Name: Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę analizy synapsy immunologicznej między ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką ocenę interakcji komórkowych ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) grantami nr. SFB-938-M oraz SA 393/3-4.

1. Przygotowanie pan-leukocytów
<ol>
	<li>Pobrać 1 mL krwi obwodowej od zdrowego dawcy (lub pacjenta) do strzykawki z heparyną. Należy upewnić się, że uzyskano zgodę właściwej komisji etycznej na pobranie krwi.</li>
	<li>Wymieszać 1 mL ludzkiej krwi obwodowej z 30 mL buforu lizującego ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 oraz 0,1 mM EDTA, pH 7,0) w probówce o pojemności 50 mL i inkubować przez 8 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uzupełnić probówki buforem PBS i wirować przy 300 x g przez 6 min. Odessać supernatant i resuspendować osad w 30 mL buforu lizującego ACK.</li>
	<li>Powtarzać kroki 1.2 i 1.3 do momentu, aż supernatant stanie się przejrzysty. Następnie przemyć komórki w PBS, wirować przy 300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej i resuspendować osad komórkowy w 2 mL pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 60 min.</li>
</ol>
2. Obciążanie komórek Raji SEB
<ol>
	<li>Przygotować dwie probówki typu Falcon o pojemności 15 mL, zawierające odpowiednio 1,5 x 106 komórek Raji w każdej probówce. Wirować komórki (300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej) i odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować komórki w pozostałym medium (około 50–100 µL), dodać 1,9 µL (1,9 µG) SEB i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać 5 mL medium hodowlanego, wirować komórki (300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej), a następnie resuspendować osad w medium hodowlanym (RPMI1640 + 10% FCS) do uzyskania zagęszczenia 1 x 106 komórek/mL.</li>
</ol>
3. Protokół indukcji synaps immunologicznych i barwienia
<ol>
	<li>Do jednej probówki FACS pipetujemy 500 µL zawiesiny komórek Raji obciążonych SEB, a do drugiej probówki FACS 500 µL zawiesiny nieobciążonych komórek Raji. Do każdej probówki dodajemy 650 µL przeciwciał pan-leukocytowych i wirujemy komórki (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej). Odcinamy nadsącz i resuspendujemy osad w 150 µL pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubujemy w 37 °C (zazwyczaj przez 45 min).</li>
	<li>Komórki delikatnie mieszamy na wortexie (10 s przy 1,000 rpm) i podczas mieszania dodajemy 1,5 mL paraformaldehydu (1,5%), aby utrwalić komórki. Fiksację przerywamy poprzez dodanie 1 mL PBS + 1% BSA. Komórki wirujemy (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej), a po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej resuspendujemy osad komórkowy w 1 mL PBS + 1% BSA.</li>
	<li>Komórki wirujemy (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i resuspendujemy w 100 µL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny na 15 min w temperaturze pokojowej w celu permeabilizacji komórek (płytka 96-dołkowa, dno w kształcie litery U).</li>
	<li>Komórki przemywamy w PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny z wykorzystaniem wirowania (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i resuspendujemy osad komórkowy w 50 µL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny zawierającej przeciwciała lub związki znakowane fluoroforami (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) oraz DAPI (1:3,000)).</li>
	<li>Komórki inkubujemy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min. Komórki przemywamy 3 razy, dodając po 1 mL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny. Wirujemy przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Komórki resuspendujemy ponownie w 60 µL PBS do analizy w przepływowej cytometrii obrazowej.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie obrazów za pomocą cytometru przepływowego
UWAGA: Poniższa procedura pozyskiwania obrazów oraz analiza danych opierają się na cytometrii przepływowej z obrazowaniem z wykorzystaniem oprogramowania takiego jak imagestream (IS100), INSPIRE oraz IDEAS. Można jednak użyć również innych cytometrów przepływowych i oprogramowania do analizy.
