Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii
7 kwietnia 2015
Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie bakteryjnej ruchliwości powierzchniowej, zwanej swarmingiem, w sposób standardowy i powtarzalny. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie i utwardzenie płytek do badania ruchliwości powierzchniowej. Drugim krokiem jest inokulacja płytek testowych bakteriami oraz inkubacja tych płytek w kontrolowanym środowisku.
Następnie wzorce wzrostu bakterii w testach na szalkach są obrazowane w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem procedury jest przetworzenie obrazów w celu przeprowadzenia analizy ilościowej. Ostatecznie procedura ta zapewnia zestandaryzowany protokół przygotowania testu ruchliwości powierzchniowej na szalkach, pozwalający na uzyskanie ilościowych informacji dynamicznych, takich jak szybkość rozprzestrzeniania się roju lub rozkład gęstości produktu biologicznego dla bakterii o ruchliwości powierzchniowej.
Wiele grup badawczych przeprowadza testy ruchliwości powierzchniowej. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie przez nas systematycznego protokołu, który minimalizuje liczne zmienne mogące prowadzić do niespójności wyników. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ruchliwości powierzchniowej bakterii, takie jak sposób, w jaki bakterie kolonizują różne rodzaje powierzchni.
Choć metoda ta, przy pewnych modyfikacjach, może dostarczyć informacji na temat motywności rojącej pseudomonas, można ją również zastosować do badania innych bakterii poruszających się po powierzchni. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ niewielkie zmiany w protokole lub środowisku laboratoryjnym mogą znacząco wpłynąć na wyniki testu rojenia. Procedurę zaprezentuje Morgan, doktorant z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć protokół, należy przygotować mieszankę agri, łącząc 200 ml pożywki FAB minus ammonium sulfate swarm w butelce do pożywek o pojemności 500 ml, dodając 0,9 g noble agar oraz 0,2 g caino acids. Do dokładnego wymieszania pożywki należy użyć mieszadła magnetycznego. Następnie pożywkę należy wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121,1 °C przez 22 minuty z opcją szybkiego odprowadzenia powietrza.
Bezpośrednio po sterylizacji mocno zakręć korek butelki z pożywką, aby zapobiec odparowaniu wody. Umieść pożywkę na magnetycznym mieszadle i schłodzić AED do 50 °C w temperaturze pokojowej przy aktywnym mieszaniu. Jeśli agar ma zostać użyty w późniejszym punkcie czasowym eksperymentu, można go przechowywać w cieple w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C lub w inkubatorze przez 15 godzin bez aktywnego mieszania.
Gdy po dodaniu 2 mL sterylizowanej przez filtr glukozy pożywka osiągnie temperaturę około 50°C, należy ją dokładnie wymieszać za pomocą mieszadełka magnetycznego, stosując standardowe techniki sterylne, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w pożywce. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą sterylnej pipety serologicznej, odmierzyć 7,5 ml pożywki do poszczególnych szalek Petriego o średnicy 60 mm. Jeśli wymagana jest większa powierzchnia do swarmingu, odmierzyć 25 ml pożywki do szalek Petriego o średnicy 100 mm.
Pozostaw wszystkie szalki nieułożone jedna na drugiej i sprawdź poziom dygestorium za pomocą poziomicy kulowej, aby upewnić się, że agar będzie krzepnął na równym, poziomym podłożu. W przypadku szalek o średnicy 60 mm odłóż pokrywki i pozostaw niezakryty agar w dygestorium na 30 minut. Większe szalki o średnicy 100 mm będą wymagały dłuższego czasu krzepnięcia.
Wilgotność, przepływ powietrza i temperatura w danym laboratorium mogą wymagać przetestowania czasu utwardzania w celu uzyskania optymalnego swarmingu bakterii. Po wysuszeniu APL należy niezwłocznie zaszczepić komórkami, które zostały wcześniej wyhodowane oddzielnie do pożądanej fazy wzrostu. Aby rozpocząć, należy pobrać pojedynczą kolonię bakterii ze świeżej płytki z pożywką LB i zaszczepić ją do sześciu mililitrów pożywki.
Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy poziomym wstrząsaniu. Następnego dnia zaszczep od 1 do 5 µL kultury nocnej na wysuszone płytki z agarem do testu swarmy, nakłuwając powierzchnię agaru sterylną wykałaczką lub drutową igłą do szczepienia, w zależności od szczepu bakterii. Przenieś płytki do testu swarmy do inkubatora z temperaturą ustawioną na 30 °C, 37 °C lub 42 °C. Odwróć płytki tak, aby nadmiar wilgoci skraplał się na pokrywce, a nie na agarze. Przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse poddaj bakterie ekwilibracji w temperaturach właściwych dla danego szczepu przez dwie lub cztery godziny.
Następnie przenieś płytki do urządzenia do obrazowania in vivo w taki sposób, aby bakterie na powierzchni agaru były skierowane w dół, w stronę odwróconej kamery urządzenia. Wypełnij wszystkie pokrywki szalek Petri niewielką ilością wody. Następnie umieść każdą pokrywkę stroną z wodą do góry na wierzchu odwróconych płytek AER.
Wewnątrz jednostki obrazującej uszczelnij komorę obrazowania, aby utrzymać stały poziom wilgotności, dostosuj ustawienia obrazowania jednostki i rozpocznij obrazowanie poklatkowe aktywności rojenia. Po obrazowaniu w czasie rzeczywistym dynamikę rojenia bakterii można przeanalizować przy użyciu standardowych narzędzi do analizy obrazu, takich jak Image J, w eksperymencie dotyczącym ruchliwości powierzchniowej. Oznaczenie zawartości wilgoci w agarze bezpośrednio przed inokulacją jest kluczowe dla uzyskania pomyślnych wyników rojenia.
Optymalnie przygotowane płytki AER umożliwią uzyskanie punktowego miejsca inokulacji i zwiększą aktywność rojenia bakterii, natomiast zbyt wysuszone płytki będą hamować ruchliwość powierzchniową. Oprócz zawartości wilgoci, na aktywność rojenia bakterii w zależności od temperatury inkubacji może wpływać obecność lub brak dodatków do pożywki, przy zastosowaniu szczepów bakterii wykazujących luminescencję lub ekspresja białek fluorescencyjnych. Dynamikę konkurencji rojenia między dwoma różnymi gatunkami bakterii można zarejestrować za pomocą filmu poklatkowego. Ponadto, zmiany lokalnej gęstości komórek oraz szybkość biosyntezy lipidów promujących ruchliwość wewnątrz roju bakterii mogą zostać określone i ilościowo ocenione za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej.
Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, w celu odpowiedzi na pytania dotyczące zachowania pojedynczych komórek oraz opracowania szczegółowej analizy mikroskopowej ruchliwości powierzchniowej bakterii. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić standardowy i powtarzalny test rojenia (swarm assay) oraz uzyskać kompleksową analizę ruchliwości powierzchniowej bakterii poprzez przygotowanie, utwardzenie i zaszczepienie podłoży do testów ruchliwości powierzchniowej, a następnie przetworzenie i analizę wyników pod kątem wzorców wzrostu bakterii.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowany protokół wizualizacji i kwantyfikacji ruchliwości rojącej bakterii. Adresuje on powszechne problemy związane z przygotowaniem testu rojenia i gromadzeniem danych, wykorzystując technikę obrazowania makroskopowego do szczegółowej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Motylność bakterii
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Ruchy roju są wypadkową różnych czynników fizycznych i środowiskowych.
- Znormalizowane protokoły są niezbędne dla powtarzalności eksperymentów.
- Obecne techniki analizy mogą nie dostarczać szczegółowych informacji na temat zachowania roju.
- Zrozumienie kolonizacji powierzchni przez bakterie jest kluczowe dla wielu zastosowań.
Cel badania
- Zapewnienie systematycznego protokołu dla testów motylości powierzchniowej.
- Zminimalizowanie zmiennych prowadzących do niespójnych wyników.
- Wygenerowanie ilościowych danych na temat tempa ekspansji roju oraz gęstości produktów biologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytek do badania ruchliwości powierzchniowej z zastosowaniem specyficznych pożywek.
- Inokulacja płytek bakteriami oraz kontrolowana inkubacja.
- Obrazowanie wzorców wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym.
- Przetwarzanie obrazów w celu kwantyfikacji dynamiki swarmingowania.
Główne wyniki
- Zdemonstrowano powtarzalną metodę oceny motywności powierzchniowej bakterii.
- Zidentyfikowano kluczowe czynniki wpływające na zachowanie rojowe, takie jak zawartość wilgoci.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące dynamiki konkurencji bakteryjnej.
- Umożliwiono szczegółową analizę zachowania bakterii z wykorzystaniem obrazowania poklatkowego.
Wnioski
- Znormalizowany protokół zwiększa wiarygodność testów swarmingowych.
- Można go dostosować do różnych szczepów bakteryjnych i warunków.
- Metoda ta przyczynia się do lepszego zrozumienia ruchliwości i kolonizacji bakterii.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analizy motywności powierzchniowej bakterii borykają się z problemami z powtarzalnością ze względu na wrażliwość na stężenie agaru, zawartość wilgoci oraz zmienne środowiskowe, co komplikuje walidację celów w procesie odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych. Niniejszy protokół standaryzuje przygotowanie i kwantyfikację testu swarmingowego, umożliwiając wiarygodne przesiewy fenotypowe oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do celów związanych z motywnością. Dostarczając ilościowe dane dynamiczne, takie jak szybkość ekspansji swarmingowej i gęstość bioproduktu, wspiera on pewność prognostyczną w wczesnych etapach procesów odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z kolonizacją bakteryjną i mechanizmami adhezji do powierzchni.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację ruchliwości jako odczytu fenotypowego służącego do walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio dzięki ilościowej ocenie dynamiki rojenia w warunkach różnych zaburzeń genetycznych lub chemicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do późniejszego screeningu związków poprzez zapewnienie powtarzalnych fenotypów rojenia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie agaru, inokulację oraz warunki obrazowania w celu zminimalizowania zmienności międzyanalizy.
- Skalowalność: Wspiera obrazowanie time-lapse oraz przepływy pracy kwantyfikacyjne kompatybilne z platformami do screeningu wysokotreściowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje ruchliwości in vitro z modelami przedklinicznymi tworzenia biofilmu oraz kolonizacji gospodarza.
- Dopasowanie biomarkerów: Umożliwia śledzenie reporterów fluorescencyjnych lub luminescencyjnych w celu skorelowania ruchliwości z ekspresją czynników wirulencji.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Dostarcza ilościowych progów dla decyzji go/no-go w walidacji celów przeciwkierunkowych przeciwko wirulencji.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w programach przeciwinfekcyjnych ukierunkowanych na czynniki wirulencji lub kolonizacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących genów lub związków wpływających na ruchliwość powierzchniową jako cechę związaną z wirulencją.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy poprzez standaryzację przygotowania pożywek i kontrolę warunków środowiskowych w celu wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty dynamiczne, takie jak szybkość ekspansji radialnej i rozkład intensywności fluorescencji, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy ruchliwości z istotnością przedkliniczną w modelach uporczywych infekcji i kolonizacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i kwantyfikacji dla wielu szczepów bakteryjnych i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych wynikających z braku odtwarzalności testów w przesiewach opartych na motywności.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i odtwarzalność między laboratoriami dzięki zdefiniowanym protokołom utwardzania, inokulacji i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w przypadku celów związanych z adhezją powierzchniową i inicjacją biofilmu.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów antywirulentnych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o skuteczność hamowania motywności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrobiologicznych i sterylnym przygotowaniu pożywek.
- Zależna od kontrolowanych warunków środowiskowych (wilgotność, temperatura, przepływ powietrza) w celu optymalnego zestalenia agaru.
- Wymaga standaryzacji objętości inokulacji i czasu inkubacji pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wymaga dostosowania stężenia agaru (0.4%-0.8% wt/vol) w zależności od wrażliwości danego szczepu bakterii na zjawisko swarmingu.
- Ograniczona koniecznością posiadania infrastruktury do obrazowania time-lapse oraz biegłości w analizie obrazu (np. ImageJ) w celu przeprowadzenia kwantyfikacji.
