Name: Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji ruchliwości roju bakterii na płytkach gradientu induktora. Technika umożliwia jednoczesne śledzenie odpowiedzi chemotaktycznych w wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tej techniki był wspierany przez fundusze z Narodowego Kluczowego Planu Badawczo-Rozwojowego Ministerstwa Nauki i Technologii (2018YFA0902604), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chińskiej Fundacji Badawczej dla Międzynarodowych Młodych Naukowców (22050410270) oraz Zewnętrznych Funduszy Instytutów Zaawansowanych Technologii w Shenzhen (DWKF20190001). Chcielibyśmy wyrazić naszą szczerą wdzięczność Pani Chen Xinyi za jej pomoc w korekcie dokumentu i zarządzaniu laboratorium.

1. Przygotowanie płyt roju gradientowego
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża roju 
	UWAGA: Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z krótkim porównaniem różnych lepkości średnich; W tym protokole zastosowano stężenie agaru na poziomie 0,7% (w/v) w pożywce roju.
	<ol>
		<li>Przygotować bulion lizogeniczny (LB) w proszku z agarem w dwóch stożkowych kolbach; każda kolba zawiera 2 g tryptonu, 2 g chlorku sodu, 1 g ekstraktu drożdżowego i 1,4 g agaru. Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH2O) i wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować końcową objętość do 200 ml, dodając dodatkowo ddH2O.</li>
		<li>Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Użyć przepuszczającej powietrze nakrętki lub folii uszczelniającej butelkę z odpowietrznikiem. 
		UWAGA: Agar rozpuści się po podgrzaniu w autoklawie.</li>
		<li>Gdy temperatura spadnie do 65 °C, wymieszaj roztwór, aby zapewnić jednorodność, a następnie przenieś pożywkę do inkubatora o temperaturze 65 °C lub łaźni wodnej w celu krótkotrwałego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie warstwy dolnej warstwy roju pożywki 
	UWAGA: Pożywka w dolnej warstwie jest mieszaniną pożywki rojowej i roztworów podstawowych induktora. Formułę płytek roju gradientu induktora przedstawiono w tabeli 1.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy resweratrolu, rozpuszczając 114,12 mg liofilizowanego proszku resweratrolu w 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 20% (w/v) roztwór podstawowy arabinozy, rozpuszczając 6 g proszku arabinozy w 30 ml ddH2O; odczekać 10-15 minut, aby arabinoza mogła się rozpuścić; i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyjąć pożywkę z inkubatora o temperaturze 65 °C i umieścić ją w temperaturze pokojowej; pozostawić pożywkę do ostygnięcia, aż kolba Erlenmeyera ostygnie na tyle, aby utrzymać temperaturę (~50 °C). Nie umieszczaj pożywki roju w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to zestalenie się agaru.</li>
		<li>Dodać wymaganą objętość roztworu podstawowego induktora do pożywki roju w temperaturze 50 °C (tabela 1). Użyj pipety, aby dozować roztwór induktora zamiast go nalewać. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać induktor z podłożem roju. 
		UWAGA: Ten krok dotyczy induktorów, których nie można sterylizować w autoklawie. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków do podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie dwuwarstwowych płyt roju gradientowego 
	UWAGA: Pożywka wierzchniej warstwy to pożywka LB zawierająca 0,7% (w/v) agaru.
	<ol>
		<li>Oznacz kwadratowe szalki Petriego o wymiarach 13 x 13 cm nazwą induktora i szczepami, a następnie oprzyj szalki nad krawędzią pokrywek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Dodać 40 ml ciepłej pożywki dolnej warstwy (50 °C) za pomocą pipety 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Alternatywnie, w przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 13 x 13 cm, odpowiednie jest 40 ml podłoża z dolnej i górnej warstwy; W przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 10 x 10 cm odpowiednia jest pożywka dolna i górna warstwa o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Pozostawić podłoże dolnej warstwy do utwardzenia bez przykrycia przez 1 godzinę w okapie z przepływem laminarnym. Nie przeszkadzać kwadratowym szalkom Petriego, gdy podłoże krzepnie. 
		UWAGA: Podczas utwardzania dolnej warstwy, podłoże roju niezawierające induktorów powinno być utrzymywane w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Gdy dolna warstwa całkowicie zestali się, zdejmij pokrywki i połóż kwadratowe szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Dodać 40 ml ciepłej pożywki wierzchniej warstwy (50 °C) za pomocą pipety 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Podłoże z górnej warstwy nie zawiera induktorów.</li>
		<li>Dwuwarstwowe płytki utwardzać na blacie pod przykryciem i w nienaruszonym stanie przez 1 godzinę. Przygotowane płytki przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 h. 