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie analityczne na komputerze podłączonym do cytometru przepływowego z obrazowaniem i kliknij menu Initialize Fluidics of the Instrument. Na prośbę programu wprowadź kuleczki do prawego portu.</li>
	<li>Wczytaj domyślny szablon z menu File i kliknij Run/Setup. Z rozwijanego menu View wybierz Beads.</li>
	<li>Jeśli wskazana wartość jest niższa niż 200, dostosuj iluminator pola jasnego, klikając Set Intensity.</li>
	<li>Uruchom procedurę kalibracyjną i testową w zakładce Assist, klikając Start All.</li>
	<li>Kliknij Flush/Lock/Load i na prośbę programu wprowadź próbki do lewego portu. Po załadowaniu komórek do cytometru przepływowego otwórz Cell Classifier i dostosuj wartości w następujący sposób: górna granica intensywności piku na 1,022 dla każdego kanału, dolna granica intensywności piku na 50 dla kanału 2 (DAPI) i kanału 5 (CD3-Pe-TxR), dolna granica pola na 50 dla kanału 1 (side scatter) oraz górna granica na 1,500.</li>
	<li>W zakładce Setup zmień moc lasera wzbudzającego na 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) oraz 647 nm (90 mW).</li>
	<li>Przełączaj rozwijane menu View między Cells a Beads, aby ocenić ustawienia klasyfikatora komórek i moc lasera. 
	UWAGA: Poprzez zmianę ustawień klasyfikatora komórek i/lub mocy laserów wzbudzających upewnij się, że wszystkie komórki i pary komórek znajdują się w widoku Cell View, a skupiska komórek, debris i obrazy z nasyconymi pikselami znajdują się w widoku Debris View.</li>
	<li>W zakładce Setup określ nazwę próbki oraz liczbę obrazów do pozyskania (15,000–25,000 dla próbek i 500 dla kontroli kompensacji). Kliknij Run/Setup, aby rozpocząć akwizycję.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Przenieś surowe pliki obrazów (.rif) na komputer do analizy danych i uruchom oprogramowanie analityczne.</li>
	<li>Utwórz macierz kompensacji zgodnie z instrukcjami w menu rozwijanym Compensation. Zapisz macierz kompensacji jako comp_Data.ctm.</li>
	<li>Otwórz surowy plik obrazu próbki (.rif) i zastosuj plik comp_Date.ctm w wyświetlanym oknie, aby wygenerować skompensowane pliki obrazów (.cif) oraz domyślny plik analizy danych (.daf).</li>
	<li>Otwórz skompensowany plik obrazu. Przełącz obrazy w tryb kolorów i dostosuj tabele wyszukiwania (lookup tables) w pasku narzędzi Image Gallery Properties, aby uzyskać optymalne kolory widoczne. Wygeneruj obraz scalony RGB, korzystając z karty Composite w pasku narzędzi Image Gallery Properties.</li>
	<li>Otwórz menedżera masek (Mask Manager) z menu rozwijanego Analysis. Utwórz maski definiujące limfocyty T oraz synapsę immunologiczną w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wybierz maskę limfocytów T: "(Fill(Threshold_Ch05, 60)." Wybierz maskę doliny (valley mask): "Valley(Ch02,3)." Wybierz maskę synapsy limfocytów T: "T-cell mask AND Valley(M02,Ch02, 3)."</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz menedżera cech (Feature Manager) z menu rozwijanego Analysis. Oblicz następujące cechy:
	<ol>
		<li>Dla całkowitej ekspresji CD3 w limfocytach T wybierz "Intensity_T-cells_Ch5." Dla całkowitej ilości F-aktyny w limfocytach T wybierz "Intensity_T-cells_Ch6." Dla ekspresji CD3 w synapsie immunologicznej wybierz "Intensity_T-cell synapse_Ch5." Dla ilości F-aktyny w synapsie immunologicznej wybierz "Intensity_T-cell synapse_Ch6."</li>
		<li>Aby obliczyć powierzchnię limfocytu T, wybierz "Area_T-cells." Aby obliczyć powierzchnię synapsy immunologicznej limfocytu T, wybierz "Area_T-cell synapse."</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz wzbogacenie F-aktyny i CD3 w synapsie immunologicznej, korzystając z równania w menedżerze cech: 
	<img alt="Wzory wzbogacenia F-aktyny i CD3, metoda obliczeń dla analizy intensywności synapsy limfocytów T." src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Zastosuj następującą strategię bramkowania (gating), korzystając z histogramów i wykresów kropkowych z obszaru Analysis (szczegóły znajdują się w referencjach 17 i 19):
	<ol>
		<li>Odrzuć komórki poza ogniskowaniem, przedstawiając "Gradient RMS_M2_Ch2" na histogramie; ustaw próg na 15.</li>
		<li>Przedstaw SSC w stosunku do intensywności CD3 na wykresie kropkowym. Ustaw bramkę na zdarzenia CD3-dodatnie.</li>
