Name: Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania złożonych substratów kulturowych z wieloma mikromacierzami szczoteczek PEG o ortogonalnych chemicznych właściwościach. Technika umożliwia precyzyjne przestrzenne immobilizowanie ligandów biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na tę pracę, GTK, TK i JDM zostały zapewnione przez Wisconsin Institute for Discovery i Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Przygotowanie stempli elastomerowych
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Aby przygotować krzemowe matryce do stempli PDMS, zaprojektuj wzory elementów fotomaski za pomocą oprogramowania wspomaganego komputerowo (CAD).
	<ol>
		<li>Zaprojektuj pierwszy wzór jako macierz 20 x 20 pierścieni o średnicy wewnętrznej (ID) 300 μm i zewnętrznej (OD) 600 μm z odstępem 1 200 μm od środka do środka.</li>
		<li>Zaprojektuj drugi wzór jako macierz 20 x 20 pierścieni o średnicy wewnętrznej (ID) 600 μm i zewnętrznej (OD) 900 μm z odstępem 1 200 μm od środka do środka.</li>
		<li>Dodatkowo umieść kwadratowe znaczniki referencyjne o wymiarach 1 x 1 mm2 we wszystkich czterech rogach każdego projektu macierzy, w odstępie 1 200 μm od środka do środka od narożnego elementu pod kątem 45°.</li>
		<li>Wykonaj krzemowe matryce do użycia w tym eksperymencie z proporcjami aspektowymi 1:1, co odpowiada głębokości elementu 300 μm, stosując standardowe techniki litografii opisane w innym miejscu15 lub we współpracy z odlewnią mikrofluidyczną. 
		UWAGA: Głębokość elementów mniejsza niż 100 μm może prowadzić do nieprawidłowej deformacji stempli przed kontaktem z powierzchniami podłoża. 
		UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że krzemowe matryce z opisanymi wzorami fotorezystu zostały już uzyskane, co wymaga zastosowania specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń typu clean room. W celu stworzenia tych wzorowanych matryc zaleca się konsultację z producentem lub jednostką centralną (core facility).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź silanizację matryc krzemowych przez noc (O/N) poprzez inkubację z oparami (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo) trichlorosilanu. 
	UWAGA: Opary silanu są silnie toksyczne i powinny być obsługiwane wyłącznie w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Stwórz odwrócone repliki matryc krzemowych poprzez utwardzanie mieszaniny prepolimeru PDMS i utwardzacza PDMS w stosunku 10:1 na wierzchu silanizowanych matryc krzemowych w szalce Petri przez noc (O/N) w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Odsuń stemple PDMS od matryc krzemowych i przyklej stemple do podkładek z akrylonitrylo-butadien-styrenu (ABS) lub innych sztywnych materiałów za pomocą kleju. 
	UWAGA: Wybrany materiał nie musi być przezroczysty ani biokompatybilny. Musi on jednak zapewniać płaską powierzchnię do styku z oprzyrządowaniem robotycznym oraz mieć większą sztywność niż PDMS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek zakrywek
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Przepłukać szkiełka nakrywkowe do mikroskopu (24 mm x 50 mm #1) w toluenie, metanolu, a następnie poddać sonikacji w acetonie przez 1 min, po czym przepłukać etanolem i osuszyć delikatnym strumieniem azotu. 
	UWAGA: Toluenem i acetonem należy operować wyłącznie w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Pokryć szkiełka nakrywkowe warstwą tytanu (Ti) o grubości ~3,5 nm, a następnie warstwą złota (Au) o grubości 18,0 nm, używając naparowarki z wiązką elektronową. 
	UWAGA: Procedura ta jest kompatybilna z różnymi podłożami pokrytymi złotem, w tym z krzemem i polistyrenem. Chociaż jest możliwe ich przygotowanie w laboratorium, podłoża pokryte złotem są również dostępne u dostawców komercyjnych. 
	UWAGA: Warstwy Ti powinny mieć grubość co najmniej 3 nm, natomiast warstwy Au na podłożach powinny mieć grubość co najmniej 5 nm i mogą osiągać grubość aż do 1 mm, w zależności od optymalnych właściwości optycznych końcowego podłoża16,17. Podłoża nie muszą być optycznie przejrzyste do procesu wytwarzania, jednak ułatwia to analizę mikroskopową przygotowanych podłoży.</li>
	<li>Przepłukać pokryte złotem szkiełka nakrywkowe etanolem i osuszyć delikatnym strumieniem azotu bezpośrednio przed użyciem.</li>
</ol>
3. R-μCP zewnętrznego pierścienia
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Przed przeprowadzeniem R-μCP z wykorzystaniem systemu z robotycznym ramieniem przegubowym SCARA (selectively compliant articulated robot arm), należy skalibrować efektory narzędziowe robota oraz towarzyszące im systemy kamer stereo za pomocą oprogramowania systemowego. 
	UWAGA: Narzędzia te są przedstawione na Rysunku 1.</li>
</ol>
<img alt="Robotyczny system dozowania cieczy, ustawienie eksperymentalne, precyzyjne pipetowanie dla badań nad automatyzacją laboratoryjną." src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. System R-μCP oraz oprzyrządowanie ramienia robotycznego. (A) Widok ogólny systemu R-μCP ze wszystkimi narzędziami i mocowaniami: (a) uchwyt próżniowy, (b) kąpiel z odczynnikiem, (c) kamera skierowana w dół, (d) uchwyt do gniazdowania stempli, (e) narzędzie robotyczne. (B) Oprzyrządowanie ramienia robotycznego przedstawiające (f) narzędzie do trawienia z diamentową końcówką oraz (g) pneumatyczne narzędzie ssące trzymające (h) stempel PDMS z podkładką z ABS.
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>Ręcznie umieść stempel z PDMS z wypukłymi pierścieniami o średnicy wewnętrznej 600 μm i zewnętrznej 900 μm stroną wypukłą do dołu w uchwycie gniazdowym stempla. Ręcznie umieść świeżo oczyszczoną szkiełko podstawowe pokryte złotem na uchwycie próżniowym, pokazanym na Rysunku 1A, i unieruchom je za pomocą podłączonej pompy próżniowej laboratoryjnej.</li>
	<li>Za pomocą sterowania robotem ustaw kamerę skierowaną w dół nad punktem środkowym szkiełka pokrytego złotem, jak na Rysunku 2A. 
	UWAGA: Punkt ten można początkowo zdefiniować poprzez inspekcję wizualną i nie wymaga on dużej dokładności, ponieważ stempel z PDMS jest znacznie większy niż szkiełko pokryte złotem.</li>
	<li>Poleć ramieniu robota wytrawienie czterech referencyjnych znaków „X” w wierzchołkach kwadratu o wymiarach 3,8 mm na 3,8 mm, wyśrodkowanego na szkiełku pokrytym złotem, przy użyciu narzędzia trawiącego z diamentową końcówką zamocowanego do ramienia robota. (Przedstawiono na Rysunku 2B; PROCES AUTOMATYCZNY) 
	UWAGA: Zapewnia to, że wszystkie cztery znaki referencyjne znajdują się w jednym polu widzenia kamery skierowanej w dół.</li>
	<li>Za pomocą pneumatycznego narzędzia ssącego robota podnieś i utrzymaj stempel z PDMS 1 mm nad uchwytem gniazdowym stempla, jak na Rysunku 2C. (PROCES AUTOMATYCZNY)</li>
	<li>Za pomocą kamery skierowanej w górę i pierścienia oświetlenia LED przedstawionych na Rysunku 2D i E, zwizualizuj kwadratowe znaki referencyjne stempla i zidentyfikuj je za pomocą oprogramowania kamery 10 razy, aby określić średnie przesunięcie X, Y oraz kątowe stempla względem środka osi narzędziowej robota. (PROCES AUTOMATYCZNY)</li>
	<li>Podobnie jak na Rysunku 2A, użyj kamery skierowanej w dół, aby zwizualizować i wykryć wytrawione znaki referencyjne szkiełka 10 razy w celu określenia średnich lokalizacji środków X, Y oraz przesunięcia kątowego szkiełka względem środka osi narzędziowej robota. (PROCES AUTOMATYCZNY). 
	UWAGA: Oprogramowanie systemu robotycznego wykonuje obliczenia wewnętrzne, aby precyzyjnie wyrównać lokalizacje środków X, Y oraz przesunięcia kątowe stempla i szkiełka w przyszłych etapach R-μCP.</li>
	<li>3.8) Umieść stempel w kąpieli inicjatora ATRP alkanotiolu, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (2 mM w etanolu), jak przedstawiono na Rysunku 2F. (PROCES AUTOMATYCZNY)</li>
	<li>Wyjmij stempel z roztworu alkanotiolu i umieść go nad strumieniem azotu pod ciśnieniem 0,48 bar (5 psi), aby odparować etanol, jak na Rysunku 2G. Po 1 min zwiększ ciśnienie strumienia azotu do 1,03 bar (15 psi), aby zapewnić jednolite osuszenie. (PROCES AUTOMATYCZNY) 
	UWAGA: Niepełne osuszenie spowoduje całkowitą lub częściową utratę wierności wzoru.</li>
	<li>Po osuszeniu przesuń stempel nad obliczoną pozycję środkową szkiełka pokrytego złotem i obniżaj go w krokach co 100 μm, monitorując siłę silnika osi Z, jak przedstawiono na Rysunku 2H. 
	UWAGA: Jest to przekazywane jako moment obrotowy działający na silnik osi Z i wyświetlane w oprogramowaniu sterującym robotem. (PROCES AUTOMATYCZNY)</li>
	<li>Przerwij obniżanie stempla po osiągnięciu ustalonego ciśnienia 79,2 kPa i utrzymuj kontakt ze szkiełkiem pokrytym złotem przez 15 s. (PROCES AUTOMATYCZNY) 
	UWAGA: Przedstawione wartości ciśnienia są zoptymalizowane dla obecnej konstrukcji stempla i wysokości cech. Jeśli konstrukcja stempla zostanie zmieniona, szczególnie w przypadku stempli o wysokim stosunku kształtu, należy odpowiednio dostosować te parametry metodą prób i błędów.</li>
	<li>Powoli usuń stempel ze szkiełka pokrytego złotem i umieść go z powrotem w uchwycie gniazdowym stempla. (PROCES AUTOMATYCZNY)</li>
</ol>
4. SI-ATRP PEGMEMA na mikrowzorowanych szkiełkach podstawowych
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Zwolnić podciśnienie utrzymujące mikrowzorcowane szkiełko podstawowe i przenieść je do kolby Schlenka o pojemności 50 ml. Zamknąć i odgazować kolbę Schlenka za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Do kolby Schlenka dodać 5,5 ml mieszaniny reakcyjnej ATRP zawierającej makromonomer PEGMEMA (208,75 mmol), wodę (34,4 ml), metanol (43,8 ml), bromek miedzi(II) (1 mmol) oraz 2’,2-bipyrydynę (3 mmol).</li>
	<li>W celu zainicjowania reakcji dodać 0,5 ml L-ascorbinianu sodu (454,3 mM) w wodzie i pozostawić do przebiegu reakcji przez 16 hr w RT w atmosferze gazu obojętnego. 
	UWAGA: Po dodaniu L-ascorbinianu sodu kolor reakcji zmieni się z jasnzielonego na ciemnobrązowy, jak pokazano na Rysunku 3A-B. 
	UWAGA: Reakcja może być kontynuowana powyżej 16 hr, jednak nie spowoduje to znaczącego zwiększenia długości szczotek PEG.</li>
</ol>
<img alt="Układ reakcji chemicznej, aparat do filtracji próżniowej; zmiana barwy, widoczne wyniki mikromacierzy." src="/files/ftp_upload/52186/52186fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Inicjacja SI-ATRP. (A) Inicjacja reakcji oraz (B) następująca po niej zmiana barwy po dodaniu L-askorbinianu sodu. (C) Obraz mikroskopowy powierzchni szkiełka podstawowego z mikrowzorcem po przeprowadzeniu procedury SI-ATRP. Pasek skali 1 mm.
<ol start="4" style="margin-left: 40px;">
	<li>Wyjmij pokrywkę szkiełka z mikrowzorcem z kolby Schenka, wypłucz etanolem, wodą i ponownie etanolem, a następnie osusz delikatnym strumieniem azotu. 
	UWAGA: Po przeprowadzeniu SI-ATRP modyfikacje powierzchni powinny być widoczne gołym okiem; można je obrazować i analizować pod mikroskopem, jak pokazano na Rysunku 3C. 
	UWAGA: Jest to najprostsza metoda testowania precyzji próby, ponieważ eliminuje konieczność barwienia immunocytochemicznego podłoży.</li>
</ol>
5. Funkcjonalizacja azydowa mikrowzorowanych łańcuchów PEGMEMA
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Umieścić mikrowzorcowane szkiełko podstawowe w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) zawierającego 100 mM azotku sodu. Reakcję prowadzić w temperaturze 37 °C przez 24 hr. 
	UWAGA: DMF należy stosować wyłącznie w dygestorium chemicznym. Należy zachować ostrożność podczas odważania azotku sodu.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu wyjąć mikrowzorcowane szkiełko podstawowe z fiolki reakcyjnej, wypłukać najpierw etanolem, a następnie wodą i osuszyć strumieniem azotu.</li>
</ol>
6. Pasywacja łańcuchów PEGMEMA funkcjonalizowanych bromem
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Umieść mikrowzorcowaną lamellkę w szklanych fiolkach reakcyjnych o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Do fiolki reakcyjnej dodaj 6 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego 100 mM etanolaminy i 300 mM trietyloaminy. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 40 °C przez 24 hr. 
