Name: Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek bezwodnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną syntezę oligosacharydów i funkcjonalizację nanocząstek bezwodnika metodą hydroput. Technika ta umożliwia precyzyjne kierowanie komórek prezentujących antygen w badaniach nad układem nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować U.S. Army Medical Research and Materiel Command (grant nr W81XWH-10-1-0806) oraz National Institutes of Health (grant nr U19 AI091031-01 i grant nr 1R01GM090280) za wsparcie finansowe. BN dziękuje za Balloun Professorship in Chemical and Biological Engineering, a NLBP dziękuje za Wilkinson Professorship of Interdisciplinary Engineering. Dziękujemy Julii Veli za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów z funkcjonalizacją nanocząstek.

1. Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów
<ol>
 <li>Przed zautomatyzowaną syntezą dimannosydy w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje się odpowiednio chronionego donora cukru, zazwyczaj trichloroacetymidydian, oraz akceptora, głównie alkenylowy alkohol fluorowy.</li>
 <li>Tworzony jest program dla zautomatyzowanej syntezy dimannosydy. Schematyczna reprezentacja podstawowej zautomatyzowanej procedury przedstawiona jest na Rysunku 2. W programie zapewnia się, aby przed dodaniem promotora mieszanina donora i akceptora była mieszana przez co najmniej 30 min.</li>
 <li>Roztwory syntetycznego donora, akceptora oraz trifluorometanosulfonianu trimetylosililu przygotowuje się w dichlorometanie. Toluenu i dichlorometanu najczęściej używa się do reakcji glikozylowania.</li>
 <li>Przygotowuje się również roztwory odczynników do usuwania czasowych grup ochronnych w 80% metanolu i 100% metanolu.</li>
 <li>Przed uruchomieniem programu należy upewnić się, że wilgotność względna w komorze automatyzacyjnej wynosi 30% lub mniej. Wysoka wilgotność jest niekorzystna dla reakcji glikozylowania.</li>
 <li>Po uruchomieniu programu ramię robota sekwencyjnie przenosi roztwory donora i akceptora do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę miesza się przez 30 min.</li>
 <li>Następnie ramię robota przenosi od 0,2 do 0,3 ekwiwalentów trifluorometanosulfonianu trimetylosililu do mieszaniny, zazwyczaj w temperaturze pokojowej, choć można osiągnąć niższe temperatury, np. -20 °C. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 30 min.</li>
 <li>Po 30 min reakcja zostaje zatrzymana i pobierana jest mała alikwota w celu monitorowania postępu reakcji. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją kontynuować, a ostatecznie zmodyfikować wymagany czas.</li>
 <li>Po zakończeniu reakcji mieszanina reakcyjna jest przenoszona na kartridże do fluorowej ekstrakcji do fazy stałej (FSPE) zawierające żel krzemionkowy modyfikowany C8F17 w celu oczyszczenia.</li>
 <li>Kartridże są najpierw płukane 80% mieszaniną metanolu i wody (8 mL), aby usunąć frakcję niefluorową.</li>
 <li>Następnie kartridże płucze się 100% metanolem, aby uzyskać pożądany produkt z etykietą fluorową. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, urządzenie można zatrzymać, a produkty reakcji usunąć w celu oczyszczenia innymi metodami.</li>
 <li>Po cyklu oczyszczania ramię robota dozuje metanolan sodu do fiolki reakcyjnej. Reakcję miesza się przez 2 hr. Jeśli reakcja nie dobiegła końca, można ją ponownie kontynuować przez dłuższy czas, a ostatecznie zmodyfikować zaprogramowany czas wymagany.</li>
 <li>Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany metodą FSPE, a następnie poddawany rozpuszczaniu w bezwodnym toluenie, po czym następuje odparowanie w celu usunięcia resztkowej wody.</li>
 <li>Następnie cykl (od kroku 6 do 13) jest powtarzany aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej.</li>
