Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Interesują nas szeroko pojęte relacje między strukturą a funkcjami mózgu, szczególnie na poziomie mikroukładów. Często stosujemy zredukowane preparaty eksperymentalne, takie jak hodowla zdysocjowanych komórek neuronowych, ponieważ są one cennym modelem do badania aktywności elektrycznej, transmisji synaptycznej i ogólnego pojawiania się stanów zbiorowych. Proponowana przez nas metoda idealnie nadaje się do szybkiego wytwarzania urządzeń polimerowych w mikroskali.

Można to natychmiast wykorzystać do eksperymentalnego badania modułowych sieci neuronowych w talerzu i nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy technicznej w zakresie miękkiej fotolitografii. Ta metoda i nasz prosty dowód słuszności koncepcji pozwalają na projektowanie modułowych sieci neuronowych, w których możemy definiować strukturę i kontrolować przepływ sygnałów biologicznych. Badania przesiewowe leków i badania stanów patologicznych natychmiast przynoszą korzyści z tych wyrafinowanych sieci neuronalnych in vitro.

Aby rozpocząć, uruchom aplikację komputerową oprogramowania do projektowania z górnego paska menu, wybierz pozycję nowy, a następnie wybierz część reprezentacja 3D pojedynczego komponentu projektu. Aby ustalić widok szkicu z góry, naciśnij Control i pięć. Na panelu bocznym wybierz szkic i wybierz prostokąt narożny.

Kliknij jedną z krawędzi prostokąta i panel parametrów, ustaw długość na 100 jednostek i ustaw długość krawędzi prostopadłej na 50 jednostek. Przeciągnij nad prostokątem i zaznacz go, przytrzymując lewy przycisk myszy. Z menu Dodaj relację wybierz opcję Napraw, aby ograniczyć relacje między liniami.

Po utworzeniu nowego małego nakładającego się prostokąta z panelu bocznego wybierz elementy i wybierz wyciągniętą podstawę. Ustaw głębokość dużego prostokąta na pięć, a mniejszego na 10 jednostek. Kierując się tymi podstawowymi zasadami, można projektować bardziej złożone obiekty.

Na koniec z menu pliku zapisz część w formacie STL. Aby rozpocząć, wygeneruj i przetwórz plik projektu wspomaganego komputerowo w formacie STL. Umieść szklane podłoże na uchwycie.

Za pomocą multimetru elektronicznego upewnij się, że strona szklanego podłoża pokryta tlenkiem indu i cyny lub ITO jest skierowana do góry i dokładnie przyklej szkło. Pod osłoną oparów chemicznych nałóż kroplę IPS Photoresist na środek szklanego podłoża i włóż uchwyt do drukarki 3D tak, aby kropla żywicy była skierowana w stronę obiektywu. Za pomocą menu pliku oprogramowania załaduj pliki GWL, wybierz przykład podejścia, a następnie znajdź interfejs.

Wybierz opcję Rozpocznij zadanie, aby rozpocząć drukowanie, a po zakończeniu naciśnij przycisk Wymień uchwyt. Delikatnie usuń podłoże za pomocą części drukowanej i pod wyciągiem inkubuj szklane podłoże w PGMEA, a następnie w izopropanolu. Aby utwardzić wysuszoną na powietrzu część drukowaną, wystaw ją na działanie światła UV o długości od 365 do 405 nanometrów przez pięć do 20 minut.

Pod okapem z przepływem laminarnym delikatnie usuń wydrukowaną część ze szklanego podłoża i umieść ją na dwumikrolitrowej kropli żywicy na szalce Petriego. Po pięciu minutach ekspozycji na promieniowanie UV zakryj naczynie i inkubuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby rozpocząć, wydrukuj formę 3D za pomocą polimeryzacji dwufotonowej i zamontuj ją na szalce Petriego, która jest teraz określana jako forma.

W celu wytworzenia urządzenia inkubuj formę z 10 mikrolitrami środka hydrofobicznego przez siedem minut i przepłucz ją 70% etanolem, a następnie dwukrotnie wodą dejonizowaną. Delikatnie dodaj wcześniej przygotowaną mieszaninę PDMS na formę, aż do osiągnięcia zamierzonej ostatecznej wysokości urządzenia. Inkubuj przykrytą formę w piekarniku nagrzanym do 80 stopni Celsjusza przez 18 minut.

Następnie delikatnie odłącz utwardzony blok PDMS od formy pod okapem z przepływem laminarnym i zanurz go w izopropanolu na 10 minut w szklanej szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą okulistycznego noża kłującego, ostrożnie wytnij środkową kwadratową część, a następnie wzdłuż krawędzi urządzenia. Następnie zanurz urządzenie w etanolu na 30 minut.

Pod okapem z przepływem laminarnym przenieś urządzenie na nową szalkę Petriego i pozostaw do wyschnięcia. Aby rozpocząć, zdobądź wydrukowaną w 3D formę i wyprodukuj urządzenie z polidimetylosiloksanu lub PDMS. Aby wysterylizować układ mikroelektrod lub MEA, zanurz go w 70% etanolu na 30 minut, a następnie trzykrotnie spłucz sterylną wodą dejonizowaną.

Za pomocą sterylnej cienkiej pęsety zamontuj urządzenie PDMS na wewnętrznej powierzchni MEA pod mikroskopem stereoskopowym. Wyrównaj jedną stronę urządzenia PDMS do środka wewnętrznego obszaru MEA. Pod wyciągiem dodaj jeden mililitr 0,1% roztworu polietylenininy do MEA i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Po pięciokrotnym przepłukaniu MEA wodą dejonizowaną, dodać jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych i inkubować MEA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zasiej MEA jednym mililitrem kultury zawierającej 1,8 miliona komórek neuronalnych wyizolowanych z mózgu szczeniaka szczura i inkubuj. Aby rozpocząć, wyprodukuj urządzenie PDMS z formy wydrukowanej w 3D.

Hodowla komórek neuronalnych w MEA zamontowanych w PDMS. Delikatnie zamontuj MEA w głównym stopniu wielokanałowego wzmacniacza elektronicznego umieszczonego w suchym 37 stopniach Celsjusza i inkubuj przez 10 minut. Uruchom oprogramowanie eksperymentatora, ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kiloherców i naciśnij rozpocznij akwizycję danych, aby rozpocząć akwizycję danych.

W panelu wyświetlania danych pojawiają się nieprzetworzone ślady aktywności zarejestrowanej poza siecią komórkową dla każdego kanału. Przejdź do panelu stymulatora oprogramowania, wybierz trzy pary sąsiednich mikroelektrod, które są aktywne podczas impulsów w całej sieci, i wybierz dwufazowy przebieg impulsu. Ustaw amplitudy pików na 800 miliwoltów, a czas trwania impulsu na 200 mikrosekund.

Aby uzyskać konfigurację bipolarną, wybierz i ustaw wartości sąsiednich elektrod. Na koniec ustaw rejestrator na 300 milisekund przed i 1000 milisekund po stymulacji, a następnie naciśnij rozpocznij akwizycję danych, aby rozpocząć nagrywanie. Obrazowanie na żywo ujawniło, że znakowane fluorescencyjnie neuryty wykazywały wzrost od źródła do celu w mikrokanale urządzenia PDMS.

Analiza elektrofizjologiczna wykazała, że wywołana odpowiedź źródła i celu w modułowych sieciach neuronalnych jest asymetryczna, podczas gdy kontrola bez PDMS nie wykazywała tego wzorca.