Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora
5 stycznia 2022
Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.
Protokół jednocześnie śledzi reakcje roju bakterii na różne stężenia induktora na półstałym agarze . Osiąga się to w sposób opłacalny. Ta wysokoprzepustowa technika przesiewowa neguje potrzebę stosowania agaru o różnych stężeniach induktora w celu obserwacji odpowiedzi mikrochemotaktycznych.
Technika ta jest przeznaczona do badań przesiewowych leków, a także do obserwacji odpowiedzi SD mikropatogenów. Może być również używany do badania mikroreakcji na różne sygnały biochemiczne w ludzkim gospodarzu. Ta metoda może zapewnić wgląd w chemotaksję bakteryjną.
Bakterie będą reagować na różne stężenia atraktantów chemicznych znanych jako pozytywna chemotaksja lub repelenty chemiczne znane jako ujemna chemotaksja. Starannie przygotowana konfiguracja jest niezbędna, aby uniknąć różnic między kątem żelu dolnej warstwy, aby zapobiec problemowi z odtwarzalnością. Na początek oznacz szalki Petriego o wymiarach 13 na 13 centymetrów kwadratowych plamami i nazwami induktorów.
Następnie podeprzyj naczynia nad krawędzią pokrywek. Dodaj roztwór arabinozy do ciepłej dolnej warstwy podłoża. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z dolnej warstwy.
Pozwól pożywce dolnej warstwy utwardzić się bez przykrycia przez godzinę w okapie z przepływem laminarnym bez zakłóceń. Gdy dolna warstwa całkowicie zastygnie, zdejmij pokrywki i umieść szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z górnej warstwy za pomocą zmotoryzowanego filtra pipetowego.
Utwardź dwuwarstwowe płytki przykryte i nienaruszone przez godzinę, a następnie przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Umieść oznaczony papier A4 pod dobrze zastygłą płytą gradientową. Wsuń szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu i dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części górnej warstwy podłoża.
Gdy końcówka dotknie dna, przestań przykładać jakąkolwiek siłę pionową do końcówki i delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki. Przesuń poziomo końcówkę pipety na niewielką odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiego miejsca odłożonego na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki.
Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas jej wyciągania. Dodaj 80 mikrolitrów nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Płytki roju należy wyjmować z inkubatora pojedynczo co 12 godzin i umieszczać je w systemie obrazowania żelu.
Wybierz tryb obrazowania żelowego, wystaw płytkę roju na działanie białego światła i dostosuj ogniskową, aby uzyskać wyraźny widok rojów. Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać precyzyjną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 milisekund. Dostosuj próg, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła.
Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku txt. Kliknij opcję Proces, a następnie Cienie, aby poprawić ostrość obrazu.
Kliknij Proces, a następnie Partia, aby przetworzyć obraz. Następnie przetwórz obraz jako odniesienie, klikając Proces, Cienie i Południe. Kliknij przycisk Proces, Partia, Makro, aby otworzyć okno Proces wsadowy.
Poszukaj poleceń wyświetlanych w oknie. Wpisz adres folderu oryginalnych obrazów w adresie pliku wyjściowego, klikając przycisk Proces w oknie Proces wsadowy. Użyj narzędzia do śledzenia różdżek, aby wybrać roje pojedynczo i kliknij dwukrotnie narzędzie do śledzenia różdżki, aby dostosować tolerancję, aż wygenerowana linia będzie prawidłowo pasować do granicy roju.
Kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby wyeksportować wartość obszaru. E.coli K12 YdeH przetestowano na płytkach gradientowych arabinozy użytych do zademonstrowania procesu rojenia się powierzchni z nakładaniem się na siebie między sąsiednimi studzienkami. Płyta z trzema dołkami testowymi umożliwiła utworzenie nienakładających się na siebie granic.
