Name: Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj technikę cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny funkcji granulocytów in vitro. Metoda ta pozwala identyfikować trzy odrębne podzbiory aktywowanych granulocytów różniących się zdolnościami funkcjonalnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecne badanie zostało częściowo sfinansowane z grantu na inicjację badań (RIG) z University of North Texas dla dr McFarlina. Autorzy nie otrzymali bezpośredniego finansowania na realizację tego badania i nie zgłaszają konfliktu interesów.

UWAGA: Wszystkie procedury pobierania krwi opisane w niniejszej metodzie zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone przez instytucjonalną komisję bioetyczną (IRB) UNT ds. badań z udziałem ludzi. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na pobranie krwi, co w niniejszej metodzie posłużyło do zapewnienia, że byli oni pozornie zdrowi, mieli prawidłową masę ciała i nie cierpieli na żadne choroby.
1. Źródło i przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>W tym badaniu należy zastosować przeciwciała CD66b-APC (klon #G10F5; DF=1:50) oraz CD45-APCeFluor780 (klon #2D1; DF=1:50). 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem badania przeprowadzono miareczkowanie przeciwciał CD45 i CD66b w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia, które pozwoli na wyraźne oddzielenie granulocytów (CD45+/66b+) od pozostałych leukocytów (CD45+/66b-) 11. Po dodaniu rozcieńczonego przeciwciała do barwienia końcowe rozcieńczenie w probówce wynosiło 875.</li>
	<li>Należy zakupić i rozmrozić stokowe bioparticles S. aureus znakowane barwnikiem pHrodo red. Zawiesić je w sterylnym PBS w stężeniu 1 mg bioparticles na ml. Rozdzielić rozcieńczone bioparticles na alykwouty i przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C do czasu użycia w badaniu.</li>
	<li>Rozpuścić dihydroetydium (DHE), które w obecności wolnych rodników tlenowych (t.j. podczas wyrzutu oksydacyjnego), przekształca się w fluorescencyjny bromek etydyny), w DMSO do końcowego stężenia 10 g/ml.</li>
	<li>Wymieszać N-etylomaleimid (stosowany w celu zapobieżenia dalszej fagocytozie po określonym czasie inkubacji w badaniu) ze sterylnym PBS w dwustopniowym rozcieńczeniu do odpowiednio 200 mg/ml i 17,5 mg/ml. W badaniu należy zastosować końcowe stężenie 15 mM. Podczas rozmrażania N-etylomaleimidu należy użyć bloku grzejnego o temperaturze 37 °C, ponieważ N-etylomaleimid nie pozostaje w roztworze.</li>
	<li>Po końcowym etapie utrwalania należy zastosować 7AAD do barwienia DNA jądrowego. Przed dodaniem należy rozcieńczyć stokowy roztwór 7AAD w stosunku 1:10 sterylnym PBS.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Poproś badanych o przybycie do laboratorium po nocnym poście (&gt;8h) i powstrzymaniu się od aktywności fizycznej (&gt;12 h).</li>
	<li>Po oczyszczeniu skóry gazikiem nasączonym alkoholem, wprowadź sterylną igłę do pobierania krwi do obwodowej żyły ramiennej.</li>
	<li>Pobierz krew do probówek próżniowych fabrycznie wypełnionych heparyną sodową.</li>
	<li>Po pobraniu krwi naklej plaster przylepny na ramię badanego.</li>
	<li>Odwróć probówki z krwią 10 razy w celu wymieszania, a następnie umieść je na mieszalniku obrotowym do czasu przeprowadzenia analizy.</li>
</ol>
3. Technika testu fagocytozy
<ol>
	<li>Odmrozić biocząsteczki S.aureus (temp. pokojowa), DHE (temp. pokojowa) oraz N-etylomaleimid (37 °C).</li>
	<li>Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieść po 20 L biocząsteczek S.aureus do 4 oddzielnych probótek o pojemności 1,2 ml.</li>
	<li>Do każdej probótki z biocząsteczkami dodać 40 L DHE.</li>
	<li>Lekko opukać probótki o blat, aby odwirować odczynniki na dno probówek.</li>
	<li>Do każdej probótki wypełnionej biocząsteczkami i DHE dodać 100 L zmieszanej krwi pełnej.</li>
	<li>Przetrzeć wewnętrzną krawędź probótek aplikatorem z watką, aby usunąć zanieczyszczenia z krwi.</li>
	<li>Wymieszać krew i odczynniki za pomocą pipety elektronicznej, wykonując trzy cykle mieszania po dodaniu krwi.</li>
	<li>Umieścić probótki z analizą w pojemniku z lodem i przykryć, aby chronić przed światłem.</li>
	<li>Inkubować probótki z analizą przez 10, 20 i 40 min. Rozpocząć od probótki na 40 min, aby wszystkie probótki zakończyły inkubację w tym samym czasie.</li>
	<li>Odmrozić N-etylomaleimid w łaźni kuleczkowej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Do każdej probótki z analizą pipetować 15 L N-etylomaleimidu (opisanego powyżej w punkcie 1.4) i inkubować przez 30 min.</li>
	<li>Pipetować 10 L rozcieńczonych przeciwciał CD66b-APC oraz 10 L CD45-APCeFluor780 (opisanych powyżej w punkcie 1.1) i inkubować przez 60 min.</li>
	<li>Do każdej probótki z analizą pipetować 750 L roztworu do utrwalania WBC/lizy RBC i inkubować przez 60 min.</li>
	<li>Odwirować probótki z analizą (10 min przy 400 x g), aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Odssać roztwór do lizy WBC/utrwalania RBC za pomocą odsysacza próżniowego, pozostawiając objętość resztkową cieczy (100 L) nad osadem komórkowym.</li>
	<li>Do każdej probótki z analizą pipetować 10 L rozcieńczonego roztworu 7AAD (opisanego powyżej w punkcie 1.5) oraz 50 L PBS.</li>
	<li>Do każdej probótki z analizą dodać jedną kroplę kuleczek kalibracyjnych (~25 L), zakręcić probótki, owinąć je folią i umieścić w lodówce.</li>
	<li>Wprowadzić probówkę z próbką do cytometru przepływowego obrazującego i zebrać minimum 3 000 zdarzeń granulocytów, korzystając z predefiniowanych parametrów: Autosampler, lasery niebieski (488 nm; 60 mW), czerwony (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) (Rycina 1).</li>
</ol>
<img alt="Stanowisko do cytometrii przepływowej z analizą danych; na ekranie wyświetlone wykresy i schematy analizy komórek." src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Metoda akwizycji i szablon. Próbki analizowano na obrazowym cytometrze przepływowym (A). Podczas akwizycji, przy użyciu oprogramowania INSPIRE v. 100.2.292.0, generowano wykresy kropkowe stosunku proporcji obrazu w polu jasnym (Bright Field Aspect Ratio) do CD66b-APC w celu oddzielenia granulocytów od dodanych kulek kalibracyjnych (B). Dla każdej próbki pobrano minimum 5 000 granulocytów przy użyciu autopodajnika oraz laserów niebieskiego (488 nm; 60 mW), czerwonego (640 nm; 100 nW) i SSC (785 nm; 8.5 mW). Należy zauważyć, że podczas akwizycji wyświetlane jest kilka histogramów służących do monitorowania ustawień laserów i innych aspektów zbierania danych. Wszystkie te histogramy są opcjonalne i są wymagane jedynie w przypadku, gdy standardowe procedury operacyjne laboratorium nakazują ich stosowanie w ramach kontroli jakości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Pozyskiwanie i analiza próbek
<ol>
	<li>Użyj automatycznego kreatora kompensacji w oprogramowaniu IDEAS, aby zastosować macierz kompensacji do surowych plików obrazów (RIF) i utworzyć skompensowane pliki obrazów (CIF).</li>
	<li>Wczytaj poszczególne pliki CIF w oprogramowaniu IDEAS i wygeneruj następujące wykresy w celu identyfikacji subpopulacji granulocytów:</li>
	<li>Ustal wstępne bramki w celu identyfikacji komórek uznanych za będące w ostrości, wykorzystując histogram dla RMS gradientu pola jasnego (Rysunek 2A). Wyznacz to dla każdej próbki pacjenta, używając nieustymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia.</li>
