Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji granulocytów jako podejścia dwuparametrowego. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację granulocytów z próbek krwi pacjenta z cząstkami biologicznymi i odczynnikiem w celu wizualizacji wybuchu oksydacyjnego. W drugim etapie fagocytoza po inkubacji jest blokowana, a następnie znakowane są receptory na powierzchni komórki, które są przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić pozytywną identyfikację granulocytów.

Ostatecznie aktywowane podzbiory granulocytów można zidentyfikować i wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii żywieniowej lub klinicznej, takie jak to, w jaki sposób nawyki żywieniowe i praktyki żywieniowe przyczyniają się do zmian i funkcji granulocytów. Zademonstruje tę procedurę Eric Prado, doktorant z mojego laboratorium.

Po rozmrożeniu próbki krwi obwodowej, biocząstki SIU i DHE w temperaturze pokojowej i etylo malamowane w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza B, po rozmrożeniu odczynników dodaj 20 mikrolitrów cząstek biologicznych ssus do czterech pojedynczych probówek o pojemności 1,2 mililitra w sterylnym kapturze. Następnie dodaj 40 mikrolitrów rozmrożonego DHE do każdej probówki zawierającej biocząsteczki i delikatnie postukaj w probówki na stole, aby zebrać odczynnik na dnie probówek. Po dodaniu 100 mikrolitrów zmieszanej krwi pełnej do każdej probówki, usuń wszelką zanieczyszczającą krew wzdłuż wewnętrznej krawędzi probówek za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i wymieszaj krew i odczynniki za pomocą elektronicznego zestawu pipet na trzy cykle.

Po trzecim cyklu umieść wszystkie probówki w pojemniku na lód chronionym przed światłem. Następnie inkubuj probówki przez 10, 20 lub 40 minut w kąpieli szybkościowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zaczynając od 40-minutowej probówki, aby upewnić się, że wszystkie inkubacje zakończą się w tym samym czasie. Pod koniec inkubacji wlej 15 mikrolitrów malamowanego etylu do każdej z probówek.

Po 30 minutach inkubować komórki z 10 mikrolitrami każdego z odpowiednich przeciwciał. Po godzinie dalej inkubować komórki w 750 mikrolitrach roztworu z czerwonych krwinek utrwalających krwinki. Po kolejnej godzinie inkubacja odwirować komórki i odessać próżniowo supernatant, pozostawiając pozostałą objętość płynu 100 mikrolitrów nad osadem komórkowym.

Teraz do każdej próbki dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozcieńczonych siedmiu A a d, 50 mikrolitrów PBS i 25 mikrolitrów kulek kalibracyjnych. Następnie zakryj probówki, zawiń je w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy cytometr przepływowy oparty na obrazie jest gotowy, uruchom każdą probówkę z próbką, zbierając co najmniej 3000 zdarzeń w miejscu ULU przy użyciu predefiniowanych parametrów do analizy próbek.

Użyj automatycznego kreatora kompensacji programowej w oprogramowaniu IDEA, aby zastosować macierz kompensacji do plików obrazów RAW i utworzyć pliki z kompensacją obrazów. Następnie załaduj poszczególne pliki CIF do oprogramowania IDEA i wygeneruj następujące wykresy, aby zidentyfikować podzbiory granulocytów dla każdej próbki pacjenta. Używając niestymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia, najpierw użyj histogramu średniej kwadratowej gradientu jasnego pola, aby ustalić początkowe bramki i zidentyfikować komórki, które uznano za zogniskowane.

Następnie, aby oddzielić komórki singletowe od szczątków i dubletów, utwórz wykres punktowy proporcji współczynnika jasności pola w stosunku do obszaru jasnego pola. Po zidentyfikowaniu czystej populacji komórek ustal wykres punktowy CD 45 w porównaniu z CD 66 B.To pozytywnie zidentyfikować CD 45 dodatnie CD 66 B granulocyty. Na koniec utwórz wykres punktowy intensywności jasnych szczegółów dla złocistego w porównaniu z intensywnością jasnych szczegółów dla wybuchu oksydacyjnego.

Aby zidentyfikować podzbiory aktywowanych granulocytów zbierających obrazy jasnego pola w kanałach pierwszym i dziewiątym, cząstki biologiczne w kanale trzecim, DHE w kanale czwartym, siedem a d w kanale piątym, CD 66 B w kanale 11 i CD 45 w kanale 12, można również wygenerować dwukolorową nakładkę przedstawiającą połączone zdarzenia DHE i biocząstek. Korzystając z cytometrii przepływowej opartej na obrazie, jednorodną populację aktywowanych granulocytów można podzielić na trzy różne podzbiory aktywacji. Dzięki tej metodzie najskuteczniejszym sposobem rozwiązania trzech podzbiorów jest wykreślenie intensywności jasnych szczegółów dla fagocytozy w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym.

Dalsze wykorzystanie kreatora kolokalizacji w oprogramowaniu IDEAS pozwala na ilościowe określenie obecności jednoczesnej fagocytozy i wybuchu oksydacyjnego granulocytów, co jest znakiem rozpoznawczym wysokiej aktywacji. Dodatkowo w tym eksperymencie 40-minutowy okres inkubacji wykazał największy odsetek wysoce aktywnych granulocytów. W związku z tym uwzględnienie w protokole co najmniej trzech okresów inkubacji ułatwia określenie, w jaki sposób dane leczenie kliniczne może zmienić czasowy stan aktywacji granulocytów.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy multipleksowe oparte na koralikach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, jak zmienia się produkcja chemokiny GRANULOCYTE w supinacie po ekspozycji na biocząstki?