Name: Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj druk 3D dwufotonową polimeryzację do tworzenia mikroskalowych urządzeń PDMS dla hodowli neuronów szczurzych. Ta metoda umożliwia badanie modułowych sieci neuronowych in vitro przy użyciu elektrofizjologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.G. dziękuje za wsparcie finansowe z Programu Ramowego Unii Europejskiej H2020 za pośrednictwem Europejskiej Rady ds. Innowacji (projekt IN-FET, GA n. 862882, projekt Arbor-IO, FLAG-ERA i Human Brain Project, ID 650003) oraz od SISSA (Obszar Neuronauki). G.N. dziękuje za wsparcie finansowe od włoskiego Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MUR) poprzez grant Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Obszar Matematyki). Dziękujemy M. Gigante, B. Pastore i M. Grandolfo za ich pomoc w druku 3D, hodowli komórek i obrazowaniu na żywo, a także dr P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente i H.C. Schultheiss za dyskusje. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z prawem europejskim i włoskim (dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22 września 2010 r. [2010/63/UE]; Dekret rządu włoskiego z dnia 4 marca 2014 r., nr 26), zostały wyraźnie zatwierdzone przez instytucjonalny OpBA (Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami) w Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati i zostały oficjalnie zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Doprowadziło to do udostępnienia materiału niezdolnego do odczuwania z eksplantowanej tkanki mózgowej szczura, który można wykorzystać do eksperymentalnej walidacji metody przedstawionej w tej pracy.
1. 3D wytwarzanie form metodą polimeryzacji dwufotonowej
<ol>
	<li>Generowanie plików CAD 
	UWAGA: Poniższe kroki demonstrują ogólny proces projektowania 3D z wykorzystaniem oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (tj. SolidWorks). Przykładowy plik projektowy STL opisany w tej pracy (Rysunek 2) jest dostępny jako Dodatkowy Plik Kodowania 1, a także za pośrednictwem Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
	<ol>
		<li>Uruchom aplikację komputerową do projektowania wspomaganego komputerowo. Na górnym pasku menu wybierz pozycję Nowy.</li>
		<li>Z opcji wybierz opcję Część: reprezentacja 3D pojedynczego komponentu projektu. Naciśnij kombinację Ctrl + 5, aby ustalić widok szkicu z góry.</li>
		<li>Na panelu bocznym wybierz opcję Szkic i wybierz opcję Prostokąt narożny. Wybierz jedną krawędź prostokąta, klikając na nią. Gdy pojawi się panel parametrów, ustaw długość na 100 jednostek.</li>
		<li>Powtórz krok 1.1.3 dla krawędzi prostopadłej do poprzedniej: ustaw jej długość na 50 jednostek. Zaznacz prostokąt, przeciągając nad nim, przytrzymując lewy przycisk myszy.</li>
		<li>Z menu Dodaj relację wybierz opcję Napraw, aby ograniczyć relacje między liniami.</li>
		<li>Zamknij szkic i powtórz kroki od 1.1.3 do 1.1.5, tworząc nowy (mniejszy) prostokąt, nakładający się na poprzedni szkic.</li>
		<li>Na panelu bocznym wybierz Operacje, a następnie wybierz Wyciągnięte dośrodkowanie/podstawę: ustaw głębokość zarówno dużego, jak i małego prostokąta odpowiednio na 5 i 10 jednostek.</li>
		<li>Z menu Plik zapisz część w formacie STL (tj. Standardowy język teselacji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie plików CAD
	<ol>
		<li>Przenieś plik STL na komputer osobisty, wyposażony w oprogramowanie użytkowe DeScribe.</li>
		<li>Uruchom Describe i z menu Plik otwórz plik STL. Pojawi się reprezentacja 3D modelu.</li>
		<li>W sekcji orientacji w menu po prawej stronie obróć model, aby odpowiednio zorientować go w przestrzeni, i wyśrodkuj go w płaszczyźnie.</li>
		<li>Dostosuj ogólne skalowanie, wybierając sekcję Skalowanie w menu po prawej stronie.</li>
		<li>Z menu rozwijanego u góry wybierz przepis IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Określa to IP-S jako fotorezystor, 25-krotne jako moc powiększenia obiektywu, podłoże pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) jako podłoże do drukowania, a drukowanie w powłokach i rusztowaniach jako tryb pracy z funkcjami średniej wielkości (MF).</li>
		<li>Poruszaj się po kreatorze, wybierając i ustawiając Odległość cięcia na 1 μm i Odległość kreskowania na 0,5 μm zarówno dla powłoki, jak i rusztowania.</li>
		<li>W kroku wyjściowym kreatora importu, w sekcji dzielenia, zdefiniuj rozmiar bloku jako X = 200 μm, Y = 200 μm i Z = 265 μm, a przesunięcie bloku jako X = 133 μm, Y = 133 μm i Z = 0, upewniając się, że linie zszywania nie mają wpływu na delikatne struktury mikrokanałów.</li>
		<li>W trybie skanowania użyj domyślnego: Galvo dla płaszczyzny X-Y i Piezo dla osi Z.</li>
		<li>Naciśnij Zapisz i w następnym menu tekstowym zamień linię var $baseLaserPower = $shellLaserPower na var $baseLaserPower = 75, aby zmniejszyć do 75% moc lasera na najniższej warstwie wydruku.</li>
		<li>Przenieś pliki GWL uzyskane w powyższych krokach na stację roboczą dedykowaną do druku 3D 2PP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Druk 3D i opracowywanie próbek
	<ol>
		<li>Uruchom aplikację NanoWrite. Po inicjalizacji drukarki kliknij Exchange Holder w interfejsie oprogramowania, aby włożyć uchwyt podłoża i zamontować obiektyw.</li>
		<li>Zamontuj obiektyw 25x w odpowiedniej pozycji na końcówce. Zidentyfikuj, która strona szklanego podłoża jest pokryta ITO, za pomocą elektronicznego multimetru ustawionego do pomiaru rezystancji: odczyt powinien być niski, taki jak 100-300 Ω, ale tylko dla strony pokrytej ITO.</li>
		<li>Umieść szklane podłoże na uchwycie, kierując stronę pokrytą powłoką ITO do góry. Użyj taśmy, aby mocno przytrzymać go na miejscu.</li>
		<li>Pod okapem oparów chemicznych nałóż kroplę fotorezystu IP-S na środek szklanego podłoża.</li>
		<li>Włóż uchwyt do drukarki 3D, kroplą żywicy skierowaną w stronę obiektywu (tj. w dół).</li>
		<li>Za pomocą menu Plik oprogramowania załaduj pliki GWL. Wybierz opcję Approach Sample (Podejdź do próbki), aby przesunąć obiektyw w pobliże kropli żywicy.</li>
		<li>Wybierz opcję Znajdź interfejs, aby umożliwić wykrywanie interfejsu drukowania ITO-fotorezystor na podstawie różnicy współczynnika załamania światła dwóch materiałów.</li>
		<li>Wybierz opcję Start Job (Rozpocznij zadanie), aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania naciśnij przycisk Exchange Holder, aby odzyskać uchwyt.</li>
		<li>Wyjmij uchwyt i delikatnie usuń podłoże z częścią drukowaną. Zanurz szklane podłoże w octanie eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 20 minut pod wyciągiem, aby rozwinąć wydrukowaną część.</li>
		<li>Usuń podłoże z PGMEA i zanurz je w izopropanolu na 5 minut. Pozostaw wydrukowaną część do wyschnięcia na powietrzu, pod okapem oparów chemicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka po wydruku i montaż formy
	<ol>
		<li>Utwardź wydrukowaną część przez wystawienie na działanie światła UV (tj. 365-405 nm) z wystarczającą mocą przez 5-20 minut (szczegóły dotyczące mocy znajdują się w Dyskusji).</li>
		<li>Pod pokrywą z przepływem laminarnym delikatnie wyjmij wydrukowaną część ze szklanego podłoża. Upuść ~2 μL żywicy na dno szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>Ostrożnie umieść wydrukowaną część nad kroplą i pozwól, aby żywica przepłynęła pod częścią. Następnie utwardź wydrukowaną część poprzez wystawienie jej na działanie światła UV przez 5 minut.</li>