		UWAGA: Dłuższy czas utwardzania zmniejszyłby zawartość wilgoci i ograniczyłby ruchliwość roju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wzrost E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki LB, dodając 5 g tryptonu, 5 g NaCl i 2,5 g ekstraktu drożdżowego do ddH2O i uzupełnić roztwór do 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu cieczy przez 20 minut w temperaturze 121 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 1,5% (w/v) pożywki LB-agar, dodając 1 g tryptonu, 1 g NaCl, 0,5 g ekstraktu drożdżowego i 1,5 g agaru do ddH2O i uzupełnić roztwór do 100 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu cieczy przez 20 minut w temperaturze 121 °C. Przenieść podłoże do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby zapobiec zestaleniu się agaru.</li>
	<li>Gdy kolba z pożywką LB-agar jest wygodna do trzymania, dodać 20 ml pożywki LB-agar do szalki Petriego (o średnicy 10 cm) za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na noc i przechowywać płytkę LB-agar w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pobrać kultury zapasowe przechowywane w temperaturze -80 °C, szczepy E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 i P. aeruginosa PAO1-YdeH na szalkach Petriego LB-agar za pomocą jednorazowych pętli inokulacyjnych. Inkubować odwrócone szalki Petriego przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Z szalek Petriego należy wybrać pojedyncze kolonie dla różnych szczepów, zaszczepić każdą kolonię w 5 ml pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w laboratoryjnej wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 220 obr./min.</li>
	<li>Gdy gęstość kultury osiągnie OD600nm ~ 1,0, wyjmij kulturę z wytrząsarki i umieść ją w temperaturze pokojowej. Dostosuj gęstość hodowli do OD600nm = 1,0, jak opisano w kroku 3.2.1.</li>
</ol>
3. Inokulacja i inkubacja płytek roju gradientowego
<ol>
	<li>Przygotowanie studzienek inokulacyjnych 
	UWAGA: Zamiast metody opisanej poniżej można zastosować modele okładek do drukowania 3D, które są w stanie generować studzienki oddalone od siebie standardową odległością (rysunek uzupełniający S1).
	<ol>
		<li>Zaznacz pozycje studzienek na papierze A4 pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C. Ustawić trzy badane stężenia na jednej kwadratowej szalce Petriego z dwoma lub trzema powtórzeniami.</li>
		<li>Umieść oznaczony papier A4 pod zastygłą płytą gradientową. Wsunąć szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 μl w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu. Dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części wierzchniej warstwy podłoża.</li>
		<li>Gdy końcówka dotknie dna, nie przykładaj do niej siły pionowej; delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki.</li>
		<li>Przesuwaj końcówki pipet w poziomie na bardzo małą odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiego miejsca odłożonego na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki, jednocześnie trzymając pipetę kciukiem i palcem środkowym.</li>
		<li>Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas wyciągania jej. 
		UWAGA: Jeśli zawartość studzienki ześlizgnie się, lekko mocniej dociśnij palcem wskazującym, aby całkowicie uszczelnić końcówkę.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.5 w każdej zaznaczonej pozycji. Przykryj płytkę roju przed inokulacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja i inkubacja na płytkach gradientowych
	<ol>
		<li>Dostosuj gęstość kultur wzrostu przez noc do OD600nm = 1,0.</li>
		<li>Odpipetować 80 μl nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Nie wylewaj kultury bakteryjnej na zewnątrz studzienek.</li>
		<li>Owiń płytki folią uszczelniającą. W przypadku długotrwałej obserwacji (3-5 dni) owiń płytki sterylną taśmą laboratoryjną. 
		UWAGA: Taśma gumowa jest mniej podatna na pęknięcie.</li>
		<li>Umieścić zlewkę wypełnioną ddH2O w inkubatorze, aby utrzymać wilgotność wewnątrz inkubatora. Inkubować płytki roju gradientowego w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Nie inkubuj płytek roju do góry nogami; Spowoduje to wyciek kultury bakteryjnej ze studzienek.</li>
		<li>Wyobraź sobie płytkę roju natychmiast po zaszczepieniu, rejestrując to jako punkt czasowy 0 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie roju bakterii na powierzchni
<ol>
	<li>Wyjmować płytki roju, pojedynczo, z inkubatora co 12 godzin, trzymając płytkę poziomo, i umieszczać je w systemie obrazowania żelu (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Nie pozostawiaj odcisków palców na powierzchni płyt; Trzymaj bok płyty roju czystymi rękawicami.</li>
	<li>Wybierz tryb obrazowania żelowego; wystaw płytkę roju na działanie białego światła i dostosuj ogniskową, aby uzyskać jak najwyraźniejszy widok rojów. 
	UWAGA: Używaj tej samej ogniskowej dla wszystkich płyt w danej partii.</li>
	<li>Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać wyraźną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 ms. