Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej
October 31st, 2014
Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie substratów do hodowli tkankowych za pomocą wielu szczotek PEG o mikrowzorze, prezentujących ortogonalne właściwości chemiczne, które umożliwiają przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych. Osiąga się to poprzez osadzanie matryc tiolu acan, inicjatora TRP za pomocą zrobotyzowanego druku mikrokontaktowego na podłożach pokrytych złotem. Jako drugi etap SI, TRP jest wykonywany na podłożach z mikrowzorem, w wyniku czego powstają szczotki PEG z końcowymi grupami bromowymi.
Następnie końcowe grupy bromowe są funkcjonalizowane jedną lub dwiema chemicznymi grupami reaktywnymi, aby umożliwić mobilizację IM odpowiednio przygotowanych ligandów biologicznych. Następnie cały proces powtarza się w celu funkcjonalizacji drugą grupą chemiczną. Wyniki pokazują mikroukłady dwóch ortogonalnie funkcjonalizowanych szczotek PEG nałożonych na siebie z dokładnością do 10 mikronów.
Jest to weryfikowane za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu po koniugacji grup reaktywnych z cząsteczkami fluorescencyjnymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami takimi jak ręczny druk mikrokontaktowy jest to, że zrobotyzowany druk mikrokontaktowy jest w stanie nakładać wiele etapów drukowania z dokładnością do mikronów, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność i projektowanie podłoża. Dokładność zapewniana przez tę metodę, w połączeniu z sekwencyjnymi reakcjami substytucji nukleofilowej, pozwala nam wygenerować substraty do kultur tkankowych, które są funkcjonalizowane wieloma ligandami biologicznymi, które są następnie zdolne do wywierania czasowej i przestrzennej kontroli siarczanu w skali mikronowej.
Przed S-I-A-T-R-P, pokryty złotem slajd okładkowy powinien być wzorowany na stemplu A-P-D-M-S. Ta stosunkowo powszechna procedura jest wyjaśniona w protokole tekstowym. Zacznij od zdjęcia opatentowanego szkiełka pokrywy z robota, zwalniając podciśnienie.
Następnie przenieś go do kolby o długości 50 mililitrów, uszczelnij kolbę i zastosuj ujemne podciśnienie 30 PSI. Następnie dodać 5,5 mililitra mieszaniny reakcyjnej TRP do kolby za pomocą strzykawki, a następnie dodać 0,5 mililitra askorbinianu sodu L do wody, również za pomocą strzykawki. Obserwuj, jak reakcja zmienia kolor z jasnozielonego na ciemnobrązowy.
Pozostawić reakcję do kontynuowania przez 16 godzin w atmosferze gazu obojętnego. Po zakończeniu reakcji zdjąć szkiełko podstawowe i spłukać je etanolem, następnie wodą, a następnie ponownie etanolem. Następnie delikatnie osusz go azotem.
Mikromatryca szczepionych szczotek P-E-G-M-E-M-A powinna być widoczna gołym okiem. Użyj mikroskopii, aby szczegółowo ujawnić te zmiany w funkcjonalności Azad – łańcuchach P-E-G-M-E-M-A. Przenieść szkiełko z wzorem do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodać sześć mililitrów DMF zawierającego 100-milimolowy azydek sodu.
Pozwól reakcji trwać przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz szkiełko patentowe etanolem i wysusz je pod delikatnym strumieniem azotu, aby uspokoić pozostałe łańcuchy P-E-G-M-E-M-A funkcjonalizowane bromem. Przenieś szkiełko zakrywające mikrowzór do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodaj sześć mililitrów DMSO zawierającego 100 milimolową aminę etanolu i 300 milimolową trietyloaminę.
Pozwól, aby ta reakcja postępowała przez 24 godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza następnego dnia. Opłucz szkiełko przykrywkowe etanolem i delikatnie wysusz je pod strumieniem azotu. Następnym krokiem jest powtórzenie drukowania mikrostyków robota za pomocą drugiego stempla PDMS i po stemplowaniu.
Użyj ponownie SI A TRP, aby narysować wykres drugiej szczotki PEG z mikromacierzą. Następnie nadszedł czas na funkcjonalizację acetylenu drugiej mikro macierzy P-E-G-M-E-A łańcuchów Francois. Osłona z mikrowzorem.
Wsunąć do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej z sześcioma mililitrami 100-milimolowej aminy propagującej w DMF. Pozwól reakcji postępować przez 24 godziny. Następnego dnia w temperaturze pokojowej przepłukać szkiełko patentowe etanolem i wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu.