		<li>Przykryj szalkę Petriego nakrętką i przenieś ją do piekarnika w celu utwardzenia termicznego przez 30 minut w temperaturze 80 °C. Nie podgrzewaj piekarnika, aby uniknąć deformacji lub pęknięcia części drukowanej. Po utwardzeniu wydrukowana część zostanie na stałe przymocowana do dna szalki Petriego. Od tej pory wydrukowana i zamontowana część będzie określana jako forma.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie urządzeń PDMS z form i substratów do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Produkcja urządzeń PDMS
	<ol>
		<li>Przygotować 20 ml mieszaniny 10:1 (stosunek wagowy) bazy iutwardzacza niespolimeryzowanego PDMS. Dla każdego urządzenia i w zależności od jego wymaganej wysokości wystarczy 1-2 ml mieszaniny PDMS. Nadmiar niespolimeryzowanego PDMS należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
		<li>Pod okapem z przepływem laminarnym dokładnie mieszaj mieszaninę przez 4 minuty. Ponieważ mieszanina równomiernie zatrzymuje pęcherzyki powietrza, stanie się nieprzezroczysta.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do probówki μtube o pojemności 50 μl i odwirować ją przy 168 x g przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszaniny i uzyskać klarowny wygląd.</li>
		<li>Potraktuj formę 10 μl środka hydrofobicznego (tj. Repel-silane ES) i pozwól jej odpocząć przez 7 minut, zapewniając późniejsze płynne oderwanie spolimeryzowanego PDMS od formy.</li>
		<li>Przepłucz formę 1x 70% etanolem i 2x wodą dejonizowaną (DI). Pozostaw formę do wyschnięcia na powietrzu pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Delikatnie wylej mieszaninę PDMS na formę, aż do osiągnięcia zamierzonej ostatecznej wysokości urządzenia. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza, mieszaninę należy wlać delikatnie i z bliskiej odległości do powierzchni formy.</li>
		<li>Przykryj formę i przenieś ją na 18 minut do piekarnika, który został wstępnie nagrzany i ustabilizowany w temperaturze 80 °C, w celu utwardzenia. W przypadku urządzeń o wysokości większej niż 5 mm i do 1 cm należy wydłużyć czas utwardzania z 18 do 25 minut.</li>
		<li>Pod okapem z przepływem laminarnym delikatnie oderwij utwardzony blok PDMS od formy i zanurz go w izopropanolu na co najmniej 10 minut, wewnątrz szklanej szalki Petriego. Izopropanol eliminuje nieusieciowany PDMS. Zawsze utrzymuj blok PDMS zakryty.</li>
		<li>Odnów izopropanol i pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie wytnij centralną kwadratową część urządzenia (zidentyfikowaną jako obszar docelowy w tej pracy) za pomocą noża okulistycznego. Następnie przystąp do dalszego cięcia wzdłuż krawędzi, aby uzyskać ostateczny kształt urządzenia.</li>
		<li>Wyjmij urządzenie z izopropanolu i zanurz je w etanolu na 30 min, a następnie przepłucz 3x sterylną wodą DI. Od tego momentu należy zachować sterylność.</li>
		<li>Pod okapem z przepływem laminarnym przenieś urządzenie na nową szalkę Petriego, pozostawiając jego nasadkę lekko uchyloną. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż urządzenia i przygotowanie substratów do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj każdą matrycę mikroelektrod (MEA), zanurzając ją w 70% etanolu na 30 minut, a następnie przepłucz ją 3x sterylną wodą DI.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej cienkiej pęsety, pod osłoną z przepływem laminarnym i mikroskopem stereoskopowym, zamontuj urządzenie PDMS na wewnętrznej powierzchni MEA. Wyrównaj jedną stronę urządzenia PDMS do środka wewnętrznego obszaru MEA, wyposażonego w mikroelektrody zintegrowane z podłożem, tak aby niewiele mikroelektrod pozostało odsłoniętych zarówno z obszaru źródłowego, jak i docelowego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Do tej pracy nie jest konieczne dopasowywanie mikroelektrod MEA do mikrokanału urządzenia PDMS. Delikatne naciśnięcie urządzenia może być wymagane w celu uzyskania szczelnego uszczelnienia między urządzeniem PDMS a powierzchnią MEA. Za wszelką cenę unikaj dotykania mikroelektrod końcówką pęsety.</li>
		<li>Włóż MEA z urządzeniem PDMS do komory czyszczenia plazmowego, aby aktywować aktywację powierzchniową za pomocą plazmy powietrznej. Rozpocznij proces od 4-minutowego opróżnienia komory pompą próżniową. Następnie lekko otwórz zawór powietrza, aby umożliwić kontrolowane odpowietrzanie. Zamknij zawór powietrza i włącz induktory plazmowe, regulując poziom mocy RF w zakresie od 10 W do 18 W.</li>
		<li>Gdy pojawi się świecące światło, pozwól procesowi działać przez 80 sekund. Następnie wyłącz induktor plazmowy, zamknij zawór pompy próżniowej i delikatnie otwórz zawór powietrza. Otwórz komorę, aby pobrać MEA. 
		UWAGA: Jeśli obróbka plazmowa polega na wystawieniu MEA na działanie niesterylnego środowiska, umieść każdy MEA pod światłem UV w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut, aby zapewnić sterylność.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu polietylenoiminy (PEI) o stężeniu 0,1% wag./obj. do MEA i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Odessać roztwór PEI i spłukać sterylną wodą DI 5x. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowej do MEA i inkubować ją przed wysiewem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla komórek neuronalnych i elektrofizjologia
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej pożywkę do preparacji, roztwór do wytrawiania i roztwory 1-3 (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Zdysocjowana hodowla komórek nerwowych.
	<ol>
		<li>Delikatnie chwyć za pysk nowonarodzonego szczeniaka szczura rasy Wistar w wieku 0-1 dni i wykonaj szybką dekapitację za pomocą ostrych nożyczek.</li>
		<li>Zdejmij skórę głowy, wykonaj nacięcie wzdłuż strzałkowej linii środkowej czaszki za pomocą cienkich nożyczek, a następnie wykonaj nacięcie koronalne przez czaszkę na styku móżdżku</li>.
		<li>Usunąć czaszkę, wyjąć mózg cienką szpatułką i przenieść go do zimnego (4 °C) podłoża preparacyjnego.</li>
		<li>Usuń tkankę podkorową, hipokamp i opony mózgowe. Zmielić tkankę na małe kawałki (tj. 1-2 mm3) i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Wyrzucić roztwór i wypłukać tkankę za pomocą świeżego podłoża preparacyjnego, a następnie przepłukać pożywką wytrawiającą.</li>
		<li>Odrzucić pożywkę wytrawiającą, a następnie dodać 1 ml roztworu 1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odrzucić roztwór 1 i spłukać tkankę świeżym podłożem preparacyjnym. Następnie dodać 1 ml roztworu 2 i przechowywać mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić roztwór 2 i opłukać tkankę świeżym podłożem preparacyjnym. Następnie dodaj 1 ml roztworu 3. Mechanicznie rozdzielić komórki, powoli pipetując roztwór w górę iw dół od 20 do 30 razy. Gdy pojawi się jednolicie mętna mieszanina zdysocjowanych komórek, zwiększ jej objętość do 3 ml, dodając pożywkę do rozwarstwienia.</li>
		<li>Zebrać osad komórkowy, odwirowując mieszaninę przy 100 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Policz komórki (tj. za pomocą komory do zliczania komórek) i odpowiednio dostosuj gęstość roztworu do wysiewu komórek.</li>
		<li>Zasiać każdy MEA 1 ml roztworu wysiewającego o nominalnej gęstości komórek 1,8 x 106 (~ 6500 komórek/mm2). Inkubować wysiane MEA w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę na świeżą (tj. cotygodniową) pożywkę hodowlaną co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa 
	UWAGA: Zdysocjowane hodowle komórek nerwowych osiągają w pełni dojrzały fenotyp elektryczny po 2-3 tygodniach in vitro. Poniższe sekcje opisują protokół stymulacji zewnątrzkomórkowej przy użyciu komercyjnego oprogramowania aplikacyjnego MEA (Experimenter) do elektrycznej stymulacji jednej z populacji neuronów hodowanych w modułach, tj. Source lub Target, przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności obu populacji w dojrzałych sieciach.
