Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

Ogólnym celem tej techniki jest wykrycie i ilościowe określenie biomolekuł o niskiej zawartości w bardzo złożonych próbkach z wysoką czułością, prostotą, niskimi kosztami, szybkością i bez użycia jakiegokolwiek znakowania. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biotechnologii, biochemii i biomedycyny, takie jak monitorowanie środowiska, bezpieczeństwo żywności, jakość wody pitnej i diagnoza medyczna. Główne zalety tej techniki to jej nieodłączna szybkość, prostota, wysoka czułość, niski koszt, łatwa manipulacja i wykrywanie w czasie rzeczywistym bez użycia odczynników do etykietowania.

Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób ze względu na jej zdolność do ilościowego określania biomolekuł o niskiej liczebności. Na przykład różne biomarkery w czasie rzeczywistym. Aby wyczyścić szklane szkiełka nakrywkowe, zanurz je w 10 mililitrach 1,0 molowego HCl na 10 minut w myjce ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej.

Następnie zanurz je w wodzie dejonizowanej i 1,0 molowym wodorotlenku sodu w tych samych warunkach. Osuszyć szklane szkiełka nakrywkowe gazowym azotem. Następnie zanurz czyste i wysuszone szkiełka nakrywkowe w 10 mililitrach roztworu APTES na jedną godzinę, aby wprowadzić grupy aminowe na powierzchnię szkła nakrywkowego w temperaturze pokojowej.

Spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną przed ponownym wysuszeniem azotu. Zanurz zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe APTES w 10 mililitrowym roztworze aldehydu glutarowego na dwie godziny, aby aktywować grupy aminowe na powierzchni w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przepłukać szkiełka nakrywkowe 10-milimolowym buforem fosforanowym w celu usunięcia nadmiaru aldehydu glutarowego z powierzchni.

Osuszyć szkiełka nakrywkowe azotem gazowym. Następnie przygotuj 1,0 mililitra roztworu matrycy w 10-milimolowym buforze fosforanowym w stężeniu 0,1 miligrama na mililitr. Upuść 200 mikrolitrów tego roztworu szablonowego na zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Aby wyczyścić elektrody, najpierw zanurz elektrody w małej zlewce zawierającej pięć mililitrów 70% etanolu na 10 minut w myjce ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej. Następnie kolejno zanurz elektrody w wodzie dejonizowanej, acetonie, wodzie dejonizowanej, kwaśnym roztworze piranii i wodzie dejonizowanej w tych samych warunkach. Osuszyć elektrody gazowym azotem.

Aby przeprowadzić elektropolimeryzację tyraminy, należy przygotować osiem mililitrów 10-milimolowego roztworu tyraminy w 10-milimolowym buforze fosforanowym zawierającym dwa mililitry etanolu. Wykonaj 15 cykli cyklicznych skanów woltamperometrycznych w tym roztworze przy użyciu potencjostatu pokrywającego potencjalny zakres od zera do 1,5 V i szybkość skanowania 50 miliwoltów na sekundę. Następnie przepłucz elektrody wodą dejonizowaną przed wysuszeniem elektrod gazowym azotem.

Zanurzyć elektrody w roztworze zawierającym 30 milimolowy chlorek akryloylu i 30 milimolową trimetyloaminę w toluenie w temperaturze pokojowej przez noc przed ponownym wypłukaniem i wysuszeniem elektrod. Przed polimeryzacją należy przygotować roztwór monimeru zawierający monomery i środek sieciujący w 820 mikrolitrach ultraczystej wody. Następnie przygotuj 5% objętości do objętości TEMED w ultra czystej wodzie.

Dodać 20 mikrolitrów roztworu TEMED do roztworu monomeru i przemywać azotem gazowym przez pięć minut. Następnie dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego APS do roztworu monomeru. Odpipetować 1,5 mikrolitra roztworu monomeru na zmodyfikowaną powierzchnię złotej elektrody.

Teraz rozpocznij polimeryzację, doprowadzając stempel szablonowy do kontaktu z powierzchnią traktowaną monomerem i pozostaw go na pięć godzin w temperaturze pokojowej. Po polimeryzacji należy ostrożnie usunąć stempel wzorcowy z powierzchni za pomocą kleszczy. Następnie przepłucz elektrodę wodą dejonizowaną i osusz gazowym azotem.

Zanurz elektrody w jednym mililitrze dziesięciu milionów jednego dodekanateolu przygotowanego w etanolu na dwadzieścia minut, aby zakryć dziurki na powierzchni elektrody. Na koniec przepłucz elektrody wodą dejonizowaną i osusz elektrody gazowym azotem przed scharakteryzowaniem ich powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Włóż nadrukowane pojemnościowe złote elektrody do elektrochemicznej komórki przepływowej zintegrowanej z pojemnościowym bioczujnikiem.

Przygotuj 100 mililitrów buforu regeneracyjnego i jeden litr buforu do biegania. Rozpocznij analizę od wstrzyknięcia bufora regeneracyjnego w celu regeneracji systemu i uruchomienia buforu w celu przywrócenia równowagi systemu przez 25 minut. Przygotować wzorcowe roztwory matrycowe w żądanym zakresie stężeń w działającym buforze.

Następnie w optymalnych warunkach należy kolejno wstrzyknąć 250 mikrolitrów tych roztworów wzorcowych do systemu. Charakterystyka powierzchni złotych elektrod odbywa się za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Pokazana jest goła złota powierzchnia.

Pokazano również bakteriofagi przylegające do powierzchni elektrody w różnych powiększeniach. Pokazano tutaj połączenie bakteriofaga w czasie rzeczywistym z nadrukowaną złotą elektrodą za pomocą sensogramu. Stabilną linię podstawową ustala się po regeneracji i ponownym zrównoważeniu układu przed wstrzyknięciem próbki.

Na elektrodzie znajdują się wgłębienia specyficzne dla fagów. Wstrzyknięcie bakteriofagów indukujących próbkę powoduje zmniejszenie pojemności, ze względu na wiązanie docelowych bakteriofagów z wdrukowanymi wgłębieniami na powierzchni złotych elektrod. Krzywe kalibracyjne pokazują zmieniającą się pojemność w funkcji wstrzykiwania białka w iniekcji bakteriofagów.

Na podstawie równań na tych wykresach można obliczyć stężenie bakteriofaga lub białka w próbce. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować ultraczuły, szybki i działający w czasie rzeczywistym system wykrywania. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin i trzydziestu minut, z wyłączeniem czasu oczekiwania pomiędzy nimi.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby przygotować wszystkie środki na świeżo, tego samego dnia. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne pomiary, takie jak mikroskopia sił atomowych, elektroniczna mikroskopia skaningowa, elipsomer i pomiary kąta kwantowego, aby określić, czy polimeryzacja lub wdrukowanie powiodły się, oraz wykryć wszelkie znaczące różnice między powierzchniami gołych i odciśniętych złotych elektrod. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biochemii, biotechnologii i biomedycyny do zbadania ultraczułego wykrywania biomolekuły w bezpieczeństwie żywności i diagnostyce medycznej.

Nie zapominaj, że praca z funkcjonalnymi monomerami, sieciownikami, inicjatorami i innymi czynnikami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tych eksperymentów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i przeprowadzanie eksperymentów polimeryzacji wewnątrz dygestorium.