Szkiełko z pokrywą patentową jest wtedy gotowe do uniesienia biotyną. Zacznij od umieszczenia szkiełka z mikro patentową pokrywą w 20-mililitrowej szklanej fiolce reakcyjnej. Po pierwsze, biotyna zjadała łańcuchy zakończone acetylenem.
Dodać sześć mililitrów siarczanu miedzi z koniugatem biotyny azydku PEG four do fiolki reakcyjnej, a następnie 1,2 mililitra 0,15. Milimolowy kwas rbi w wodzie, aby zainicjować reakcję, bąbelkować reakcję azotem przez 10 sekund. Następnie zamknij fiolkę paraformem i pozwól reakcji przejść przez 24 godziny.
Następnego dnia w temperaturze pokojowej opłucz szkiełko nakrywkowe wodą i przenieś je do 12-dołkowego naczynia polistyrenowego. Następnie w temperaturze pokojowej w DPBS z surowicą osła przez godzinę godzinę później, barwienie w grupach unieruchomionych biotyną koniugatem paciorkowca DEIN 5 46 w ilości dwóch mikrogramów na mililitr w barwieniu DPBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej dwie godziny później. Przepłucz szkiełko pokrywy w DPBS pięć razy delikatną roślinnością.
Tobi ITIN aate azi zakończone łańcuchy. Umieść szkiełko nakrywkowe w studzience z sześciodołkową płytą polistyrenową i nałóż dwa mililitry DPBS zawierającego 20 mikromolowych D-B-C-O-P-G czterech biotyny. Następnie inkubować szkiełko przykrywkowe przez 24 godziny w temperaturze pokojowej 24 godziny później.
Opłucz szkiełko pokrywy jak przed czwartą i zabarwij je streptawidyną 4 88. Koniugowany w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w DPBS. Dwie godziny później.
Ponownie opłucz szkiełko podstawowe, a następnie zobrazuj je pod mikroskopem. Korzystanie z tego protokołu drukowania mikrostyków robota. Dokładnie wzorzysty układ szczotki PEG ANN UI z końcowymi grupami alkinowymi został utworzony w oddzielnej tablicy większych szczotek PEG ANN UI z końcowymi grupami azi.
Rozkład przestrzenny grup azydkowych i alkinowych obserwowano za pomocą chemii kliknięć i wiązania streptawidyny w sondach fluorescencyjnych. Nakładka obu kanałów fluorescencyjnych pokazuje, że stemple nie zachodziły na siebie. Dokładność wyrównania obliczono na poziomie poniżej 10 mikronów, co znajduje się na granicy SCAR.
System używany do drukowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować niestandardowe podłoża do kultur tkankowych za pomocą zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego w celu nałożenia wielu układów szczoteczek kołkowych. Funkcjonalizowany za pomocą ortogonalnej chemii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje zautomatyzowaną produkcję podłoży do hodowli tkankowej z mikromodelowanymi szczotkami poli(etylenoglikolu) (PEG). Te szczotki prezentują ortogonalne chemie, które ułatwiają przestrzennie precyzyjne i miejscowo specyficzne unieruchomienie ligandów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biomateriały
- Mikrofabrykacja
Tło
- Podłoża do hodowli komórkowej są niezbędne dla zastosowań inżynierii tkankowej.
- Mikromodelowanie pozwala na precyzyjną kontrolę nad prezentacją ligandów.
- Szczotki PEG są wszechstronnym materiałem do funkcjonalizacji.
- Ortogonalne chemie umożliwiają złożone modyfikacje powierzchni.
Cel badania
- Stworzyć podłoża do hodowli tkankowej z wieloma mikromodelowanymi szczotkami PEG.
- Wzmocnić miejscowo specyficzne unieruchomienie ligandów biologicznych.
- Przedstawić automatyzację procesu produkcji.
Zastosowane metody
- Robotyczne drukowanie mikrokontaktowe kan tiolu na powłokach pokrytych złotem.
- Kolejne inicjowane powierzchniowo przeniesienie rodników polimeryzacji atomowej (SI-ATRP) w celu wygenerowania szczotek PEG.
- Funkcjonalizacja końcowych grup bromu z reaktywnymi grupami chemicznymi.
- Powtórzenie procesu w celu osiągnięcia podwójnej funkcjonalizacji.
Główne wyniki
- Udane stworzenie mikrotablicach z dwoma ortogonalnie funkcjonalnymi szczotkami PEG.
- Osiągnięto dokładność nakładania się na poziomie 10 mikrometrów.
- Wykazano wszechstronność w funkcjonalizacji podłoży.
- Umożliwiono przestrzennie precyzyjne unieruchomienie ligandów.
Wnioski
- Metoda pozwala na złożone modyfikacje powierzchni w inżynierii tkankowej.
- Automatyzowane procesy zwiększają powtarzalność i efektywność.
- Potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