	<li>Użyj wykresów wtórnych, aby oddzielić pojedyncze komórki od debris i dubletów, wykorzystując wykres kropkowy stosunku proporcji pola jasnego (stosunek wysokości do szerokości komórki) względem pola powierzchni w polu jasnym (Rysunek 2B). Wyznacz to dla każdej próbki pacjenta, używając nieustymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu czystej populacji komórek, utwórz wykres kropkowy CD45 względem CD66b (Rysunek 2C), aby jednoznacznie zidentyfikować granulocyty (CD45+/66b+). Utwórz wykres pochodny (Rysunek 3) intensywności jasnych szczegółów dla S. aureus (oś X) względem intensywności jasnych szczegółów dla wyrzutu oksydacyjnego (DHE, oś Y), aby zidentyfikować subpopulacje aktywowanych granulocytów. Zbieraj obrazy pola jasnego w kanale 1 i 9, biopartykuły w kanale 2, DHE w kanale 4, 7AAD w kanale 5, CD66b w kanale 11 oraz CD45 w kanale 12.</li>
</ol>
<img alt="Wykresy analizy obrazów w jasnym polu, przedstawiające częstotliwość, stosunek proporcji do pola powierzchni oraz porównanie markerów." src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. szablon analizy.Na rycinie przedstawiono serię wykresów wygenerowanych w celu identyfikacji komórek znajdujących się w ostrości (A), pojedynczych komórek (B) oraz granulocytów (C). Dodatkowe wykresy posłużyły do wyodrębnienia trzech podzbiorów aktywowanych granulocytów w porównaniu do granulocytów nieaktywnych. Cała analiza pozyskanych plików obrazów została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li>
<li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li>
<li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis%2C+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li>
<li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
<li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-year+school-based+diet%2Fexercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Nutr%22%5BJournal%5D)">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li>
<li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity%2C+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Physiol.+Nutr.+Metab%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li>
<li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise%3A+implications+for+infection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li>
<li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li>
<li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li>
<li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis%3A+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold%2FFlu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diet.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsza metoda stanowi udoskonalenie istniejących metod oceny funkcji granulocytów za pomocą cytometrii przepływowej 1,3,4,12-14. Krytyczne etapy tego testu są zwykle związane z prawidłowym wymieszaniem próbki krwi z biocząstkami i DHE. Niepełne mieszanie spowoduje niedokładne wyniki. Chociaż całkowite wymieszanie ma kluczowe znaczenie, metoda mieszania powinna być z natury delikatna. Sugeruje się, aby mieszanie odbywało się za pomocą pipety elektronicznej z funkcją mieszania, a nie mieszalnika wirowego. Kolejnym krytycznym krokiem w teście jest zawsze upewnienie się, że górna połowa probówki testowej nie zanieczyszcza krwi. Tę pozostałą krew można usunąć za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Całkowite usunięcie jest ważne, ponieważ niezastosowanie się do tego może spowodować zanieczyszczenie końcowego preparatu testowego niezlizowanymi krwinkami czerwonymi.
Przed zastosowaniem tej metody należy dodać odpowiednie kontrole kompensacyjne w celu kontroli nakładania się widm między odczynnikami stosowanymi do identyfikacji różnych aspektów funkcji granulocytów. W przypadku tej metody kontrole kompensacyjne polegają na pobraniu próbek krwi, którym zasugerowano 40-minutową inkubację testu, a następnie znakowaniu pojedynczym markerem (tj. E. coli, DHE itp.). Po oznakowaniu zbierane są pojedyncze zdarzenia pozytywne, a za pomocą automatycznego kreatora w oprogramowaniu analitycznym IDEAS generowana jest matryca kompensacji. Bardzo ważne jest, aby w przypadku zastosowania tego testu przeprowadzono odpowiednie kontrole kompensacyjne w celu zapewnienia prawidłowej wydajności testu.