		<li>Przedstaw "Aspect ratio" dla M02 (barwienie DAPI) w stosunku do powierzchni M02 (barwienie DAPI). Odpowiednio bramkuj singlety limfocytów T oraz pary komórek. Skoryguj wyniki dla rzeczywistych par komórek, korzystając z powierzchni maski synapsy, jak opisano wcześniej17,19.</li>
		<li>Wyznacz ilość F-aktyny w singletach limfocytów T oraz w limfocytach T tworzących pary limfocyt T/APC, a także procent F-aktyny w synapsie immunologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
<li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin%3A+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li>
<li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+and+Traction%3A+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68(2016).</li>
<li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+engine+in+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Netw%22%5BJournal%5D)">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li>
<li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li>
<li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li>
<li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiskott-Aldrich+Syndrome%3A+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj przepływ pracy umożliwia ilościowe określenie synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T (ex vivo) a APC. Warto zauważyć, że jako źródła limfocytów T wykorzystano panleukocyty poddane lizie erytrocytów, dzięki czemu etapy oczyszczania komórek T stały się zbędne. Linia komórkowa chłoniaka B-komórkowego Raji służyła jako zastępcze APC. Niesie to ze sobą znaczące korzyści, ponieważ umożliwia porównania między dawcami krwi po stronie limfocytów T synapsy immunologicznej. Co więcej, autologiczne...

T limfocyty są głównymi regulatorami adaptacyjnego układu odpornościowego i są aktywowane przez peptydy antygenowe, które są prezentowane w kontekście głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC). Pełna aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygnałów: sygnału kompetencji za pośrednictwem kompleksu receptora limfocytów T specyficznego dla antygenu (TCR)/CD3 oraz sygnału kostymulującego za pośrednictwem receptorów dodatkowych. Oba sygnały są generowane w wyniku bezpośredniego oddziaływania limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC). Dojrzałe APC dostarczają sygnał kompetencyjny do aktywacji limfocytów T przez kompleksy peptydowe MHC i eksprymują ligandy kostymulujące (np. CD80 lub CD86), aby zapewnić postęp aktywacji komórek T1. Jedną z ważnych funkcji kostymulacji jest przegrupowanie cytoszkieletu aktynowego class2,3,4. Korowa F-aktyna jest stosunkowo statyczna w spoczynkowych limfocytach T. Stymulacja limfocytów T przez APC zawierające antygen prowadzi do głębokiej rearanżacji cytoszkieletu aktynowego. Dynamika aktyny (tj. szybkie okręgi polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny) umożliwia limfocytom T wytwarzanie sił, które są wykorzystywane na przykład do transportu białek lub organelli. Co więcej, cytoszkielet aktynowy jest ważny dla rozwoju specjalnej strefy kontaktu między limfocytami T a APC, zwanej synapsą immunologiczną. Ze względu na znaczenie cytoszkieletu aktynowego dla synapsy immunologicznej, niezbędne stało się opracowanie metod ilościowego określania zmian w cytoszkielecie aktynowym limfocytów T5,6,7,8,9.
Za pomocą pomocy cytoszkieletu aktyny, receptory powierzchniowe i białka sygnałowe są segregowane w supramolekularne klastry aktywacji (SMAC) w synapsie immunologicznej. Stabilność synapsy immunologicznej jest zapewniona przez wiązanie receptorów z wiązkami F-aktyny, które zwiększają elastyczność cytoszkieletu aktynowego. Wykazano, że tworzenie synaps immunologicznych ma kluczowe znaczenie dla generowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Szkodliwe skutki wadliwego tworzenia synaps immunologicznych in vivo zostały po raz pierwszy uświadomione u pacjentów cierpiących na zespół Wiskotta-Aldricha (WAS), chorobę, w której zaburzona jest polimeryzacja aktyny i jednoczesne tworzenie synaps immunologicznych10. Pacjenci z WAS mogą cierpieć na egzemę, ciężkie nawracające infekcje, choroby autoimmunologiczne i czerniaki. Pomimo tego odkrycia nie wiadomo obecnie, czy tworzenie synaps immunologicznych różni się w limfocytach T osób zdrowych i pacjentów cierpiących na defekty immunologiczne lub choroby autoimmunologiczne.