	<ol>
		<li>Delikatnie zamontuj jeden MEA wewnątrz stopnia głównego wielokanałowego wzmacniacza elektronicznego, w suchym inkubatorze (37 °C, 5% CO2) i pozwól mu się pomieścić przez 10 minut. Niestandardowa nasadka PDMS może być wytwarzana osobno i używana jako szczelna osłona dla każdego MEA, aby zmniejszyć parowanie wody i zachować sterylność.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie Experimenter. Ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kHz i rozpocznij akwizycję danych, naciskając Start DAQ. W panelu Wyświetlanie danych pojawiają się nieprzetworzone ślady aktywności zarejestrowanej poza siecią komórkową dla każdego kanału.</li>
		<li>Monitoruj spontaniczną aktywność oraz wizualnie identyfikuj i wybieraj 3 pary sąsiednich mikroelektrod, które są aktywne podczas impulsów spontanicznych zsynchronizowanych impulsów aktywności w całej sieci, zarówno z mikroelektrod po stronie źródłowej, jak i docelowej.</li>
		<li>W panelu stymulatora oprogramowania skonfiguruj parametry dla każdej z par mikroelektrod stymulujących w konfiguracji bipolarnej: wybierz dwufazowy przebieg impulsu i ustaw amplitudy pików na ± 800 mV, a czas trwania impulsu na 200 μs.</li>
		<li>Ustaw rejestrator i nagrywaj na okres 300 ms przed do 1000 ms po stymulacji.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.3.3 do 3.3.5 dla strony źródłowej i docelowej z przeplotem dla wymaganej liczby powtórzeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Applications of 3D-Printing for Micro-Scale Neuronal Cell Culture Devices

<ol><li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front Neuroeng. 4, 13(2011).</li>
<li>Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+generation+and+propagation+of+synchronized+bursting+in+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).</li>
<li>Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+neural+networks+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Inst+Electr+Electron+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing neural networks in culture.</a> Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).</li>
<li>DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+propagation+of+temporal+and+rate+information+between+cortical+populations+during+coherent+activation+in+engineered+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks.</a> Front Neural Circuits. 10, 32(2016).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J Neural Eng. 9 (3), 036010(2012).</li>
<li>Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionality+shapes+the+dynamics+of+cortical+interconnected+to+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks.</a> J Neural Eng. 15 (5), 056044(2020).</li>
<li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PLoS One. 9 (9), e107400(2014).</li>
<li>Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Neural circuits on a chip.</a> Micromachines. 7 (9), 157(2016).</li>
<li>Aebersold, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BBrains+on+a+chip%26%2334%3B%3A+Towards+engineered+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Tren+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">34;Brains on a chip&#34;: Towards engineered neural networks.</a> TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).</li>
<li>Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complexity+emerging+from+anatomical+constraints+in+the+brain%3A+The+significance+of+network+modularity+and+rich-clubs%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs.</a> Sci Rep. 6, 38424(2016).</li>
<li>Eytan, D., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+effective+topology+underlying+synchronization+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).</li>
<li>Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potential+activity+in+a+predefined+microtunnel+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046031(2011).</li>
<li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+corticostriatal+network+on-a-chip+reveals+the+contribution+of+the+presynaptic+compartment+to+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease.</a> Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).</li>
<li>Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+outgrowth+of+dissociated+neurons+on+patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates.</a> J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).</li>
<li>Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+micropatterned+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks.</a> Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).</li>
<li>Staii, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+and+guidance+of+neurons+on+gold+surfaces+by+directed+assembly+of+proteins+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy.</a> Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).</li>
<li>Fricke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+rat+cortical+neurons+by+microcontact+printed+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients.</a> Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).</li>
<li>Gladkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cultured+neuron+networks+in+vitro+with+predefined+connectivity+using+asymmetric+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels.</a> Sci Rep. 7 (1), 15625(2017).</li>
<li>le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barbed+channels+enhance+unidirectional+connectivity+between+neuronal+networks+cultured+on+multi+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays.</a> Front Neurosci. 9, 412(2015).</li>
<li>Peyrin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+diodes+for+the+reconstruction+of+oriented+neuronal+networks+in+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers.</a> Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+Spec+Top%22%5BJournal%5D)">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> J Vis Exp. (119), e55276(2017).</li>
<li>Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+custom+microfluidic+devices+for+research+and+educational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications.</a> J Vis Exp. (153), e60307(2019).</li>
<li>Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfabrication+with+two-photon-absorbed+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization.</a> Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).</li>
<li>Baldacchini, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaldacchini%2C+T+%22Three-dimensional+microfabrication+using+two-photon+polymerization%3A+Fundamentals%2C+technology%2C+and+applications%22">Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications</a>. , Elsevier. (2015).</li>
<li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadou%2C+MJ+%22Fundamentals+of+Microfabrication%22">Fundamentals of Microfabrication</a>. , CRC Press. (2018).</li>
<li>Sun, H. B., Kawata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+photopolymerization+and+3D+lithographic+microfabrication%5BTitle%5D)+AND+%22NMR%2C+3D+Anal%2C+Photopolymeriz.+Adv+Poly+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication.</a> NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+Lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+periodic+synchronized+bursting+during+formation+of+mature+patterns+of+connections+in+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures.</a> Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs).</a> J Vis Exp. (39), e2056(2010).</li>
<li>Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QSPIKE+tools%3A+A+generic+framework+for+parallel+batch+preprocessing+of+extracellular+neuronal+signals+recorded+by+substrate+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays.</a> Front Neuroinform. 8, 26(2014).</li>
<li>Pulizzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+wide-field+photostimuli+evoke+and+modulate+oscillatory+reverberating+activity+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks.</a> Sci Rep. 6 (1), 24701(2016).</li>
<li>Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+impact+of+electrical+stimulation+temporal+distribution+on+cortical+network+responses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses.</a> BMC Neurosci. 18 (1), 49(2017).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+replication+of+polymeric+and+metallic+high+aspect+ratio+microstructures+using+PDMS+and+liga+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+Technologies%22%5BJournal%5D)">Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology.</a> Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).</li>
<li>Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+multiphoton+absorption+polymerization%3A+Fabrication+of+microfluidic+channels+with+arbitrary+cross-sections+and+high+aspect+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios.</a> Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).</li>
<li>Bunea, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Micro+3D+printing+by+two-photon+polymerization%3A+Configurations+and+parameters+for+the+nanoscribe+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micro%22%5BJournal%5D)">et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system.</a> Micro. 1 (2), 164-180 (2021).</li>
<li>Taylor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
<li>Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-print+UV+curing+method+for+improving+the+mechanical+properties+of+prototypes+derived+from+two-photon+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography.</a> Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).</li>
<li>Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochip%2Flaser+cell+deposition+system+to+assess+polarized+axonal+growth+from+single+neurons+and+neuron%2Fglia+pairs+in+microchannels+with+novel+asymmetrical+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 13408(2011).</li>
<li>Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+PDMS+shrinkage+when+replicating+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures.</a> J Micromech Microeng. 24 (12), 127002(2014).</li>
<li>Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+lab-on-a-chip+fabrication+using+3D+printed+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates.</a> Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).</li>
<li>Chan, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((one-step+molding+of+3D-printed+structures+for+convenient+fabrication+of+truly+3D+PDMS+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips.</a> Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo dziesięcioleci, zastosowanie technologii 2PP w formowaniu replik na podstawie PDMS w skali mikrometrycznej jest niedawnym osiągnięciem43,44. W tym kontekście, poniżej omówiono szereg punktów, które mają pomóc użytkownikom w skutecznym odtworzeniu tego dzieła.
W przypadku projektowania modelu 3D upewnij się, że model nie ma otworów ani samoprzecięć. Uprzywilejuj format pliku binarnego podczas zapisywania jako STL, ze względu na mniejszy rozmiar pliku niż w przypadku pliku zakodowanego w formacie ASCII. Jest to szczególnie korzystne w przypadku projektów o skomplikowanej geometrii i obiektów o szerokości mililitrów. Korzystanie z binarnych plików STL wiąże się również z niskim obciążeniem procesora, co w późniejszym okresie procesu wymaga przygotowania części mechanicznej do druku 3D. Fizyczne wymiary elementów w pliku STL są reprezentowane w jednostkach bezwymiarowych. Podczas przetwarzania końcowego pliku STL jednostki są interpretowane jako mikrometry. Dlatego zaleca się, aby przy sporządzaniu pliku z góry przyjąć jednostkę zainteresowania, tj. mikrometr. Dokładność drukowanego modelu jest określana przez liczbę powierzchni aproksymujących mozaikowe trójkąty. W przypadku niewystarczającej liczby powierzchni pojawi się niepożądana chropowatość powierzchni. Niemniej jednak dążenie do zbyt dużej dokładności przez bardzo dużą liczbę powierzchni odbywa się kosztem dużego obciążenia obliczeniowego, co powoduje powolne przetwarzanie plików.
W przypadku druku 3D, podczas drukowania, fizyczny obiekt 3D jest formowany za pomocą szybkiego skanowania galvo w płaszczyźnie x-y i ruchu piezoelektrycznego w kierunku z. Powoduje to skupienie wiązki lasera femtosekundowego w obrębie dowolnego woksela 3D. Jeśli jednak struktury drukarskie są większe niż zakresy pokrycia przestrzennego galvo i piezo, obiekt musi zostać programowo podzielony na bloki. Chociaż jest to wymóg w przypadku części drukowanych o rozmiarach milimetrowych, połączenia między blokami są związane z (niedoskonałymi) liniami zszywania. Staranna optymalizacja liczby bloków i rozmieszczenie linii zszywania w kierunkach x, y i z ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zakłócenia krytycznych cech geometrycznych końcowego obiektu liniami zszywania. Pęcherzyki mogą tworzyć się na interfejsie drukowania z różnych powodów (np. podłoża, zanieczyszczenia i niejednorodności fotorezystu) i negatywnie wpływać na jakość i integralność drukowanej struktury. Co więcej, wyższa moc lasera może prowadzić do zwiększenia ich występowania. Zmniejszenie mocy lasera na najniższej warstwie drukowanej części zminimalizuje ryzyko tworzenia się pęcherzyków. Jako alternatywę dla drukowania całej części jako konstrukcji bryłowej można rozważyć metodę skorupowo-rusztowania. Polega ona na wydrukowaniu jedynie zewnętrznej powierzchni części (powłoki) oraz znajdujących się w jej obrębie trójkątnych elementów pryzmatycznych. Elementy te są oddzielone poziomymi warstwami (rusztowaniami), utrzymującymi niespolimeryzowaną żywicę w małych kieszeniach. Metoda ta znacznie skraca czas drukowania, co ma znaczenie zwłaszcza w przypadku konstrukcji o rozmiarach milimetrowych. Jednakże, ponieważ pozostaje żywica niespolimeryzowana, ekspozycja na promieniowanie UV po wydrukowaniu jest konieczna, aby zapewnić pełną stabilność mechaniczną, chociaż ten krok należy wykonać delikatnie, aby uniknąć deformacji drukowanej części. Czas utwardzania zależy od wybranej żywicy, grubości części i mocy UV40. W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się przeprowadzenie wstępnej próby w celu oszacowania czasu potrzebnego do utwardzenia na pełnej głębokości, przy użyciu kropli fotorezystu i oceny jej przekroju, po ekspozycji na promieniowanie UV. Zwykle czas utwardzania wynosi od 5 do 20 minut.
