Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii
7 kwietnia 2015
Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie ruchliwości powierzchni bakterii zwanej rojem w standardowy i powtarzalny sposób. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i utwardzenie płytek ruchliwości powierzchni. Drugim krokiem jest zaszczepienie bakteriami płytek do oznaczania ruchliwości powierzchni i inkubacja tych płytek w kontrolowanym środowisku.
Następnie wzorce wzrostu bakterii na płytkach są obrazowane w czasie rzeczywistym. Ostatnim etapem procedury jest przetworzenie obrazów w celu oceny ilościowej. Ostatecznie procedura ta zapewnia ustandaryzowany protokół przygotowania testu ruchliwości powierzchni płytki w celu wygenerowania ilościowych informacji dynamicznych, takich jak szybkość ekspansji roju lub rozkład gęstości produktu biologicznego dla bakterii modalnych powierzchniowych.
Wiele grup przeprowadza testy ruchliwości powierzchni. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewniamy systematyczny protokół, który minimalizuje wiele zmiennych, które mogą prowadzić do niespójności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ruchliwości powierzchni bakterii, takie jak to, w jaki sposób bakterie kolonizują różne rodzaje powierzchni.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruchliwość roju Pseudomonas z pewnymi modyfikacjami, może być również stosowana do badania innych powierzchniowych bakterii modalnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ niewielkie zmiany w protokole lub środowisku laboratoryjnym mogą znacznie wpłynąć na wyniki testów roju. Procedurę zademonstruje Morgan, doktorant z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć protokół, przygotuj mieszankę rolniczą, łącząc 200 mililitrów FAB minus pożywka roju siarczanu amonu, 0,9 grama szlachetnego agaru i 0,2 grama kwasów caino w 500-mililitrowej butelce z podłożem. Użyj płytki do mieszania, aby dokładnie wymieszać media. Następnie sterylizuj pożywkę w autoklawie ustawionym na 121,1 stopni Celsjusza przez 22 minuty z opcją szybkiego odpowietrzania.
Natychmiast po sterylizacji dokręć nakrętkę butelki z pożywką, aby zapobiec parowaniu wody. Umieść pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej i schłodzić AED do 50 stopni Celsjusza w temperaturze otoczenia z aktywnym mieszaniem. Jeśli agar ma być użyty w późniejszym okresie doświadczalnym, można go utrzymywać w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza lub w inkubatorze przez 15 godzin bez aktywnego mieszania.
Gdy pożywka osiągnie około 50 stopni Celsjusza przy dwóch mililitrach wysterylizowanej glukozy z filtrem, przy użyciu standardowych sterylnych technik, dokładnie wymieszaj z mieszadłem magnetycznym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w pożywce. W kapturze użyj sterylnej pipety serologicznej, aby podać 7,5 mililitra edii na pojedyncze 60-milimetrowe szalki Petriego. Jeśli pożądana jest większa powierzchnia roju, podnieś 25 litrów edii na 100-milimetrowe szalki Petriego.
Pozostaw wszystkie naczynia nieułożone w stos i sprawdź kaptur poziomicą, aby zapewnić równą poziomą powierzchnię, na której agar może zastygnąć. W przypadku talerzy o średnicy 60 milimetrów odłóż pokrywki naczyń i utwardź odkryty agar w kapturze przez 30 minut. Większe naczynia o grubości 100 milimetrów będą wymagały dłuższego czasu utwardzania.
Wilgotność, przepływ powietrza i temperatura w danym laboratorium mogą wymagać przetestowania czasu utwardzania w celu optymalnego roju bakterii. Po wysuszeniu APL należy natychmiast zaszczepić komórkami, które zostały wstępnie wyhodowane oddzielnie do pożądanej fazy wzrostu. Na początek wybierz izolowaną kolonię bakterii ze świeżej płytki LB i zaszczepij w sześciu mililitrach kultury. Media.
Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z poziomym wstrząsaniem. Następnego dnia zaszczepić od jednego do pięciu mikrolitrów nocnej kultury na wysuszonych płytkach agarowych roju, szturchając powierzchnię agaru sterylną wykałaczką lub drucianą igłą do zaszczepiania, w zależności od szczepu bakterii, przenieść płytki testowe roju do inkubatora o temperaturze ustawionej na 30 stopni Celsjusza, 37 stopni Celsjusza, lub 42 stopnie Celsjusza. Odwróć płytki tak, aby nadmiar wilgoci skondensował się na pokrywce płytki, a nie na agarze Zrównoważ bakterie w temperaturach specyficznych dla szczepu przez dwie lub cztery godziny tuż przed obrazowaniem poklatkowym.
Następnie przenieś płytki do aparatu do obrazowania in vivo tak, aby bakterie na powierzchni agri były skierowane w dół w kierunku odwróconej kamery urządzenia. Napełnij wszystkie pokrywki szalek Petriego niewielką ilością wody. Następnie umieść każdą pokrywkę stroną wodną skierowaną do góry na odwróconych płytkach AER.
Wewnątrz zespołu obrazowania uszczelnij obudowę obrazowania, aby utrzymać stały poziom wilgotności, dostosuj ustawienia obrazowania zespołu obrazowania i rozpocznij obrazowanie poklatkowe aktywności roju. Po zobrazowaniu w czasie rzeczywistym dynamikę roju bakterii można przeanalizować za pomocą standardowej analizy obrazu, takiej jak Image J, w eksperymencie z ruchliwością powierzchni. Oznaczanie zawartości wilgoci w agarze tuż przed inokulacją ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pomyślnych wyników roju.
