Name: Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek bezwodnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną syntezę oligosacharydów i funkcjonalizację nanocząstek bezwodnika metodą hydroput. Technika ta umożliwia precyzyjne kierowanie komórek prezentujących antygen w badaniach nad układem nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować U.S. Army Medical Research and Materiel Command (grant nr W81XWH-10-1-0806) oraz National Institutes of Health (grant nr U19 AI091031-01 i grant nr 1R01GM090280) za wsparcie finansowe. BN dziękuje za Balloun Professorship in Chemical and Biological Engineering, a NLBP dziękuje za Wilkinson Professorship of Interdisciplinary Engineering. Dziękujemy Julii Veli za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów z funkcjonalizacją nanocząstek.

1. Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów
<ol>
 <li>Przed zautomatyzowaną syntezą dimannosydy w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje się odpowiednio chronionego donora cukru, zazwyczaj trichloroacetymidydian, oraz akceptora, głównie alkenylowy alkohol fluorowy.</li>
 <li>Tworzony jest program dla zautomatyzowanej syntezy dimannosydy. Schematyczna reprezentacja podstawowej zautomatyzowanej procedury przedstawiona jest na Rysunku 2. W programie zapewnia się, aby przed dodaniem promotora mieszanina donora i akceptora była mieszana przez co najmniej 30 min.</li>
 <li>Roztwory syntetycznego donora, akceptora oraz trifluorometanosulfonianu trimetylosililu przygotowuje się w dichlorometanie. Toluenu i dichlorometanu najczęściej używa się do reakcji glikozylowania.</li>
 <li>Przygotowuje się również roztwory odczynników do usuwania czasowych grup ochronnych w 80% metanolu i 100% metanolu.</li>
 <li>Przed uruchomieniem programu należy upewnić się, że wilgotność względna w komorze automatyzacyjnej wynosi 30% lub mniej. Wysoka wilgotność jest niekorzystna dla reakcji glikozylowania.</li>
 <li>Po uruchomieniu programu ramię robota sekwencyjnie przenosi roztwory donora i akceptora do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę miesza się przez 30 min.</li>
 <li>Następnie ramię robota przenosi od 0,2 do 0,3 ekwiwalentów trifluorometanosulfonianu trimetylosililu do mieszaniny, zazwyczaj w temperaturze pokojowej, choć można osiągnąć niższe temperatury, np. -20 °C. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 min.</li>
 <li>Po 30 min reakcja zostaje zatrzymana i pobierana jest mała alikwota w celu monitorowania postępu reakcji. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją kontynuować, a ostatecznie zmodyfikować wymagany czas.</li>
 <li>Po zakończeniu reakcji mieszanina reakcyjna jest przenoszona na kartridże do fluorowej ekstrakcji do fazy stałej (FSPE) zawierające żel krzemionkowy modyfikowany C8F17 w celu oczyszczenia.</li>
 <li>Kartridże są najpierw płukane 80% mieszaniną metanolu i wody (8 mL), aby usunąć frakcję niefluorową.</li>
 <li>Następnie kartridże płucze się 100% metanolem, aby uzyskać pożądany produkt z etykietą fluorową. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, urządzenie można zatrzymać, a produkty reakcji usunąć w celu oczyszczenia innymi metodami.</li>
 <li>Po cyklu oczyszczania ramię robota dozuje metanolan sodu do fiolki reakcyjnej. Reakcję miesza się przez 2 hr. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją ponownie kontynuować przez dłuższy czas, a ostatecznie zmodyfikować zaprogramowany czas wymagany.</li>
 <li>Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany metodą FSPE, a następnie poddawany rozpuszczaniu w bezwodnym toluenie, po czym następuje odparowanie w celu usunięcia resztkowej wody.</li>
 <li>Następnie cykl (od kroku 6 do 13) jest powtarzany aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej.</li>
 <li>Chroniony produkt otrzymany z automatyzacji jest następnie poddawany dalszemu oczyszczaniu i pełnej charakterystyce za pomocą technik takich jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Pełne usuwanie grup ochronnych (usunięcie wszystkich pozostałych grup ochronnych) końcowej cząsteczki docelowej odbywa się zazwyczaj poza platformą automatyzacyjną, ponieważ zazwyczaj wiąże się to z wydzielaniem wybuchowego wodoru i użyciem palladu. Końcowy etap usuwania grup ochronnych przeprowadzono laboratoryjnie poza platformą automatyzacyjną. Pierwszym krokiem była ozonoliza wiązania podwójnego w etykiecie fluorowej, a następnie utlenianie powstałego aldehydu do kwasu karboksylowego. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej. Ostatnim etapem było usunięcie grup eteru benzylowego poprzez uwodornienie katalizowane palladem. Produkt przepuszczono przez warstwę celitu, aby usunąć pallad i uzyskać czysty produkt końcowy.</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowa funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek
<ol>
 <li>Wysokoprzepustowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząstek odbywa się zgodnie z protokołem i konfiguracją robotyczną opisaną przez Petersen et al19. Systemy kopolimerowe wykorzystane do wytwarzania cząstek opierają się na kwasie sebacowym (SA) i 1,6-bis(para-karboksyfenoksy)heksanie (CPH) oraz 1,8-bis(para-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoctanie (CPTEG) i CPH. Schematyczny rysunek zastosowanego aparatu do robotycznego nanoszenia jest przedstawiony na Rysunku 1b.</li>
 <li>Po wytworzeniu nanocząstek uchwyt zawierający probówki z biblioteką nanocząstek zostaje ponownie przytwierdzony do platformy z siłownikiem liniowym.</li>
 <li>W celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząstek polianhydrydowych przeprowadza się reakcję sprzęgania aminy z kwasem karboksylowym 20, składającą się z dwóch następujących po sobie etapów.</li>
 <li>W pierwszej reakcji strzykawka w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana 10 ekwiwalentami (eq.) (ekwiwalenty średniego molowego stężenia kwasu karboksylowego na powierzchni cząstki) chlorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i 10 eq. etylenodiaminy w roztworze wodnym, natomiast strzykawka w drugiej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana 12 eq. N-hydroksysukcynimidu (NHS) w roztworze wodnym.</li>
 <li>Za pomocą programu LabVIEW zawiesiny reagentów są nanoszone do biblioteki nanocząstek*.</li>
 <li>Następnie każda próbka jest poddawana sonikacji (30 s przy 40 Hz), a uchwyt do probówek zostaje odłączony od platformy robotycznej.</li>
 <li>Zawiesiny nanocząstek są inkubowane przez 9 h** przy stałej rotacji w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Po upływie czasu reakcji probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i przenoszone z powrotem do stacji robotycznej w celu przeprowadzenia dwóch etapów płukania.</li>
 <li>Do płukania jedna strzykawka pozostaje pusta i jest zamontowana w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej, podczas gdy strzykawka w drugiej pompie jest napełniona zimną wodą. Nadosad w każdej probówce jest pobierany do pustej strzykawki, a druga pompa nanosi zimną wodę.</li>
 <li>Homogenizacja zawiesiny nanocząstek jest przeprowadzana zgodnie z opisem w kroku 2.6. Następnie probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i przeprowadzany jest drugi etap płukania, zgodnie z opisem w kroku 2.9.</li>
 <li>W drugiej reakcji stosuje się dwa etapy nanoszenia. W pierwszym etapie nanoszenia jedna pompa podaje 12 eq. EDC, a druga pompa podaje 12 eq. NHS.</li>
 <li>Drugi etap nanoszenia obejmuje 10 eq. konkretnego sacharydu w pierwszej i drugiej pompie (tj. galaktozy, laktozy lub di-mannozy)*** oraz trzecią pompę z 10 eq. kwasu glikolowego (używanego jako kontrola****).</li>
 <li>Zawiesiny nanocząstek są homogenizowane zgodnie z opisem w kroku 2.6 i inkubowane przez 9 h przy stałej rotacji w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Po zakończeniu czasu reakcji przeprowadza się etap płukania zgodnie z opisem w krokach 2.8, 2.9 i 2.10.</li>
 <li>Zfunkcjonalizowana biblioteka nanocząstek jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu wysuszenia przez co najmniej 2 h.</li>
 <li>Zfunkcjonalizowane nanocząstki są następnie charakteryzowane za pomocą spektroskopii rentgenowskiej fotoelektronów (XPS) oraz wysokoprzepustowego testu kwasem fenolo-siarkowym w celu oznaczenia odpowiednio składu powierzchniowego i stężenia sacharydu. Skaningowa mikroskopia elektronowa i dynamiczne rozpraszanie światła są wykorzystywane do wyznaczenia rozmiaru cząstek, rozkładu wielkości oraz ładunku powierzchniowego.</li>
</ol>
Uwagi: *Objętości osadzania różnią się w zależności od masy nanocząsteczek zawartych w każdej probówce. 
**Czas trwania pierwszej i drugiej reakcji może zostać zmieniony w celu dostosowania końcowego stężenia sacharydów. 
***Każdy sacharyd jest nanoszony do probówek w zależności od pożądanej grupy. 
****W przypadku specyficznej reakcji zastosowanej w niniejszym badaniu do przyłączania węglowodanów, kwas glikolowy jest używany jako kontrola łącznika, ponieważ odchronione sacharydy mają już tę cząsteczkę połączoną kowalencyjnie, co umożliwia dalsze przyłączenie do powierzchni nanocząsteczek.