W przypadku formowania replik PDMS, czysta produkcja urządzenia PDMS z funkcjami skali mikrometrycznej, bez urządzeń w pomieszczeniach czystych, może być wyzwaniem: mikrocząsteczki unoszące się w powietrzu mogą znajdować się na wysoce przyczepnej powierzchni PDMS i utrudniać uszczelnienie między urządzeniem a podłożem lub blokować przekrój poszczególnych mikrokanałów. Wykonywanie kroków protokołu pod okapem z przepływem laminarnym i konsekwentne osłanianie powierzchni PDMS izopropanolem znacznie minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia. Temperatura utwardzania i czas jego trwania mają bezpośredni wpływ na sieciowanie PDMS i wynikające z niego właściwości fizyczne. W szczególności kluczowym czynnikiem jest przyczepność utwardzonego PDMS. Z jednej strony wymagane jest szczelne uszczelnienie między urządzeniem PDMS a powierzchnią używaną do hodowli komórek neuronalnych (np. szklanym szkiełkiem nakrywkowym lub MEA), aby skutecznie ograniczyć przejście neurytów. Z drugiej strony urządzenie PDMS powinno przyczepiać się do podłoża odwracalnie, tak aby delikatna warstwa izolacyjna MEA nie uległa uszkodzeniu po zdjęciu urządzenia. Podczas gdy skurcz PDMS podczas utwardzania występuje i może zostać skorygowany przez wcześniejsze przeskalowanie formy, dla wskazanych tutaj temperatur i interwałów utwardzania skurcz będzie mniejszy niż 2%42 i nie wpłynie znacząco na jednowarstwowe urządzenia PDMS. Ogólnie rzecz biorąc, dokładnie przestrzegaj zalecanych wartości temperatury i czasu utwardzania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
Przegląd zalet i ograniczeń metody Zaproponowano technikę opartą na bezpośrednim zapisie laserowym 2-fotonowym do szybkiego wytwarzania urządzeń polimerowych w mikroskali do eksperymentalnego badania modułowych sieci neuronowych. W przeciwieństwie do miękkiej fotolitografii, proponowane podejście nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy technicznej, pod warunkiem, że funkcjonalna konfiguracja druku 3D 2PP jest dostępna i działa. Co ciekawe, metoda ta umożliwia przejście od zaprojektowanego przez CAD modelu 3D do funkcjonalnego urządzenia PDMS w ciągu jednego dnia, zapewniając w ten sposób bezpośrednią i wydajną ścieżkę od koncepcji do namacalnej realizacji. W szczególności wybór trybu drukowania w skorupie i rusztowaniu znacznie skraca czas potrzebny na stworzenie formy, ponieważ drukowany jest tylko ułamek jej objętości. Późniejsze utwardzanie drukowanego elementu promieniami UV gwarantuje jego stabilność mechaniczną i wytrzymałość, co zostało potwierdzone w ponad 50 cyklach odlewania za pomocą PDMS.
W porównaniu z tradycyjnymi metodami, druk 3D 2PP ma wyraźną przewagę, która jest najbardziej widoczna, jeśli chodzi o wytwarzanie form o znacznych proporcjach, wysokich wymaganiach dotyczących rozdzielczości i złożonych geometriach trójwymiarowych. Produkcja form wzorcowych przy użyciu standardowej litografii UV jest ograniczona przez grubość rezystu wynoszącą około 200 μm. Aby osiągnąć większą wysokość i proporcje, wymagane są skomplikowane sekwencje cykli powlekania wirowego i naświetlania35, kosztowne procesy LIGA (litografia, galwanizacja i formowanie) lub głębokie reaktywne trawienie jonowe (DRIE)36 . W ostrym kontraście, jak wykazano w pionierskiej pracy Kumi i in. w 2010 r.37 , technika 2PP oferuje zasadniczo nieograniczony zakres proporcji drukowanych części, od submikrometra do milimetra. W tym miejscu zilustrowano proces mikroprodukcji formy ze znaczną różnicą wysokości jej porcji, charakteryzujący się ponad 100-krotną różnicą między wysokością mikrokanalików (5 μm) a maksymalną wysokością formy (545 μm; patrz rysunek 2).
Ponadto rozdzielczość submikrometrową można łatwo osiągnąć, postępując zgodnie z opisanymi specyfikacjami protokołu. Dla porównania, osiągnięcie lepszych rozdzielczości formy za pomocą fotolitografii UV wymaga inwestycji kapitałowych. Maski o najwyższej rozdzielczości, wykorzystujące osadzanie chromu na kwarcu o nominalnej rozdzielczości 600 nm, są wyceniane o kilka rzędów wielkości wyżej niż drukowane laserowo maski przezroczyste nad głową, które mają rozdzielczość 250 μm35, jednak patrz praca Pirlo i wsp.41. Aby można ją było stosować we własnym zakresie, wybrana metoda musi być opłacalna. Dla wielu laboratoriów biologicznych całkowite koszty związane z konwencjonalną miękką fotolitografią lub bezpośrednim pisaniem laserowym stanowią barierę. Chociaż możliwe jest zwiększenie dostępności obu technologii poprzez zakup i montaż niezbędnych komponentów, podejście to wymaga dodatkowej wiedzy specjalistycznej i nadal wymaga znacznych inwestycji. W tym kontekście istotną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę, jest szersze spektrum zastosowań, które można osiągnąć dzięki bezpośredniemu pisaniu laserowemu. W przeciwieństwie do konwencjonalnej miękkiej fotolitografii, ograniczonej głównie do mikroprodukcji form, druk 3D 2PP wykazuje niezwykłą wszechstronność. Jego potencjalne zastosowania obejmują zarówno mikrofluidykę i mikrooptykę, jak i zintegrowaną fotonikę i mikromechanikę. To sprawia, że inwestowanie w tę technologię jest atrakcyjne jako wspólny obiekt dla wielu i różnorodnych dziedzin nauki. Na przykład metodologia oparta na 2PP opracowana w tym protokole jest wynikiem interdyscyplinarnej współpracy między wydziałami neuronauki i matematyki w naszej instytucji. Dodatkowo, rozwój fotorezystu jest aktywnym polem badań i może potencjalnie rozszerzyć zakres zastosowań druku 3D 2PP. Dobrym przykładem jest niedawne wprowadzenie żywicy IP-PDMS. Polimeryzując w struktury o właściwościach takich jak PDMS38, żywica ta uwalnia potencjał do bezpośredniej mikrofabrykacji biokompatybilnych komponentów, które mają pofałdowaną powierzchnię lub zawierają puste przestrzenie. Te zawiłości stanowią barierę w osiąganiu podobnych wyników za pomocą konwencjonalnych procedur formowania replik.
Jako demonstrację tej metody przedstawiono dowody sugerujące rozwój jednokierunkowej łączności między dwoma modułami w modułowej sieci neuronowej. Forma w mikroskali, wykonana techniką 2PP, miała wystarczającą wytrzymałość, aby poddać się wielokrotnemu odlewaniu PDMS i ma wymaganą precyzję w mikroskali. Podsumowując, zakres stosowania protokołu opisanego w niniejszej pracy wykracza poza zilustrowany przypadek. Ponieważ dostęp do technologii druku 2PP staje się coraz powszechniejszy, początkowe inwestycje wymagane do jej wdrożenia będą się zmniejszać, a zakres jej potencjalnych zastosowań będzie się rozszerzał.

Badanie aktywności neuronalnej w zachowujących się organizmach stanowi kilka wyzwań. Na przykład fizyczny dostęp do tkanki mózgowej jest ograniczony przez konieczność utrzymania jej integralności, więc powierzchowne obszary mózgu są łatwiejsze do rozważenia. Wyizolowanie określonych celów w nienaruszonej tkance jest często trudnym zadaniem, a czasami niemożliwym. Chociaż zdysocjowane jednorodne kultury neuronalne zapewniają wygodny dostęp do właściwości molekularnych, biochemicznych i biofizycznych poszczególnych (sub)komórkowych składników obwodu neuronalnego, realistyczna łączność i anatomiczna organizacja nienaruszonego mózgu zostaje utracona. Te fundamentalne ograniczenia zainspirowały wysiłki badawcze mające na celu osiągnięcie kompromisu, w którym unika się złożoności in vivo, a strukturę można skonstruować in vitro, co jest na żądanie1,2,3,4,5,6,7,8,9. W szczególności modułowe kultury neuronalne były przedmiotem szeroko zakrojonych badań prowadzonych w ciągu ostatnich dziesięcioleci, mających na celu rozwiązanie kluczowych pytań dotyczących fizjologii mózgu, jak opisano poniżej.
Organizacja: Badania in vivo pokazują, że mózg jest zbudowany anatomicznie w warstwach z precyzyjnymi typami komórek i układami projekcji. Testy funkcjonalne ujawniły organizację sieci neuronalnych w zespołach węzłów i modułach, z precyzyjnymi schematami połączeń10,11. Rola połączeń i motywów mikroukładów nie może być jednak odpowiednio zbadana in vivo ze względu na samą liczbę zaangażowanych synaps, a także przeplatające się efekty rozwoju i plastyczności zależnej od aktywności.
Transfer sygnału: W hodowlach in vivo lub losowych in vitro, trudno jest ocenić transfer sygnału. Badanie przewodnictwa aksonalnego i potencjału czynnościowego na całej jego długości wymaga kierowania wzrostem neurytów poprzez funkcjonalizację powierzchni lub wzorcowanie chemiczne, zapewniając wysoki stosunek sygnału do szumu w zewnątrzkomórkowych odczytach aktywności elektrycznej12.
Znaczenie translacyjne: Rozszyfrowanie wyłącznej roli elementów pre- i postsynaptycznych w różnych stanach patologicznych wymaga indywidualnego dostępu do tych elementów. Kultury modularne z ograniczoną łącznością, skutecznie segregujące elementy pre- i postsynaptyczne, są niezbędnymi narzędziami do tego celu13.
