Name: Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę bephore lithography do unieruchamiania DNA na powierzchniach biochipów. Technika ta umożliwia wieloetapową litografię i ekspresję genów bezkomórkową, oferując prostą powtarzalność oraz komercyjną dostępność komponentów dla badań biotechnologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe dla tego projektu przez Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) i Europejską Radę ds. Badań Naukowych (umowa o grant nr 694410 - AEDNA). M.S.-S. potwierdza wsparcie ze strony DFG za pośrednictwem GRK 2062.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Litografia Bephore jest solidną i wszechstronną techniką wzorzystego unieruchomienia DNA lub RNA. Procedura obejmuje jednak kilka kroków, które - jeśli zostaną zmienione - mogą być źródłem awarii lub obniżonej wydajności systemu.
Kluczowym krokiem w wytwarzaniu chipów Bephore jest pegylacja podłoża, która zapewnia biokompatybilność powierzchni. W tym przypadku ważny jest etap czyszczenia za pomocą procedury RCA, ponieważ aktywuje on również powierzchnię do późniejszej silanizacji. Podczas właś...

Bezkomórkowe reakcje ekspresji genów są bardzo interesujące dla różnych zastosowań w biochemii, biotechnologii i biologii syntetycznej. Bezkomórkowa ekspresja białek odegrała zasadniczą rolę w przygotowaniu próbek czystych białek, które stanowiły podstawę licznych badań z zakresu biologii strukturalnej. Na przykład systemy bezkomórkowe zostały z powodzeniem wykorzystane do ekspresji kompleksów białkowych1 lub białek błonowych2, które są trudne do wytworzenia przy użyciu ekspresji opartej na komórkach. Warto zauważyć, że bezkomórkowe reakcje ekspresji genów zostały również wykorzystane do wyjaśnienia struktury kodu genetycznego, począwszy od przełomowych eksperymentów przeprowadzonych przez Nirenberga i Matthaeia w 1961 roku3.
Ostatnio ponownie pojawiło się zainteresowanie metodami bezkomórkowymi w biotechnologii i biologii syntetycznej4,5,6. Systemy bezkomórkowe mogą być wzbogacane o związki niebiologiczne, a składniki o różnym pochodzeniu biologicznym mogą być łatwiej łączone7. Mimo że systemy bezkomórkowe mają tę wyraźną wadę, że nie "rosną i nie dzielą się", można sobie wyobrazić przygotowanie otwartych, bezkomórkowych bioreaktorów z podstawowymi funkcjami metabolicznymi i pozwolenie im na syntezę metabolitów, gdy są wyposażone w proste dane wejściowe węgla i energii8. W rozwijającej się dziedzinie biologii syntetycznej systemy bezkomórkowe mogą być bardziej przewidywalnym "podwoziem" do realizacji syntetycznych funkcji biologicznych.
Obecnie, reakcje ekspresji genów bez komórek są przeprowadzane albo za pomocą ekstraktów komórkowych (z różnych źródeł, takich jak bakterie, drożdże, owady), albo systemów transkrypcji/translacji, które zostały zoptymalizowane pod kątem różnych zastosowań (np. ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych, produkcja białek błonowych, itp.). Popularny protokół przygotowania ekstraktu z komórek bakteryjnych (powszechnie określany jako TXTL) został niedawno dostarczony przez V. Noireaux i współpracowników9. Jego właściwości biofizyczne zostały dokładnie scharakteryzowane10, a system TXTL został już z powodzeniem wykorzystany do wykonania szeregu złożonych zadań biochemicznych: np. składanie funkcjonalnych bakteriofagów poprzez bezkomórkową ekspresję genomu faga11, synteza włókien białek bakteryjnych12, lub implementacja obwodów genowych bezkomórkowych13,14.
Innym systemem popularnym w bezkomórkowej biologii syntetycznej jest system PURE, który jest odtwarzany z oczyszczonych składników15,16. W porównaniu z systemem TXTL nie zawiera nukleaz ani maszynerii degradacji białek. Podczas gdy degradacja liniowego DNA, cząsteczek RNA lub białek jest mniejszym problemem w systemie PURE, szlaki rozpadu są w rzeczywistości ważne dla realizacji funkcji dynamicznych. W celu zmniejszenia efektu degradacji egzonukleazy liniowych matryc genów w systemie TXTL (poprzez RecBCD), należy dodać białko GamS chroniące końce. Zarówno TXTL, jak i system PURE są dostępne na rynku.
Temat ściśle związany z biologią bezkomórkową dotyczy badania wpływu podziału na reakcje biochemiczne oraz dalszego tworzenia sztucznych struktur podobnych do komórek lub protokomórek17,18,19,20. Badania nad sztucznymi komórkami zazwyczaj obejmują enkapsulację biochemicznego systemu reakcji wewnątrz przedziałów pęcherzykowych wykonanych z fosfolipidów lub innych amfifilów. Podczas gdy takie systemy pomagają badać podstawowe aspekty kompartmentalizacji lub pojawiania się struktur komórkowych i samoreplikujących, napotykają typowe problemy systemów zamkniętych: przy braku funkcjonującego metabolizmu i odpowiednich mechanizmów transportu błonowego trudno jest utrzymać reakcje przedziałowe przez dłuższy czas - cząsteczki paliwa są zużywane, a produkty odpadowe gromadzą się.
Ciekawą alternatywą dla podziału wewnątrz takich przedziałów naśladujących komórki jest przestrzenna organizacja materiału genetycznego za pomocą metod fotolitograficznych. Immobilizacja "genów na chipie" została zapoczątkowana przez grupę Bar-Ziv w Instytucie Weizmanna ponad dziesięć lat temu21. Do głównych problemów, które należało rozwiązać, należały niespecyficzna adsorpcja DNA i potencjalna denaturacja białek na powierzchni chipa. Bar-Ziv i in. opracowali dedykowany rezystor fotolitograficzny o nazwie "Daisy", który składał się z reaktywnego końcowego silanu do immobilizacji cząsteczek rezystu na powierzchniach dwutlenku krzemu, długiego dystansera z glikolu polietylenowego (PEG), który zapewniał biokompatybilność, oraz fotorozszczepialnej grupy czołowej, która została przekształcona w reaktywną aminę po naświetleniu światłem ultrafioletowym (UV). Wykazano, że Daisy może być używana do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu (o długości kilku kilopar zasad (kbp)) na powierzchni chipa. Z punktu widzenia fizyki polimerów systemy te reprezentowały szczotki polimerowe przeszczepione na stałe podłoże. Ze względu na polielektrolitowy charakter DNA, na konformację tych szczotek duży wpływ mają efekty osmotyczne i inne specyficzne dla jonów22,23.
Najważniejsze, wykazano, że geny unieruchomione przez substrat są nadal funkcjonalne i mogą być transkrybowane i tłumaczone na RNA i białka. Szczotki genowe są dostępne dla polimeraz RNA z solution24, a złożona makromolekularna mieszanina transkrypcji/translacji nie ulega denaturacji na powierzchni. Jedną z zalet immobilizacji składników genetycznych na podłożu jest to, że mogą one pracować w otwartym systemie reaktora mikroprzepływowego, który jest stale zasilany małymi cząsteczkami prekursorowymi i z którego można usunąć produkty przemiany materii25,26.
Niedawno opracowaliśmy wariant tej metody o nazwie Bephore (od Biocompatible electron-beam and photoresist)27, który opierał się wyłącznie na komercyjnie dostępnych komponentach i wykorzystywał specyficzne dla sekwencji reakcje inwazji nici DNA do realizacji prostej do wdrożenia wieloetapowej procedury litografii do tworzenia sztucznych komórek opartych na chipach. Schematyczny przegląd procedury przedstawiono na rysunku 1. Opiera się na cząsteczkach DNA spinki do włosów zawierających grupę fotorozszczepialną, które są unieruchomione na biokompatybilnej warstwie PEG. Fotorozszczepienie spinki do włosów odsłania jednoniciową sekwencję trzymania palca, przez którą interesujące cząsteczki DNA (zawierające "wypierającą" sekwencję DIS) mogą być przyłączane poprzez inwazję nici za pośrednictwem palca.
Chociaż Bephore jest potencjalnie prostszy do wdrożenia, Daisy pozwala na realizację bardzo gęstych i czystych "szczotek genowych", co ma zalety w niektórych zastosowaniach. W zasadzie jednak litografię Daisy i Bephore można było łatwo połączyć. Powiązana metoda litograficzna wykorzystująca przemieszczenie nici DNA do strukturyzacji szczotek DNA na złocie została wcześniej opracowana przez Huang i wsp., ale nie została wykorzystana w kontekście ekspresji genów bez komórek28,29.
W poniższym protokole podajemy szczegółowy opis produkcji szczotek DNA do ekspresji genów bez komórek przy użyciu metody Bephore. Opisujemy, w jaki sposób wytwarzane są chipy genowe i demonstrujemy zastosowanie wieloetapowej fotolitografii do przestrzennie ustrukturyzowanej immobilizacji genów na chipie. Omawiamy również wytwarzanie komór reakcyjnych i zastosowanie mikrofluidyki do przeprowadzania reakcji ekspresji genów w układzie scalonym.

<table><tbody><tr><td>Wafel krzemowy z dwutlenkiem krzemu 50 nm (podłoże Bephore)</td><td>Grubość wafla</td><td></td> Siegert <td>(&micro; m): 525 &plusmn; 25, Średnica (mm): 100</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy (do formy głównej PDMS)</td> <td>Grubość wafla</td><td></td> Siegert <td>(&mikro; m): 525 &plusmn; 25, Średnica (mm): 76,2 (3 ")</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane nr 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane nr 1.5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5 000</td></tr><tr><td>Bezwodny toluen</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Scientific S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>Zestaw do PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td></tr><tr><td>Żel Wizard SV i system czyszczenia PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Zestaw do czyszczenia PCR z kolumną spinową</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Bezkomórkowy system ekspresji</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PTFE (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>technologia mikrorezystu&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>technologia mikrorezystu&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>Twórca fotorezystu</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Promotor przyczepności</td></tr><tr><td>Dwuskładnikowy klej silikonowy</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żółta folia chroniąca przed promieniowaniem UV</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maski do fotolitografii</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Fotolitografia i obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Obiektyw 60x zanurzeniowy w wodzie</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Używany z Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>20x obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Używany z aparatem Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td></td><td>Fotometria</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Używany z Olympus BX51</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Używany z Olympus BX51</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluorescencja obrazowanie ekspresji genów</td></tr><tr><td>4x obiektyw</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Używany z aparatem Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Używany z Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td> Używany z inkubatorem klatkowym <td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Okolab</td><td>bold line</td> Używany z regulatorem ciśnienia <td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td></td><td>pomiar stężenia DNA</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, działająca przy 0,8 mbar z próbką w klatce Faradaya</td></tr></tbody></table>

funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilizacja genów na litograficznie strukturalnych powierzchniach pozwala na badanie procesów ekspresji genów w otwartym systemie mikroprzepływowego bioreaktora. W przeciwieństwie do innych podejść do sztucznych systemów komórkowych, taka konfiguracja pozwala na ciągłe zaopatrywanie w odczynniki do ekspresji genów i jednoczesne odprowadzanie produktów przemiany materii. Ułatwia to realizację bezkomórkowych procesów ekspresji genów w dłuższych okresach czasu, co jest ważne dla realizacji dynamicznych systemów regulacyjnego sprzężenia zwrotnego genów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wytwarzania biochipów genetycznych przy użyciu prostej w użyciu techniki litograficznej opartej na reakcjach przemieszczenia nici DNA, która wykorzystuje wyłącznie dostępne na rynku komponenty. Zapewniamy również protokół integracji genów podzielonych na przedziały z systemem mikroprzepływowym opartym na polidimetylosiloksanie (PDMS). Ponadto wykazaliśmy, że system jest kompatybilny z mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), która może być używana do bezpośredniej obserwacji oddziaływań molekularnych między DNA a cząsteczkami zawartymi w mieszance ekspresji.

Litografia dwuetapowa: Rycina 5 przedstawia wynik dwuetapowego procesu litograficznego na szkiełku przedmiotowym z nakładającymi się wzorami fluorescencyjnie znakowanych nici DIS.
Ekspresja białka fluorescencyjnego z pędzla genowego: Rycina 6 przedstawia ekspresję białka fluorescencyjnego YPet z unieruchomionego DNA. W kilku punktach czasowych ocenialiśmy tempo ekspresj...

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Biochipy DNA są atrakcyjną platformą badawczą dla biologii samoresyntetycznej, pierwotnie opracowaną przez grupę BASF, która pozwala na działanie obwodów genowych in vitro przez dłuższy czas. Mamy nadzieję, że dzięki temu protokołowi technologia ta będzie dostępna dla szerszego grona badaczy. Nasza metoda, określana jako litografia beforowa, reprezentuje strategię immobilizacji DNA opartą na reakcji przemieszczenia nici DNA.Siła tej techniki tkwi w jej wieloetapowych możliwościach litograficznych, łatwej odtwarzalności i komercyjnej dostępności wszystkich komponentów. Podobnie jak inne rozwiązania biochipowe, bephore można łączyć z różnymi technologiami. Na przykład funkcjonalne szczoteczki genowe mogą być montowane w mikrokompartmentach w celu ekspresji białek.Na początek przygotuj mieszaninę RCA, mieszając pięć części wody z jedną częścią 30% roztworu amoniaku w szklanej zlewce. Podgrzej mieszaninę do 70 stopni Celsjusza na gorącej płycie, mieszając. Gdy osiągnie 70 stopni Celsjusza, dodaj jedną część 30% nadtlenku wodoru.Następnie umieść wafel krzemowy o średnicy 100 milimetrów w roztworze, aby usunąć z niego materiał organiczny i cząstki. Po 30 minutach wyjmij podłoże, dokładnie spłucz je wodą z butelki do mycia i osusz pistoletem do azotu. Natychmiast przystąp do pegylacji podłoża.Aby to osiągnąć, najpierw rozcieńczyć biotynę-PEG-silan w suchym toluenie do 5 miligramów na mililitr i mieszać roztwór, aż zostanie dobrze wymieszany. Po umieszczeniu substratu na szklanej szalce Petriego, powoli pipetować roztwór na podłoże, pokrywając całą powierzchnię, ale nie dopuszczać, aby roztwór przepływał przez krawędź. Po pokryciu powierzchni zamknij szalkę Petriego, a następnie dodaj dodatkową pokrywę.Po 30 minutach zdejmij pokrywę i dodaj około 40 mililitrów alkoholu izopropylowego do szalki Petriego. Następnie wyjmij podłoże, ponownie dokładnie spłucz je alkoholem izopropylowym i osusz pistoletem do azotu. Po wyschnięciu przechowuj podłoże w ciemności, aż będzie potrzebne.Przygotuj podłoże za pomocą noża do szkła lub skalpela, aby uformować kawałki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. Następnie dodaj prosty znak wyrównania, wykonując krótką rysę od środka w kierunku krawędzi podłoża. Zdmuchnij wszelkie małe cząstki z chipa za pomocą pistoletu do azotu.Następnie wymieszaj dwie kropelki dwuskładnikowego kleju silikonowego i nałóż klej na powierzchnię chipa, pozostawiając obszar wokół końcówki półfabrykatu do zadrapania. Tam klej zapewnia hydrofobową barierę, utrzymując roztwory wodne na chipie. Ułatwia to kolejne etapy mycia i zmniejsza ilość DNA potrzebną do inkubacji.W późniejszym kroku klej można łatwo odkleić. W kolejnych krokach fotorozszczepialne DNA jest obsługiwane tylko w środowisku światła żółtego. Przykryj chip około 10 mikrolitrami mieszanki bephore w temperaturze pokojowej i umieść chip w pudełku częściowo wypełnionym wodą, aby zmniejszyć parowanie.Po godzinie umyj chip kilka razy PBS, aby usunąć niezwiązaną mieszankę bephore. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszanki pasywacyjnej do chipa. Po dwóch godzinach kilkakrotnie umyj chip PBS, aby usunąć niezwiązane środki pasywacyjne.Przytnij wydrukowaną maskę fotograficzną do odpowiedniego rozmiaru, aby pasowała do odpowiedniego uchwytu maski. Włóż go w miejscu ogranicznika pola i użyj znaczników wyrównania, aby wyrównać maskę w uchwycie. Po umieszczeniu podłoża na stoliku mikroskopowym włóż czerwony filtr do ścieżki oświetlenia i skup się na powierzchni podłoża.Następnie przejdź do obszaru podłoża, który zostanie odsłonięty. Następnie włóż uchwyt maski, zablokuj oświetlenie i zmień filtr UV na filtr UV. Przy słabym natężeniu światła otwórz migawkę i użyj aparatu, aby szybko ustawić ostrość maski na podłożu.Gdy podłoże jest teraz wyrównane, a maska jest ostra, zablokuj ścieżkę światła do aparatu i oświetl podłoże o dużym natężeniu światła przez żądany czas ekspozycji. Po naświetleniu wyjmij próbkę z mikroskopu i ostrożnie usuń jak najwięcej buforu z podłoża, nie susząc go. Następnie dodaj od 10 do 20 mikrolitrów DNA z sekwencją do przyłączenia do powierzchni.Umieść substrat w mokrym pudełku, aby nie wyschł, i inkubuj DNA na podłożu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Aby zaobserwować ekspresję genów w podziale na przedziały pod mikroskopem odwróconym, najpierw oddzielnie przygotuj dwie części uchwytu na próbkę. Zacznij od przyklejenia chipa bephore z unieruchomioną szczoteczką genową do uchwytu na wióry za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.Następnie dodaj trochę smaru próżniowego wokół środkowego otworu w dolnej części uchwytu i włóż uchwyt na wióry. Teraz zamontuj górną część uchwytu. Wytnij cienki chip PDMS z jak najmniejszymi przegródkami, pozostawiając kanał otwarty z jednej strony, aby później umożliwić wymianę odpadów i cząsteczek prekursorowych przez dyfuzję Następnie poddaj plazmie szklane szkiełko nakrywkowe z tyłu chipa PDMS plazmą tlenową.Natychmiast po zabiegu umieść chip PDMS na środku szkiełka podstawowego, tak aby przegródki były skierowane do góry. Następnie piecz szklankę z PDMS przez godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Na krótko przed montażem całego uchwytu na próbkę, należy poddać szkło działaniu plazmowe za pomocą chipa PDMS, tak jak poprzednio.Następnie dodaj trochę tłuszczu próżniowego wokół dużego otworu górnego uchwytu i umieść na nim szklane szkiełko z PDMS. Delikatnie dociśnij szklankę do smaru. Ostrożnie wyjmij bufor z chipa i umyj go raz 10 mikrolitrami systemu do ponownego wyrażania siebie.Następnie dodaj 60 mikrolitrów systemu do samodzielnego wyrażania na chipie i usuń dwuskładnikowy klej silikonowy z krawędzi. Teraz dodaj 20 mikrolitrów systemu odciągania do PDMS. Po umieszczeniu kropli na PDMS należy szybko sprawdzić w mikroskopie stereoskopowym, czy komory są dobrze mokre i bez pęcherzyków powietrza.Jeśli są pęcherzyki powietrza, spróbuj je zmyć. Aby zmontować dwie części uchwytu oraz wyrównać komory i szczoteczki DNA, pracuj pod mikroskopem stereoskopowym. Unieruchom dolny uchwyt za pomocą ramienia chwytaka, aby dwie i nakrętki motylkowe były łatwo dostępne obiema rękami.Włóż górny uchwyt do dolnego uchwytu i opuść go, aż kropelki bezkomórkowego systemu ekspresji połączą się. Następnie sprawdź, czy przedziały i znak wyrównania znajdują się w podobnym obszarze w płaszczyźnie XY. Od dołu przykręć nakrętki motylkowe, aż dotkną dolnej części uchwytu.Wyrównując komory i chip w płaszczyźnie XY, delikatnie dokręć nakrętki motylkowe. Ten krok wymaga pewnego doświadczenia i zależy od konstrukcji uchwytu na próbki. PDMS należy dociskać do chipa tylko z delikatną siłą.Następnie spryskaj wodą gąbkę w obudowie zapobiegającej parowaniu i włóż uchwyt do pudełka. Następnie napełnij pięciomililitrową strzykawkę dwuskładnikowym klejem silikonowym i użyj jej do uszczelnienia pudełka. Na koniec przenieś pudełko do mikroskopu o kontrolowanej temperaturze i zobrazuj szczoteczkę DNA i reakcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Dwuetapowy proces litograficzny, tutaj wykonywany na szkiełku podstawowym z beforu, pozwala uzyskać nakładające się na siebie wzory fluorescencyjnie znakowanych nici DNA. W tej demonstracji ekspresji genów na chipie, DNA jest unieruchomione w komorze po lewej stronie. Po wystawieniu na działanie mieszanki ekspresji, żółte białko fluorescencyjne YPet jest syntetyzowane z unieruchomionego DNA.Aby ocenić aktywność systemu ekspresji genów, obserwuje się odzyskanie fluorescencji po etapie bielenia. Po dwóch godzinach intensywność fluorescencji szybko wróciła. Jednak po czterech i sześciu godzinach nie powrócił do normy, co wskazuje, że bez świeżego dopływu mieszanki ekspresji reakcja zakończyła się około czwartej godziny.Chociaż ekspresja genów jest ograniczona w systemie zamkniętym, może być utrzymywana przez dłuższy czas, zaopatrując przedziały ekspresji w dodatkowe cząsteczki prekursorowe za pośrednictwem mikrofluidyki. Metoda bephore służy do immobilizacji oligonukleotydów lub DNA o długości genów, które można zastosować do konstruowania systemów oddziałujących szczotek DNA w celu samodzielnej ekspresji genów. Technika ta może być również wykorzystywana do innych zastosowań w biofizyce, takich jak badania fluorescencji pojedynczych cząsteczek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyprodukować biochipy bephore z wafli lub szkiełek i zintegrować je ze swoimi projektami badawczymi.

functional-surface-immobilization-genes-using-multistep-strand

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach.  Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie.  Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Te badania donoszą o odwracalnym przyczepianiu wektorów genów adenowirusa do bezpowłokowych metalowych powierzchni stentów i modelowych dysków siatkowych. Przedłużone uwalnianie cząstek wirusa kompetentnych do transdukcji, uzależnione od hydrolizy środków sieciujących stosowanych do immobilizacji wektorów, skutkuje trwałą, specyficzną dla miejsca ekspresją transgenu w komórkach naczyniowych i stentowanych tętnicach.

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Poznaj metodę bephore lithography do unieruchamiania DNA na powierzchniach biochipów. Technika ta umożliwia wieloetapową litografię i ekspresję genów bezkomórkową, oferując prostą powtarzalność oraz komercyjną dostępność komponentów dla badań biotechnologicznych.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Przeglądaj więcej filmów