Optymalnie płytki AER ułatwią ciasne miejsce inokulacji i zwiększą aktywność roju bakterii, podczas gdy nadmiernie wysuszone płytki będą tłumić ruchliwość powierzchni oprócz zawartości wilgoci, obecność lub brak dodatków do pożywek może również wpływać na aktywność rojową bakterii w funkcji temperatury inkubacji poprzez wykorzystanie szczepów bakterii, wyrażających białka luminescencyjne lub fluorescencyjne. Dynamikę rywalizacji roju między dwoma różnymi gatunkami bakterii można uchwycić na filmie poklatkowym. Co więcej, zmiany w lokalnej gęstości komórek i tempie biosyntezy lipidów promujących ruchliwość w roju bakterii można również ustalić i określić ilościowo za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej.
Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, mogą być stosowane w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące zachowania poszczególnych komórek w celu wygenerowania szczegółowej, mikroskopowej i mikroskopowej analizy ruchliwości powierzchni bakterii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać standardowy i powtarzalny test roju oraz uzyskać kompleksową analizę ruchliwości powierzchni bakterii poprzez przygotowanie, utwardzenie i zaszczepienie testów ruchliwości powierzchni oraz przetwarzanie i analizowanie wyników we wzorcach wzrostu bakterii.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zstandaryzowany protokół do wizualizacji i ilościowego określania motylkowatości bakterii. Porusza on wspólne wyzwania w przygotowaniu badań swarm assay oraz zbiorze danych, wykorzystując makroskopijną technikę obrazowania do szczegółowej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Motylkowatość bakterii
- Techniki obrazowania
Tło
- Motylkowatość jest wpływana przez różne czynniki fizyczne i środowiskowe.
- Zstandaryzowane protokoły są niezbędne dla reproduktywalności w eksperymentach.
- Obecne techniki analizy mogą nie posiadać szczegółowych wglądów w zachowanie swarm.
- Rozumienie kolonizacji bakterii na powierzchniach jest kluczowe dla różnych zastosowań.
Cel badania
- Zapewnienie systematycznego protokołu do badań motylkowatości na powierzchni.
- Minimalizowanie zmiennych prowadzących do niekonsekwentnych wyników.
- Generowanie ilościowych danych dotyczących szybkości ekspansji swarm i gęstości produktu bio.
Stosowane metody
- Przygotowanie płytek motylkowatości na powierzchni z określonymi mediami.
- Inokulacja płytek bakteriami i kontrolowane inkubacja.
- Rejestrowane w czasie rzeczywistym obrazowanie wzorców wzrostu bakterii.
- Obróbka obrazów do ilościowego określania dynamiki motylkowatości.
Główne wyniki
- Wykazano reproduktywalną metodę oceny motylkowatości bakterii na powierzchni.
- Zidentyfikowano kluczowe czynniki wpływające na zachowanie motylkowatości, takie jak zawartość wilgoci.
- Dostarczono wglądów w dynamikę konkurencji bakterii.
- Umożliwiono szczegółową analizę zachowania bakterii przy użyciu obrazowania time-lapse.
Wnioski
- Zstandaryzowany protokół poprawia wiarygodność badań swarm assay.
- Może być przystosowany do różnych szczepów bakterii i warunków.
- Ta metoda przyczynia się do lepszego zrozumienia motylkowatości i kolonizacji bakterii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Bacterial surface motility assays face reproducibility challenges due to sensitivity to agar concentration, moisture content, and environmental variables, complicating target validation in antimicrobial discovery. This protocol standardizes swarm assay preparation and quantification, enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking of motility-related targets. By providing quantitative dynamic outputs such as swarm expansion rate and bio-product density, it supports predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to bacterial colonization and surface adherence mechanisms.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating motility as a phenotypic readout for target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through quantitative assessment of swarm dynamics under varying genetic or chemical perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by ensuring reproducible swarm phenotypes.
- Operational Value: Standardizes agar preparation, inoculation, and imaging conditions to minimize inter-assay variability.
- Scalability: Supports time-lapse imaging and quantification workflows compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro motility observations to preclinical models of biofilm formation and host colonization.
- Biomarker Alignment: Enables tracking of fluorescent or luminescent reporters to correlate motility with virulence factor expression.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions in anti-virulence target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for anti-infective programs targeting virulence or colonization factors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting surface motility as a virulence-associated trait.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized media preparation and environmental controls for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dynamic readouts such as radial expansion rate and fluorescence intensity distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Links motility phenotypes to preclinical relevance in persistent infection and colonization models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for multiple bacterial strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false negatives from assay irreproducibility in motility-based screens.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories through defined curing, inoculation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in surface adherence and biofilm initiation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on motility inhibition efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile media preparation.
- Dependent on controlled environmental conditions (humidity, temperature, airflow) for optimal agar solidification.
- Necessitates standardization of inoculation volume and incubation timing across users and sites.
- Requires adaptation of agar concentration (0.4%-0.8% wt/vol) based on bacterial strain swarming sensitivity.
- Limited by the need for time-lapse imaging infrastructure and image analysis proficiency (e.g., ImageJ) for quantification.