Istnieje kilka metod pozwalających na uzyskanie pewnej formy struktury w kulturze neuronalnej. Można je ogólnie podzielić na chemiczne i fizyczne manipulacje powierzchnią9. Poprzednie metody14,15 opierają się na skłonności komórek nerwowych do przyłączania się do pewnych związków (bio)chemicznych. Wymaga to osadzania kleju lub atrakcyjnych cząsteczek na powierzchni z precyzją w skali mikro i podążania za szczegółowym wzorem. Chociaż pozwala to na częściowe pokrycie powierzchni komórek, zgodnie z pożądanym wzorcem, metody chemiczne są z natury ograniczone i mają stosunkowo niski wskaźnik sukcesu w wytycznych dotyczących wzrostu neurytów16. Pełna kontrola nad kierunkowością aksonów wymaga ustanowienia przestrzennego gradientu substancji chemicznych ad hoc w celu kształtowania prowadzenia aksonów17. Te ostatnie metody obejmują fizyczną manipulację powierzchnią i są częściej stosowane do strukturyzacji sieci neuronalnych in vitro. Komórki neuronalne są fizycznie ograniczone w pożądanych miejscach przez geometryczne ograniczenia, takie jak mikroskopijne komory, ściany, kanały itp., kształtując biokompatybilny polimer, taki jak polidimetylosiloksan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 utwardzony i zestalony w urządzenie mikroprzepływowe. De facto metodą wytwarzania mikroprzepływowego PDMS jest miękka fotolitografia21, gdzie dwuwymiarowa maska jest wzorowana w mikroskali i wykorzystywana do selektywnego wytrawiania materiału na bazie krzemu pod wpływem promieniowania UV. Krótko mówiąc, żywica utwardzana promieniami UV (tj. fotorezyst) jest powlekana na płytce krzemowej poprzez powlekanie wirowe, osiągając określoną wysokość określoną przez jej lepkość i prędkość wirowania. Następnie wzorzysta maska jest umieszczana nad fotorezystem i wystawiana na działanie światła UV. Przezroczyste obszary wewnątrz maski, odpowiadające obszarom zainteresowania, pozwolą światłu UV indukować miejscowe sieciowanie cząsteczek fotorezystu. Obszary nienaświetlonego fotorezystu są zmywane za pomocą rozpuszczalnika, co powoduje powstanie pleśni. Jest to wielokrotnie używane do wypalania wybranego elastomeru (tj. PDMS), który jest następnie grawerowany z pożądaną geometrią w dowolnej liczbie replik. Taka metoda produkcji jest najpowszechniejszą metodą wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych22. Być może głównymi ograniczeniami miękkiej fotolitografii są warunki wstępne znacznych inwestycji kapitałowych oraz nieznajomość laboratoriów biologicznych z wymaganymi technikami i wiedzą specjalistyczną. Przygotowanie maski i etapy miękkiej fotolitografii wymagane do projektowania złożonych geometrii o wielu wysokościach i wysokim współczynniku proporcji są nietrywialne23 i często wymagają outsourcingu. Mimo że zaproponowano alternatywne i niskobudżetowe metody, nie zawsze spełniają one wysokie wymagania precyzji prototypowania biologicznego24.
Tutaj prezentowana jest alternatywna metoda produkcji, polegająca na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) i wytwarzaniu przyrostowym. Jest prosty i sam w sobie nie wymaga zaawansowanej wiedzy z zakresu mikrofabrykacji i mikrofotolitografii. Dziedzina badawcza mikroprodukcji 2PP pojawiła się pod koniec lat 90-tych25 i od tego czasu była świadkiem wykładniczego wzrostu26. Więcej na temat podstawowych zasad tej techniki można znaleźć gdzie indziej26. Krótko mówiąc, skupiając impuls świetlny wzbudzenia w przestrzeni trójwymiarowej, 2PP wykorzystuje nieliniową zależność absorpcji wielofotonowej od intensywności. Daje to zdolność do ograniczonej absorpcji, zapewniając precyzyjne i selektywne wzbudzenie w bardzo zlokalizowanych regionach. Zasadniczo fotorezystor o ujemnym tonie, materiał o zmniejszonej rozpuszczalności po ekspozycji na światło, jest poddawany skupionej wiązce femtosekundowych impulsów laserowych w niskim cyklu pracy27. Pozwala to na otrzymywanie impulsów o dużym natężeniu przy niskich mocach średnich, umożliwiając polimeryzację bez uszkadzania materiału. Oddziaływanie fotoindukowanych monomerów rodnikowych prowadzi do powstania oligomerów rodnikowych, inicjując polimeryzację, która rozciąga się na cały fotorezystor aż do określonej objętości, tj. woksela, którego wielkość zależy od intensywności i czasu trwania impulsów laserowych28.
W tej pracy prezentowane są dwa elementy: A) projekt i szybkie wykonanie formy wydrukowanej w 3D, wielokrotnie wielokrotnego użytku do produkcji jednorazowych polimerowych urządzeń do hodowli komórek neuronalnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), oraz B) ich mechaniczne sprzężenie na powierzchni płaskich substratów hodowli komórek neuronalnych, lub nawet zintegrowanych z substratem układów mikroelektrod zdolnych do wielomiejscowego zapisu sygnałów bioelektrycznych.
Komputerowo wspomagane projektowanie modelu mechanicznego 3D jest tutaj bardzo krótko opisane i towarzyszą mu kroki prowadzące do wydrukowanej w 3D formy i produkcji urządzeń PDMS.
Różnorodne aplikacje do projektowania wspomaganego komputerowo mogą być używane do generowania początkowego modelu obiektowego 3D i tworzenia pliku STL do kontrolowania procesu drukowania 2PP. W Tabeli Materiałów pierwsza i ostatnia aplikacja wymienione są bezpłatne lub dostarczane z bezpłatną licencją. Konstruowanie modelu 3D zawsze wymaga stworzenia szkicu 2D, który następnie jest wyciągany w kolejnych krokach modelowania. Aby zademonstrować tę koncepcję, w sekcji protokołu przedstawiono ogólny proces projektowania oprogramowania CAD 3D, co prowadzi do struktury wykonanej z nakładających się na siebie sześcianów. Aby uzyskać bardziej wyczerpujące informacje, dostępnych jest wiele samouczków online i bezpłatnych zasobów szkoleniowych, jak wskazano w Tabeli materiałów.
Wynikowy plik STL jest następnie przekształcany w serię poleceń, które mają być wykonane przez drukarkę 3D (np. procedura krojenia). W przypadku konkretnej używanej drukarki 3D 2PP oprogramowanie DeScribe służy do importowania pliku STL i konwertowania go na zastrzeżony format ogólnego języka pisania (GWL). Sukces procesu drukowania 2PP zależy od różnych parametrów, w szczególności mocy lasera i jego prędkości skanowania, odległości zszywania i kreskowania-krojenia. Dobór tych parametrów, wraz z doborem obiektywu i fotorezystu, zależy od najmniejszych cech konstrukcji, a także od zamierzonego zastosowania. W związku z tym optymalizacja parametrów staje się niezbędna, aby spełnić wymagania różnych scenariuszy projektowych i przypadków użycia. Do tej pracy jako konfigurację parametrów drukowania została uwzględniona zalecana receptura IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Ostatecznie stabilna mechanicznie część drukowana jest drukowana z niezbędną rozdzielczością przy jednoczesnej minimalizacji czasu drukowania 3D.
Projekt formy i związany z nim plik STL, zademonstrowany w tej pracy, składa się z kwadratowej ramki do segregacji przestrzeni hodowli komórkowej w dwóch przedziałach: obszarze zewnętrznym (tj. zwanym później Źródłem) i obszarze wewnętrznym (tj. określanym później jako Cel). Te dwa przedziały są połączone zestawami mikrokanałów, z których każdy charakteryzuje się ostrymi krawędziami, zaprojektowanymi tak, aby specjalnie utrudniać wzrost neurytów od Celu do Źródła, ale nie odwrotnie, i jako takie promują kierunkową łączność synaptyczną między neuronami rosnącymi w tych dwóch obszarach.
Wcześniejsze badania wykorzystywały różne geometrie mikrokanałów, aby zachęcić do kierunkowego wzrostu neurytów. Przykładami są kształty trójkątne18, struktury kolczaste kanałów19 i kanały zwężające20. W tym przypadku zastosowano konstrukcję z ostrymi barierami kątowymi na granicach mikrokanału, charakteryzującą się również asymetrycznymi wejściami. Te mikrokanały służą do ustanowienia ciągłości między zamkniętym wnętrzem, przedziałem docelowym, a obszarem zewnętrznym, przedziałem źródłowym. Lejkowaty kształt początkowej części mikrokanałów, od strony Źródła, ma za zadanie sprzyjać tworzeniu się wiązek aksonalnych i ich wzrostowi wzdłuż najkrótszej, tj. w linii prostej, drogi łączącej Źródło z Celem. Trójkątna przestrzeń realizowana przez skierowanie się pod ostrymi kątami ma większą objętość po stronie celu, aby skutecznie opóźnić znajdowanie drogi przez neuryty, jednocześnie sprzyjając szybkiemu strzelaniu wiązek pochodzących ze Źródła i zajęciu dostępnej przestrzeni. Wybór 540 μm dla długości mikrokanalików skutecznie odfiltrowuje ogólnie krótsze wyrostki dendrytyczne39. Ponadto ich wysokość 5 μm zapobiega przenikaniu somatów komórkowych przez mikrokanały. Ogólnie rzecz biorąc, ta konfiguracja okazała się promować jednokierunkową łączność między zewnętrznymi, źródłowymi i wewnętrznymi modułami docelowymi, i jest tutaj przedstawiona jako dowód zasady wśród wielu alternatywnych wyborów.
Podczas gdy urządzenia PDMS, wyprodukowane przez formę 2PP, mogą być przymocowane do powierzchni popularnych substratów do hodowli komórkowych, takich jak szklane szkiełka nakrywkowe lub szalki Petriego, w tej pracy użyto dostępnych na rynku układów mikroelektrod zintegrowanych z substratem. Nie podjęto żadnych wysiłków w celu optymalizacji projektu 3D pod kątem układu mikroelektrod, a mechaniczne sprzężenie zostało wykonane pod nadzorem stereomikroskopii, mając na celu jedynie ustawienie urządzenia w poprzek układu, pozostawiając część mikroelektrody odsłoniętej po obu stronach, źródle i celu. Umożliwia to wstępną ocenę funkcjonalnych konsekwencji ograniczonej łączności w hodowlach komórek neuronalnych.