Ruchliwość roju P.aeruginosa PAO1 YdeH była promowana ze zwiększonym stężeniem arabinozy od najniższego stężenia, ale stopniowo ograniczanym przy wyższych stężeniach stężeń arabinozy. Szczepy E.coli K12 typu dzikiego testowane na płytkach gradientowych resweratrolu w zakresie stężeń od zera do 400 mikrolitrów wykazały umiarkowane ograniczenie ruchliwości roju wraz ze wzrostem stężenia resweratrolu. Obszary roju zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Krzywa roju wyświetlała wielokrotne reakcje stężenia. Najważniejszą częścią tej procedury jest wyprodukowanie dwuwarstwowej płytki roju o określonym zakresie stężeń induktorów. Metoda ta umożliwia naukowcom zbadanie indukowanego roju powierzchniowego w określonym zakresie stężeń oraz ilościowe określenie wpływu innych induktorów i składników na rój.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę wysoko przepustowości wykrywania za pomocą płytek z gradientem induktora do oceny motylkowatości bakterii. Metoda ta pozwala na jednoczesne śledzenie reakcji bakterii na różne stężenia induktora na półpłynnych podłożach agarowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Chemotaktyka bakteryjna
- Wykrywanie leków
Tło
- Motylkowatość bakterii jest krytycznym zachowaniem dla patogenezy.
- Tradycyjne metody wymagają wielu płytek agarowych o różnych stężeniach induktora.
- Techniki wysoko przepustowości mogą zwiększyć efektywność procesów wykrywania.
- Rozumienie reakcji bakterii może wpłynąć na opracowywanie leków i strategie leczenia.
Cel badania
- Ocena motylkowatości bakterii przy użyciu opłacalnej metody.
- Obserwacja mikrochemotaktykowych reakcji na różne bodźce biochemiczne.
- Ułatwienie wykrywania leków w zakresie odpowiedzi mikropatogenów.
Zastosowane metody
- Płytki z gradientem induktora do jednoczesnego śledzenia odpowiedzi na stężenie.
- Półpłynny agar do wspierania wzrostu i ruchu bakterii.
- Wysoko przepustowe wykrywanie, aby zminimalizować zużycie zasobów.
- Obserwacja chemotaksji bakterii w odpowiedzi na różne bodźce.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie śledzi reakcje motylkowatości bakterii.
- Dostarcza wglądu w chemotaksję i zachowanie bakterii.
- Wykazuje potencjał zastosowań w wykrywaniu leków.
- Oferuje opłacalną alternatywę dla tradycyjnych metod.
Wnioski
- Ta technika poprawia rozumienie motylkowatości bakterii.
- Może być zastosowana do badania odpowiedzi na bodźce biochemiczne w ludzkim organizmie.
- Metoda ma znaczenie dla przyszłego rozwoju leków i badań mikrobiologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial swarming motility across inducer gradients enables high-throughput interrogation of microbial responses to biochemical cues. This approach supports early-stage drug screening and mechanistic de-risking by providing reproducible, multiplexed data on bacterial chemotaxis. Integrating gradient plate assays into discovery workflows enhances predictive confidence for anti-infective and microbiome-targeted portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic evaluation of bacterial responses to candidate inducers or inhibitors.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying chemotactic and motility phenotypes.
- Facilitates functional target validation for anti-virulence or microbiome modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, multiplexed platform for high-throughput screening of compound libraries.
- Delivers quantitative, reproducible measurements of swarming area using digital image analysis.
- Reduces assay variability by consolidating concentration gradients onto a single plate.
- Enables rapid comparison of multiple strains or conditions in parallel.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro motility phenotypes with disease-relevant bacterial behaviors.
- Supports translational biomarker identification for microbial response to host or therapeutic cues.
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by standardizing motility readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This gradient plate method bridges early discovery and screening, providing actionable data for lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies bacterial chemotaxis and motility in response to defined biochemical gradients.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, multiplexed evaluation of compound effects.
- Analytics: Generates quantitative area measurements for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Links in vitro motility changes to potential in vivo phenotypes when supported by downstream studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse bacterial species and inducer classes for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bacterial response profiling and target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by reducing plate-to-plate variability and manual handling.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions for anti-infective and microbiome-targeted programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds and mechanistic hypotheses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological technique and digital image analysis.
- Needs access to imaging systems and quantitative analysis software (e.g., ImageJ).
- Demands careful plate preparation to ensure gradient uniformity and reproducibility.
- Adaptable to various bacterial strains and inducer types with protocol optimization.
- Potential limitations include overlap of swarms at high density or suboptimal gradient formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:03
Preparation of Double-Layer Gradient Swarm Plates
1:51
Inoculation and Incubation of Gradient Swarm Plates
2:42
Imaging Bacterial Surface Swarming
3:29
Quantify the Swarm Area Using ImageJ Software
4:22
Results: Quantification of Bacterial Surface Swarming Motility
5:22
Conclusion
