Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro
December 26th, 2014
Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji granulocytów jako podejścia dwuparametrowego. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację granulocytów z próbek krwi pacjenta z cząstkami biologicznymi i odczynnikiem w celu wizualizacji wybuchu oksydacyjnego. W drugim etapie fagocytoza po inkubacji jest blokowana, a następnie znakowane są receptory na powierzchni komórki, które są przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić pozytywną identyfikację granulocytów.
Ostatecznie aktywowane podzbiory granulocytów można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii żywieniowej lub klinicznej, takie jak to, w jaki sposób nawyki żywieniowe i praktyki żywieniowe przyczyniają się do zmian i funkcji granulocytów. Zademonstruje tę procedurę Eric Prado, doktorant z mojego laboratorium.
Po rozmrożeniu próbki krwi obwodowej, biocząstki SIU i DHE w temperaturze pokojowej i etylo malamowane w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza B, po rozmrożeniu odczynników dodaj 20 mikrolitrów cząstek biologicznych ssus do czterech pojedynczych probówek o pojemności 1,2 mililitra w sterylnym kapturze. Następnie dodaj 40 mikrolitrów rozmrożonego DHE do każdej probówki zawierającej biocząsteczki i delikatnie postukaj w probówki na stole, aby zebrać odczynnik na dnie probówek. Po dodaniu 100 mikrolitrów zmieszanej krwi pełnej do każdej probówki, usuń wszelką zanieczyszczającą krew wzdłuż wewnętrznej krawędzi probówek za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i wymieszaj krew i odczynniki za pomocą elektronicznego zestawu pipet na trzy cykle.
Po trzecim cyklu umieść wszystkie probówki w pojemniku na lód chronionym przed światłem. Następnie inkubuj probówki przez 10, 20 lub 40 minut w kąpieli szybkościowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zaczynając od 40-minutowej probówki, aby upewnić się, że wszystkie inkubacje zakończą się w tym samym czasie. Pod koniec inkubacji wlej 15 mikrolitrów malamowanego etylu do każdej z probówek.
Po 30 minutach inkubować komórki z 10 mikrolitrami każdego z odpowiednich przeciwciał. Po godzinie dalej inkubować komórki w 750 mikrolitrach roztworu z czerwonych krwinek utrwalających krwinki. Po kolejnej godzinie inkubacja odwirować komórki i odessać próżniowo supernatant, pozostawiając pozostałą objętość płynu 100 mikrolitrów nad osadem komórkowym.
Teraz do każdej próbki dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozcieńczonych siedmiu A a d, 50 mikrolitrów PBS i 25 mikrolitrów kulek kalibracyjnych. Następnie zakryj probówki, zawiń je w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy cytometr przepływowy oparty na obrazie jest gotowy, uruchom każdą probówkę z próbką, zbierając co najmniej 3000 zdarzeń w miejscu ULU przy użyciu predefiniowanych parametrów do analizy próbek.
Użyj automatycznego kreatora kompensacji programowej w oprogramowaniu IDEA, aby zastosować macierz kompensacji do plików obrazów RAW i utworzyć pliki z kompensacją obrazów. Następnie załaduj poszczególne pliki CIF do oprogramowania IDEA i wygeneruj następujące wykresy, aby zidentyfikować podzbiory granulocytów dla każdej próbki pacjenta. Używając niestymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia, najpierw użyj histogramu średniej kwadratowej gradientu jasnego pola, aby ustalić początkowe bramki i zidentyfikować komórki, które uznano za zogniskowane.
Następnie, aby oddzielić komórki singletowe od szczątków i dubletów, utwórz wykres punktowy proporcji współczynnika jasności pola w stosunku do obszaru jasnego pola. Po zidentyfikowaniu czystej populacji komórek ustal wykres punktowy CD 45 w porównaniu z CD 66 B.To pozytywnie zidentyfikować CD 45 dodatnie CD 66 B granulocyty. Na koniec utwórz wykres punktowy intensywności jasnych szczegółów dla złocistego w porównaniu z intensywnością jasnych szczegółów dla wybuchu oksydacyjnego.
Aby zidentyfikować podzbiory aktywowanych granulocytów zbierających obrazy jasnego pola w kanałach pierwszym i dziewiątym, cząstki biologiczne w kanale trzecim, DHE w kanale czwartym, siedem a d w kanale piątym, CD 66 B w kanale 11 i CD 45 w kanale 12, można również wygenerować dwukolorową nakładkę przedstawiającą połączone zdarzenia DHE i biocząstek. Korzystając z cytometrii przepływowej opartej na obrazie, jednorodną populację aktywowanych granulocytów można podzielić na trzy różne podzbiory aktywacji. Dzięki tej metodzie najskuteczniejszym sposobem rozwiązania trzech podzbiorów jest wykreślenie intensywności jasnych szczegółów dla fagocytozy w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym.
Dalsze wykorzystanie kreatora kolokalizacji w oprogramowaniu IDEAS pozwala na ilościowe określenie obecności jednoczesnej fagocytozy i wybuchu oksydacyjnego granulocytów, co jest znakiem rozpoznawczym wysokiej aktywacji. Dodatkowo w tym eksperymencie 40-minutowy okres inkubacji wykazał największy odsetek wysoce aktywnych granulocytów. W związku z tym uwzględnienie w protokole co najmniej trzech okresów inkubacji ułatwia określenie, w jaki sposób dane leczenie kliniczne może zmienić czasowy stan aktywacji granulocytów.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy multipleksowe oparte na koralikach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, jak zmienia się produkcja chemokiny GRANULOCYTE w supinacie po ekspozycji na biocząstki?
Przegląd
Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesne pomiary fagocytozy bakterii i utleniania wybuchu. Cytometria przepływowa oparta na obrazach pozwoliła na identyfikację trzech różnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, które różniły się względem ich względnej zdolności funkcjonalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Badania kliniczne
Tło
- Granulocyty odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Rozumienie ich funkcji może dostarczyć wglądu w różne stany zdrowia.
- To badanie koncentruje się na ocenie aktywacji i funkcji granulocytów.
- Cytometria przepływowa oparta na obrazach jest wykorzystywana do szczegółowej analizy.
Cel badania
- Ocenić funkcję granulocytów za pomocą dwuparametrowego podejścia.
- Zidentyfikować aktywne podzbiory granulocytów.
- Zbadać wpływ nawyków żywieniowych na funkcję granulocytów.
Stosowane metody
- Inkubacja granulocytów z bio cząstkami i reagentami.
- Blokowanie fagocytozy i oznaczanie receptorów na powierzchni komórki.
- Cytometria przepływowa oparta na obrazach do analizy podzbiorów granulocytów.
- Ilościowe określenie fagocytozy i utleniania wybuchu.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano trzy różne podzbiory aktywowanych granulocytów.
- Okres inkubacji wpływał na status aktywacji granulocytów.
- Cytometria przepływowa oparta na obrazach dostarczyła szczegółowych wglądów w funkcję granulocytów.
- Wyniki mogą informować o leczeniu klinicznym i praktykach żywieniowych.
Wnioski
- Ta metoda skutecznie ocenia funkcję granulocytów.
- Pozwalla na identyfikację funkcjonalnie odrębnych podzbiorów granulocytów.
- Dalsze badania mogą zbadać implikacje funkcji granulocytów w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis and oxidative burst using image-based flow cytometry enables multidimensional functional profiling critical for immunology-focused drug discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage target validation by resolving distinct activation phenotypes and temporal dynamics. The method supports risk-adjusted portfolio decisions by providing quantitative, reproducible immune function readouts relevant to both discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of innate immune cell function through dual-parameter analysis of phagocytosis and oxidative burst.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing low, moderate, and high activation granulocyte subsets.
- Facilitates functional target validation by quantifying treatment-induced shifts in granulocyte activation states.
- Improves predictive confidence for immune-modulating therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiparametric immune cell assays for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, quantitative outputs for reproducible compound evaluation.
- Enables assay scalability and platform reuse through automated image-based cytometry and software-driven analysis.
- Supports robust screening readiness by resolving functional heterogeneity within granulocyte populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro immune function assays with disease-relevant biomarker endpoints.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by tracking functional immune responses over time.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative immune activation profiles.
- Supports translational biomarker development by linking functional phenotypes to clinical treatment effects.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven immune function testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying granulocyte activation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or treatment evaluation in immune cell assays.
- Analytics: Delivers multiparametric measurements and statistical outputs for comparing activation states and treatment effects.
- Translational Research: Bridges in vitro immune function data with preclinical and clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for immune cell functional analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of immune function assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, immunology, and quantitative image analysis.
- Needs access to image-based flow cytometers with quantitative imaging and multi-laser capabilities.
- Demands cross-team standardization of gating, compensation, and analysis protocols.
- May require adaptation for different immune cell types or disease models.
- Dependent on robust software tools for multiparametric data analysis and colocalization quantification.