Mikroskopia fluorescencyjna, w tym mikroskopia konfokalna, TIRF i mikroskopia superrozdzielcza, została wykorzystana do odkrycia architektury synapsy immunologicznej11,12,13,14. Wysoka rozdzielczość tych układów oraz możliwość wykonywania obrazowania żywych komórek umożliwia zbieranie dokładnych, czasoprzestrzennych informacji o cytoszkielecie aktynowym oraz białkach powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych w synapsie immunologicznej. Wiele wyników opiera się jednak na analizie zaledwie kilkudziesięciu limfocytów T. Ponadto limfocyty T muszą zostać oczyszczone do tego typu mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak w przypadku wielu pytań badawczych ogromne znaczenie ma użycie nieoczyszczonych komórek, a nie jak najwyższa rozdzielczość. Jest to istotne, jeśli analizowane są limfocyty T od pacjentów, ponieważ ilość oddawanej krwi jest ograniczona i może zaistnieć potrzeba równoległego przetwarzania wielu próbek.
Stworzyliśmy mikroskopijne metody, które pozwalają na analizę cytoszkieletu aktynowego w synapsie immunologicznej w ludzkim systemie15,16,17. Metody te opierają się na obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową18. Jako hybryda wielospektralnej cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowa cytometria przepływowa ma swoje mocne strony w analizie parametrów morfologicznych i lokalizacji białek w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak panleukocyty z krwi obwodowej. Wprowadziliśmy metodologię, która umożliwia nam ilościowe oznaczanie F-aktyny w koniugatach limfocytów T/APC ludzkich limfocytów T z próbek krwi pełnej, bez konieczności czasochłonnych i kosztownych etapów oczyszczania17. Przedstawiona tutaj technika obejmuje cały przebieg pracy, od pobrania próbki krwi do ilościowego określenia F-aktyny w synapsie immunologicznej.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa rurka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Roth</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS Saponina</td><td></td> płucząca <td>PBS 1% BSA 0,15 Saponina</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Koralik</td> <td>prędkościAmnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>Minishaker MS1</td><td>IKA Działa</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>Enterotoksyna SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>MHCD0317 1:30</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Phalloidin-AF647</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>Obrazowanie cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Oprogramowanie Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Oprogramowanie</td> <td>Amnis</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Synapsa immunologiczna to obszar komunikacji między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen (APC). Limfocyty T polaryzują receptory powierzchniowe i białka w kierunku synapsy immunologicznej, aby zapewnić stabilne wiązanie i wymianę sygnału. Do badania synapsy immunologicznej wykorzystano klasyczną mikroskopię konfokalną, TIRF lub mikroskopię superrozdzielczą. Ponieważ metody te wymagają ręcznego pozyskiwania obrazu i czasochłonnej kwantyfikacji, obrazowanie rzadkich zdarzeń jest trudne. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy, który umożliwia analizę morfologiczną dziesiątek tysięcy komórek. Synapsy immunologiczne są indukowane między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T w preparatach panleukocytów a komórkami Raji załadowanymi enterotoksyną B (SEB) Staphylococcus aureus jako APC. Akwizycja obrazu odbywa się za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową, która łączy w sobie cechy cytometru przepływowego i mikroskopu fluorescencyjnego. Zapewniona jest kompletna strategia bramkowania do identyfikacji par limfocytów T / APC i analizy synaps immunologicznych. Ponieważ ten przepływ pracy umożliwia analizę synaps immunologicznych w nieoczyszczonych preparatach panleukocytów, a zatem wymaga tylko niewielkiej objętości krwi (tj. 1 ml), można go zastosować do próbek od pacjentów. Co ważne, kilka próbek może być przygotowywanych, mierzonych i analizowanych równolegle.