<table><tbody>Kompaktowy polimeryzator <tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>BB utwardzany</td><td>PCube Srl</td><td></td><td>Długości fal 365-405 nm, moc 120W</td></tr><tr><td>BioMed Amber Resin 1 L</td><td>formlabs Żywica</td><td></td><td>używana do montażu formy drukowanej w 3D na szalce Petriego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie aplikacyjne CAD SolidWorks</td><td>Dassault Syst&egrave; mes SolidWorks Corporation, US</td><td></td><td>Fusion 360 (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone), AutoCAD (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone), PTC Creo (PTC Corp., Stany Zjednoczone), SolidWorks (Dassault Syst&egrave; mes SolidWorks corp., Stany Zjednoczone) i Tinkercad (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone). &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; -------------------------------------- Poradniki: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Szkolenia: https://www.autodesk.com/training</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>Tocris</td><td>#0106</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>DeScribe</td><td>Nanoscribe GmbH & Co.&nbsp; </td><td></td><td></td>KG</tr><tr><td>Wodorofosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&prime; Sole zrównoważone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>system rejestracji MEA in vitro MEA2000 mini</td><td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IP-S Photoresist</td><td>Nanoscribe GmbH & Co.&nbsp; </td><td></td><td></td>KG</tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie aplikacyjne do nagrywania MEA (Eksperymentator)</td><td>Systemy wielokanałowe GmBH, Reutlingen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51412C</td><td></td></tr><tr><td>NanoWrite</td><td>Nanoscribe GmbH & Co.&nbsp; </td><td></td><td></td>KG</tr><tr><td>nóż okulistyczny 15&deg;</td>Drukarka 3D <td>HESTIA Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photonic Professional GT2 (PPGT2)</td><td>Nanoscribe GmbH & Co.&nbsp; KG</td><td>SN617</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>HARRICK PLASMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli(etyleniminy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Octan eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>Repel-silan ES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17133201</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża sodowo-wapniowe ITO dla 3D MF DiLL</td><td>Nanoscribe GmbH & Co.&nbsp; </td><td></td><td></td>KG</tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Zintegrowane z substratem planarne MEA (120MEA100/30iR-ITO-gr)</td><td>Systemy wielokanałowe GmBH, Reutlingen, Niemcy</td><td></td><td>Elektrody TiN, izolator SiN, 4 wewnętrzne elektrody odniesienia, 120 elektrod rejestrujących, Rozstaw elektrod 100 i mikro; m, średnica elektrody 30 i mikro; m</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Pompa próżniowa Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Jednofazowa asynchroniczna 2-biegunowa&nbsp;</td><td>CIMAMOTORI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

polimeryzacja dwufotonowa: druk 3d urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Hodowle neuronów są referencyjnym modelem eksperymentalnym od kilkudziesięciu lat. Brakuje jednak układu komórek 3D, ograniczeń przestrzennych dotyczących wzrostu neurytów i realistycznych połączeń synaptycznych. To ostatnie ogranicza badania nad strukturą i funkcją w kontekście kompartmentalizacji i zmniejsza znaczenie kultur w neurobiologii. Przybliżenie ex vivo ustrukturyzowanego anatomicznego układu połączeń synaptycznych nie jest trywialne, mimo że jest kluczem do powstania rytmów, plastyczności synaptycznej i ostatecznie patofizjologii mózgu. W tym przypadku polimeryzacja dwufotonowa (2PP) jest stosowana jako technika druku 3D, umożliwiająca szybkie wytwarzanie polimerowych urządzeń do hodowli komórek przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) w skali mikrometrycznej. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami formowania replik opartymi na mikrofotolitografii, druk w mikroskali 2PP umożliwia szybką i niedrogą realizację prototypów. Protokół ten ilustruje projektowanie i wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS, mających na celu hodowlę modułowych sieci neuronowych. Jako dowód słuszności zasady przedstawiono urządzenie dwukomorowe, które fizycznie ogranicza łączność. W szczególności faworyzuje się asymetryczny wyrostek aksonalny podczas rozwoju ex vivo i pozwala się na kierowanie z jednej komory do drugiej. W celu zbadania funkcjonalnych konsekwencji jednokierunkowych oddziaływań synaptycznych wybrano komercyjne układy mikroelektrod do monitorowania aktywności bioelektrycznej połączonych ze sobą modułów neuronalnych. W tym miejscu zilustrowano metody 1) wytwarzania form z mikrometryczną precyzją i 2) wykonywania wieloośrodkowych zapisów zewnątrzkomórkowych in vitro w kulturach neuronów kory mózgowej szczurów. Dzięki zmniejszeniu kosztów i przyszłej powszechnej dostępności druku 3D 2PP, metoda ta będzie coraz bardziej przydatna w laboratoriach badawczych na całym świecie. Zwłaszcza w neurotechnologii i wysokoprzepustowym rejestrowaniu danych neuronowych, łatwość i szybkość prototypowania uproszczonych modeli in vitro poprawi kontrolę eksperymentalną i teoretyczne zrozumienie wielkoskalowych systemów neuronowych in vivo.

W niniejszej pracy opisano wytworzenie dwukomorowego polimerowego urządzenia do hodowli komórek (neuronalnych), obrazującego zastosowanie druku 3D 2PP do szybkiego prototypowania urządzeń z PDMS. W szczególności wykonano urządzenie dla modularnych sieci neuronalnych z jednokierunkową łącznością synaptyczną, a jego charakterystykę funkcjonalną przedstawiono w ramach wielostanowiskowej elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej. W skrócie, formę w skali mikrometrycznej zrealizowano za pomocą bezpośredniego zapisu laserowego, wykorzystując dostępną komercyjnie drukarkę 3D. W szczególności drukarka dostarcza moc 50 mW poprzez impulsy laserowe o długości fali środkowej 780 nm i czasie trwania od 80 do 100 fs. Podczas procesu wytwarzania wiązka laserowa jest ogniskowana przez obiektyw (25x, NA=0.8) drukarki na fotorezyst negatywowy (IP-S), aby przeskanować objętość druku przy użyciu skanera galwanometrycznego dla osi x i y oraz stołu piezoelektrycznego dla osi z. Objętość druku została odpowiednio podzielona na bloki o wymiarach 200 mm x 200 mm x 265 mm, aby uzyskać formę o całkowitym rozmiarze 6500 mm x 6500 mm x 545 mm i objętości nominalnej 12,423 mL. Rycina 2A przedstawia dwuwymiarowy szkic formy, wyróżniając jej wymiary oraz rozmiary elementów, natomiast Rycina 2B pokazuje zbliżenie zdjęcia gotowego urządzenia zamontowanego na MEA. Formy przygotowane zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji były trwałe i mogły być używane ponownie ponad 50 razy do wytwarzania urządzeń z PDMS.
Wydrukowana forma została wykorzystana do odlewania urządzenia z PDMS, które następnie zamontowano na wewnętrznym obszarze szklanych podłoży zintegrowanych z macierzami mikrolektrod (MEA), w celu przeprowadzenia wielopunktowych zewnątrzkomórkowych rejestracji aktywności elektrycznej neuronów oraz w ramach dowodu koncepcyjnego. Komercyjne zintegrowane podłoża MEA wykorzystano do monitorowania aktywności kultur modułowych w odpowiedzi na przestrzennie zlokalizowane bodźce elektryczne, dostarczane zewnątrzkomórkowo przez podzbiór mikrolektrod znajdujących się w każdym przedziale hodowlanym. Każda MEA zawiera 120 mikrolektrod z azotku tytanu (TiN) o średnicy 30 µm i odstępie międzyelektrodowym 100 µm. Rycina 2C-D przedstawia rozmieszczenie urządzenia z PDMS na górnej powierzchni MEA. Cechy geometryczne poszczególnych mikrokanałów urządzenia wraz z całkowitym obszarem komory pokazanym na Rycini 2C prowadzą do kompartymentacji hodowlanych neuronów. Można je rozróżnić na podstawie przynależności do przedziału w obszarze zewnętrznym (Źródło) lub wewnętrznym (Cel) urządzenia. Preferencyjne prowadzenie aksonów, ograniczone z obszaru Źródło do obszaru Cel, jest determinowane przez krawędzie mikrokanałów o ostrym kącie. Rycina 2D przedstawia rozmieszczenie polimerowego urządzenia na MEA oraz względny obszar pokrycia elektrod rejestrujących zlokalizowanych w przedziałach Źródło lub Cel. Należy zauważyć, że w naszym badaniu przypadku nie wymagano ani nie dążono do precyzyjnego dopasowania wnętrza mikrokanałów urządzenia do jednego lub kilku rzędów mikrolektrod MEA.
Reprezentatywne dowody na asymetryczny wzrost neurytów przedstawiono na Rysunku 3 podczas rozwoju ex vivo, pokazując neuryty znakowane fluorescencyjnie w obrazowaniu na żywo, 6 dni (Rysunek 3A) oraz 2 dni po wysianiu komórek (Rysunek 3B-D). Podczas gdy neuryty po stronie docelowej (Target) urządzenia napotykały bariery pod ostrym kątem, które stanowiły przeszkody hamujące ich progresję w przestrzeni, neuryty pochodzące ze strony źródłowej (Source) rosły niezakłóconie i przecinały kanały. Taka asymetria sprzyja jednokierunkowemu połączeniu aksonalnemu między neuronami w dwóch przedziałach, z projekcją ze źródła do celu, co było zamierzeniem konstrukcyjnym. Wynik ten jest dodatkowo potwierdzony (funkcjonalną) oceną elektrofizjologiczną odpowiedzi elektrycznych wywołanych przez bodźce dostarczane naprzemiennie do każdego z dwóch przedziałów.
Po 3-4 tygodniach hodowli in vitro, gdy sieci neuronalne osiągnęły pełną dojrzałość29,30, badano łączność funkcjonalną między dwiema komorami poprzez podawanie krótkich impulsów elektrycznych i monitorowanie wywołanych przez nie odpowiedzi neuronalnych31. Dwufazowe impulsy elektryczne o amplitudzie 800 mV aplikowano naprzemiennie tylko do populacji Źródłowej (Source) lub tylko do populacji Docelowej (Target) (N powtórzeń = 150, N kultur modułowych = 6), przy użyciu 3 zestawionych par płaskich mikroelektrod w konfiguracji bipolarnej, w sposób przeplatany. Zatem 3 pary elektrod mogły znajdować się w obszarze Źródła MEA lub w obszarze Docelowym MEA. Odpowiedzi elektryczne wywołane przez każdy bodziec mogły być następnie wykrywane przez wszystkie mikroelektrody MEA po opóźnieniu propagacyjnym. Rejestracja była prowadzona z częstotliwością próbkowania 25 kHz/kanał, a otrzymane surowe sygnały elektryczne zewnątrzkomórkowe zostały zdigitalizowane z rozdzielczością konwersji analogowo-cyfrowej 16 bitów. W trybie offline zastosowano algorytm detekcji szczytów przez przekroczenie progu32 w celu wykrycia czasu wystąpienia potencjałów czynnościowych zewnątrzkomórkowych, bez wykonywania sortowania impulsów (spike sorting). Rycina 4A-B wyraźnie ukazuje silną asymetrię wywołanych odpowiedzi, powtórzoną 150 razy, w zależności od miejsca podania bodźca, co sugeruje znaczący wpływ ograniczeń geometrycznych na preferowany kierunek łączności. W rzeczywistości, po stymulacji strony Źródła, częstotliwość wyładowań populacji neuronalnej Źródła – oszacowana poprzez obliczenie histogramu czasów impulsów okołobodźcowych – wzrosła zgodnie z oczekiwaniami, generując pełny wybuch (burst) potencjałów czynnościowych sieci33,31,34, po czym z opóźnieniem nastąpił wzrost częstotliwości wyładowań populacji Docelowej. Jednak gdy stymulacja była podawana w obrębie populacji Docelowej, wzrosła jedynie częstotliwość wyładowań populacji Docelowej, podczas gdy populacja Źródła pozostała w większości nieaktywna. Rycina 4C-D powtórzyła ten sam paradygmat bodziec/odpowiedź w kulturze kontrolnej, bez obecności urządzenia polimerowego (tj. w nieustrukturyzowanej kulturze neuronalnej); bodźce zewnątrzkomórkowe podawano również w 4 powtórzeniach. W takich warunkach kontrolnych nie wystąpiła asymetria w odpowiedziach wywołanych przez żaden z bodźców. Choć podzbiór mikroelektrod MEA użyty do podawania bodźców był zgodny z tym użytym w sieciach modułowych, miejsce podania bodźca prowadziło do podobnej odpowiedzi wywołanej z całej populacji. Potwierdza to, że urządzenie PDMS sprzyjało jednokierunkowej łączności synaptycznej między dwiema komorami. Ogólnie, asymetryczne odpowiedzi wywołane w kulturach modułowych (N = 6) oraz symetryczne odpowiedzi wywołane w kulturach kontrolnych (N = 4) silnie wskazują na ograniczoną łączność anatomiczną w przedzielonym systemie in vitro. Dane elektrofizjologiczne oraz skrypty użyte do wygenerowania Ryciny 4 są dostępne za pośrednictwem Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
<img alt="Proces od CAD do produkcji 3D; schemat; obejmuje projekt CAD, litografię IP-S, oddzielanie formy PDMS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat wytwarzania mikroformy 2PP i odlewania replik z PDMS. (A) Model 3D zostaje zaprojektowany w programie CAD i wyeksportowany do pliku w formacie Standard Tessellation Language (STL), (B) następnie wykonuje się dwufotonowy druk 3D poprzez polimeryzację indukowaną laserem w kropli żywicy (IP-S). (C) Powstała struktura służy jako forma do powtarzalnego wytwarzania replik z PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy i zdjęcia projektu urządzenia mikrofluidycznego do analizy przepływu płynów i wyrównania czujników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykład wewnętrznego szybkiego prototypowania polimerowego urządzenia PDMS do hodowli komórek (neuronalnych). (A) W czasie krótszym niż 24 h addytywne wytwarzanie w mikro skali pozwala na przejście od modelu CAD do wydrukowanej w 3D matrycy, która może być użyta natychmiast i wielokrotnie jako forma do replikacji z elastomerów biokompatybilnych, takich jak PDMS. (B-C) Powstałe urządzenia PDMS są łączone z płaskim podłożem do hodowli komórek neuronalnych, reprezentowanym tutaj przez macierz mikroelektrod. Dla konkretnego projektu próbki w (A) zdefiniowano dwie komory: jedną określoną jako Źródło (Source), oznaczoną literą S, oraz drugą określoną jako Cel (Target), oznaczoną literą T. (D) Neurony wysiane w każdej komorze mogą rozwijać neuryty wyłącznie przez szereg mikrokanałów. Po odpowiednim wyrównaniu pod kierunkiem mikroskopii stereoskopowej w (C), dwie grupy zintegrowanych z podłożem mikroelektrod pozostają odsłonięte, dzięki czemu aktywność bioelektryczna pobliskich neuronów znajdujących się w obu przedziałach może być stymulowana i rejestrowana. Należy zauważyć, że wyrównanie mikroelektrod wewnątrz poszczególnych mikrokanałów nie było priorytetem w tym dowodzie koncepcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i schemat mikrokanału dla analizy ruchu komórkowego i nawigacji ścieżek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie na żywo nieprzenikających przez błonę komórkową fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych pozwala zidentyfikować neuryty wydłużone przez neurony kilka dni po wysianiu komórek. (A-D) Reprezentatywne mikrografie fluorescencyjne konfokalne modularnych kultur neuronalnych z urządzenia wykonanego zgodnie z Rysunkiem 1 i Rysunkiem 2 (N = 4, 128 pojedynczych mikrokanałów) zostały wykonane 2 i 6 dni po wysianiu komórek. (B-D) Powiększenie 40x oraz odwrócona skala szarości mikrografii w celu zwiększenia widoczności. Końce mikrokanałów z przedziałów Źródła (Source) i Celu (Target) są oznaczone odpowiednio literami S i T. (A) przedstawia obraz szerokiego skanowania kultury, w którym Źródło (tj. wewnętrzny obszar kwadratu) i Cel (tj. obszar zewnętrzny) są wypełnione komórkami 6 dni po wysianiu. (B) i (C) pokazują, w wcześniejszym punkcie czasowym 2 dni po wysianiu, wzrost neurytów odpowiednio po stronie Źródła i po stronie Celu mikrokanałów. Małe czarne trójkąty wskazują reprezentatywne przykłady zakończeń domniemanych wiązek aksonów, które najwyraźniej pochodzą tylko ze Źródła. Strzałkowate granice mikrokanałów wskazują wydłużanie się neurytów wzdłuż krawędzi (B), gdzie ich przejście jest nieprzerwane i skierowane w stronę Celu. W przeciwnym kierunku, obok końcówki mikrokanału po stronie Celu (C), neuryty pochodzące z Celu i posuwające się w stronę Źródła zostają uwięzione w ostrych narożnikach. (D) dodatkowo ujawnia szczegóły wzrostu neurytów wewnątrz mikrokanału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy częstotliwości wyładowań neuronów z bodźcem, porównujące efekty urządzenia w czasie w milisekundach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Funkcjonalna charakterystyka elektrycznych odpowiedzi neuronowych, z urządzeniem PDMS oraz bez niego. MEA zostały wykorzystane jako podłoża do hodowli komórek i służyły do pomiaru odpowiedzi impulsowych w całej sieci, wywołanych bardzo krótkim (tj. 200 µs, 0.8V) dwufazowym impulsem stymulacji elektrycznej, dostarczonym w konfiguracji bipolarnej. Przy zastosowaniu urządzenia PDMS z Rysunku 2, rejestrowane odpowiedzi impulsowe neuronów z obszaru źródłowego (Source, czerwony) i docelowego (Target, niebieski) różnią się w zależności od miejsca dostarczenia bodźca. Prawdopodobne opóźnienia aksonalne, synaptyczne i integracyjne stają się widoczne w (A), ale nie w (B), co sugeruje istnienie preferencyjnej łączności synaptycznej (tj. z obszaru Source do Target). (C-D) W warunkach kontrolnych (tj. bez urządzenia PDMS) odpowiedzi wywołane, wykryte w dwóch różnych zestawach mikroelektrod MEA, nie zależą od miejsca dostarczenia bodźca. Jasne zacieniowanie otaczające linie na wykresach oznacza chwilowy błąd standardowy średniej (N bodźców = 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa roztworu</td>
			<td colspan="3">Skład </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polietylenoimina (PEI) 0,1%</td>
			<td colspan="3">1 ml roztworu stokowego PEI, 9 ml sterylnej wody dejonizowanej (DI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka hodowlana (50 ml)</td>
			<td colspan="3">podłoże Minimum Essential Medium (MEM), uzupełnione o 20 μM Glukoza, 50 μg/mL Gentamycyna, 50 μM L-glutamina oraz 10% inaktywowana termicznie surowica konia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do sekcji (1000 ml)</td>
			<td colspan="3">Zrównoważone sole Hanksa 9,52 g, wodorowęglan sodu 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glukoza 6 g, kwas kynurenowy (stężenie końcowe 200 μM), D-AP5 (stężenie końcowe 25 μM), gentamycyna 250 μl, albuminy surowicy bydlęcej 300 mg, siarczanu magnezu 1,44 g. Dostosować pH do wartości 7,3, chronić przed światłem i przechowywać w 4°C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do trawienia (100 ml)</td>
			<td colspan="3">Chlorek sodu 800 mg, chlorek potasu 37 mg, wodorowęglan sodu (II) 99 mg, HEPES 600 mg, wodorowęglan sodu 35 mg, kwas kynurenowy, 200 μL (z roztworu zapasowego 100 mM), D-AP5 100 μL (z roztworu zapasowego 25 mM). Dostosować pH do 7,4, chronić przed światłem i przechowywać w 4 °C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór 1</td>
			<td colspan="3">Trypsyna 5 mg, dezoksyrybonukleaza I 1,5 mg w 2 ml medium do trawienia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór 2</td>
			<td colspan="3">Inhibitor trypsyny 5 mg w 5 ml medium do sekcji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór 3</td>
			<td colspan="3">Deoksynukleaza I 1,5 g w 2,5 ml podłoża do sekcji.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela roztworów.Opisy produktów znajdują się w tabeli materiałów.
Uzupełniający plik kodu 1: Plik projektowy STL odpowiada strukturze przedstawionej na Rysunku 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/binary.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...

Interesują nas szeroko pojęte relacje między strukturą a funkcjami mózgu, szczególnie na poziomie mikroukładów. Często stosujemy zredukowane preparaty eksperymentalne, takie jak hodowla zdysocjowanych komórek neuronowych, ponieważ są one cennym modelem do badania aktywności elektrycznej, transmisji synaptycznej i ogólnego pojawiania się stanów zbiorowych. Proponowana przez nas metoda idealnie nadaje się do szybkiego wytwarzania urządzeń polimerowych w mikroskali.Można to natychmiast wykorzystać do eksperymentalnego badania modułowych sieci neuronowych w talerzu i nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy technicznej w zakresie miękkiej fotolitografii. Ta metoda i nasz prosty dowód słuszności koncepcji pozwalają na projektowanie modułowych sieci neuronowych, w których możemy definiować strukturę i kontrolować przepływ sygnałów biologicznych. Badania przesiewowe leków i badania stanów patologicznych natychmiast przynoszą korzyści z tych wyrafinowanych sieci neuronalnych in vitro.Aby rozpocząć, uruchom aplikację komputerową oprogramowania do projektowania z górnego paska menu, wybierz pozycję nowy, a następnie wybierz część reprezentacja 3D pojedynczego komponentu projektu. Aby ustalić widok szkicu z góry, naciśnij Control i pięć. Na panelu bocznym wybierz szkic i wybierz prostokąt narożny.Kliknij jedną z krawędzi prostokąta i panel parametrów, ustaw długość na 100 jednostek i ustaw długość krawędzi prostopadłej na 50 jednostek. Przeciągnij nad prostokątem i zaznacz go, przytrzymując lewy przycisk myszy. Z menu Dodaj relację wybierz opcję Napraw, aby ograniczyć relacje między liniami.Po utworzeniu nowego małego nakładającego się prostokąta z panelu bocznego wybierz elementy i wybierz wyciągniętą podstawę. Ustaw głębokość dużego prostokąta na pięć, a mniejszego na 10 jednostek. Kierując się tymi podstawowymi zasadami, można projektować bardziej złożone obiekty.Na koniec z menu pliku zapisz część w formacie STL. Aby rozpocząć, wygeneruj i przetwórz plik projektu wspomaganego komputerowo w formacie STL. Umieść szklane podłoże na uchwycie.Za pomocą multimetru elektronicznego upewnij się, że strona szklanego podłoża pokryta tlenkiem indu i cyny lub ITO jest skierowana do góry i dokładnie przyklej szkło. Pod osłoną oparów chemicznych nałóż kroplę IPS Photoresist na środek szklanego podłoża i włóż uchwyt do drukarki 3D tak, aby kropla żywicy była skierowana w stronę obiektywu. Za pomocą menu pliku oprogramowania załaduj pliki GWL, wybierz przykład podejścia, a następnie znajdź interfejs.Wybierz opcję Rozpocznij zadanie, aby rozpocząć drukowanie, a po zakończeniu naciśnij przycisk Wymień uchwyt. Delikatnie usuń podłoże za pomocą części drukowanej i pod wyciągiem inkubuj szklane podłoże w PGMEA, a następnie w izopropanolu. Aby utwardzić wysuszoną na powietrzu część drukowaną, wystaw ją na działanie światła UV o długości od 365 do 405 nanometrów przez pięć do 20 minut.Pod okapem z przepływem laminarnym delikatnie usuń wydrukowaną część ze szklanego podłoża i umieść ją na dwumikrolitrowej kropli żywicy na szalce Petriego. Po pięciu minutach ekspozycji na promieniowanie UV zakryj naczynie i inkubuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby rozpocząć, wydrukuj formę 3D za pomocą polimeryzacji dwufotonowej i zamontuj ją na szalce Petriego, która jest teraz określana jako forma.W celu wytworzenia urządzenia inkubuj formę z 10 mikrolitrami środka hydrofobicznego przez siedem minut i przepłucz ją 70% etanolem, a następnie dwukrotnie wodą dejonizowaną. Delikatnie dodaj wcześniej przygotowaną mieszaninę PDMS na formę, aż do osiągnięcia zamierzonej ostatecznej wysokości urządzenia. Inkubuj przykrytą formę w piekarniku nagrzanym do 80 stopni Celsjusza przez 18 minut.Następnie delikatnie odłącz utwardzony blok PDMS od formy pod okapem z przepływem laminarnym i zanurz go w izopropanolu na 10 minut w szklanej szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą okulistycznego noża kłującego, ostrożnie wytnij środkową kwadratową część, a następnie wzdłuż krawędzi urządzenia. Następnie zanurz urządzenie w etanolu na 30 minut.Pod okapem z przepływem laminarnym przenieś urządzenie na nową szalkę Petriego i pozostaw do wyschnięcia. Aby rozpocząć, zdobądź wydrukowaną w 3D formę i wyprodukuj urządzenie z polidimetylosiloksanu lub PDMS. Aby wysterylizować układ mikroelektrod lub MEA, zanurz go w 70% etanolu na 30 minut, a następnie trzykrotnie spłucz sterylną wodą dejonizowaną.Za pomocą sterylnej cienkiej pęsety zamontuj urządzenie PDMS na wewnętrznej powierzchni MEA pod mikroskopem stereoskopowym. Wyrównaj jedną stronę urządzenia PDMS do środka wewnętrznego obszaru MEA. Pod wyciągiem dodaj jeden mililitr 0,1% roztworu polietylenininy do MEA i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Po pięciokrotnym przepłukaniu MEA wodą dejonizowaną, dodać jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych i inkubować MEA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zasiej MEA jednym mililitrem kultury zawierającej 1,8 miliona komórek neuronalnych wyizolowanych z mózgu szczeniaka szczura i inkubuj. Aby rozpocząć, wyprodukuj urządzenie PDMS z formy wydrukowanej w 3D.Hodowla komórek neuronalnych w MEA zamontowanych w PDMS. Delikatnie zamontuj MEA w głównym stopniu wielokanałowego wzmacniacza elektronicznego umieszczonego w suchym 37 stopniach Celsjusza i inkubuj przez 10 minut. Uruchom oprogramowanie eksperymentatora, ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kiloherców i naciśnij rozpocznij akwizycję danych, aby rozpocząć akwizycję danych.W panelu wyświetlania danych pojawiają się nieprzetworzone ślady aktywności zarejestrowanej poza siecią komórkową dla każdego kanału. Przejdź do panelu stymulatora oprogramowania, wybierz trzy pary sąsiednich mikroelektrod, które są aktywne podczas impulsów w całej sieci, i wybierz dwufazowy przebieg impulsu. Ustaw amplitudy pików na 800 miliwoltów, a czas trwania impulsu na 200 mikrosekund.Aby uzyskać konfigurację bipolarną, wybierz i ustaw wartości sąsiednich elektrod. Na koniec ustaw rejestrator na 300 milisekund przed i 1000 milisekund po stymulacji, a następnie naciśnij rozpocznij akwizycję danych, aby rozpocząć nagrywanie. Obrazowanie na żywo ujawniło, że znakowane fluorescencyjnie neuryty wykazywały wzrost od źródła do celu w mikrokanale urządzenia PDMS.Analiza elektrofizjologiczna wykazała, że wywołana odpowiedź źródła i celu w modułowych sieciach neuronalnych jest asymetryczna, podczas gdy kontrola bez PDMS nie wykazywała tego wzorca.

two-photon-polymerization-3d-printing-micro-scale-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

Poznaj druk 3D dwufotonową polimeryzację do tworzenia mikroskalowych urządzeń PDMS dla hodowli neuronów szczurzych. Ta metoda umożliwia badanie modułowych sieci neuronowych in vitro przy użyciu elektrofizjologii.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Przeglądaj więcej filmów