Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek bezwodnika

W tym artykule wideo opisujemy nowatorski protokół hydro put do automatycznej syntezy oligosacharydów w fazie roztworu i funkcjonalizacji nanocząstek polianhy. Dzięki tym środkom docelowym opartym na węglowodanach, pierwsze cząsteczki węglowodanów są syntetyzowane przy użyciu zautomatyzowanego systemu, który wykorzystuje syntezę fazy roztworu zamiast syntezatorów fazy stałej. Następnie półprodukty oligosacharydowe są oczyszczane przez kwiaciarnię, ekstrakcję do fazy stałej lub FSPE.

Wytworzone cząsteczki węglowodanów są charakteryzowane przez NMR, a następnie są przyłączane do nanocząstek polibezwodnika przez koniugację carbo IDE. Wreszcie, nanocząstki funkcjonalizowane węglowodanami charakteryzują się rentgenowską spektroskopii fotoelektronowej i testem kwasu fenylosiarkowego hydroputt. Ostatecznie, wykorzystując opisaną tutaj metodologię hydro put, uzyskano warunki reakcji w celu optymalizacji morfologii nanocząstek i gęstości węglowodanów na powierzchni cząstek.

Główną przewagą tej metody nad istniejącymi, takimi jak synteza oligosacharydów w postaci stałej, jest to, że w tej metodzie używamy znacznie mniejszej ilości elementów budulcowych W tej metodzie zazwyczaj używamy dwóch do trzech odpowiedników zamiast 10 do 20 równoważników. Po raz pierwszy mamy pomysł na tę metodę, gdy wykazujemy skuteczność efektów powierzchniowych, funkcjonalizacji nanocząstek poli hydro, wykorzystania węglowodanów do celowania w receptory ceep na komórkach zapobiegających wgnieceniom. Następnie chcieliśmy zaprojektować system o wysokiej przepustowości, który umożliwi nam badanie przesiewowe wielu parametrów związanych z produkcją i zastosowaniem tych nowatorskich nośników.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ opracowanie zautomatyzowanych platform do wysokoprzepustowej syntezy oligosacharydów i ich przyłączania do cząstek polimerowych jest nowym obszarem badań, w którym nie ma zbyt wiele dostępnej dokumentacji przed automatyczną syntezą dianokwasu. Odpowiednio chroniony donor cukru, zazwyczaj tri chloroacetamid, który akceptuje głównie w Alcon, alkohol fluorowy jest syntetyzowany na stole i przygotowywany w chlorometanie przygotowuje się również silos trimetylowy, sulfonian trifluorometanu w chlorometanie, 80% metanolu i 100% metanolu. Upewnij się, że wilgotność względna w pomieszczeniu wynosi 30% lub mniej w komorze automatyki.

Wysoka wilgotność jest szkodliwa dla reakcji glikozylacji. Poniższe kroki są wykonywane za pomocą platformy automatyzacji. Pierwszą glikozylację przeprowadza się za pomocą dawcy i alkoholu kwiaciarni.

Po zakończeniu powstała cząsteczka cukru z etykiety kwiaciarni jest oczyszczana przez FSPE. Tymczasowa grupa ochronna jest następnie usuwana przez sód, tlenek mety i metanol, a następnie ponownie produkt jest oczyszczany przez FSPE. Następnie cukier z etykiety kwiaciarni jest używany jako akceptor i sprzężony z tym samym dawcą w celu uzyskania disacharydu, disacharyd jest oczyszczany przez FSPE, aby rozpocząć.

Umieść odczynniki, w tym promotor akceptora dawcy, 80% metanolu wody, 100% metanolu, metamfetaminy sodu w platformie robotycznej i rozpocznij program. Ramię robota wyjmie dawcę, a następnie akceptor z fiolek i przeniesie je do fiolki reakcyjnej. Następnie mieszaninę dawcy i akceptora miesza się przez 30 minut.

