Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej
7 stycznia 2019
Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii człowieka, takie jak to, w jaki sposób komunikacja między leukocytami zachodzi na poziomie molekularnym i komórkowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że nieoczyszczone ludzkie limfocyty T mogą być analizowane ex vivo w stosunkowo krótkim czasie. Procedurę tę zademonstruje Henning Kirchgessner, technik z naszego laboratorium.
Zacznij od zmieszania jednego mililitra świeżo pobranej ludzkiej krwi obwodowej z 30 mililitrami buforu do lizy ACK w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Po ośmiu minutach w temperaturze pokojowej napełnij probówkę PBS w celu przepłukania wirówką i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej na 60-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać pięć razy 10 do piątej enterotoksyny B Staphylococcus aureus lub obciążonych lub niezaładowanych SEB komórek Raji w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej do pojedynczych probówek FACS, a następnie 650 mikrolitrów panleukocytów.
Odwiruj kokultury i ponownie zawieś granulki w 150 mikrolitrach świeżej pożywki hodowlanej na 45-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie wiruj komórki przez 10 sekund z prędkością 100 obr./min, dodając 1,5 mililitra 1,5% paraformaldehydu. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej przerwij utrwalanie jednym mililitrem PBS uzupełnionym 1% BSA i zbierz komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS plus BSA i 0,1% saponiny, a następnie dodać próbki komórek do dwóch pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej odwirować płytkę i ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach PBS plus BSA i saponiny zawierającej przeciwciała lub związki sprzężone z fluoroforem na 30-minutową inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie w 150 mikrolitrach PBS plus BSA i saponiny i ponownie zawiesić granulki w 60 mikrolitrach PBS.
Aby zobrazować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, otwórz oprogramowanie analityczne, sprawdź poziom cieczy i kliknij przycisk Uruchamianie w menu Instrument. Następnie kliknij przycisk Załaduj i po wyświetleniu monitu załaduj próbki do portu. Na karcie Oświetlenie zmień moc lasera wzbudzenia na odpowiednie długości nanometrów.
Następnie dostosuj bramki dla kanałów czwartego i 11 oraz dostosuj obszar dla kanału pierwszego. Aby ocenić regulację bramkowania i mocy lasera, przełącz menu View na odpowiednią bramkę i dostosuj bramki i moce lasera, aż komórki i pary komórek będą widoczne. Następnie na karcie File Acquisition (Pobieranie plików) zdefiniuj nazwę próbki i liczbę obrazów do pobrania oraz odpowiednią bramkę do barwienia CD3 i kliknij przycisk Acquire, aby rozpocząć akwizycję.
Aby przeanalizować uzyskane obrazy komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne. Postępując zgodnie z instrukcjami w menu rozwijanym Wynagrodzenie, utwórz macierz wynagrodzeń i zapisz ją jako datę comp ctm. Następnie otwórz przykładowy plik obrazu RAW i zastosuj datę comp ctm w oknie, aby wygenerować skompensowany obraz i domyślne pliki analizy danych.
Po otwarciu skompensowanych plików graficznych przekonwertuj obrazy na tryb kolorów. Dostosuj tabele odnośników, aby uzyskać optymalne widoczne kolory na pasku narzędzi Właściwości galerii obrazów. Otwórz Menedżera masek w menu Analiza i zdefiniuj komórki T, wybierając maskę 60%Threshold dla kanału piątego i wypełniając maskę, aby utworzyć maskę komórek T.
Następnie wybierz Maska doliny dla kanału drugiego o szerokości trzech pikseli, aby utworzyć maskę doliny, a następnie połącz maski komórki T i doliny, aby utworzyć maskę synapsy komórek T. Aby obliczyć całkowite wyrażenie CD3 w komórkach T, otwórz Menedżera funkcji i utwórz cechę Intensywność, komórka T, kanał piąty. Aby obliczyć całkowitą ilość F-aktyny w limfocytach T, utwórz cechę Intensywność, limfocyty T, kanał szósty.
Aby ocenić ilość CD3 w synapsach immunologicznych, utwórz funkcję Intensywność, synapsę komórek T, kanał piąty. Aby określić ilość F-aktyny w synapsie immunologicznej, utwórz cechę Intensywność, synapsę limfocytów T, kanał szósty. Wreszcie, aby zdefiniować wzbogacenie F-aktyny i CD3, oblicz odpowiednio proporcje F-aktyny lub CD3 w synapsie immunologicznej i całkowitą ekspresję wybranego białka.
Na tych wykresach przedstawiono przegląd krytycznej strategii bramkowania do ilościowego określania wzbogacenia białek w synapsie immunologicznej między zastępczymi komórkami prezentującymi antygen lub APC a limfocytami T w nieoczyszczonych panleukocytach pobranych z próbki krwi ludzkiej o małej objętości. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy koniugatów limfocytów T-APC z niskimi poziomami CD3 i F-aktyny w ich synapsach immunologicznych przy braku SEB, podczas gdy te koniugaty limfocytów T-APC wykazują silne wzbogacenie CD3 i F-aktyny w obecności SEB. Przy braku superantygenu 15% limfocytów T wykazywało wzbogacenie zarówno CD3, jak i F-aktyny w synapsie immunologicznej, podczas gdy w obecności superantygenu obserwuje się 29% wzbogacenie.
Rzeczywiście, przy braku superantygenu mniej niż 20% całkowitej F-aktyny w komórkach gromadzi się w synapsie immunologicznej, a ponad 30% obserwuje się w synapsie w obecności superantygenu. Warto zauważyć, że CD3 gromadzi się w synapsie immunologicznej nawet przy braku superantygenu, chociaż akumulacja ta jest również znacznie zwiększona przez dodanie superantygenu, co dowodzi przydatności tej metody do ilościowego określania akumulacji białka w synapsie immunologicznej limfocytów T-APC. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu wszystkich istotnych kontroli, w tym próbek bez superantygenu, ponieważ wzbogacanie białek występuje również wtedy, gdy używane są APC bez SEB. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia superrozdzielcza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące delikatnej struktury synapsy immunologicznej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komunikacją komórkową do zbadania synapsy immunologicznej u ludzi w celach badań podstawowych, prób klinicznych i nauk translacyjnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować strefę łączną limfocytów T-APC i synapsę immunologiczną w ludzkich limfocytach T ex vivo. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi materiałami ludzkimi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek lub praca w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje schemat analizy synaps immunologicznych pomiędzy ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen z wykorzystaniem cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Metoda ta umożliwia szybką akwizycję i ocenę licznych obrazów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Wprowadzenie
- Zrozumienie komunikacji między leukocytami jest kluczowe w immunologii.
- Synapsy immunologiczne odgrywają kluczową rolę w aktywacji limfocytów T.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać efektywnej analizy nieoczyszczonych ludzkich limfocytów T.
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście pozwalające przezwyciżyć te ograniczenia.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy schemat analizy synaps immunologicznych.
- Aby pogłębić zrozumienie interakcji limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen.
- Aby ułatwić analizę ex vivo ludzkich limfocytów T.
Zastosowane metody
- Mieszanie ludzkiej krwi obwodowej z buforem lizującym ACK.
- Wirowanie i resuspensja w pożywce hodowlanej.
- Wprowadzenie komórek Raji obciążonych enterotoksyną B gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus).
- Wykorzystanie obrazującej cytometrii przepływowej do analizy.
Główne wyniki
- Pomyślna analiza synaps immunologicznych między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen.
- Wykazanie skuteczności metody w ocenie oddziaływań międzykomórkowych.
- Wgląd w molekularne mechanizmy komunikacji leukocytów.
- Potencjalne zastosowania w badaniach immunologicznych.
Wnioski
- Opisany schemat postępowania jest skuteczny w analizie synaps immunologicznych.
- Metoda ta umożliwia szybką i szczegółową ocenę interakcji limfocytów T.
- Dostarcza ona cennych informacji w zakresie immunologii człowieka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy schemat postępowania umożliwia wysokoprzepustową analizę morfologiczną synaps immunologicznych w pierwotnych ludzkich limfocytach T z nieoczyszczonych próbek krwi, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej walidacji celów immunologicznych. Poprzez kwantyfikację wzbogacenia białek na styku limfocyt T-APC z wykorzystaniem cytometrii przepływowej z obrazowaniem, metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków. Kompatybilność tej metody z małymi objętościami próbek pacjentów ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po kliniczną ocenę biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar wzbogacenia CD3 i F-aktyny w synapsie immunologicznej jako funkcjonalnego odczytu aktywacji limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego dzięki ilościowej, powtarzalnej ocenie zaangażowania celu w pierwotnych ludzkich komórkach bez konieczności ich oczyszczania.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na generowanie wskaźników opartych na stosunku (intensywność białka w synapsie/całkowita intensywność białka), co pomaga w selekcji kandydatów immunomodulujących na podstawie ich potencji mechanistycznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ustandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania kompatybilne z bibliotekami przesiewowymi związków, co pozwala na ocenę efektów wpływających na tworzenie synapsy immunologicznej.
- Skalowalność: Umożliwia równoległe przetwarzanie wielu próbek, wspierając kampanie przesiewowe o średniej przepustowości w badaniach nad immunologią.
- Powtarzalność: Wdraża pełną strategię bramkowania dla par limfocytów T/APC oraz masek synapsy, co redukuje zmienność w analizach końcowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystuje preparaty panleukocytowe wymagające jedynie 1 mL krwi, co umożliwia bezpośrednie zastosowanie w próbkach pacjentów do monitorowania farmakodynamicznego ex vivo.
- Zgodność biomarkerów: Pomiar wzbogacenia CD3 i F-aktyny jako biomarkerów farmakodynamicznych aktywacji limfocytów T indukowanej superantygenami, co jest możliwe do przełożenia na kliniczne monitorowanie odporności.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Dostarcza progi wzbogacenia (np. 29% tworzenia synaps z SEB), które służą do podejmowania decyzji go/no-go w przedklinicznym rozwoju immunomodulatorów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po optymalizację wiodących związków, szczególnie w przypadku immunomodulatorów i szczepionek, w których dynamika synapsy immunologicznej ma istotne znaczenie mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ilościowe określanie reorganizacji przestrzennej białek sygnałowych (CD3, F-actin) w synapsie immunologicznej, co pozwala wyjaśnić mechanizm działania.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników (stosunków intensywności białek), które umożliwiają wiarygodne porównanie między warunkami testowymi a kontrolnymi.
- Analityka: Generuje skompensowane, zamaskowane dane obrazowe oraz cechy intensywności, które wspierają statystyczne porównanie wzbogacenia białek pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez wykorzystanie pierwotnych ludzkich komórek i objętości próbek kompatybilnych z pacjentem, co umożliwia ex vivo ocenę biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku panel cytometrii przepływowej obrazowej do analizy synaps immunologicznych w wielu projektach dotyczących stanów zapalnych, autoimmunologii i chorób zakaźnych.
Wpływ Operacyjny i Przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji punktu uchwycenia poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej wizualizacji i kwantyfikacji tworzenia się synapsy immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez zdefiniowane protokoły bramkowania, kompensacji i maskowania, które można stosować w różnych ośrodkach i przez różnych użytkowników.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybki screening immunomodulatorów w pierwotnych ludzkich komórkach, co zmniejsza zależność od modeli o niższej wartości prognostycznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając ilościowe progi zaangażowania celu, które stanowią podstawę decyzji o dalszym rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi obrazującej cytometrii przepływowej, kompensacji fluorescencji oraz oprogramowania do analizy obrazów w celu generowania masek i cech.
- Metoda jest zależna od dostępu do aparatury do obrazującej cytometrii przepływowej z odpowiednimi kanałami wzbudzenia laserowego i detekcji dla CD3, aktyny F oraz barwników do oceny żywotności.
- Konieczna jest standaryzacja strategii bramkowania między zespołami (np. bramkowanie limfocytów T CD3+, maska Valley do definicji synapsy), aby zapewnić porównywalność danych.
- W przypadku rozszerzenia metody na nie-ludzkie systemy modelowe lub alternatywne komórki prezentujące antygen inne niż komórki Raji obciążone SEB, należy uwzględnić niezbędne modyfikacje.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność dokładnego miareczkowania SEB oraz optymalizacji czasów inkubacji w celu uniknięcia niespecyficznej aktywacji, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi kontroli.