 <li>Chroniony produkt otrzymany z automatyzacji jest następnie poddawany dalszemu oczyszczaniu i pełnej charakterystyce za pomocą technik takich jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Pełne usuwanie grup ochronnych (usunięcie wszystkich pozostałych grup ochronnych) końcowej cząsteczki docelowej odbywa się zazwyczaj poza platformą automatyzacyjną, ponieważ zazwyczaj wiąże się to z wydzielaniem wybuchowego wodoru i użyciem palladu. Końcowy etap usuwania grup ochronnych przeprowadzono laboratoryjnie poza platformą automatyzacyjną. Pierwszym krokiem była ozonoliza wiązania podwójnego w etykiecie fluorowej, a następnie utlenianie powstałego aldehydu do kwasu karboksylowego. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej. Ostatnim etapem było usunięcie grup eteru benzylowego poprzez uwodornienie katalizowane palladem. Produkt przepuszczono przez warstwę celitu, aby usunąć pallad i uzyskać czysty produkt końcowy.</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowa funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek
<ol>
 <li>Wysokoprzepustowa synteza polimerów i wytwarzanie nanocząstek odbywa się zgodnie z protokołem i konfiguracją robotyczną opisaną przez Petersen et al19. Systemy kopolimerowe wykorzystane do wytwarzania cząstek opierają się na kwasie sebacowym (SA) i 1,6-bis(para-karboksyfenoksy)heksanie (CPH) oraz 1,8-bis(para-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoctanie (CPTEG) i CPH. Schematyczny rysunek zastosowanego aparatu do robotycznego nanoszenia jest przedstawiony na Rysunku 1b.</li>
 <li>Po wytworzeniu nanocząstek uchwyt zawierający probówki z biblioteką nanocząstek zostaje ponownie przytwierdzony do platformy z siłownikiem liniowym.</li>
 <li>W celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząstek polianhydrydowych przeprowadza się reakcję sprzęgania aminy z kwasem karboksylowym 20, składającą się z dwóch następujących po sobie etapów.</li>
 <li>W pierwszej reakcji strzykawka w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana 10 ekwiwalentami (eq.) (ekwiwalenty średniego molowego stężenia kwasu karboksylowego na powierzchni cząstki) chlorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i 10 eq. etylenodiaminy w roztworze wodnym, natomiast strzykawka w drugiej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana 12 eq. N-hydroksysukcynimidu (NHS) w roztworze wodnym.</li>
 <li>Za pomocą programu LabVIEW zawiesiny reagentów są nanoszone do biblioteki nanocząstek*.</li>
 <li>Następnie każda próbka jest poddawana sonikacji (30 s przy 40 Hz), a uchwyt do probówek zostaje odłączony od platformy robotycznej.</li>
 <li>Zawiesiny nanocząstek są inkubowane przez 9 h** przy stałej rotacji w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Po upływie czasu reakcji probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i przenoszone z powrotem do stacji robotycznej w celu przeprowadzenia dwóch etapów płukania.</li>
 <li>Do płukania jedna strzykawka pozostaje pusta i jest zamontowana w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej, podczas gdy strzykawka w drugiej pompie jest napełniona zimną wodą. Nadosad w każdej probówce jest pobierany do pustej strzykawki, a druga pompa nanosi zimną wodę.</li>
 <li>Homogenizacja zawiesiny nanocząstek jest przeprowadzana zgodnie z opisem w kroku 2.6. Następnie probówki są wirowane (12000 x g przez 5 min) i przeprowadzany jest drugi etap płukania, zgodnie z opisem w kroku 2.9.</li>
 <li>W drugiej reakcji stosuje się dwa etapy nanoszenia. W pierwszym etapie nanoszenia jedna pompa podaje 12 eq. EDC, a druga pompa podaje 12 eq. NHS.</li>
 <li>Drugi etap nanoszenia obejmuje 10 eq. konkretnego sacharydu w pierwszej i drugiej pompie (tj. galaktozy, laktozy lub di-mannozy)*** oraz trzecią pompę z 10 eq. kwasu glikolowego (używanego jako kontrola****).</li>
 <li>Zawiesiny nanocząstek są homogenizowane zgodnie z opisem w kroku 2.6 i inkubowane przez 9 h przy stałej rotacji w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Po zakończeniu czasu reakcji przeprowadza się etap płukania zgodnie z opisem w krokach 2.8, 2.9 i 2.10.</li>
 <li>Zfunkcjonalizowana biblioteka nanocząstek jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu wysuszenia przez co najmniej 2 h.</li>
 <li>Zfunkcjonalizowane nanocząstki są następnie charakteryzowane za pomocą spektroskopii rentgenowskiej fotoelektronów (XPS) oraz wysokoprzepustowego testu kwasem fenolo-siarkowym w celu oznaczenia odpowiednio składu powierzchniowego i stężenia sacharydu. Skaningowa mikroskopia elektronowa i dynamiczne rozpraszanie światła są wykorzystywane do wyznaczenia rozmiaru cząstek, rozkładu wielkości oraz ładunku powierzchniowego.</li>
</ol>
Uwagi: *Objętości osadzania różnią się w zależności od masy nanocząsteczek zawartych w każdej probówce. 
**Czas trwania pierwszej i drugiej reakcji może zostać zmieniony w celu dostosowania końcowego stężenia sacharydów. 
***Każdy sacharyd jest nanoszony do probówek w zależności od pożądanej grupy. 
****W przypadku specyficznej reakcji zastosowanej w niniejszym badaniu do przyłączania węglowodanów, kwas glikolowy jest używany jako kontrola łącznika, ponieważ odchronione sacharydy mają już tę cząsteczkę połączoną kowalencyjnie, co umożliwia dalsze przyłączenie do powierzchni nanocząsteczek.
3. Reprezentatywne wyniki
W pełni chroniony dimannozyd przedstawiony na Rysunku 2 został zsyntetyzowany przy użyciu platformy automatyzacyjnej. Zsyntetyzowany związek scharakteryzowano za pomocą 1H NMR w spektrometrze VXR 400 MHz, stosując CDCl3 jako rozpuszczalnik. Widmo NMR przedstawiono na Rysunku 3.
Wykorzystując opisaną w niniejszej pracy wysokoprzepustową metodę wytwarzania i funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydu, pomyślnie przeprowadzono przyłączenie dimannozy, laktozy i galaktozy 10, 11. Przy zastosowaniu tego układu zidentyfikowano optymalne warunki reakcji (tj. temperaturę i czas reakcji), aby uzyskać pożądaną funkcjonalizację i morfologię nanocząsteczek. Gdy reakcję przeprowadzono w temperaturze 4 °C zamiast w temperaturze pokojowej, w badaniu SEM zaobserwowano zmniejszenie agregacji nanocząsteczek (dane nie przedstawiono). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne wyniki charakterystyki funkcjonalizowanych nanocząsteczek 50:50 CPTEG:CPH z dimannozą lub laktozą, zsyntetyzowanych w 4 °C. Dane wskazują na niewielki wzrost średnicy nanocząsteczek wynikający z funkcjonalizacji. Podczas gdy nanocząsteczki niefunkcjonalizowane posiadały ujemny potencjał zeta wynoszący ok. -20 mV, cząstki funkcjonalizowane wykazały dodatnią wartość potencjału zeta, co dowodzi pomyślnej funkcjonalizacji powierzchni nanocząsteczek. Laktoza i dimannoza są cukrami obojętnymi; jednakże za dodatni potencjał zeta mogą odpowiadać wolne grupy aminowe z łącznika etylenodiaminowego wykorzystanego do przyłączenia sacharydów.
Czas reakcji jest kolejną zmienną, która może wpływać zarówno na ostateczną morfologię nanocząstek, jak i na uzyskany stopień przyczepienia cukrów. Poprzez regulację czasu reakcji można kontrolować końcowe stężenie cukrów przyczepionych do powierzchni nanocząstek, co przedstawiono na Rysunku 4A. Zgodnie z oczekiwaniami, stężenie dimannozy na powierzchni nanocząstek 50:50 CPTEG:CPH wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągnęło maksimum po 18 hr. Nanocząstki funkcjonalizowane przy całkowitym czasie reakcji 24 hr zostały wykorzystane do oceny ich zdolności do celowania w receptory lektynowe (CLR) w komórkach dendrytycznych (DCs) myszy pochodzących z szpiku kostnego. Do oceny ekspresji dwóch receptorów CL (tj. CIRE (CD209, DC-SIGN) oraz receptora mannozy (CD206)) po stymulacji nanocząstkami niefunkcjonalizowanymi oraz funkcjonalizowanymi laktozą i dimannozą wykorzystano cytometrię przepływową (Rysunek 4B). Wyższą ekspresję obu receptorów, co świadczy o skutecznym celowaniu, uzyskano po stymulacji komórek nanocząstkami funkcjonalizowanymi zarówno laktozą, jak i dimannozą. Jednakże cząstki funkcjonalizowane dimannozą wykazały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na specyficzność tego ligandu względem badanych receptorów.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Typ nanocząstek</td>
 <td>Średnia średnica cząstek (nm)</td>
 <td>Średni potencjał ζ cząstek (mV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Niefunkcjonalizowane</td>
 <td>162 ± 43</td>
 <td>-20 ± 0.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laktoza</td>
 <td>235 ± 34</td>
 <td>26 ± 2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Di-mannoza</td>
 <td>243 ± 32</td>
 <td>30 ± 4.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Charakterystyka nanocząsteczek. Nanocząsteczki niefunkcjonalizowane i funkcjonalizowane scharakteryzowano za pomocą quasi-elastycznego rozpraszania światła oraz pomiarów potencjału zeta. Dane dotyczące rozmiaru cząsteczek reprezentują wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD) z danych dynamicznego rozpraszania światła zebranych w trzech niezależnych eksperymentach. Dane dotyczące potencjału zeta reprezentują wartość średnią ± SD z trzech niezależnych odczytów. Zmiana znaku potencjału zeta wykazuje, że cukier został efektywnie sprzężony z powierzchnią nanocząsteczki 50:50 CPTEG:CPH.
<img alt="Schemat chemii nanocząstek i węglowodanów, układ spektroskopowy, analiza danych, wiązanie receptorów." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Graficzna reprezentacja podejścia polegającego na funkcjonalizacji węglowodanowej nanocząstek polianhydrydowych oraz przykład bibliotek funkcjonalizowanych nanocząstek, które można zaprojektować za pomocą opisanego podejścia wysokoprzepustowego. (B) Schematyczna reprezentacja zautomatyzowanego urządzenia do nanoszenia wykorzystywanego do funkcjonalizacji cząstek, które składa się z (i) trzech pomp NE 1000; (ii) platformy robotycznej zintegrowanej z dwoma siłownikami (Zaber): jednym do ruchu w kierunku x i drugim do ruchu w kierunku y; (iii) drugiej platformy robotycznej z dwoma sąsiednimi statywami (przystosowanymi do probówek i kuwet) składającej się z trzech siłowników, po jednym dla każdego kierunku (x, y i z). Pompy i łącznie pięć siłowników są połączone szeregowo. Siłowniki i pompy są sterowane przez komputer za pomocą oprogramowania LabVIEW. Schemat nie jest zachowany w skali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3967/3967fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Schemat automatycznej syntezy; montaż węglowodanów; 1,5 cyklu; proces chemii organicznej." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Graficzna prezentacja automatycznej syntezy iteracyjnej węglowodanów na przykładzie mannozy.
<img alt="Wykres widma NMR; piki przesunięcia chemicznego; analiza struktury cząsteczkowej; wyniki spektroskopii." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widmo 1H NMR chronionego dimannozydu.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający stężenie cząstek w czasie reakcji; analiza ekspresji CIRE i CD206." src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. (A) Wpływ czasu reakcji na stężenie sacharydu na powierzchni nanocząsteczek. Na przedstawionych danych nanocząsteczki CPTEG:CPH w stosunku 50:50 zostały funkcjonalizowane dimannozą w różnych odstępach czasu, a reakcja odbywała się w temperaturze 4 °C. Przedstawiono średnią oraz błąd standardowy z dwóch niezależnych eksperymentów funkcjonalizacji. (B) Nanocząsteczki funkcjonalizowane laktozą i dimannozą skutecznie celują w DC-SIGN (CIRE, CD209) oraz receptor mannozowy (CD206) w komórkach dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, co wykazano poprzez zwiększoną ekspresję tych dwóch markerów po stymulacji funkcjonalizowanymi nanocząsteczkami 50:50 CPTEG:CPH w porównaniu z ekspresją uzyskaną przy użyciu cząstek niefunkcjonalizowanych.

<ol><li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+Consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+%22pathogen-like%22+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose-functionalized+%22pathogen-like%22+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
<li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials%3A+developing+the+next+generation+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li>
<li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose%2FN-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686(2002).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+through+C-type+lectin+receptors%3A+shaping+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+oligosaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Carb.+Res%22%5BJournal%5D)">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li>
<li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis%3A+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li>
<li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li>
<li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+T+%22Solid-phase+peptide+synthesis%3A+a+practical+approach%22">Solid-phase peptide synthesis: a practical approach</a>. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+chemistry+and+the+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li>
<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
<li>Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+NL+%22Chemical+Glycobiology%22">Chemical Glycobiology</a>. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).</li>
</ol>

NLBP jest współzałożycielem i posiada udziały w firmie zajmującej się węglowodanami LuCella Biosciences, Inc.

Skuteczność węglowodanów jako czynników celujących, kierujących oddziaływania nanocząstek do komórek odpornościowych, została wykazana we wcześniejszych badaniach 10, 11. Poprzednie badania w naszych laboratoriach wykazały, że specyficzne cukry przyłączone do nanocząstek polianhydrydowych są w stanie celować w różne receptory lektynowe (CLR) na komórkach prezentujących antygen (APC), zwiększając tym samym aktywację komórek odpornościowych, co może mieć istotne znaczenie dla dalszej aktywacji limfocytów T ...

<table><tbody><tr><td>Zmotoryzowany stół XYZ: 3x T-LSM050A, zakres ruchu 50 mm na oś</td><td>Zaber Technologies</td><td>T-XYZ-LSM050A-KT04</td><td></td></tr><tr><td>Jednopompowa pompa strzykawkowa NE-1000</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wielorazowe szklane probówki do hodowli Pyrex* Vista* bez kołnierza</td><td>Corning</td><td>07-250-125</td><td></td></tr><tr><td>ASW 1000</td><td>Chemspeed Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>776671-35</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki gazoszczelne SGE, Luer Loc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>509507</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator XL-2000</td><td>Qsonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>Rotator do mini-probówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

W celu racjonalnego projektowania skutecznych nośników szczepionek konieczne jest zastosowanie podejść transdyscyplinarnych, obejmujących takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia. Platformy oparte na nanocząsteczkach mogą przedłużać obecność antygenów szczepionkowych, co może poprawić immunogenność szczepionki1. Badano szereg polimerów biodegradowalnych jako nośniki do dostarczania szczepionek1; w szczególności cząstki polianhydrydowe wykazały zdolność do zapewnienia przedłużonego uwalniania stabilnych antygenów białkowych oraz do aktywacji komórek prezentujących antygen i modulowania odpowiedzi immunologicznej2-12.
Projekt molekularny tych nośników szczepionek musi integrować racjonalny dobór właściwości polimerów oraz włączenie odpowiednich czynników celujących. Wysokoprzepustowa zautomatyzowana synteza ligandów celujących i funkcjonalizowanych cząsteczek jest potężnym narzędziem, które zwiększy możliwość badania szerokiego zakresu właściwości i doprowadzi do opracowania powtarzalnych urządzeń do dostarczania szczepionek.
Wykazano, że dodanie ligandów celujących, zdolnych do bycia rozpoznawanymi przez specyficzne receptory na komórkach odpornościowych, pozwala na modulowanie i dostosowywanie odpowiedzi immunologicznych10,11,13. Receptory lektynowe typu C (CLRs) są receptorami rozpoznającymi wzorce (PRRs), które rozpoznają węglowodany obecne na powierzchni patogenów. Stymulacja komórek odpornościowych za pośrednictwem CLRs umożliwia zwiększoną internalizację antygenu i jego późniejszą prezentację w celu dalszej aktywacji limfocytów T14,15. W związku z tym cząsteczki węglowodanowe odgrywają istotną rolę w badaniu odpowiedzi immunologicznych; jednakże zastosowanie tych biomolekuł często utrudnia brak dostępności strukturalnie dobrze zdefiniowanych i czystych węglowodanów. Platforma automatyzacyjna oparta na iteracyjnych reakcjach w fazie ciekłej może umożliwić szybką i kontrolowaną syntezę tych trudnych syntetycznie cząsteczek przy użyciu znacznie mniejszych ilości bloków budulcowych niż tradycyjne metody w fazie stałej16,17.
W niniejszym pracy przedstawiamy protokół zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej, takich jak ligandów celujących opartych na mannozie, z wykorzystaniem fluoryzowanej ekstrakcji w fazie stałej do oczyszczania produktów pośrednich. Po opracowaniu zautomatyzowanych metod otrzymywania czynnika celującego opartego na węglowodanach, opisujemy metody ich przytwierdzania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydowych przy użyciu zautomatyzowanego zestawu robotycznego sterowanego programem LabVIEW, zgodnie z wcześniejszym opisem10. Funkcjonalizacja powierzchni węglowodanami wykazała skuteczność w celowaniu w CLR10,11, a zwiększenie wydajności metody wytwarzania w celu odkrycia złożoności związanych z systemem wieloparametrycznym będzie miało dużą wartość (Rycyna 1a).

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Należy wykorzystać podejścia transdyscyplinarne, obejmujące takie dziedziny jak projektowanie materiałów, nanotechnologia, chemia i immunologia, aby racjonalnie zaprojektować ...

W tym artykule wideo opisujemy nowy protokół hydro-put dla zautomatyzowanej syntezy oligosacharydów w fazie ciekłej oraz funkcjonalizacji nanocząsteczek polianhydrydowych. W przypadku tych węglowodanowych czynników celujących, w pierwszej kolejności cząsteczki węglowodanów są syntetyzowane przy użyciu zautomatyzowanego systemu, który wykorzystuje syntezę w fazie ciekłej zamiast syntezatorów w fazie stałej. Następnie produkty pośrednie oligosacharydów są oczyszczane za pomocą ekstrakcji w fazie stałej typu florist, czyli FSPE.Wytworzone cząsteczki węglowodanów charakteryzuje się za pomocą NMR, a następnie przyłącza się je do nanocząsteczek polianhydrydu poprzez konjugację karbo-IDE. Na koniec funkcjonalizowane węglowodanami nanocząsteczki charakteryzuje się za pomocą spektroskopii fotoelektronów emitowanych promieniami rentgenowskim oraz testu z kwasem fenylosulfonowym metodą hydro putt. Ostatecznie, wykorzystując opisaną tutaj metodologię hydro put, wyznaczono warunki reakcji optymalizujące morfologię nanocząsteczek oraz gęstość węglowodanów na powierzchni cząstek.Główną zaletą tej metody w porównaniu do istniejących rozwiązań, takich jak synteza oligosacharydów na podłożu stałym,

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysokowydajna synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydów

Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Schematy syntezy w celu przygotowania wysoce stabilnych nanocząsteczek włochatych na bazie włókien drzewnych i funkcjonalnych biopolimerów na bazie celulozy zostały szczegółowo opisane.

Wysoce stabilne, funkcjonalne włochate nanocząstki i biopolimery z włókien drzewnych: w kierunku zrównoważonej nanotechnologii

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ten protokół pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Opisano w nim również ogólną procedurę eksperymentów z oznaczaniem RRV i jednogarnkową glikozylacją SSEA-4.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Białka i ligandy zawierające aminy mogą być kowalencyjnie połączone z polisacharydami aktywowanymi przez odczynnik cyjanelacyjny, tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), tworząc kowalencyjne koniugaty białkowe (ligand)-polisacharydy. W artykule opisano ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji CDAP w temperaturze 0 °C i zmiennym pH oraz przeprowadzania późniejszej koniugacji aktywowanych polisacharydów.

Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Poznaj zautomatyzowaną syntezę oligosacharydów i funkcjonalizację nanocząstek bezwodnika metodą hydroput. Technika ta umożliwia precyzyjne kierowanie komórek prezentujących antygen w badaniach nad układem nerwowym.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Przeglądaj więcej filmów