Analiza jest przeprowadzana za pomocą wyszukiwarki funkcji i kreatorów kolokalizacji, aby określić, że intensywność jasnych szczegółów jest najlepszą zmienną do oddzielenia populacji, a także określić, w jakim stopniu istnieje nakładanie się sygnałów wybuchu oksydacyjnego i fagocytozy. W szczególności zastosowanie cytometrii opartej na obrazie umożliwiło segregację aktywowanych granulocytów na trzy podzbiory. Ten podział podzbioru został określony na podstawie intensywności jasnych szczegółów fagocytozy w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym. Oprócz zbadania tych pojedynczych funkcji komórek, zidentyfikowano komórki, które wykazywały oba zdarzenia w tym samym czasie w tym samym miejscu anatomicznym (kolokalizacja). Granulocyty, które należały do podzbioru "wysoce aktywnego", były jedynym fenotypem, który wykazywał stałą kolokalizację między fagocytozą a wybuchem oksydacyjnym. Ta identyfikacja aktywowanych podzbiorów granulocytów jest największym obszarem, w którym potrzebne jest rozwiązywanie problemów. Bardzo ważne jest, aby nowy użytkownik poświęcił czas na zrozumienie przebiegu procesu próbkowania w IDEAS i zrozumienie mechaniki bramkowania populacji komórek za pomocą komponentu obrazowania. Inne modyfikacje, które użytkownik może chcieć wprowadzić, obejmują wybór alternatywnych lub dodatkowych czasów inkubacji testu. Obecna metoda sugeruje stosowanie czasu trwania 10-40 minut; Jednak w zależności od modelu doświadczalnego, w którym metoda ta ma być stosowana, może być konieczne wybranie dłuższych czasów trwania testu. Taka modyfikacja musiałaby być oceniana indywidualnie.
Ponadto ustalono, że czas trwania inkubacji testu ma znaczący wpływ na pojawienie się trzech aktywowanych podzbiorów. Podejście opisane w tym raporcie stanowi rozszerzenie tego, co można było wcześniej uzyskać na temat funkcji granulocytów 3,4,13,15. Inne laboratoria wykazały znaczenie oceny zmian w funkcji granulocytów w ramach kompleksowej oceny odporności i choroby 15-17. Pomimo potencjału tego testu, nie jest on pozbawiony ograniczeń. Jednym z głównych ograniczeń jest koszt i czasochłonność związane z wysoką przepustowością przetwarzania próbek. Gdy projekt badania wymaga dużej liczby próbek w danym dniu, może to być trudne do przetworzenia. Przetwarzanie jest usprawnione dzięki zastosowaniu elektronicznych pipet i dozowników, ale są one zwykle drogie i niekoniecznie są dostępne w każdym laboratorium.
Nasz obszar badań koncentruje się na badaniu, w jaki sposób ćwiczenia i nawyki żywieniowe wpływają na zdrowie i funkcjonowanie układu odpornościowego 6,8-10,18-20. Cele te mają istotne implikacje praktyczne dla różnych dziedzin zdrowia ludzkiego. Poza badaniami nad ćwiczeniami fizycznymi i efektami żywieniowymi, metoda fagocytozy przedstawiona w tym manuskrypcie może być przydatna w innych obszarach immunologii klinicznej, w których monitorowanie funkcji fagocytozy ma kluczowe znaczenie dla wyników leczenia. Obecny test jest pierwszym z wielu, które są testami immunologicznymi, które mogą zostać ponownie wynalezione poprzez wykorzystanie unikalnych informacji obrazowych, które można uzyskać z cytometru przepływowego opartego na obrazie.

Granulocyty reprezentują jeden ze składników wrodzonego układu odpornościowego organizmu, który stanowi pierwszą linię obrony przed atakującymi antygenami. Poprzednie metody oceny funkcji granulocytów koncentrowały się na zdolności fagocytozy lub wybuchu oksydacyjnym przy użyciu oddzielnych metod, co utrudnia zbiorcze ustalenie, jak zmieniły się granulocyty 1-4. Postępy w dziedzinie cytometrii przepływowej zaowocowały wyprodukowaniem przyrządów stacjonarnych zdolnych do wysokorozdzielczego, wielokolorowego obrazowania komórek w sposób wysokoprzepustowy 5. Możliwość połączenia obrazowania z tradycyjną cytometrią przepływową stanowi postęp, który zapewnia platformę technologiczną potrzebną do wprowadzania innowacji w istniejących metodach cytometrii przepływowej i wydobywania nowych informacji o układzie odpornościowym.
W ciągu ostatnich dziesięciu lat, nasze laboratorium, między innymi, skupiało się na wpływie różnych wzorców odżywiania i ćwiczeń na wrodzoną funkcję immunologiczną 6-9. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie ma praktyczne implikacje w dziedzinie immunologii klinicznej. Obecna metoda wykorzystuje moc cytometrii przepływowej opartej na obrazie do jednoczesnego pomiaru fagocytozy cząstek bakteryjnych i wybuchu oksydacyjnego. Dzięki takiemu podejściu można oddzielić aktywowane granulocyty za pomocą zmiennych dostarczonych przez część analizy opartą na obrazie. Podzbiory te można było zidentyfikować dopiero po ocenie obrazów komórkowych na poszczególnych granulocytach. Dalszy czas inkubacji testu wpłynął na przejście między trzema podzbiorami aktywacji 10. W związku z tym prawdopodobne jest, że zastosowanie wielokrotnych czasów inkubacji może pozwolić na metodę badania zmiany funkcji granulocytów po określonym leczeniu eksperymentalnym. Celem tego artykułu było zademonstrowanie metody oceny funkcji granulocytów za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie do jednoczesnego pomiaru fagocytozy z wybuchem oksydacyjnym.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>używane do pobierania krwi</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Roztwór do lizy</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>klon G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>klon 2D1</td><td></td></tr><tr><td>S. biocząstki złociste złociste</td> Life <td>Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomalemid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Milipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator hematologiczny</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-kanałowa pipeta</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Inkubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie Cytometr przepływowy</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie INSPIRE</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Oprogramowanie</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Stacja robocza</td><td>Komputery Dell</td><td>Różne</td><td>używane do analizy IDEAS</td></tr></tbody></table>

technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocyty odgrywają kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcje bakteryjne i wirusowe. Chociaż istnieją metody pomiaru funkcji granulocytów, na ogół są one ograniczone pod względem informacji, które mogą dostarczyć. Na przykład większość istniejących testów podaje jedynie procent liczby granulocytów, które są aktywowane po pojedynczej inkubacji o ustalonej długości. Sprawę komplikuje fakt, że większość testów koncentruje się tylko na jednym aspekcie funkcji ze względu na ograniczenia w technologii wykrywania. W artykule przedstawiono technikę jednoczesnego pomiaru fagocytozy granulocytów bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Mierząc obie te funkcje w tym samym czasie, zidentyfikowano trzy unikalne fenotypy aktywowanych granulocytów: 1) Niska aktywacja (minimalna fagocytoza, brak wybuchu oksydacyjnego), 2) Umiarkowana aktywacja (umiarkowana fagocytoza, pewien wybuch oksydacyjny, ale brak kolokalizacji dwóch zdarzeń funkcjonalnych) oraz 3) Wysoka aktywacja (wysoka fagocytoza, wysoki wybuch oksydacyjny, kolokalizacja fagocytozy i wybuch oksydacyjny). Zidentyfikowano również czwartą populację, która składała się z inaktywowanych granulocytów. Stosując inkubacje testowe trwające 10, 20 i 40 minut, oceniono wpływ czasu trwania inkubacji testu na redystrybucję aktywowanych fenotypów granulocytów. Czwartą inkubację zakończono na lodzie jako kontrolę. Wykorzystując inkubacje w czasie seryjnym, test może być w stanie wykryć, w jaki sposób leczenie wpływa przestrzennie na funkcję granulocytów. Wszystkie próbki mierzono za pomocą cytometru przepływowego opartego na obrazie, wyposażonego w opcję obrazowania ilościowego (QI), autosampler i wiele laserów (488, 642 i 785 nm).

Zastosowanie cytometrii przepływowej obrazowej pozwoliło nam na rozdzielenie homogennej populacji aktywowanych granulocytów na trzy różne podgruby aktywacji (Rysunek 3). W tej metodzie najskuteczniejszym sposobem rozróżnienia trzech podgrup aktywacji jest przedstawienie intensywności jasnych szczegółów dla fagocytozy (S. aureus) w funkcji wyrzutu oksydacyjnego (DHE) (Rysunek 3; Rysunek 4). Ponadto użycie kreatora kolokalizacji w oprogramowaniu IDEAS umożliwi ilościowe określenie jednoczesnego występowania fagocytozy i wyrzutu oksydacyjnego, co jest charakterystycznym znakiem silnie aktywowanych granulocytów.
<img alt="Wykresy rozrzutu fagocytozy względem wyrzutu oksydacyjnego; obrazy z mikroskopii poklatkowej w 10, 20 i 40 minucie." src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Identyfikacja podzbiorów aktywowanych granulocytów. Po identyfikacji granulocytów przy użyciu markerów powierzchniowych (CD45+/66b+), wygenerowano wykres pochodny, zestawiając intensywność jasnych detali dla fagocytozy z intensywnością jasnych detali dla wyrzutu oksydacyjnego. Stosując to podejście, określono odsetek granulocytów nieaktywnych (fioletowe), nisko aktywnych (czerwone, A), umiarkowanie aktywnych (niebieskie, B) oraz wysoko aktywnych (żółte, C). Tę technikę bramkowania wykorzystano również do oceny wpływu czasu inkubacji testu na względną liczebność poszczególnych podzbiorów aktywowanych granulocytów. Najwyższy odsetek granulocytów „wysoko aktywnych” odnotowano po 40 min inkubacji. Wszystkie analizy pozyskanych plików obrazów wykonano przy użyciu oprogramowania IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Oprócz wykazania obecności trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, udowodniono, że czas inkubacji w teście wpływa na względną liczebność każdego z tych podzbiorów. W szczególności 40 min inkubacji skutkowało najwyższym odsetkiem granulocytów „wysoko aktywnych”. Dzięki zastosowaniu co najmniej trzech różnych czasów inkubacji możliwe może być określenie, w jaki sposób dana terapia kliniczna zmienia czasowy status aktywacji granulocytów. Jest to pierwsza opublikowana metoda wykorzystująca cytometrię przepływową opartą na obrazowaniu do identyfikacji różnych podzbiorów aktywowanych granulocytów w funkcji jednoczesnych pomiarów fagocytozy i wyrzutu oksydacyjnego.
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; analiza wielokanałowa, obrazowanie spektroskopowe, badanie komórek." src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywne obrazy markerów komórkowych. Na tej rycinie przedstawiono galerię obrazów komórek sklasyfikowanych jako wysoko aktywne (A), umiarkowanie aktywne (B) oraz nisko aktywne (C). Biocząstki S.aureus znajdują się w Ch03, wyrzut oksydacyjny w Ch04, 7AAD dla jądra w Ch05, rozproszenie boczne (side scatter) w Ch06, CD66b w Ch11, a CD45 w Ch12. Wyświetlono również obraz z nałożeniem (merge) kolokalizacji fagocytozy (Ch03) i wyrzutu oksydacyjnego (Ch04). Żółte obszary na obrazie z nałożeniem oznaczają, że fagocytoza i wyrzut oksydacyjny zachodzą w tej samej przestrzeni anatomicznej w tym samym czasie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji granulocytów jako podejścia dwuparametrowego. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację granulocytów z próbek krwi pacjenta z cząstkami biologicznymi i odczynnikiem w celu wizualizacji wybuchu oksydacyjnego. W drugim etapie fagocytoza po inkubacji jest blokowana, a następnie znakowane są receptory na powierzchni komórki, które są przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić pozytywną identyfikację granulocytów.Ostatecznie aktywowane podzbiory granulocytów można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii żywieniowej lub klinicznej, takie jak to, w jaki sposób nawyki żywieniowe i praktyki żywieniowe przyczyniają się do zmian i funkcji granulocytów. Zademonstruje tę procedurę Eric Prado, doktorant z mojego laboratorium.Po rozmrożeniu próbki krwi obwodowej, biocząstki SIU i DHE w temperaturze pokojowej i etylo malamowane w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza B, po rozmrożeniu odczynników dodaj 20 mikrolitrów cząstek biologicznych ssus do czterech pojedynczych probówek o pojemności 1,2 mililitra w sterylnym kapturze. Następnie dodaj 40 mikrolitrów rozmrożonego DHE do każdej probówki zawierającej biocząsteczki i delikatnie postukaj w probówki na stole, aby zebrać odczynnik na dnie probówek. Po dodaniu 100 mikrolitrów zmieszanej krwi pełnej do każdej probówki, usuń wszelką zanieczyszczającą krew wzdłuż wewnętrznej krawędzi probówek za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i wymieszaj krew i odczynniki za pomocą elektronicznego zestawu pipet na trzy cykle.Po trzecim cyklu umieść wszystkie probówki w pojemniku na lód chronionym przed światłem. Następnie inkubuj probówki przez 10, 20 lub 40 minut w kąpieli szybkościowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zaczynając od 40-minutowej probówki, aby upewnić się, że wszystkie inkubacje zakończą się w tym samym czasie. Pod koniec inkubacji wlej 15 mikrolitrów malamowanego etylu do każdej z probówek.Po 30 minutach inkubować komórki z 10 mikrolitrami każdego z odpowiednich przeciwciał. Po godzinie dalej inkubować komórki w 750 mikrolitrach roztworu z czerwonych krwinek utrwalających krwinki. Po kolejnej godzinie inkubacja odwirować komórki i odessać próżniowo supernatant, pozostawiając pozostałą objętość płynu 100 mikrolitrów nad osadem komórkowym.Teraz do każdej próbki dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozcieńczonych siedmiu A a d, 50 mikrolitrów PBS i 25 mikrolitrów kulek kalibracyjnych. Następnie zakryj probówki, zawiń je w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy cytometr przepływowy oparty na obrazie jest gotowy, uruchom każdą probówkę z próbką, zbierając co najmniej 3000 zdarzeń w miejscu ULU przy użyciu predefiniowanych parametrów do analizy próbek.Użyj automatycznego kreatora kompensacji programowej w oprogramowaniu IDEA, aby zastosować macierz kompensacji do plików obrazów RAW i utworzyć pliki z kompensacją obrazów. Następnie załaduj poszczególne pliki CIF do oprogramowania IDEA i wygeneruj następujące wykresy, aby zidentyfikować podzbiory granulocytów dla każdej próbki pacjenta. Używając niestymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia, najpierw użyj histogramu średniej kwadratowej gradientu jasnego pola, aby ustalić początkowe bramki i zidentyfikować komórki, które uznano za zogniskowane.Następnie, aby oddzielić komórki singletowe od szczątków i dubletów, utwórz wykres punktowy proporcji współczynnika jasności pola w stosunku do obszaru jasnego pola. Po zidentyfikowaniu czystej populacji komórek ustal wykres punktowy CD 45 w porównaniu z CD 66 B.To pozytywnie zidentyfikować CD 45 dodatnie CD 66 B granulocyty. Na koniec utwórz wykres punktowy intensywności jasnych szczegółów dla złocistego w porównaniu z intensywnością jasnych szczegółów dla wybuchu oksydacyjnego.Aby zidentyfikować podzbiory aktywowanych granulocytów zbierających obrazy jasnego pola w kanałach pierwszym i dziewiątym, cząstki biologiczne w kanale trzecim, DHE w kanale czwartym, siedem a d w kanale piątym, CD 66 B w kanale 11 i CD 45 w kanale 12, można również wygenerować dwukolorową nakładkę przedstawiającą połączone zdarzenia DHE i biocząstek. Korzystając z cytometrii przepływowej opartej na obrazie, jednorodną populację aktywowanych granulocytów można podzielić na trzy różne podzbiory aktywacji. Dzięki tej metodzie najskuteczniejszym sposobem rozwiązania trzech podzbiorów jest wykreślenie intensywności jasnych szczegółów dla fagocytozy w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym.Dalsze wykorzystanie kreatora kolokalizacji w oprogramowaniu IDEAS pozwala na ilościowe określenie obecności jednoczesnej fagocytozy i wybuchu oksydacyjnego granulocytów, co jest znakiem rozpoznawczym wysokiej aktywacji. Dodatkowo w tym eksperymencie 40-minutowy okres inkubacji wykazał największy odsetek wysoce aktywnych granulocytów. W związku z tym uwzględnienie w protokole co najmniej trzech okresów inkubacji ułatwia określenie, w jaki sposób dane leczenie kliniczne może zmienić czasowy stan aktywacji granulocytów.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy multipleksowe oparte na koralikach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, jak zmienia się produkcja chemokiny GRANULOCYTE w supinacie po ekspozycji na biocząstki?

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten film demonstruje test in vitro badający immunomodulacyjny wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na proliferację efektorowych limfocytów T. Test obejmuje jednoczesną hodowlę MSCs z PBMC w celu skłonienia populacji monocytów do uzyskania fenotypu immunomodulującego, prowadzącego do wydzielania interleukiny-10 (IL-10). Po inkubacji z aktywowanymi limfocytami T CD4 + indukowane monocyty skutecznie hamują proliferację limfocytów T.

Test in vitro do oceny immunomodulacyjnego wpływu monocytów na proliferację leukocytów

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody pomiaru fagocytozy monocytów i granulocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego w próbkach ludzkiej krwi.

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Poznaj technikę cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny funkcji granulocytów in vitro. Metoda ta pozwala identyfikować trzy odrębne podzbiory aktywowanych granulocytów różniących się zdolnościami funkcjonalnymi.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Przeglądaj więcej filmów