężeniem biomolekuł.
- Skuteczne zastosowanie w wykrywaniu bakteriofagów na powierzchniach elektrod.
- Technikę można przeprowadzić w ciągu około pięciu i pół godziny.
Wnioski
- Opracowana metoda jest wydajna w wykrywaniu biomolekuł o niskiej liczności.
- Ma ona istotne znaczenie dla diagnostyki i monitorowania środowiska.
- Protokół jest prosty i może zostać dostosowany do różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda odpowiada na potrzebę bezznacznikowej, wysokoczułej detekcji niskonapięciowych biomarkerów w złożonych matrycach, co stanowi krytyczną lukę w wczesnym etapie walidacji celów oraz opracowywaniu testów. Dzięki połączeniu polimerów z nadrukiem molekularnym z pojemnościowym biosensorem, umożliwia ona kwantyfikację w czasie rzeczywistym bez użycia przeciwciał lub znaczników fluorescencyjnych, co zmniejsza złożoność i koszt analizy. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w procesach detekcji biomarkerów, szczególnie w zastosowaniach wymagających szybkiego przesiewu próbek środowiskowych lub klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednią detekcję niskostężonych biomolekuł w natywnych warunkach próbki.
- Wartość operacyjna: Eliminuje zależność od przeciwciał, co redukuje zmienność i umożliwia powtarzalne badania angażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ilościowe oznaczanie biomarkerów w celu ograniczania ryzyka mechanistycznego i doboru celu w oparciu o hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia bezetykietowe, ilościowe odczyty dla kampanii przesiewowych, w których tradycyjne testy immunoenzymatyczne nie wykazują wystarczającej czułości.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testów poprzez pomiar pojemnościowy, co umożliwia spójną interpretację sygnału pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.
- Skalowalność: Wspiera zastosowanie wielorazowych platform sensorowych po regeneracji, co redukuje koszt pojedynczego testu oraz ilość odpadów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia monitorowanie wahań biomarkerów w systemach istotnych dla przebiegu choroby, od etapu odkrycia po ocenę przedkliniczną.
- Decyzje korygowane o ryzyko: Ilościowe zmiany pojemności korelują z stężeniem celu, co pozwala określić kryteria go/no-go w oparciu o wykrywalne progi.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza obecność celu w złożonych matrycach biologicznych bez artefaktów związanych z znakowaniem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celu po wykrywanie biomarkerów gotowych do analizy, wspierając fazy identyfikacji wiodących związków, w których kluczowe znaczenie mają czułość i swoistość.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez wykrywanie niskostężonych celów w złożonych lizatach lub płynach biologicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników bez użycia znaczników, odpowiednich do pierwotnego przesiewania bibliotek związków pod kątem celów odciśniętych.
- Analityka: Pomiary pojemności zapewniają ilościowe dane w czasie rzeczywistym, pozwalające na porównanie warunków wiązania i obliczenie stężeń celu.
- Badania translacyjne: Wspierają dopasowanie biomarkerów w modelach przedklinicznych poprzez wykrywanie zaangażowania celu w surowicy lub ekstraktach tkankowych.
- Ponowne wykorzystanie w przemyśle: Powierzchnie sensorów mogą być regenerowane i ponownie wykorzystywane, co czyni tę metodę zrównoważoną platformą do powtarzalnego przesiewania biomarkerów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w detekcji biomarkerów poprzez eliminację etapów znakowania, które mogą zmieniać natywne wiązanie.
- Wartość operacyjna: Upraszcza proces badawczy dzięki detekcji bezznakowej i monitorowaniu w czasie rzeczywistym, co skraca czas pracy manualnej oraz liczbę etapów z użyciem odczynników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w walidacji celu poprzez zapewnienie natychmiastowej, ilościowej informacji o obecności celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wykrywalnych zakresów stężeń w złożonych próbkach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu chemii powierzchni, elektropolimeryzacji oraz aparatury biosensorowej.
- Zależy od zintegrowanych z potencjostatem systemów biosensorów pojemnościowych w celu pomiaru i kontroli.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów regeneracji i równoważenia pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do nowych celów wymaga optymalizacji warunków imprintingu (stężenie matrycy, czas polimeryzacji).
- Ograniczenia praktyczne obejmują zabrudzenie powierzchni w próbkach o wysokim stopniu złożoności, co jest niwelowane przez etapy pasywacji tiolami opisane w protokole.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Modification of Glass Cover Slips (Template Stamps)
2:17
Modification of Capacitive Gold Electrodes
3:34
Preparation of Protein-imprinted Capacitive Gold Electrodes
4:54
Real-time Capacitive Measurements with Template-imprinted Capacitive Gold Electrodes
5:39
Results: Detection of Bacteriophage and Protein Binding to Imprinted Gold Electrodes
6:46
Conclusion
