Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici
October 25th, 2018
Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.
Biochipy DNA są atrakcyjną platformą badawczą dla biologii samoresyntetycznej, pierwotnie opracowaną przez grupę BASF, która pozwala na działanie obwodów genowych in vitro przez dłuższy czas. Mamy nadzieję, że dzięki temu protokołowi technologia ta będzie dostępna dla szerszego grona badaczy. Nasza metoda, określana jako litografia beforowa, reprezentuje strategię immobilizacji DNA opartą na reakcji przemieszczenia nici DNA.
Siła tej techniki tkwi w jej wieloetapowych możliwościach litograficznych, łatwej odtwarzalności i komercyjnej dostępności wszystkich komponentów. Podobnie jak inne rozwiązania biochipowe, bephore można łączyć z różnymi technologiami. Na przykład funkcjonalne szczoteczki genowe mogą być montowane w mikrokompartmentach w celu ekspresji białek.
Na początek przygotuj mieszaninę RCA, mieszając pięć części wody z jedną częścią 30% roztworu amoniaku w szklanej zlewce. Podgrzej mieszaninę do 70 stopni Celsjusza na gorącej płycie, mieszając. Gdy osiągnie 70 stopni Celsjusza, dodaj jedną część 30% nadtlenku wodoru.
Następnie umieść wafel krzemowy o średnicy 100 milimetrów w roztworze, aby usunąć z niego materiał organiczny i cząstki. Po 30 minutach wyjmij podłoże, dokładnie spłucz je wodą z butelki do mycia i osusz pistoletem do azotu. Natychmiast przystąp do pegylacji podłoża.
Aby to osiągnąć, najpierw rozcieńczyć biotynę-PEG-silan w suchym toluenie do 5 miligramów na mililitr i mieszać roztwór, aż zostanie dobrze wymieszany. Po umieszczeniu substratu na szklanej szalce Petriego, powoli pipetować roztwór na podłoże, pokrywając całą powierzchnię, ale nie dopuszczać, aby roztwór przepływał przez krawędź. Po pokryciu powierzchni zamknij szalkę Petriego, a następnie dodaj dodatkową pokrywę.
Po 30 minutach zdejmij pokrywę i dodaj około 40 mililitrów alkoholu izopropylowego do szalki Petriego. Następnie wyjmij podłoże, ponownie dokładnie spłucz je alkoholem izopropylowym i osusz pistoletem do azotu. Po wyschnięciu przechowuj podłoże w ciemności, aż będzie potrzebne.
Przygotuj podłoże za pomocą noża do szkła lub skalpela, aby uformować kawałki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. Następnie dodaj prosty znak wyrównania, wykonując krótką rysę od środka w kierunku krawędzi podłoża. Zdmuchnij wszelkie małe cząstki z chipa za pomocą pistoletu do azotu.
Następnie wymieszaj dwie kropelki dwuskładnikowego kleju silikonowego i nałóż klej na powierzchnię chipa, pozostawiając obszar wokół końcówki półfabrykatu do zadrapania. Tam klej zapewnia hydrofobową barierę, utrzymując roztwory wodne na chipie. Ułatwia to kolejne etapy mycia i zmniejsza ilość DNA potrzebną do inkubacji.
W późniejszym kroku klej można łatwo odkleić. W kolejnych krokach fotorozszczepialne DNA jest obsługiwane tylko w środowisku światła żółtego. Przykryj chip około 10 mikrolitrami mieszanki bephore w temperaturze pokojowej i umieść chip w pudełku częściowo wypełnionym wodą, aby zmniejszyć parowanie.
Po godzinie umyj chip kilka razy PBS, aby usunąć niezwiązaną mieszankę bephore. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszanki pasywacyjnej do chipa. Po dwóch godzinach kilkakrotnie umyj chip PBS, aby usunąć niezwiązane środki pasywacyjne.
Przytnij wydrukowaną maskę fotograficzną do odpowiedniego rozmiaru, aby pasowała do odpowiedniego uchwytu maski. Włóż go w miejscu ogranicznika pola i użyj znaczników wyrównania, aby wyrównać maskę w uchwycie. Po umieszczeniu podłoża na stoliku mikroskopowym włóż czerwony filtr do ścieżki oświetlenia i skup się na powierzchni podłoża.
Następnie przejdź do obszaru podłoża, który zostanie odsłonięty. Następnie włóż uchwyt maski, zablokuj oświetlenie i zmień filtr UV na filtr UV. Przy słabym natężeniu światła otwórz migawkę i użyj aparatu, aby szybko ustawić ostrość maski na podłożu.
Gdy podłoże jest teraz wyrównane, a maska jest ostra, zablokuj ścieżkę światła do aparatu i oświetl podłoże o dużym natężeniu światła przez żądany czas ekspozycji. Po naświetleniu wyjmij próbkę z mikroskopu i ostrożnie usuń jak najwięcej buforu z podłoża, nie susząc go. Następnie dodaj od 10 do 20 mikrolitrów DNA z sekwencją do przyłączenia do powierzchni.
Umieść substrat w mokrym pudełku, aby nie wyschł, i inkubuj DNA na podłożu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby zaobserwować ekspresję genów w podziale na przedziały pod mikroskopem odwróconym, najpierw oddzielnie przygotuj dwie części uchwytu na próbkę. Zacznij od przyklejenia chipa bephore z unieruchomioną szczoteczką genową do uchwytu na wióry za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.
Następnie dodaj trochę smaru próżniowego wokół środkowego otworu w dolnej części uchwytu i włóż uchwyt na wióry. Teraz zamontuj górną część uchwytu. Wytnij cienki chip PDMS z jak najmniejszymi przegródkami, pozostawiając kanał otwarty z jednej strony, aby później umożliwić wymianę odpadów i cząsteczek prekursorowych przez dyfuzję Następnie poddaj plazmie szklane szkiełko nakrywkowe z tyłu chipa PDMS plazmą tlenową.
Natychmiast po zabiegu umieść chip PDMS na środku szkiełka podstawowego, tak aby przegródki były skierowane do góry. Następnie piecz szklankę z PDMS przez godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Na krótko przed montażem całego uchwytu na próbkę, należy poddać szkło działaniu plazmowe za pomocą chipa PDMS, tak jak poprzednio.
Następnie dodaj trochę tłuszczu próżniowego wokół dużego otworu górnego uchwytu i umieść na nim szklane szkiełko z PDMS. Delikatnie dociśnij szklankę do smaru. Ostrożnie wyjmij bufor z chipa i umyj go raz 10 mikrolitrami systemu do ponownego wyrażania siebie.
Następnie dodaj 60 mikrolitrów systemu do samodzielnego wyrażania na chipie i usuń dwuskładnikowy klej silikonowy z krawędzi. Teraz dodaj 20 mikrolitrów systemu odciągania do PDMS. Po umieszczeniu kropli na PDMS należy szybko sprawdzić w mikroskopie stereoskopowym, czy komory są dobrze mokre i bez pęcherzyków powietrza.
Jeśli są pęcherzyki powietrza, spróbuj je zmyć. Aby zmontować dwie części uchwytu oraz wyrównać komory i szczoteczki DNA, pracuj pod mikroskopem stereoskopowym. Unieruchom dolny uchwyt za pomocą ramienia chwytaka, aby dwie i nakrętki motylkowe były łatwo dostępne obiema rękami.
Włóż górny uchwyt do dolnego uchwytu i opuść go, aż kropelki bezkomórkowego systemu ekspresji połączą się. Następnie sprawdź, czy przedziały i znak wyrównania znajdują się w podobnym obszarze w płaszczyźnie XY. Od dołu przykręć nakrętki motylkowe, aż dotkną dolnej części uchwytu.
Wyrównując komory i chip w płaszczyźnie XY, delikatnie dokręć nakrętki motylkowe. Ten krok wymaga pewnego doświadczenia i zależy od konstrukcji uchwytu na próbki. PDMS należy dociskać do chipa tylko z delikatną siłą.
Następnie spryskaj wodą gąbkę w obudowie zapobiegającej parowaniu i włóż uchwyt do pudełka. Następnie napełnij pięciomililitrową strzykawkę dwuskładnikowym klejem silikonowym i użyj jej do uszczelnienia pudełka. Na koniec przenieś pudełko do mikroskopu o kontrolowanej temperaturze i zobrazuj szczoteczkę DNA i reakcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Dwuetapowy proces litograficzny, tutaj wykonywany na szkiełku podstawowym z beforu, pozwala uzyskać nakładające się na siebie wzory fluorescencyjnie znakowanych nici DNA. W tej demonstracji ekspresji genów na chipie, DNA jest unieruchomione w komorze po lewej stronie. Po wystawieniu na działanie mieszanki ekspresji, żółte białko fluorescencyjne YPet jest syntetyzowane z unieruchomionego DNA.
Aby ocenić aktywność systemu ekspresji genów, obserwuje się odzyskanie fluorescencji po etapie bielenia. Po dwóch godzinach intensywność fluorescencji szybko wróciła. Jednak po czterech i sześciu godzinach nie powrócił do normy, co wskazuje, że bez świeżego dopływu mieszanki ekspresji reakcja zakończyła się około czwartej godziny.
Chociaż ekspresja genów jest ograniczona w systemie zamkniętym, może być utrzymywana przez dłuższy czas, zaopatrując przedziały ekspresji w dodatkowe cząsteczki prekursorowe za pośrednictwem mikrofluidyki. Metoda bephore służy do immobilizacji oligonukleotydów lub DNA o długości genów, które można zastosować do konstruowania systemów oddziałujących szczotek DNA w celu samodzielnej ekspresji genów. Technika ta może być również wykorzystywana do innych zastosowań w biofizyce, takich jak badania fluorescencji pojedynczych cząsteczek.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyprodukować biochipy bephore z wafli lub szkiełek i zintegrować je ze swoimi projektami badawczymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia litograficzną procedurę nieruchomego umieszczania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchniach, ułatwiającą eksperymenty z ekspresją genów bezkomórkowych na biochipach. Metoda znana jako bephore litografia wykorzystuje reakcje wypierania nici DNA do skutecznego unieruchomienia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Genetyka
- Inżynieria biomedyczna
Tło
- Biochipy DNA są niezbędne dla samoreplikującej się syntetycznej biologii.
- Oryginalnie opracowane przez grupę BASF, umożliwiają operacje obwodów genowych in vitro.
- Technologia ma na celu poszerzenie dostępności dla naukowców.
- Bephore litografia jest nowatorskim podejściem do unieruchamiania DNA.
Cel badania
- Wprowadzić prostą i powtarzalną metodę unieruchamiania DNA.
- Poprawić funkcjonalność biochipów do badań nad ekspresją genów.
- Zapewnienie wszechstronnej platformy dla różnych zastosowań biotechnologicznych.
Stosowane metody
- Technika bephore litografii do unieruchamiania DNA.
- Wieloetapowe możliwości litograficzne dla złożonych struktur.
- Połączenie z funkcjonalnymi szczotkami genowymi dla ekspresji białek.
- Wykorzystanie komercyjnie dostępnych komponentów dla łatwości użycia.
Główne wyniki
- Skuteczne unieruchomienie DNA o długości genu na powierzchniach.
- Wykazana powtarzalność i skuteczność metody.
- Możliwość wydłużonej operacji obwodów genowych in vitro.
- Zgodność z różnymi podejściami biotechnologicznymi.
Wnioski
- Bephore litografia oferuje obiecującą metodę unieruchamiania DNA.
- Ta technika może znacząco postępować w badaniach nad ekspresją genów bezkomórkowych.
- Otwierają nowe możliwości dla zastosowań w syntetycznej biologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Functional surface-immobilization of genes enables sustained cell-free expression systems, supporting the development of dynamic gene regulatory networks and synthetic biology constructs. This approach provides a reproducible platform for mechanistic de-risking of genetic circuit behavior prior to cellular implementation. Compatibility with microfluidics and TIRF microscopy allows real-time monitoring of molecular interactions, enhancing predictive confidence in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through compartmentalized gene expression in defined microenvironments.
- Operational Value: Supports biological de-risking by isolating genetic variables and clarifying pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by allowing sustained expression of gene-length constructs for functional screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via stable DNA brush immobilization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through lithographically defined surface patterns.
- Scalability: Enables platform reuse and integration with microfluidic systems for continuous reagent supply and waste removal.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene circuit validation to preclinical modeling through sustained expression dynamics.
- Mechanistic De-risking: Supports predictive confidence by enabling observation of fluorescence recovery and decay kinetics under controlled conditions.
- Disease-Relevant System: Applicable to constructing interacting DNA brushes that mimic self-regulating gene networks for target pathway analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification through immobilized gene expression systems, supporting lead identification via sustained protein output.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing controlled, compartmentalized expression of gene-length DNA to test regulatory interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through stable, fluorescently labeled DNA immobilization compatible with TIRF-based readouts.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence recovery measurements that enable comparison of expression system performance over time.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling dynamic gene regulatory feedback relevant to pathway modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable lithographic platform for constructing diverse genetic circuits across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genetic circuit behavior, reduction of mechanistic ambiguity in synthetic biology design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via commercially available components and simple lithographic steps.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through sustained expression data, capital efficiency via reduced reliance on cellular systems.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of genetic constructs based on expression stability and feedback dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA handling, lithography, and fluorescence microscopy.
- Needs access to UV illumination systems, microfluidic chip fabrication tools, and temperature-controlled imaging platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent surface preparation and compartment alignment.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different substrate materials or compartment geometries.
- Practical limitation: Gene expression duration is constrained by reagent depletion, requiring microfluidic supply for extended operation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Chip Fabrication
2:43
Substrate Preparation for Photolithography
4:11
Projection Lithography
5:40
Holder Assembly for Compartmentalized Gene Expression
7:17
Setup for Gene Expression Analysis
9:23
Results: Bephore Lithography and Compartmentalized Gene Expression
10:29
Conclusion