Głównym celem opisanej tutaj metody jest kwantyfikacja wzbogacenia białek (np. , F-aktyny) w synapsie immunologicznej pomiędzy zastępczymi APC (komórki Raji) a limfocytami T w nieoczyszczonych pan-leukocytach pobranych z małymi objętościami (1 mL) próbek ludzkiej krwi. Zrzut ekranu na Rysunku 1 przedstawia przegląd kluczowej strategii bramkowania tej metody. Po lewej stronie widoczna jest galeria obrazów, a po prawej obszar analizy (Rysunek 1). G...

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii człowieka, takie jak sposób komunikacji między leukocytami na poziomie molekularnym i komórkowym. Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy nieoczyszczonych ludzkich limfocytów T ex vivo w stosunkowo krótkim czasie. Procedurę tę zaprezentuje Henning Kirchgessner, technik z naszego laboratorium.Rozpocznij od zmieszania 1 mL świeżo pobranej krwi obwodowej człowieka z 30 mL buforu do lizy ACK w stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Po ośmiu minutach w temperaturze pokojowej napełnij probówkę PBS w celu przeprowadzenia płukania przez wirowanie, a następnie zawiesić pellet w 2 mL pożywki hodowlanej i inkubuj przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji do poszczególnych probek FACS dodaj 5 × 10⁵ komórek Raji obciążonych lub nieobciążonych enterotoksyną B gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) lub SEB w 500 µL pożywki hodowlanej, a następnie dodaj 650 µL przeciwciał pan-leukocytowych.Odwiruj kokultury, a następnie przesuspenduj osady w 150 µL świeżej pożywki hodowlanej i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie wymieszaj komórki na wortexie przez 10 sekund przy 100 rpm, dodając 1,5 ml 1,5% paraformaldehydu. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej przerwij fiksację, dodając 1 ml PBS uzupełnionego o 1% BSA, a następnie odzyskaj komórki poprzez wirowanie.Resuspender osady w 100 µl PBS z dodatkiem BSA i 0,1% saponiny, a następnie przenieść próbki komórek do dwóch oddzielnych studzienek płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej odwirować płytkę i resuspender osady w 50 µl PBS z dodatkiem BSA i saponiny zawierającego przeciwciała sprzężone z fluoroforem lub interesujące związki, inkubując przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki trzykrotnie w 150 µl PBS z dodatkiem BSA i saponiny, a następnie resuspender osady w 60 µl PBS.Aby obrazować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, otwórz oprogramowanie analityczne, sprawdź poziom cieczy i kliknij Startup w menu Instrument. Następnie kliknij Load i wprowadź próbki do portu po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu. W zakładce Illumination zmień moc laserów wzbudzania na odpowiednie długości fal w nanometrach.Następnie dostosuj bramki dla kanałów czwartego i 11 oraz skoryguj obszar dla kanału pierwszego. Aby ocenić ustawienia bramek i mocy laserów, przełącz menu Widok (View) na odpowiednią bramkę i reguluj bramki oraz moc laserów, aż komórki i pary komórek staną się widoczne. Następnie w karcie Pozyskiwanie Plików (File Acquisition) określ nazwę próbki, liczbę obrazów do pozyskania oraz odpowiednią bramkę dla barwienia CD3, a następnie kliknij Pozyskaj (Acquire), aby rozpocząć akwizycję.Aby przeanalizować uzyskane obrazy komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne. Postępując zgodnie z instrukcjami w menu rozwijanym Compensation, utwórz macierz kompensacji i zapisz ją jako comp date ctm. Następnie otwórz surowy plik obrazu z próbki i zastosuj plik comp date ctm w oknie programu, aby wygenerować obraz skompensowany oraz domyślne pliki analizy danych.Po otwarciu plików obrazów skompensowanych, zmień tryb obrazów na kolorowy. Dostosuj tablice wyszukiwania (lookup tables) w pasku narzędzi Właściwości Galerii Obrazów, aby uzyskać optymalne kolory widzialne. Otwórz Menedżera Masek (Mask Manager) w menu Analizy, a następnie zdefiniuj limfocyty T, wybierając maskę z progiem 60% (60%Threshold) dla kanału piątego i wypełniając maskę w celu utworzenia maski limfocytów T.Następnie wybierz maskę Valley dla kanału drugiego o szerokości trzech pikseli, aby utworzyć maskę Valley, a następnie połącz maski komórek T oraz maskę Valley, aby utworzyć maskę synapsy komórek T. Aby obliczyć całkowitą ekspresję