Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii człowieka, takie jak to, w jaki sposób komunikacja między leukocytami zachodzi na poziomie molekularnym i komórkowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że nieoczyszczone ludzkie limfocyty T mogą być analizowane ex vivo w stosunkowo krótkim czasie. Procedurę tę zademonstruje Henning Kirchgessner, technik z naszego laboratorium.

Zacznij od zmieszania jednego mililitra świeżo pobranej ludzkiej krwi obwodowej z 30 mililitrami buforu do lizy ACK w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Po ośmiu minutach w temperaturze pokojowej napełnij probówkę PBS w celu przepłukania wirówką i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej na 60-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać pięć razy 10 do piątej enterotoksyny B Staphylococcus aureus lub obciążonych lub niezaładowanych SEB komórek Raji w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej do pojedynczych probówek FACS, a następnie 650 mikrolitrów panleukocytów.

Odwiruj kokultury i ponownie zawieś granulki w 150 mikrolitrach świeżej pożywki hodowlanej na 45-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie wiruj komórki przez 10 sekund z prędkością 100 obr./min, dodając 1,5 mililitra 1,5% paraformaldehydu. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej przerwij utrwalanie jednym mililitrem PBS uzupełnionym 1% BSA i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS plus BSA i 0,1% saponiny, a następnie dodać próbki komórek do dwóch pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej odwirować płytkę i ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach PBS plus BSA i saponiny zawierającej przeciwciała lub związki sprzężone z fluoroforem na 30-minutową inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie w 150 mikrolitrach PBS plus BSA i saponiny i ponownie zawiesić granulki w 60 mikrolitrach PBS.

Aby zobrazować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, otwórz oprogramowanie analityczne, sprawdź poziom cieczy i kliknij przycisk Uruchamianie w menu Instrument. Następnie kliknij przycisk Załaduj i po wyświetleniu monitu załaduj próbki do portu. Na karcie Oświetlenie zmień moc lasera wzbudzenia na odpowiednie długości nanometrów.

Następnie dostosuj bramki dla kanałów czwartego i 11 oraz dostosuj obszar dla kanału pierwszego. Aby ocenić regulację bramkowania i mocy lasera, przełącz menu View na odpowiednią bramkę i dostosuj bramki i moce lasera, aż komórki i pary komórek będą widoczne. Następnie na karcie File Acquisition (Pobieranie plików) zdefiniuj nazwę próbki i liczbę obrazów do pobrania oraz odpowiednią bramkę do barwienia CD3 i kliknij przycisk Acquire, aby rozpocząć akwizycję.

Aby przeanalizować uzyskane obrazy komórek, otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne. Postępując zgodnie z instrukcjami w menu rozwijanym Wynagrodzenie, utwórz macierz wynagrodzeń i zapisz ją jako datę comp ctm. Następnie otwórz przykładowy plik obrazu RAW i zastosuj datę comp ctm w oknie, aby wygenerować skompensowany obraz i domyślne pliki analizy danych.

Po otwarciu skompensowanych plików graficznych przekonwertuj obrazy na tryb kolorów. Dostosuj tabele odnośników, aby uzyskać optymalne widoczne kolory na pasku narzędzi Właściwości galerii obrazów. Otwórz Menedżera masek w menu Analiza i zdefiniuj komórki T, wybierając maskę 60%Threshold dla kanału piątego i wypełniając maskę, aby utworzyć maskę komórek T.

Następnie wybierz Maska doliny dla kanału drugiego o szerokości trzech pikseli, aby utworzyć maskę doliny, a następnie połącz maski komórki T i doliny, aby utworzyć maskę synapsy komórek T. Aby obliczyć całkowite wyrażenie CD3 w komórkach T, otwórz Menedżera funkcji i utwórz cechę Intensywność, komórka T, kanał piąty. Aby obliczyć całkowitą ilość F-aktyny w limfocytach T, utwórz cechę Intensywność, limfocyty T, kanał szósty.

Aby ocenić ilość CD3 w synapsach immunologicznych, utwórz funkcję Intensywność, synapsę komórek T, kanał piąty. Aby określić ilość F-aktyny w synapsie immunologicznej, utwórz cechę Intensywność, synapsę limfocytów T, kanał szósty. Wreszcie, aby zdefiniować wzbogacenie F-aktyny i CD3, oblicz odpowiednio proporcje F-aktyny lub CD3 w synapsie immunologicznej i całkowitą ekspresję wybranego białka.

Na tych wykresach przedstawiono przegląd krytycznej strategii bramkowania do ilościowego określania wzbogacenia białek w synapsie immunologicznej między zastępczymi komórkami prezentującymi antygen lub APC a limfocytami T w nieoczyszczonych panleukocytach pobranych z próbki krwi ludzkiej o małej objętości. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy koniugatów limfocytów T-APC z niskimi poziomami CD3 i F-aktyny w ich synapsach immunologicznych przy braku SEB, podczas gdy te koniugaty limfocytów T-APC wykazują silne wzbogacenie CD3 i F-aktyny w obecności SEB. Przy braku superantygenu 15% limfocytów T wykazywało wzbogacenie zarówno CD3, jak i F-aktyny w synapsie immunologicznej, podczas gdy w obecności superantygenu obserwuje się 29% wzbogacenie.

Rzeczywiście, przy braku superantygenu mniej niż 20% całkowitej F-aktyny w komórkach gromadzi się w synapsie immunologicznej, a ponad 30% obserwuje się w synapsie w obecności superantygenu. Warto zauważyć, że CD3 gromadzi się w synapsie immunologicznej nawet przy braku superantygenu, chociaż akumulacja ta jest również znacznie zwiększona przez dodanie superantygenu, co dowodzi przydatności tej metody do ilościowego określania akumulacji białka w synapsie immunologicznej limfocytów T-APC. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu wszystkich istotnych kontroli, w tym próbek bez superantygenu, ponieważ wzbogacanie białek występuje również wtedy, gdy używane są APC bez SEB. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia superrozdzielcza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące delikatnej struktury synapsy immunologicznej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komunikacją komórkową do zbadania synapsy immunologicznej u ludzi w celach badań podstawowych, prób klinicznych i nauk translacyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować strefę łączną limfocytów T-APC i synapsę immunologiczną w ludzkich limfocytach T ex vivo. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi materiałami ludzkimi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek lub praca w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.