	UWAGA: DMSO, etanolaminą oraz trietyloaminą należy posługiwać się wyłącznie pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji wyjmij mikrowzorcowaną lamellkę z fiolki, wypłucz ją etanolem, a następnie wodą i osusz strumieniem azotu.</li>
</ol>
7. R-μCP wewnętrznego pierścienia oraz SI-ATRP PEGMEMA
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Należy przeprowadzić etapy R-μCP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.2 oraz 3.6 – 3.12, zastępując stempel PDMS stemplem z wystającymi pierścieniami o średnicy wewnętrznej (ID) 300 μm i średnicy zewnętrznej (OD) 600 μm, w taki sposób, aby pierścienie o mniejszych wymiarach zostały umieszczone wewnątrz wcześniej naniesionych mikrostruktur pierścieniowych. 
	UWAGA: Próg ciśnienia dla tego stempla wynosi 132.0 kPa. Jak wspomniano wcześniej, ustawienia ciśnienia są zoptymalizowane pod kątem elementów stempla wykorzystywanych w tym eksperymencie.</li>
	<li>Należy przeprowadzić etapy SI-ATRP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 4.1 – 4.4.</li>
</ol>
8. Funkcjonalizacja acetylenowa mikrowzorowanych łańcuchów PEGMEMA
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Umieścić mikrowzorcowaną szkiełko podstawowe w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml DMSO zawierającego 100 mM propargylaminy. Reakcję prowadzić w RT przez 24 hr. 
	UWAGA: DMSO oraz propargylaminę należy obsługiwać wyłącznie w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Po zakończeniu wyjąć mikrowzorcowaną szkiełko podstawowe z fiolki reakcyjnej, wypłukać etanolem, a następnie wodą i osuszyć strumieniem azotu.</li>
</ol>
9. Biotynilacja łańcuchów PEGMEMA zakończonych acetylenem katalizowana miedzią metodą „Click”
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Umieścić pokrywek ze wzorem mikroskopowym w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml roztworu siarczanu miedzi (15 mM) / Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]aminy (TBTA, 30 mM) (1:1 v/v woda/DMF) zawierającego 562 μM koniugatu azyd-PEG4-Biotyny. Do mieszaniny dodać 1,2 ml kwasu L-askorbinowego (0,15 mM) w wodzie, aby zainicjować reakcję.</li>
	<li>Przez 10 s przepuścić azot przez roztwór reakcyjny, uszczelnić fiolkę Parafilmem i inkubować przez 24 hr w RT.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji wyjąć pokrywek ze wzorem mikroskopowym z fiolki, opłukać wodą i umieścić w polistyrenowej płytce 12-dołkowej.</li>
</ol>
10. Immunofluorescencyjna detekcja biotynylowanych grup acetylenowych
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Blokować mikrowzorowane szkiełko podstawowe w DPBS (3% surowica osła) przez 1 hr w RT. Barwić grupy acetylenowe biotynilowane przy użyciu koniugatu Streptavidyna-546 (2 μg/ml) w DBPS (3% surowica osła w PBS) przez 2 hr w RT.</li>
	<li>Płukać mikrowzorowane szkiełko podstawowe 5 razy w DPBS przez 10 min przy łagodnym mieszaniu. 
	UWAGA: Rysunek 4B przedstawia obraz szkiełka po zakończeniu tego etapu.</li>
</ol>
11. Bezmiedziowa biotynylacja „klikowa” łańcuchów PEGMEMA zakończonych grupą azydkową
UWAGA: Jeśli zajdzie taka potrzeba, ten etap modyfikacji podłoża można przeprowadzić in situ podczas hodowli komórek.
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Po płukaniu w DBPS pozostaw lamellkę z mikrowzorami w polistyrenowej płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Dodaj 2 ml DBPS (lub pożywki hodowlanej) zawierającej 20 μM DBCO-PEG4-Biotin i pozostaw odczynnik do reakcji na 24 hr w RT (lub w 37 °C w inkubatorze).</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji wypłucz lamellkę z mikrowzorami 5 razy w DPBS (lub po prostu wymień pożywkę).</li>
</ol>
12. Detekcja grup azydkowych biotynilowanych metodą immunofluorescencji
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>Barwić grupy azydowe biotynilowane koniugatem Streptavidin-488 (2 μg/ml) w 2 ml DPBS (3% surowica osła) przez 2 hr w RT.</li>
	<li>Płukać mikrowzorowane szkiełko podstawowe 5 razy w DPBS przez 10 min przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Wykonać obrazowanie mikrowzorowanego szkiełka podstawowego przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Rysunek 4A-C przedstawia obrazy szkiełka po zakończeniu tego etapu. 
	UWAGA: W przypadku stosowania podłoży do testów hodowli tkankowych, należy pominąć sekcje 10 i 12 niniejszego protokołu. Po uzyskaniu pożądanego stopnia funkcjonalizacji, wysterylizować zmodyfikowane szkiełko podstawowe, płucząc obie strony 100% etanolem i susząc w strumieniu azotu. Przenieść szkiełko do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i wypłukać szkiełko pięciokrotnie PBS przed przystąpieniem do wysiewania i hodowli komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology%3A+Current+Applications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li>
<li>Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li>
<li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Pursuit+of+Zero%3A+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li>
<li>Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click%E2%80%9D+Chemistry+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Click” Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li>
<li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li>
<li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li>
<li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD%E2%80%94Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li>
<li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li>
<li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Self-Assembled+Monolayers%3A+Efficient%2C+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li>
<li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Fouling%E2%80%9D+Oligo%28ethylene+glycol%29-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li>
<li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li>
<li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).</li>
<li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+robotic+microcontact+printing+%28R-%CE%BCCP%29+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li>
<li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo%28ethylene+glycol%29+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li>
<li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li>
<li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283%2B2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Idealne podłoża dla inżynierii tkankowej byłyby inspirowane biologicznie, a tym samym odzwierciedlałyby rozkład przestrzenny krytycznych bioaktywnych ligandów znajdujących się w tkankach natywnych. Posiadałyby one również dynamiczne właściwości, które umożliwiają czasowe dostosowanie ligandów i wzorców przestrzennych, w których są prezentowane, aby umożliwić ukierunkowaną morfogenezę tkanek i przestrzennie ograniczoną indukcję losu komórki. Wytwarzanie takich substratów wymaga unieruchomienia wielu sygnałów biochemicznyc...

Zdolność powierzchni szczepionych PEG do wyświetlania kowalencyjnie związanych biochemicznych ligandów przy jednoczesnym zachowaniu naturalnych właściwości zapobiegających zarastaniu, czyni je idealnym wyborem do projektowania niestandardowych środowisk mikroskalowych na podłożach hodowlanych1,2,3. Interakcje biospecyficzne, w których pośredniczą sprzężone z ligandami szczotki PEG, umożliwiają redukcjonistyczną analizę wpływu sygnałów biochemicznych znajdujących się w złożonych mikrośrodowiskach tkanek in vivo na poszczególne fenotypy komórek. Co więcej, bioortogonalne chemie "klik" mogą być stosowane w celu ułatwienia kierunkowego unieruchomienia ligandów, tak aby były one prezentowane w natywnych konformacjach4-6. Tak więc przestrzenne wzorce szczotek PEG w mikroskali są wszechstronnym narzędziem do tworzenia designerskich nisz in vitro do badania sygnalizacji komórkowej indukowanej przez unieruchomione sygnały biochemiczne6,7.
Powszechna metoda generowania przestrzennych wzorów sygnałów biochemicznych polega na drukowaniu mikrokontaktowym (μCP) na podłożach pokrytych złotem z wzorami sprzężonych z PEG alkanetioli. Następnie, mikrowzorzyste, samoorganizujące się monowarstwy (SAM) alkanetioli peg-ylowanych ogranicza fizyczną adsorpcję cząsteczek biochemicznych, np. białek, tylko do niewzorzystych regionów substratu8,9. Jednak SAM generowane tą techniką są wrażliwe na utlenianie w długoterminowych pożywkach do hodowli komórkowych. W związku z tym alkanetiotiolowe SAM μCP są często dalej szczepione szczotkami polimerowymi PEG przy użyciu inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (SI-ATRP) w celu zwiększenia stabilności regionu bez zanieczyszczeń10. W szczególności μCP inicjatora polimeryzacji alkanetiolu, bromoizomaślanu ω-meraptoundecylu, na powierzchniach pokrytych złotem, a następnie monomerów SI-ATRP metakrylanu eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (PEGMEMA) generuje powierzchnie z długotrwałymi, stabilnymi i niebrudzącymi szczotkami PEG z mikrowzorami. Co więcej, mogą one być dalej modyfikowane w celu przedstawienia różnych ugrupowań chemicznych11.
Korzystając z tej właściwości, Sha et al. opracowali metodę inżynierii substratów kulturowych za pomocą wieloskładnikowych szczotek PEGMEMA prezentujących ortogonalne "klik" chemii. W tej metodzie wykorzystują serię etapów μCP / SI-ATRP przeplatanych sekwencyjnymi podstawieniami nukleofilowymi azydku sodu, etanoloaminy i propargyloaminy w celu stworzenia substratów hodowlanych prezentujących mikroskalowe wzory wielu immobilizowanych ligandów6. Chociaż potencjał wykorzystania takich substancji chemicznych w połączeniu z ręcznym μCP do inżynierii nowych substratów hodowlanych jest ogromny, jest on ograniczony przez precyzję i dokładność, z jaką można dostosować wiele kroków μCP do jednego podłoża. Do powtarzalnego wytwarzania złożonych nisz in vitro przy użyciu tych wszechstronnych technik wymagany byłby wysoki poziom precyzji i dokładności.
Aby rozwiązać ten problem, wygenerowano kilka zautomatyzowanych i półautomatycznych systemów μCP. Czakra i wsp. opracowano system μCP, w którym niestandardowe stemple są umieszczane na systemie szynowym i doprowadzane do konforemnego kontaktu z pozłacanymi szkiełkami za pomocą sterowanego komputerowo siłownika pneumatycznego. Jednak metoda ta wymaga precyzyjnego wytwarzania niestandardowych projektów stempli i podaje precyzję 10 μm bez raportu o dokładności osiągniętej podczas wykonywania wielu kroków μCP12. Niedawno metoda wykorzystująca zintegrowany system sprzęgania kinematycznego wykazała precyzję poniżej 1 μm przy użyciu pojedynczego wzoru, ale nie była w stanie dokładnie wyrównać wielu wzorów z powodu braku precyzyjnej kontroli cech stempla od formydo formy 13. Ponadto obie poprzednie metody wymagają, aby podłoże pozostało nieruchome między etapami modelowania, co znacznie ogranicza różnorodność chemii modyfikacji powierzchni, które można wykorzystać. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowany system R-μCP zdolny do dokładnego i precyzyjnego wyrównania wielu kroków μCP, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność w projektowaniu i produkcji stempli. Co więcej, wzorzyste podłoża mogą być wielokrotnie usuwane z systemu między tłoczeniami, co pozwala na stosowanie różnych substancji chemicznych modyfikacji substratów, w tym sekwencyjnych podstawień nukleofilowych. Substraty zmodyfikowane przy użyciu takich substancji chemicznych były wcześniej używane do hodowli komórkowych zarówno przez nas6,14, jak i innych7. W związku z tym połączyliśmy R-μCP i sekwencyjne reakcje substytucji nukleofilowej, aby opracować metodę skalowalnej produkcji substratów hodowlanych ze złożonymi i mikrowzorcowymi wskazówkami biochemicznymi.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>W razie potrzeby dostępne są modele z wyższej półki o zwiększonej precyzji.</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>UWAGA, Należy obchodzić się wyłącznie w wyciągu chemicznym. Podczas silanizacji wafli nikt nie powinien wchodzić do okapu, dopóki cały silan nie zostanie odparowany.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Dokładnie odgazuj roztwory poprzez wystawienie na działanie próżni przed użyciem. Dopuszczalne są alternatywne zestawy, takie jak Kit 182.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mm #1</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Można je kupić od wielu dostawców o różnych wymiarach, w zależności od potrzeb.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Parownik wiązki elektronów</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Wymaga specjalistycznego szkolenia.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST&</td><td></td></tr><tr><td>omega;-mertcaptoundecyl bromoisomaslan</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0,2</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Inne inicjatory ATRP mogą być używane jako ten R-&mu; Platforma CP ma zastosowanie do wszystkich modalności mikromodelowania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolba rurkowa Schlenk 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Wymaga gumowych korków z membraną.</td></tr><tr><td>Metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Shipping, zawierający gotowe inhibitory wolne od MEHQ i BHT.</td></tr><tr><td>Metanol (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>UWAGA, należy obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Bromek miedzi(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.</td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.</td></tr><tr><td>N,N-dimetyformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w wyciągach chemicznych.</td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>UWAGA, obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotyna</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilizowany w DMF</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>UWAGA, ogranicz ekspozycję maską chirurgiczną.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Przedmioty zanieczyszczone surowicą osła są uważane za materiał niebezpieczny biologicznie i należy je odpowiednio zutylizować. Różne inne związki (np. BSA) są dostępne i służą temu celowi.</td></tr><tr><td>12-dołkowa płyta polistyrenowa</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Płyty można kupić u wielu dostawców o różnych wymiarach.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotyna</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilizowany w DMF</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 488 Sprużone</td> technologie <td>życia</td><td>S-11223</td><td>Rozpuszczane w PBS</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 546 sprużone</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Rozpuszczone w PBS</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon Nikon Eclipse</td><td></td><td>Ti, A1R</td><td>Mikroskop epifluorescencyjny jest wystarczający do zobrazowania funkcjonalizowanych podłoży mikrowzorcowych.</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (r-μcp) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

W inżynierii tkankowej pożądane jest wykazywanie przestrzennej kontroli morfologii tkanek i losu komórek w hodowli w skali mikronów. Do realizacji tego zadania można wykorzystać substraty hodowlane z szczepionymi szczotkami z poli(glikolu etylenowego) (PEG) poprzez tworzenie mikroskalowych, nieporostowych i odpornych na adhezję komórek regionów, a także regionów, w których komórki uczestniczą w biospecyficznych interakcjach z kowalencyjnie uwiązanymi ligandami. Aby zaprojektować złożone tkanki przy użyciu takich substratów, konieczne będzie sekwencyjne modelowanie wielu szczotek PEG funkcjonalnych w celu nadania zróżnicowanej bioaktywności i ustawionych w orientacjach w mikroskali, które naśladują nisze in vivo. Druk mikrokontaktowy (μCP) jest wszechstronną techniką modelowania takich szczepionych szczotek PEG, ale ręcznego μCP nie można wykonać z precyzją w mikroskali. W związku z tym połączyliśmy zaawansowaną robotykę z technikami miękkiej litografii i pojawiającymi się reakcjami chemii powierzchni, aby opracować metodę wspomaganą przez zrobotyzowany druk mikrokontaktowy (R-μCP) do wytwarzania substratów kulturowych ze złożonymi, mikroskalowymi i wysoce uporządkowanymi wzorami szczotek PEG prezentujących ortogonalną chemię "klik". W tym miejscu szczegółowo opisujemy przebieg produkcji takich podłoży.

Zastosowanie technik manualnego wyrównywania μCP w celu projektowania podłoży hodowlanych z macierzami szczotek z przeszczepionym PEG, funkcjonalizowanych ortogonalną chemią „klik”, zostało wykazane w poprzednich pracach6. Oferuje ono jednak minimalną kontrolę nad orientacją wzoru i często prowadzi do nakładania się obszarów funkcjonalizowanych. W niniejszym opracowaniu zastosowano nowy system R-μCP, aby przezwyciężyć to ograniczenie, oraz wykazano jego zdolność do precyzyjnego tworzenia wzoru macierzy pierści...

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie substratów do hodowli tkankowych za pomocą wielu szczotek PEG o mikrowzorze, prezentujących ortogonalne właściwości chemiczne, które umożliwiają przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych. Osiąga się to poprzez osadzanie matryc tiolu acan, inicjatora TRP za pomocą zrobotyzowanego druku mikrokontaktowego na podłożach pokrytych złotem. Jako drugi etap SI, TRP jest wykonywany na podłożach z mikrowzorem, w wyniku czego powstają szczotki PEG z końcowymi grupami bromowymi.Następnie końcowe grupy bromowe są funkcjonalizowane jedną lub dwiema chemicznymi grupami reaktywnymi, aby umożliwić mobilizację IM odpowiednio przygotowanych ligandów biologicznych. Następnie cały proces powtarza się w celu funkcjonalizacji drugą grupą chemiczną. Wyniki pokazują mikroukłady dwóch ortogonalnie funkcjonalizowanych szczotek PEG nałożonych na siebie z dokładnością do 10 mikronów.Jest to weryfikowane za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu po koniugacji grup reaktywnych z cząsteczkami fluorescencyjnymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami takimi jak ręczny druk mikrokontaktowy jest to, że zrobotyzowany druk mikrokontaktowy jest w stanie nakładać wiele etapów drukowania z dokładnością do mikronów, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność i projektowanie podłoża. Dokładność zapewniana przez tę metodę, w połączeniu z sekwencyjnymi reakcjami substytucji nukleofilowej, pozwala nam wygenerować substraty do kultur tkankowych, które są funkcjonalizowane wieloma ligandami biologicznymi, które są następnie zdolne do wywierania czasowej i przestrzennej kontroli siarczanu w skali mikronowej.Przed S-I-A-T-R-P, pokryty złotem slajd okładkowy powinien być wzorowany na stemplu A-P-D-M-S. Ta stosunkowo powszechna procedura jest wyjaśniona w protokole tekstowym. Zacznij od zdjęcia opatentowanego szkiełka pokrywy z robota, zwalniając podciśnienie.Następnie przenieś go do kolby o długości 50 mililitrów, uszczelnij kolbę i zastosuj ujemne podciśnienie 30 PSI. Następnie dodać 5,5 mililitra mieszaniny reakcyjnej TRP do kolby za pomocą strzykawki, a następnie dodać 0,5 mililitra askorbinianu sodu L do wody, również za pomocą strzykawki. Obserwuj, jak reakcja zmienia kolor z jasnozielonego na ciemnobrązowy.Pozostawić reakcję do kontynuowania przez 16 godzin w atmosferze gazu obojętnego. Po zakończeniu reakcji zdjąć szkiełko podstawowe i spłukać je etanolem, następnie wodą, a następnie ponownie etanolem. Następnie delikatnie osusz go azotem.Mikromatryca szczepionych szczotek P-E-G-M-E-M-A powinna być widoczna gołym okiem. Użyj mikroskopii, aby szczegółowo ujawnić te zmiany w funkcjonalności Azad – łańcuchach P-E-G-M-E-M-A. Przenieść szkiełko z wzorem do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodać sześć mililitrów DMF zawierającego 100-milimolowy azydek sodu.Pozwól reakcji trwać przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz szkiełko patentowe etanolem i wysusz je pod delikatnym strumieniem azotu, aby uspokoić pozostałe łańcuchy P-E-G-M-E-M-A funkcjonalizowane bromem. Przenieś szkiełko zakrywające mikrowzór do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej i dodaj sześć mililitrów DMSO zawierającego 100 milimolową aminę etanolu i 300 milimolową trietyloaminę.Pozwól, aby ta reakcja postępowała przez 24 godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza następnego dnia. Opłucz szkiełko przykrywkowe etanolem i delikatnie wysusz je pod strumieniem azotu. Następnym krokiem jest powtórzenie drukowania mikrostyków robota za pomocą drugiego stempla PDMS i po stemplowaniu.Użyj ponownie SI A TRP, aby narysować wykres drugiej szczotki PEG z mikromacierzą. Następnie nadszedł czas na funkcjonalizację acetylenu drugiej mikro macierzy P-E-G-M-E-A łańcuchów Francois. Osłona z mikrowzorem.Wsunąć do 20-mililitrowej szklanej fiolki reakcyjnej z sześcioma mililitrami 100-milimolowej aminy propagującej w DMF. Pozwól reakcji postępować przez 24 godziny. Następnego dnia w temperaturze pokojowej przepłukać szkiełko patentowe etanolem i wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu.Szkiełko z pokrywą patentową jest wtedy gotowe do uniesienia biotyną. Zacznij od umieszczenia szkiełka z mikro patentową pokrywą w 20-mililitrowej szklanej fiolce reakcyjnej. Po pierwsze, biotyna zjadała łańcuchy zakończone acetylenem.Dodać sześć mililitrów siarczanu miedzi z koniugatem biotyny azydku PEG four do fiolki reakcyjnej, a następnie 1,2 mililitra 0,15. Milimolowy kwas rbi w wodzie, aby zainicjować reakcję, bąbelkować reakcję azotem przez 10 sekund. Następnie zamknij fiolkę paraformem i pozwól reakcji przejść przez 24 godziny.Następnego dnia w temperaturze pokojowej opłucz szkiełko nakrywkowe wodą i przenieś je do 12-dołkowego naczynia polistyrenowego. Następnie w temperaturze pokojowej w DPBS z surowicą osła przez godzinę godzinę później, barwienie w grupach unieruchomionych biotyną koniugatem paciorkowca DEIN 5 46 w ilości dwóch mikrogramów na mililitr w barwieniu DPBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej dwie godziny później. Przepłucz szkiełko pokrywy w DPBS pięć razy delikatną roślinnością.Tobi ITIN aate azi zakończone łańcuchy. Umieść szkiełko nakrywkowe w studzience z sześciodołkową płytą polistyrenową i nałóż dwa mililitry DPBS zawierającego 20 mikromolowych D-B-C-O-P-G czterech biotyny. Następnie inkubować szkiełko przykrywkowe przez 24 godziny w temperaturze pokojowej 24 godziny później.Opłucz szkiełko pokrywy jak przed czwartą i zabarwij je streptawidyną 4 88. Koniugowany w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w DPBS. Dwie godziny później.Ponownie opłucz szkiełko podstawowe, a następnie zobrazuj je pod mikroskopem. Korzystanie z tego protokołu drukowania mikrostyków robota. Dokładnie wzorzysty układ szczotki PEG ANN UI z końcowymi grupami alkinowymi został utworzony w oddzielnej tablicy większych szczotek PEG ANN UI z końcowymi grupami azi.Rozkład przestrzenny grup azydkowych i alkinowych obserwowano za pomocą chemii kliknięć i wiązania streptawidyny w sondach fluorescencyjnych. Nakładka obu kanałów fluorescencyjnych pokazuje, że stemple nie zachodziły na siebie. Dokładność wyrównania obliczono na poziomie poniżej 10 mikronów, co znajduje się na granicy SCAR.System używany do drukowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować niestandardowe podłoża do kultur tkankowych za pomocą zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego w celu nałożenia wielu układów szczoteczek kołkowych. Funkcjonalizowany za pomocą ortogonalnej chemii.

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Białko związane z CRISPR, Cpf1, może być prowadzone przez specjalnie zaprojektowane RNA CRISPR (crRNA) do rozszczepiania dwuniciowego DNA w pożądanych miejscach, generując lepkie końce. Na podstawie tej cechy ustalono standard składania DNA (C-Brick), a protokół szczegółowo opisujący jego użycie opisano tutaj.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Poznaj metodę wytwarzania złożonych substratów kulturowych z wieloma mikromacierzami szczoteczek PEG o ortogonalnych chemicznych właściwościach. Technika umożliwia precyzyjne przestrzenne immobilizowanie ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Przeglądaj więcej filmów