Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie substratów do hodowli tkankowych za pomocą wielu szczotek PEG o mikrowzorze, prezentujących ortogonalne właściwości chemiczne, które umożliwiają przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych. Osiąga się to poprzez osadzanie matryc tiolu acan, inicjatora TRP za pomocą zrobotyzowanego druku mikrokontaktowego na podłożach pokrytych złotem. Jako drugi etap SI, TRP jest wykonywany na podłożach z mikrowzorem, w wyniku czego powstają szczotki PEG z końcowymi grupami bromowymi.

Następnie końcowe grupy bromowe są funkcjonalizowane jedną lub dwiema chemicznymi grupami reaktywnymi, aby umożliwić mobilizację IM odpowiednio przygotowanych ligandów biologicznych. Następnie cały proces powtarza się w celu funkcjonalizacji drugą grupą chemiczną. Wyniki pokazują mikroukłady dwóch ortogonalnie funkcjonalizowanych szczotek PEG nałożonych na siebie z dokładnością do 10 mikronów.

Jest to weryfikowane za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu po koniugacji grup reaktywnych z cząsteczkami fluorescencyjnymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami takimi jak ręczny druk mikrokontaktowy jest to, że zrobotyzowany druk mikrokontaktowy jest w stanie nakładać wiele etapów drukowania z dokładnością do mikronów, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność i projektowanie podłoża. Dokładność zapewniana przez tę metodę, w połączeniu z sekwencyjnymi reakcjami substytucji nukleofilowej, pozwala nam wygenerować substraty do kultur tkankowych, które są funkcjonalizowane wieloma ligandami biologicznymi, które są następnie zdolne do wywierania czasowej i przestrzennej kontroli siarczanu w skali mikronowej.

Przed S-I-A-T-R-P, pokryty złotem slajd okładkowy powinien być wzorowany na stemplu A-P-D-M-S. Ta stosunkowo powszechna procedura jest wyjaśniona w protokole tekstowym. Zacznij od zdjęcia opatentowanego szkiełka pokrywy z robota, zwalniając podciśnienie.

Następnie przenieś go do kolby o długości 50 mililitrów, uszczelnij kolbę i zastosuj ujemne podciśnienie 30 PSI. Następnie dodać 5,5 mililitra mieszaniny reakcyjnej TRP do kolby za pomocą strzykawki, a następnie dodać 0,5 mililitra askorbinianu sodu L do wody, również za pomocą strzykawki. Obserwuj, jak reakcja zmienia kolor z jasnozielonego na ciemnobrązowy.

Pozostawić reakcję do kontynuowania przez 16 godzin w atmosferze gazu obojętnego. Po zakończeniu reakcji zdjąć szkiełko podstawowe i spłukać je etanolem, następnie wodą, a następnie ponownie etanolem. Następnie delikatnie osusz go azotem.

Mikromatryca szczepionych szczotek P-E-G-M-E-M-A powinna być widoczna gołym okiem. Użyj mikroskopii, aby szczegółowo ujawnić te zmiany w funkcjonalności Azad – łańcuchach P-E-G-M-E-M-A. Przenieść szkiełko z wzorem do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodać sześć mililitrów DMF zawierającego 100-milimolowy azydek sodu.

Pozwól reakcji trwać przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz szkiełko patentowe etanolem i wysusz je pod delikatnym strumieniem azotu, aby uspokoić pozostałe łańcuchy P-E-G-M-E-M-A funkcjonalizowane bromem. Przenieś szkiełko zakrywające mikrowzór do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodaj sześć mililitrów DMSO zawierającego 100 milimolową aminę etanolu i 300 milimolową trietyloaminę.

Pozwól, aby ta reakcja postępowała przez 24 godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza następnego dnia. Opłucz szkiełko przykrywkowe etanolem i delikatnie wysusz je pod strumieniem azotu. Następnym krokiem jest powtórzenie drukowania mikrostyków robota za pomocą drugiego stempla PDMS i po stemplowaniu.

Użyj ponownie SI A TRP, aby narysować wykres drugiej szczotki PEG z mikromacierzą. Następnie nadszedł czas na funkcjonalizację acetylenu drugiej mikro macierzy P-E-G-M-E-A łańcuchów Francois. Osłona z mikrowzorem.

Wsunąć do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej z sześcioma mililitrami 100-milimolowej aminy propagującej w DMF. Pozwól reakcji postępować przez 24 godziny. Następnego dnia w temperaturze pokojowej przepłukać szkiełko patentowe etanolem i wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu.

Szkiełko z pokrywą patentową jest wtedy gotowe do uniesienia biotyną. Zacznij od umieszczenia szkiełka z mikro patentową pokrywą w 20-mililitrowej szklanej fiolce reakcyjnej. Po pierwsze, biotyna zjadała łańcuchy zakończone acetylenem.

Dodać sześć mililitrów siarczanu miedzi z koniugatem biotyny azydku PEG four do fiolki reakcyjnej, a następnie 1,2 mililitra 0,15. Milimolowy kwas rbi w wodzie, aby zainicjować reakcję, bąbelkować reakcję azotem przez 10 sekund. Następnie zamknij fiolkę paraformem i pozwól reakcji przejść przez 24 godziny.

Następnego dnia w temperaturze pokojowej opłucz szkiełko nakrywkowe wodą i przenieś je do 12-dołkowego naczynia polistyrenowego. Następnie w temperaturze pokojowej w DPBS z surowicą osła przez godzinę godzinę później, barwienie w grupach unieruchomionych biotyną koniugatem paciorkowca DEIN 5 46 w ilości dwóch mikrogramów na mililitr w barwieniu DPBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej dwie godziny później. Przepłucz szkiełko pokrywy w DPBS pięć razy delikatną roślinnością.

Tobi ITIN aate azi zakończone łańcuchy. Umieść szkiełko nakrywkowe w studzience z sześciodołkową płytą polistyrenową i nałóż dwa mililitry DPBS zawierającego 20 mikromolowych D-B-C-O-P-G czterech biotyny. Następnie inkubować szkiełko przykrywkowe przez 24 godziny w temperaturze pokojowej 24 godziny później.

Opłucz szkiełko pokrywy jak przed czwartą i zabarwij je streptawidyną 4 88. Koniugowany w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w DPBS. Dwie godziny później.

Ponownie opłucz szkiełko podstawowe, a następnie zobrazuj je pod mikroskopem. Korzystanie z tego protokołu drukowania mikrostyków robota. Dokładnie wzorzysty układ szczotki PEG ANN UI z końcowymi grupami alkinowymi został utworzony w oddzielnej tablicy większych szczotek PEG ANN UI z końcowymi grupami azi.

Rozkład przestrzenny grup azydkowych i alkinowych obserwowano za pomocą chemii kliknięć i wiązania streptawidyny w sondach fluorescencyjnych. Nakładka obu kanałów fluorescencyjnych pokazuje, że stemple nie zachodziły na siebie. Dokładność wyrównania obliczono na poziomie poniżej 10 mikronów, co znajduje się na granicy SCAR.

System używany do drukowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować niestandardowe podłoża do kultur tkankowych za pomocą zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego w celu nałożenia wielu układów szczoteczek kołkowych. Funkcjonalizowany za pomocą ortogonalnej chemii.