Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie ruchliwości powierzchni bakterii zwanej rojem w standardowy i powtarzalny sposób. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i utwardzenie płytek ruchliwości powierzchni. Drugim krokiem jest zaszczepienie bakteriami płytek do oznaczania ruchliwości powierzchni i inkubacja tych płytek w kontrolowanym środowisku.

Następnie wzorce wzrostu bakterii na płytkach są obrazowane w czasie rzeczywistym. Ostatnim etapem procedury jest przetworzenie obrazów w celu oceny ilościowej. Ostatecznie procedura ta zapewnia ustandaryzowany protokół przygotowania testu ruchliwości powierzchni płytki w celu wygenerowania ilościowych informacji dynamicznych, takich jak szybkość ekspansji roju lub rozkład gęstości produktu biologicznego dla bakterii modalnych powierzchniowych.

Wiele grup przeprowadza testy ruchliwości powierzchni. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewniamy systematyczny protokół, który minimalizuje wiele zmiennych, które mogą prowadzić do niespójności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ruchliwości powierzchni bakterii, takie jak to, w jaki sposób bakterie kolonizują różne rodzaje powierzchni.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruchliwość roju Pseudomonas z pewnymi modyfikacjami, może być również stosowana do badania innych powierzchniowych bakterii modalnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ niewielkie zmiany w protokole lub środowisku laboratoryjnym mogą znacznie wpłynąć na wyniki testów roju. Procedurę zademonstruje Morgan, doktorant z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć protokół, przygotuj mieszankę rolniczą, łącząc 200 mililitrów FAB minus pożywka roju siarczanu amonu, 0,9 grama szlachetnego agaru i 0,2 grama kwasów caino w 500-mililitrowej butelce z podłożem. Użyj płytki do mieszania, aby dokładnie wymieszać media. Następnie sterylizuj pożywkę w autoklawie ustawionym na 121,1 stopni Celsjusza przez 22 minuty z opcją szybkiego odpowietrzania.

Natychmiast po sterylizacji dokręć nakrętkę butelki z pożywką, aby zapobiec parowaniu wody. Umieść pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej i schłodzić AED do 50 stopni Celsjusza w temperaturze otoczenia z aktywnym mieszaniem. Jeśli agar ma być użyty w późniejszym okresie doświadczalnym, można go utrzymywać w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza lub w inkubatorze przez 15 godzin bez aktywnego mieszania.

Gdy pożywka osiągnie około 50 stopni Celsjusza przy dwóch mililitrach wysterylizowanej glukozy z filtrem, przy użyciu standardowych sterylnych technik, dokładnie wymieszaj z mieszadłem magnetycznym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w pożywce. W kapturze użyj sterylnej pipety serologicznej, aby podać 7,5 mililitra edii na pojedyncze 60-milimetrowe szalki Petriego. Jeśli pożądana jest większa powierzchnia roju, podnieś 25 litrów edii na 100-milimetrowe szalki Petriego.

Pozostaw wszystkie naczynia nieułożone w stos i sprawdź kaptur poziomicą, aby zapewnić równą poziomą powierzchnię, na której agar może zastygnąć. W przypadku talerzy o średnicy 60 milimetrów odłóż pokrywki naczyń i utwardź odkryty agar w kapturze przez 30 minut. Większe naczynia o grubości 100 milimetrów będą wymagały dłuższego czasu utwardzania.

Wilgotność, przepływ powietrza i temperatura w danym laboratorium mogą wymagać przetestowania czasu utwardzania w celu optymalnego roju bakterii. Po wysuszeniu APL należy natychmiast zaszczepić komórkami, które zostały wstępnie wyhodowane oddzielnie do pożądanej fazy wzrostu. Na początek wybierz izolowaną kolonię bakterii ze świeżej płytki LB i zaszczepij w sześciu mililitrach kultury. Media.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z poziomym wstrząsaniem. Następnego dnia zaszczepić od jednego do pięciu mikrolitrów nocnej kultury na wysuszonych płytkach agarowych roju, szturchając powierzchnię agaru sterylną wykałaczką lub drucianą igłą do zaszczepiania, w zależności od szczepu bakterii, przenieść płytki testowe roju do inkubatora o temperaturze ustawionej na 30 stopni Celsjusza, 37 stopni Celsjusza, lub 42 stopnie Celsjusza. Odwróć płytki tak, aby nadmiar wilgoci skondensował się na pokrywce płytki, a nie na agarze Zrównoważ bakterie w temperaturach specyficznych dla szczepu przez dwie lub cztery godziny tuż przed obrazowaniem poklatkowym.

Następnie przenieś płytki do aparatu do obrazowania in vivo tak, aby bakterie na powierzchni agri były skierowane w dół w kierunku odwróconej kamery urządzenia. Napełnij wszystkie pokrywki szalek Petriego niewielką ilością wody. Następnie umieść każdą pokrywkę stroną wodną skierowaną do góry na odwróconych płytkach AER.

Wewnątrz zespołu obrazowania uszczelnij obudowę obrazowania, aby utrzymać stały poziom wilgotności, dostosuj ustawienia obrazowania zespołu obrazowania i rozpocznij obrazowanie poklatkowe aktywności roju. Po zobrazowaniu w czasie rzeczywistym dynamikę roju bakterii można przeanalizować za pomocą standardowej analizy obrazu, takiej jak Image J, w eksperymencie z ruchliwością powierzchni. Oznaczanie zawartości wilgoci w agarze tuż przed inokulacją ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pomyślnych wyników roju.

Optymalnie płytki AER ułatwią ciasne miejsce inokulacji i zwiększą aktywność roju bakterii, podczas gdy nadmiernie wysuszone płytki będą tłumić ruchliwość powierzchni oprócz zawartości wilgoci, obecność lub brak dodatków do pożywek może również wpływać na aktywność rojową bakterii w funkcji temperatury inkubacji poprzez wykorzystanie szczepów bakterii, wyrażających białka luminescencyjne lub fluorescencyjne. Dynamikę rywalizacji roju między dwoma różnymi gatunkami bakterii można uchwycić na filmie poklatkowym. Co więcej, zmiany w lokalnej gęstości komórek i tempie biosyntezy lipidów promujących ruchliwość w roju bakterii można również ustalić i określić ilościowo za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, mogą być stosowane w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące zachowania poszczególnych komórek w celu wygenerowania szczegółowej, mikroskopowej i mikroskopowej analizy ruchliwości powierzchni bakterii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać standardowy i powtarzalny test roju oraz uzyskać kompleksową analizę ruchliwości powierzchni bakterii poprzez przygotowanie, utwardzenie i zaszczepienie testów ruchliwości powierzchni oraz przetwarzanie i analizowanie wyników we wzorcach wzrostu bakterii.