3. Reprezentatywne wyniki
W pełni chroniony dimannozyd przedstawiony na Rysunku 2 został zsyntetyzowany przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Zsyntetyzowany związek scharakteryzowano za pomocą 1H NMR w spektrometrze VXR 400 MHz, stosując CDCl3 jako rozpuszczalnik. Widmo NMR przedstawiono na Rysunku 3.
Wykorzystując opisaną w niniejszej pracy wysokoprzepustową metodę wytwarzania i funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydu, pomyślnie przeprowadzono przyłączenie dimannozy, laktozy i galaktozy 10, 11. Przy zastosowaniu tego układu zidentyfikowano optymalne warunki reakcji (tj. temperaturę i czas reakcji), aby uzyskać pożądaną funkcjonalizację i morfologię nanocząsteczek. Gdy reakcję przeprowadzono w temperaturze 4 °C zamiast w temperaturze pokojowej, w badaniu SEM zaobserwowano zmniejszenie agregacji nanocząsteczek (dane nie przedstawiono). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne wyniki charakterystyki funkcjonalizowanych nanocząsteczek 50:50 CPTEG:CPH z dimannozą lub laktozą, zsyntetyzowanych w 4 °C. Dane wskazują na niewielki wzrost średnicy nanocząsteczek wynikający z funkcjonalizacji. Podczas gdy nanocząsteczki niefunkcjonalizowane posiadały ujemny potencjał zeta wynoszący ok. -20 mV, cząstki funkcjonalizowane wykazały dodatnią wartość potencjału zeta, co dowodzi pomyślnej funkcjonalizacji powierzchni nanocząsteczek. Laktoza i dimannoza są cukrami obojętnymi; jednakże za dodatni potencjał zeta mogą odpowiadać wolne grupy aminowe z łącznika etylenodiaminowego wykorzystanego do przyłączenia sacharydów.
Czas reakcji jest kolejną zmienną, która może wpływać zarówno na ostateczną morfologię nanocząstek, jak i na uzyskany stopień przyczepienia cukrów. Poprzez regulację czasu reakcji można kontrolować końcowe stężenie cukrów przyczepionych do powierzchni nanocząstek, co przedstawiono na Rysunku 4A. Zgodnie z oczekiwaniami, stężenie dimannozy na powierzchni nanocząstek 50:50 CPTEG:CPH wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 hr. Nanocząstki funkcjonalizowane przy całkowitym czasie reakcji 24 hr zostały wykorzystane do oceny ich zdolności do celowania w receptory lektynowe (CLR) w komórkach dendrytycznych (DCs) myszy pochodzących z szpiku kostnego. Do oceny ekspresji dwóch receptorów CL (tj. CIRE (CD209, DC-SIGN) oraz receptora mannozy (CD206)) po stymulacji nanocząstkami niefunkcjonalizowanymi oraz funkcjonalizowanymi laktozą i dimannozą wykorzystano cytometrię przepływową (Rysunek 4B). Wyższą ekspresję obu receptorów, co świadczy o skutecznym celowaniu, uzyskano po stymulacji komórek nanocząstkami funkcjonalizowanymi zarówno laktozą, jak i dimannozą. Jednakże cząstki funkcjonalizowane dimannozą wykazały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na specyficzność tego ligandu względem badanych receptorów.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Typ nanocząstek</td>
 <td>Średnia średnica cząstek (nm)</td>
 <td>Średni potencjał ζ cząstek (mV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Niefunkcjonalizowane</td>
 <td>162 ± 43</td>
 <td>-20 ± 0.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laktoza</td>
 <td>235 ± 34</td>
 <td>26 ± 2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Di-mannoza</td>
 <td>243 ± 32</td>
 <td>30 ± 4.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Charakterystyka nanocząsteczek. Nanocząsteczki niefunkcjonalizowane i funkcjonalizowane scharakteryzowano za pomocą quasi-elastycznego rozpraszania światła oraz pomiarów potencjału zeta. Dane dotyczące rozmiaru cząsteczek reprezentują wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD) z danych dynamicznego rozpraszania światła zebranych w trzech niezależnych eksperymentach. Dane dotyczące potencjału zeta reprezentują wartość średnią ± SD z trzech niezależnych odczytów. Zmiana znaku potencjału zeta wykazuje, że cukier został efektywnie sprzężony z powierzchnią nanocząsteczki 50:50 CPTEG:CPH.
<img alt="Schemat chemii nanocząstek i węglowodanów, układ spektroskopowy, analiza danych, wiązanie receptorów." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Graficzna reprezentacja podejścia polegającego na funkcjonalizacji węglowodanowej nanocząstek polianhydrydowych oraz przykład bibliotek funkcjonalizowanych nanocząstek, które można zaprojektować za pomocą opisanego podejścia wysokoprzepustowego. (B) Schematyczna reprezentacja zautomatyzowanego urządzenia do nanoszenia wykorzystywanego do funkcjonalizacji cząstek, które składa się z (i) trzech pomp NE 1000; (ii) platformy robotycznej zintegrowanej z dwoma siłownikami (Zaber): jednym do ruchu w kierunku x i drugim do ruchu w kierunku y; (iii) drugiej platformy robotycznej z dwoma sąsiednimi statywami (przystosowanymi do probówek i kuwet) składającej się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku (x, y i z). Pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłowniki i pompy są sterowane przez komputer za pomocą oprogramowania LabVIEW. Schemat nie jest zachowany w skali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3967/3967fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Schemat automatycznej syntezy; montaż węglowodanów; 1,5 cyklu; proces chemii organicznej." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Graficzna prezentacja automatycznej syntezy iteracyjnej węglowodanów na przykładzie mannozy.
<img alt="Wykres widma NMR; piki przesunięcia chemicznego; analiza struktury cząsteczkowej; wyniki spektroskopii." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widmo 1H NMR chronionego dimannozydu.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający stężenie cząstek w czasie reakcji; analiza ekspresji CIRE i CD206." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. (A) Wpływ czasu reakcji na stężenie sacharydu na powierzchni nanocząsteczek. Na przedstawionych danych nanocząsteczki CPTEG:CPH w stosunku 50:50 zostały funkcjonalizowane dimannozą w różnych odstępach czasu, a reakcja odbywała się w temperaturze 4 °C. Przedstawiono średnią oraz błąd standardowy z dwóch niezależnych eksperymentów funkcjonalizacji. (B) Nanocząsteczki funkcjonalizowane laktozą i dimannozą skutecznie celują w DC-SIGN (CIRE, CD209) oraz receptor mannozowy (CD206) w komórkach dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, co wykazano poprzez zwiększoną ekspresję tych dwóch markerów po stymulacji funkcjonalizowanymi nanocząsteczkami 50:50 CPTEG:CPH w porównaniu z ekspresją uzyskaną przy użyciu cząstek niefunkcjonalizowanych.

<ol><li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+Consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+%22pathogen-like%22+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose-functionalized+%22pathogen-like%22+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
<li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials%3A+developing+the+next+generation+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li>
<li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose%2FN-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686(2002).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+through+C-type+lectin+receptors%3A+shaping+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+oligosaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Carb.+Res%22%5BJournal%5D)">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li>
<li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis%3A+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li>
<li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li>
<li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+T+%22Solid-phase+peptide+synthesis%3A+a+practical+approach%22">Solid-phase peptide synthesis: a practical approach</a>. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+chemistry+and+the+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li>
<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
<li>Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+NL+%22Chemical+Glycobiology%22">Chemical Glycobiology</a>. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).</li>
</ol>

NLBP jest współzałożycielem i posiada udziały w firmie zajmującej się węglowodanami LuCella Biosciences, Inc.

Skuteczność węglowodanów jako czynników celujących, kierujących oddziaływania nanocząstek do komórek odpornościowych, została wykazana we wcześniejszych badaniach 10, 11. Poprzednie badania w naszych laboratoriach wykazały, że specyficzne cukry przyłączone do nanocząstek polianhydrydowych są w stanie celować w różne receptory lektynowe (CLR) na komórkach prezentujących antygen (APC), zwiększając tym samym aktywację komórek odpornościowych, co może mieć istotne znaczenie dla dalszej aktywacji limfocytów T ...

<table><tbody><tr><td>Zmotoryzowany stół XYZ: 3x T-LSM050A, zakres ruchu 50 mm na oś</td><td>Zaber Technologies</td><td>T-XYZ-LSM050A-KT04</td><td></td></tr><tr><td>Jednopompowa pompa strzykawkowa NE-1000</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wielorazowe szklane probówki do hodowli Pyrex* Vista* bez kołnierza</td><td>Corning</td><td>07-250-125</td><td></td></tr><tr><td>ASW 1000</td><td>Chemspeed Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>776671-35</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki gazoszczelne SGE, Luer Loc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>509507</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator XL-2000</td><td>Qsonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>Rotator do mini-probówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

W celu racjonalnego projektowania skutecznych nośników szczepionek konieczne jest zastosowanie podejść transdyscyplinarnych, obejmujących takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia. Platformy oparte na nanocząsteczkach mogą przedłużać obecność antygenów szczepionkowych, co może poprawić immunogenność szczepionki1. Badano szereg polimerów biodegradowalnych jako nośniki do dostarczania szczepionek1; w szczególności cząstki polianhydrydowe wykazały zdolność do zapewnienia przedłużonego uwalniania stabilnych antygenów białkowych oraz do aktywacji komórek prezentujących antygen i modulowania odpowiedzi immunologicznej2-12.
Projekt molekularny tych nośników szczepionek musi integrować racjonalny dobór właściwości polimerów oraz włączenie odpowiednich czynników celujących. Wysokoprzepustowa zautomatyzowana synteza ligandów celujących i funkcjonalizowanych cząsteczek jest potężnym narzędziem, które zwiększy możliwość badania szerokiego zakresu właściwości i doprowadzi do opracowania powtarzalnych urządzeń do dostarczania szczepionek.
Wykazano, że dodanie ligandów celujących, zdolnych do bycia rozpoznawanymi przez specyficzne receptory na komórkach odpornościowych, pozwala na modulowanie i dostosowywanie odpowiedzi immunologicznych10,11,13. Receptory lektynowe typu C (CLRs) są receptorami rozpoznającymi wzorce (PRRs), które rozpoznają węglowodany obecne na powierzchni patogenów. Stymulacja komórek odpornościowych za pośrednictwem CLRs umożliwia zwiększoną internalizację antygenu i jego późniejszą prezentację w celu dalszej aktywacji limfocytów T14,15. W związku z tym cząsteczki węglowodanowe odgrywają istotną rolę w badaniu odpowiedzi immunologicznych; jednakże zastosowanie tych biomolekuł często utrudnia brak dostępności strukturalnie dobrze zdefiniowanych i czystych węglowodanów. Platforma automatyzacyjna oparta na iteracyjnych reakcjach w fazie ciekłej może umożliwić szybką i kontrolowaną syntezę tych trudnych syntetycznie cząsteczek przy użyciu znacznie mniejszych ilości bloków budulcowych niż tradycyjne metody w fazie stałej16,17.
W niniejszym pracy przedstawiamy protokół zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej, takich jak ligandów celujących opartych na mannozie, z wykorzystaniem fluoryzowanej ekstrakcji w fazie stałej do oczyszczania produktów pośrednich. Po opracowaniu zautomatyzowanych metod otrzymywania czynnika celującego opartego na węglowodanach, opisujemy metody ich przytwierdzania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydowych przy użyciu zautomatyzowanego zestawu robotycznego sterowanego programem LabVIEW, zgodnie z wcześniejszym opisem10. Funkcjonalizacja powierzchni węglowodanami wykazała skuteczność w celowaniu w CLR10,11, a zwiększenie wydajności metody wytwarzania w celu odkrycia złożoności związanych z systemem wieloparametrycznym będzie miało dużą wartość (Rycyna 1a).

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Należy wykorzystać podejścia transdyscyplinarne, obejmujące takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia, aby racjonalnie zaprojektować ...

W tym artykule wideo opisujemy nowy protokół hydro-put dla zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej oraz funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydowych. W przypadku tych węglowodanowych czynników celujących, w pierwszej kolejności cząsteczki węglowodanów są syntetyzowane przy użyciu zautomatyzowanego systemu, który wykorzystuje syntezę w fazie ciekłej zamiast syntezatorów w fazie stałej. Następnie produkty pośrednie oligosacharydów są oczyszczane za pomocą ekstrakcji w fazie stałej typu florist, czyli FSPE.Wytworzone cząsteczki węglowodanów charakteryzuje się za pomocą NMR, a następnie przyłącza się je do nanocząsteczek polianhydrydu poprzez konjugację karbo-IDE. Na koniec funkcjonalizowane węglowodanami nanocząsteczki charakteryzuje się za pomocą spektroskopii fotoelektronów emitowanych promieniami rentgenowskim oraz testu z kwasem fenylosulfonowym metodą hydro putt. Ostatecznie, wykorzystując opisaną tutaj metodologię hydro put, wyznaczono warunki reakcji optymalizujące morfologię nanocząsteczek oraz gęstość węglowodanów na powierzchni cząstek.Główną zaletą tej metody w porównaniu do istniejących rozwiązań, takich jak synteza oligosacharydów na podłożu stałym, jest wykorzystanie znacznie mniejszej ilości bloków budulcowych. W tej metodzie zazwyczaj stosuje się od dwóch do trzech ekwiwalentów zamiast od 10 do 20 ekwiwalentów. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy wykazaliśmy skuteczność efektów powierzchniowych oraz funkcjonalizacji nanocząsteczek polihydroksylowych przy użyciu węglowodanów w celu celowania w receptory na komórkach antydentynowych. Następnie chcieliśmy zaprojektować system wysokoprzepustowy, który umożliwiłby nam przesiewanie wielu parametrów zaangażowanych w wytwarzanie i zastosowanie tych nowatorskich nośników.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opracowanie zautomatyzowanych platform do wysokoprzepustowej syntezy oligosacharydów oraz ich przywiązania do cząsteczek polimerowych jest nowym obszarem badań, dla którego dostępna jest ograniczona dokumentacja. Przed zautomatyzowaną syntezą kwasu diano, odpowiednio chroniony donor cukru, zazwyczaj trichloroacetamid, oraz akceptor, głównie w alkoholu fluorowym, są syntetyzowane metodą tradycyjną i przygotowywane w chlorometanie; należy również przygotować trimetylosilan, trifluorometanosulfonian w chlorometanie, 80% methanol oraz 100% methanol. Należy upewnić się, że wilgotność względna w pomieszczeniu oraz w komorze automatyzacji nie przekracza 30%.Wysoka wilgotność jest szkodliwa dla reakcji glikozylowania. Poniższe etapy są wykonywane przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Pierwsze glikozylowanie przeprowadza się z użyciem donora i alkoholu florystycznego.Po zakończeniu reakcji otrzymaną cząsteczkę cukru z etykietą florist jest oczyszczana za pomocą FSPE. Następnie tymczasowa grupa ochronna jest usuwana przy użyciu tlenku sodu i metanolu, a produkt ponownie poddawany jest oczyszczaniu metodą FSPE. Po tym etapie cukier z etykietą florist służy jako akceptor i jest sprzęgany z tym samym donorem w celu otrzymania disacharydu; uzyskany disacharyd jest oczyszczany za pomocą FSPE przed dalszymi etapami.Umieść odczynniki, w tym promotor donor-akceptor, wodę z 80% metanolem, 100% metanol oraz metanolan sodu, na platformie robotycznej i uruchom program. Ramię robota pobierze donor, a następnie akceptor z fiolek i przeniesie je do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę donora i akceptora miesza się przez 30 minut.Po upływie 30 minut ramię robotyczne przenosi katalityczny trifluorometanosulfonian trimetylsilyl do mieszaniny. Następnie roztwór jest mieszany przez kolejne 30 minut. Po zakończeniu mieszania program zostaje wstrzymany.Pobrać alikwot 10 µL, aby sprawdzić za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC), czy reakcja dobiegła końca. Jeśli reakcja jest zakończona, cząsteczka akceptora nie będzie widoczna. Jeśli reakcja nie jest zakończona, akceptor na płycie TLC nadal będzie widoczny.Jeśli tak się stanie, należy przerwać program, zresetować czas glikozylacji na około 30 minut i dodać nadmiar promotora trimetylosilofluorometanosulfonianu. Po zakończeniu reakcji należy przejść do następnego kroku. Po ukończeniu reakcji robot przenosi mieszaninę reakcyjną do kartridży FSPE zawierających modyfikowany żel krzemionkowy C9 F17 w celu przeprowadzenia oczyszczania.Następnie wkłady przemywa się ośmioma mililitrami 80% methanol, a następnie ośmioma mililitrami 100% methanol. Aby wyeliminować frakcję nie-floris, przesącz zbiera się do fiolki, by uzyskać pożądany produkt znakowany floris. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, należy zatrzymać robota i usunąć odpowiednie produkty reakcji.W zależności od struktury, donory mogą być niezwykle nieaktywne, a część cząsteczek akceptora florystycznego może pozostać nawet po dodaniu odpowiedniej ilości promotora. W takim przypadku FSPE nie będzie wystarczająco wydajne do oczyszczania, dlatego po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać dodatkowe oczyszczanie za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Ramię robotyczne dozuje metanolan sodu do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszanka jest mieszana przez dwie godziny na platformie robotycznej; jeśli analiza TLC wykaże, że reakcja nie została zakończona, czas inkubacji należy przedłużyć o około godzinę.Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany za pomocą FSPE w taki sam sposób jak wcześniej. Następnie należy wyjąć produkt reakcji z robota i na blacie laboratoryjnym poddać go rozpuszczeniu w bezwodnym toluenie, a następnie odparowaniu w celu usunięcia resztek wody. Po wysuszeniu próbki należy ponownie umieścić ją w robocie i powtórzyć ten sam cykl, obejmujący glikozylację oraz oczyszczanie metodą FSPE.Głęboka ochrona tymczasowej grupy ochronnej, a następnie glikozylacja, są powtarzane aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej; aby usunąć grupę ochronną z produktu otrzymanego w procesie automatycznym, należy wyjąć fiolkę z robota. Końcowe etapy procedury wykorzystują wybuchowy wodór i muszą być przeprowadzone poza platformą automatyczną. Na blacie laboratoryjnym następuje ozonoliza wiązania podwójnego w znaczniku florystycznym, a następnie utlenianie powstałego aldehydu do kwasu karboksylowego.Oczyszczono otrzymany produkt za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym na stole laboratoryjnym, wykorzystując mieszaninę 30% metanolu w dichlorometanie. Następnie, aby usunąć grupy benzoeterowe poprzez uwodornienie katalizowane palladem, produkt przepuszczono przez podkład z adsorbentu (satellite pad) w celu usunięcia palladu i otrzymania czystego produktu końcowego. Produkt w pełni scharakteryzowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).Wysokoprzepływowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząstek są przeprowadzane zgodnie z protokołem opisanym przez Petersona i współpracowników. Jak wspomniano w towarzyszącym dokumencie, zautomatyzowane urządzenie do nanoszenia wykorzystywane do funkcjonalizacji cząstek składa się z trzech pomp ne 1000, robotycznego stołu zintegrowanego z dwoma siłownikami (jednym do ruchu w kierunku X i drugim do ruchu w kierunku Y) oraz drugiego stołu robotycznego z dwoma sąsiadującymi regałami składającymi się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku; pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłowniki i pompy są sterowane za pomocą komputera z wykorzystaniem oprogramowania LabVIEW.Systemy kopolimerowe wykorzystywane do wytwarzania cząsteczek opierają się na kwasie SEBA lub SA oraz 1,6-bis(p-karboksyfenoksy)heksanie lub CPH i 1,8-bis(p-karboksyfenoksy)-3,6-dioksanie lub CP Teeg. Po etapie wytwarzania nanocząsteczek umieść statyw zawierający probówki do wirowania o pojemności 1,7 ml z biblioteką nanocząsteczek na stole siłownika liniowego w celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząsteczek polianhydrydów; przeprowadzana jest reakcja sprzęgania kwasu karboksylowego składająca się z dwóch następujących po sobie etapów. W przypadku pierwszej reakcji napełnij strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej wodnym roztworem EDC i etylenodiaminy w stężeniach odpowiednio 2 mg per mg nanocząsteczek oraz 0,6 mg per mg nanocząsteczek.Napełnij drugą strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej roztworem wodnym NHSA o stężeniu 2,5 mg na mg cząsteczek, tak aby całkowita ilość wynosiła 12 równoważników na próbkę nanocząstek. Następnie, korzystając z programu LabVIEW, zaprogramuj robota tak, aby naniósł zawiesiny reagentów do biblioteki nanocząsteczek. Siłowniki robota przesuną następnie uchwyt probówek w odpowiednie miejsce na platformie w celu dozowania roztworów, EDC oraz NHS.Aktywuj grupy kwasu karboksylowego na powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu, aby umożliwić sprzęganie średnie. Następnie zanurz sondę sonikacyjną w każdej probówce i poddaj każdą próbkę sonikacji przez 30 sekund przy częstotliwości 40 hertz. Przed przejściem do następnej próbki oczyść sondę acetonem.Po nasyceniu wszystkich próbek uchwyt do probówek zostaje odłączony od platformy robotycznej. Inkubuj zawiesiny nanocząstek przez dziewięć godzin przy stałym obrotowaniu w temperaturze 4 °C. Czas trwania pierwszej i drugiej reakcji można zmienić, aby dostosować końcowe stężenie sacharydu.Po zakończeniu reakcji odwiruj probówki z prędkością 12 000 ×g przez pięć minut. W warunkach chłodniczych przenieś je z powrotem do stacji robotycznej. Przymocuj uchwyt na probówki do ramienia robota i napełnij drugą strzykawkę w platformie robotycznej.W przypadku użycia zimnej wody pierwsza strzykawka powinna pozostać pusta. Uruchom robota. Nadpływ z każdej probówki zostaje wciągnięty do pustej strzykawki, a druga pompa dozuje zimną wodę do probówek.Ten etap przeprowadza się w celu usunięcia wszystkich niereagujących reagentów z zawiesin nanocząsteczek. Następnie homogenizuje się zawiesinę nanocząsteczek poprzez sonikację, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Potem probówki wiruje się w wirówce z przyspieszeniem 12 000 ×g przez pięć minut.Przeprowadź drugie płukanie zimną wodą przy użyciu urządzenia robotycznego. Dla drugiej partii reakcji wprowadź do pierwszej pompy 12 równoważników EDC na próbkę nanocząsteczki, a do drugiej pompy 12 równoważników NHS na próbkę nanocząsteczki. Uruchom platformę robotyczną, aby dozować odpowiednie objętości do probówek zawierających nanocząsteczki. Obecność EDC i NHS umożliwi utworzenie wiązania amidowego pomiędzy grupami aminowymi etylenoditaminy, która jest już przyłączona do powierzchni nanocząsteczek, a grupą kwasu karboksylowego chronionego cukru.Po zakończeniu procesu osadzania należy załadować 10 równoważników konkretnego sacharydu. W tym przypadku wykorzystano laktozę oraz kwas glikolowy jako kontrolę w dwóch dostępnych pompach. Każdy sacharyd jest dozowany do probówek w zależności od pożądanej funkcjonalizacji w każdej z nich, co jest wcześniej zaprogramowane w oprogramowaniu LabVIEW, służącym do sterowania siłownikami i funkcjami pomp dla konkretnej reakcji. W niniejszym badaniu, w celu przyłączenia węglowodanów, kwas glikolowy jest stosowany jako kontrolny łącznik, ponieważ głęboko chronione sacharydy mają już kowalencyjnie przyłączoną tę cząsteczkę, co umożliwia dalsze przytwierdzenie do powierzchni nanocząsteczki.Zawiesiny nanocząstek homogenizuje się poprzez sonikację, analogicznie jak wcześniej, a następnie inkubuje przez dziewięć godzin przy stałej rotacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji zawiesiny nanocząstek należy przemyć poprzez wirowanie z usunięciem nadsączu, a następnie resuspender osad w zimnej wodzie i poddać sonikacji. Probówki zawierające obecnie bibliotekę funkcjonalizowanych nanocząstek umieszcza się w komorze próżniowej w celu osuszenia przez co najmniej dwie godziny. Funkcjonalizowane nanocząstki charakteryzuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła oraz innych metod w celu oceny składu powierzchni, stężenia, wielkości cząstek, rozkładu wielkości oraz ładunku powierzchniowego.W pełni chroniony produkt diano przedstawiony tutaj został zsyntetyzowany przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Zsyntetyzowany związek został scharakteryzowany metodą protonowego NMR w spektrometrze VXR 400 megahertz. Przy zastosowaniu CDC 13 jako rozpuszczalnika, powstanie produktu można potwierdzić na podstawie obecności kilku charakterystycznych sygnałów.Na widmie NMR protonowego, cztery protony w zakresie od 1,79 do 2,21 oraz dwa protony przy 3,38 pochodzą z etykiety florystycznej. Pik singletowy przy 2,16 odpowiada pikowi octanowemu, a piki przy 4,94 i 5,11 to protony anomeryczne; służą one do oceny wpływu czasu reakcji na końcową morfologię nanocząsteczek oraz stopień przyłączenia cukrów. Nanocząsteczki funkcjonalizowano przy zwiększaniu czasu reakcji, jak pokazano tutaj; stężenie diano na powierzchni nanocząsteczek 50 50 CPT CPH wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 godzinach.Nanocząsteczki funkcjonalizowane przez całkowity czas reakcji wynoszący 24 godziny zostały następnie wykorzystane do oceny ich zdolności do celowania w receptory lektynowe typu C (CLR) na pochodzących z szpiku kostnego myszy komórkach dendrytycznych przy użyciu cytometrii przepływowej, jak pokazano tutaj. Po stymulacji nanocząsteczkami niefunkcjonalizowanymi, a także funkcjonalizowanymi laktozą i dermanem, zaobserwowano zwiększoną ekspresję DC-SIGN oraz receptora mannozowego należącego do receptorów lektynowych typu C. Wskazuje to na skuteczne celowanie.Jednakże cząsteczki funkcjonalizowane Diano wykazały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na swoistość tego liganda względem badanych receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania wysokoprzepustowej zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów, jak również funkcjonalizacji nanocząsteczek polimerowych. Wykorzystując te węglowodany jako czynniki celujące, po opanowaniu syntezy chronionego cukru donor-akceptor, montaż aparatury można przeprowadzić w ciągu 24 do 48 godzin.Oczywiście czas trwania zależy od rozmiaru biblioteki oraz czasu funkcjonalizacji. Stosując tę metodę, należy pamiętać, że warunki reakcji funkcjonalizacji biodegradowalnych cząsteczek hydrożelowych można optymalizować w zależności od chemii nanocząsteczek. Postępując zgodnie z tą procedurą, można syntetyzować różne struktury węglowodanów w celu celowania w różne receptory komórkowe, aby wpłynąć na efekt immunologiczny.

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysokowydajna synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydów

Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Schematy syntezy w celu przygotowania wysoce stabilnych nanocząsteczek włochatych na bazie włókien drzewnych i funkcjonalnych biopolimerów na bazie celulozy zostały szczegółowo opisane.

Wysoce stabilne, funkcjonalne włochate nanocząstki i biopolimery z włókien drzewnych: w kierunku zrównoważonej nanotechnologii

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ten protokół pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Opisano w nim również ogólną procedurę eksperymentów z oznaczaniem RRV i jednogarnkową glikozylacją SSEA-4.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Białka i ligandy zawierające aminy mogą być kowalencyjnie połączone z polisacharydami aktywowanymi przez odczynnik cyjanelacyjny, tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), tworząc kowalencyjne koniugaty białkowe (ligand)-polisacharydy. W artykule opisano ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji CDAP w temperaturze 0 °C i zmiennym pH oraz przeprowadzania późniejszej koniugacji aktywowanych polisacharydów.

Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Poznaj zautomatyzowaną syntezę oligosacharydów i funkcjonalizację nanocząstek bezwodnika metodą hydroput. Technika ta umożliwia precyzyjne kierowanie komórek prezentujących antygen w badaniach nad układem nerwowym.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Przeglądaj więcej filmów