Po upływie 30 minut. Ramię robota przenosi katalityczny silos trimetylowy, trifluoro, sulfonian metanu do mieszaniny. Roztwór jest następnie mieszany przez dodatkowe 30 minut Po zakończeniu mieszania program się zatrzymuje.

Usunąć podwielokrotność 10 mikrolitrów, aby sprawdzić, czy reakcja została zakończona za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Jeśli reakcja zostanie zakończona, cząsteczka akceptora nie będzie widoczna. Jeśli reakcja nie jest kompletna, akceptor na TLC jest nadal widoczny.

W takim przypadku należy zatrzymać program, zresetować czas glikozylacji o około 30 minut i dodać nadmiar silosu trimetylowego promotora, trifluoro, sulfonianu metanu. Po zakończeniu reakcji przejdź do następnego kroku. Po zakończeniu reakcji robot przenosi mieszaninę reakcyjną do wkładów FSPE zawierających zmodyfikowany żel krzemionkowy C nine F 17 w celu oczyszczenia.

Następnie wkłady przemywa się ośmioma mililitrami 80% metanolu, a następnie ośmioma mililitrami 100% metanolu. Aby wyeliminować frakcję non floris, przepływ jest zbierany do fiolki w celu uzyskania pożądanego produktu oznaczonego w kwiaciarni. Jeśli wymagane jest dodatkowe oczyszczanie, zatrzymaj robota i usuń odpowiednie produkty reakcji.

W zależności od struktury, donory mogą być skrajnie niereaktywne, a niektóre cząsteczki akceptujące kwiaciarnię pozostaną nawet po dodaniu wystarczającej ilości promotora. W takim przypadku FSPE nie będzie wystarczająco wydajny do oczyszczania, a dodatkowe oczyszczanie za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym można przeprowadzić po oczyszczeniu ramię robota dozuje tlenek metanu sodu do fiolki reakcyjnej. Reakcja jest następnie mieszana przez dwie godziny w platformie robotycznej, jeśli nie zostanie zakończona zgodnie z TLC, wydłuż okres inkubacji o około godzinę.

Po zakończeniu reakcji produkt jest oczyszczany przez FSPE tak jak poprzednio. Następnie należy usunąć produkt reakcji z robota i na stole poddanym rozpuszczeniu w bezwodnym toluenie, a następnie odparować w celu usunięcia resztek wody. Po wyschnięciu próbki umieść ją z powrotem w robocie w tym samym cyklu, w tym oczyszczaniu glikozylacją przez FSPE.

Głęboką ochronę tymczasowej grupy ochronnej, a następnie glikozylację powtarza się, aż do uzyskania pożądanej długości łańcucha dla cząsteczki docelowej, aby de chronić chroniony produkt uzyskany z automatyzacji, wyjmij fiolkę z robota. Końcowe etapy procedury wykorzystują wybuchowy wodór gazowy i muszą być wykonywane poza platformą automatyzacji. Na uncji stołowej zachodzi liza podwójnego wiązania w etykiecie kwiaciarni, po której następuje utlenianie wytworzonego aldehydu do kwasu karboksylowego.

Oczyść otrzymany produkt za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym na stole laboratoryjnym przy użyciu mieszaniny 30% metanolu w di chlorometanie. Wreszcie, aby zapobiec ochronie grup benzoeterowych przez uwodornienie katalizowane palladem, przepuść produkt przez podkładkę satelitarną, aby pozbyć się palladu, aby uzyskać czysty produkt końcowy. W pełni scharakteryzować produkt za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego lub spektroskopii NMR.

Synteza polimerów o wysokim rzucie i wytwarzanie nanocząstek odbywa się zgodnie z protokołem opisanym przez Petersona i wsp. Jak wskazano w dokumencie towarzyszącym, zautomatyzowane urządzenie do osadzania wykorzystywane do funkcjonalizacji cząstek składa się z trzech pomp ne 1000, stopnia robotycznego zintegrowanego z dwoma siłownikami, z których jeden służy do ruchu w kierunku X, a drugi do ruchu w kierunku Y, oraz drugiego stopnia zrobotyzowanego z dwoma przylegającymi do siebie stojakami składającymi się z trzech siłowników, Po jednym dla każdego kierunku, pompy i łącznie pięć siłowników są połączone. Szeregowo siłowniki i pompy są obsługiwane przez komputer za pomocą oprogramowania lab view.

Systemy kopolimerowe stosowane do wytwarzania cząstek są oparte na kwasie SEBA lub SA i jednym sześciu bis, paraicznym karboksylowym, oksyloheanowym lub CPH i jednym ósmym BIS para karboksylowym fenoksy trzem sześciodioksanowym lub CP Teeg. Po miejscu wytwarzania nanocząstek, dla pierwszej reakcji przeprowadza się stojak zawierający 1,7 mililitrowe probówki wirówkowe z biblioteką nanocząstek do stopnia siłownika liniowego w celu przyłączenia węglowodanów do powierzchni cząstek polianhy i średniej reakcji sprzęgania kwasu karboksylowego składającej się z dwóch kolejnych reakcji. Napełnić strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej wodnym roztworem EDC i etylenodiaminy o stężeniu odpowiednio dwóch miligramów na miligram nanocząstek i 0,6 miligrama na miligram nanocząstek.

Napełnij drugą strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej 2,5 miligrama na miligram cząstek NHSA, w sumie 12 ekwiwalentów na próbkę nanocząstek, roztworem wodnym. Następnie, korzystając z programu do podglądu laboratorium, poinstruuj robota, aby zdeponował zawiesiny odczynników w bibliotece nanocząstek. Siłowniki robota przesunęłyby następnie uchwyt rurki do właściwej pozycji na platformie w celu dozowania roztworów, EDC i NHS.

Aktywuj grupy kwasu karboksylowego na powierzchni nanocząstek polibezwodnika i pozwól na średnie sprzężenie. Następnie zanurz sondę soniczną w każdej probówce i poddaj ją sonizacji każdej próbki przez 30 sekund przy 40 hercach. Przed przejściem do następnej próbki wyczyść sondę acetonem.

Po nasyceniu wszystkich próbek uchwyt probówki jest odłączany od platformy robota. Inkubować zawiesiny nanocząstek przez dziewięć godzin ze stałą rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Czas reakcji dla pierwszej i drugiej reakcji można zmienić, aby dostosować końcowe stężenie sacharydu.

Po zakończeniu reakcji odwirować probówki o sile 12 000 razy G przez pięć minut. W zimnym otoczeniu wróć do stanowiska robota. Ponownie przymocuj uchwyt rurki do ramienia robota i napełnij drugą strzykawkę w platformie robota.

W przypadku zimnej wody pierwsza strzykawka powinna pozostać pusta. Uruchom robota. Supernatant z każdej probówki jest pobierany do pustej strzykawki, a druga pompa wprowadza zimną wodę do probówek.

Ten etap jest wykonywany w celu usunięcia wszelkich niereaktywnych odczynników z zawiesin nanocząstek. Następnie homogenizuj zawiesinę nanocząstek za pomocą sonikacji, jak pokazano wcześniej. Następnie odwirować probówki w temperaturze 12 000 razy G przez pięć minut.

Wykonaj drugie płukanie zimną wodą, wykorzystując aparaturę robotyczną, dla drugiego obciążenia reakcyjnego: 12 równoważników na próbkę nanocząstek EDC do pierwszej pompy i 12 równoważników na próbkę nanocząstek NHS do drugiej pompy. Uruchom platformę robotyczną, aby dozować odpowiednie objętości do probówek zawierających nanocząstki. Obecność EDC i NHS pozwoli na utworzenie wiązania amidowego między grupami aminowymi z ditynu etylenu już przyłączonymi do powierzchni nanocząstki a grupą kwasów karboksylowych głęboko chronionego cukru.

Po zakończeniu osadzania załaduj 10 odpowiedników określonego sacharydu. W tym przypadku zastosowano laktozę i kontrolę kwasu glikolowego w dwóch dostępnych pompach. Każdy sacharyd jest umieszczany w probówkach w zależności od pożądanej funkcjonalizacji do osiągnięcia w każdej probówce, która jest wcześniej zaprogramowana w programie widoku laboratoryjnego, wykorzystywana do obsługi siłowników i funkcji pompy dla określonej reakcji zastosowanej W tym badaniu do przyłączania węglowodanów kwas glikolowy jest stosowany jako kontrola łącznika, ponieważ głęboko chronione sacharydy mają już tę cząsteczkę kowalencyjnie połączoną, co pozwala na dalsze przyleganie do powierzchni nanocząstki.

Zawiesiny nanocząstek są homogenizowane przez sonikację jak poprzednio, a następnie inkubowane przez dziewięć godzin ze stałą rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umyj zawiesiny nanocząstek przez odwirowanie, usuwając supernatant, a następnie Resus zawiesza osad w zimnej wodzie i sonicznie umieszcza probówki, które teraz zawierają funkcjonalizowaną bibliotekę nanocząstek, w komorze próżniowej do wyschnięcia przez co najmniej dwie godziny. Funkcjonalizowane nanocząstki charakteryzują się dynamicznym rozpraszaniem światła i innymi metodami oceny składu powierzchniowego, stężenia, wielkości cząstek, rozkładu wielkości i ładunku powierzchniowego.

Pokazana tutaj w pełni zabezpieczona strona diano została zsyntetyzowana przy użyciu platformy automatyzacji. Zsyntetyzowany związek scharakteryzowano za pomocą protonowego NMR w spektrometrze VXR 400 megaherców. Stosując CDC 13 jako rozpuszczalnik, tworzenie się produktu można potwierdzić na podstawie obecności pewnych charakterystycznych pików.

Na diagramie protonowego NMR cztery protony od 1,79 do 2,21 i dwa protony o wartości 3,38 pochodzą z tagu kwiaciarni. Pik singletowy o wartości 2,16 odpowiada pikom piku octanu o wartości 4,94 i 5,11 to anomeryczne protony służące do oceny wpływu czasu reakcji na końcową morfologię nanocząstek i osiągnięty stopień przyłączenia cukru. Nanocząstki funkcjonalizowano ze zwiększającymi się czasami reakcji, jak pokazano tutaj, stężenie diano na powierzchni 50 50 nanocząstek CPT CPH wzrastało wraz z całkowitym czasem reakcji i osiągało maksimum po 18 godzinach.

Nanocząstki funkcjonalizowane z 24-godzinnym całkowitym czasem reakcji wykorzystano następnie do oceny ich zdolności do celowania w CLR na komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano tutaj. Zwiększoną ekspresję znaku DC i receptora mano do receptorów lektyny typu C zaobserwowano po stymulacji nanocząstkami niefunkcjonalizowanymi, a także nanocząstkami funkcjonalizowanymi laktozą i dano. Wskazuje to na skuteczne kierowanie.

Jednak cząstki funkcjonalizowane Diano wykazywały wyższy poziom ekspresji, co wskazuje na specyficzność tego liganda dla badanych receptorów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić automatyczną syntezę oligosacharydów o wysokiej przepustowości, a także funkcjonalizację poli nanocząstek. Używając tych baz węglowodanowych na środkach docelowych, Po opanowaniu syntezy cukru chronionego przez akceptor donora, a także montaż aparatu można wykonać w ciągu 24 do 48 godzin.

Oczywiście długość czasu zależy od wielkości biblioteki, a także czasu funkcjonalizacji. Uczestnicząc w tej metodzie, należy pamiętać, że można zoptymalizować warunki reakcji funkcjonalizacji biodegradowalnych poli hydrocząstek w zależności od składu chemicznego nanocząstek. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zsyntetyzować różne struktury węglowodanów w celu celowania w różne receptory komórkowe w celu wpływania na wynik immunologiczny.