CD3 w komórkach T, otwórz Menedżera Cech (Feature Manager) i utwórz cechę Intensity, T cell, kanał piąty. Aby obliczyć całkowitą ilość F-aktyny w komórkach T, utwórz cechę Intensity, T cells, kanał szósty.Aby ocenić ilość CD3 w synapsach immunologicznych, utwórz cechę Intensity, T cell synapse, kanał piąty. Aby określić ilość F-aktyny w synapsie immunologicznej, utwórz cechę Intensity, T cell synapse, kanał szósty. Na koniec, aby zdefiniować wzbogacenie F-aktyny i CD3, oblicz odpowiednio stosunki F-aktyny lub CD3 w synapsie immunologicznej do całkowitej ekspresji wybranego białka.Na tych wykresach przedstawiono przegląd krytycznej strategii bramkowania służącej do ilościowego określenia wzbogacenia białek w synapsie immunologicznej pomiędzy zastępczymi komórkami prezentującymi antygen (APC) a limfocytami T w nieoczyszczonych pan-leukocytach pobranych z niskobjednościowej próbki krwi ludzkiej. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy koniugatów limfocyt T-APC z niskimi poziomami CD3 i F-aktyny w obrębie ich synaps immunologicznych w obecności SEB, podczas gdy koniugaty te wykazują silne wzbogacenie CD3 i F-aktyny w obecności SEB. W przypadku braku superantygenu 15% limfocytów T wykazywało wzbogacenie zarówno CD3, jak i F-aktyny w synapsie immunologicznej, natomiast w obecności superantygenu obserwuje się wzbogacenie na poziomie 29%.Rzeczywiście, w przypadku braku superantygenu w synapsie immunologicznej gromadzi się mniej niż 20% całkowitej ilości F-aktyny w komórkach, podczas gdy w obecności superantygenu w synapsie obserwuje się ponad 30%. Co istotne, CD3 gromadzi się w synapsie immunologicznej nawet bez obecności superantygenu, choć akumulacja ta jest również znacząco zwiększona po dodaniu superantygenu, co dowodzi przydatności tej metody do ilościowego oznaczania gromadzenia białek w synapsie immunologicznej między limfocytem T a APC. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura może zostać zakończona w ciągu sześciu do siedmiu godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o uwzględnieniu wszystkich odpowiednich kontroli, w tym próbek bez superantygenu, ponieważ wzbogacenie białek zachodzi również w przypadku użycia komórek APC bez SEB. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia superrozdzielcza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące struktury detali synapsy immunologicznej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu komunikacji komórkowej do badania synapsy immunologicznej u ludzi w badaniach podstawowych, badaniach klinicznych oraz nauce translacyjnej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat analizy strefy połączenia limfocytów T z APC oraz synapsy immunologicznej w ludzkich limfocytach T ex vivo. Należy pamiętać, że praca z pierwotnymi materiałami ludzkimi może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek lub praca w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

qualitative-quantitative-analysis-immune-synapse-human-system-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Opisujemy zastosowanie technologii ImageStream (www.amnis.com), która łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w celu ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Nasze badania stanowią wzorzec dla analiz translacyjnych służących do ilościowego określania specyficznych dla linii komórkowych odpowiedzi w małych próbkach pobranych z kohort...

Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Ten film analizuje tworzenie się synaps immunologicznych między limfocytami T w nieoczyszczonych preparatach pan-leukocytów a enterotoksyną B, komórkami Raji Staphylococcus aureus obciążonymi SEB. Wzbogacenie CD3 i F-aktyny obserwuje się w synapsie immunologicznej za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Analiza synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T a komórkami Raji załadowanymi SEB przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i...

Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół pomiaru aktywności kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę analizy synapsy immunologicznej między ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką ocenę interakcji komórkowych ex vivo.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów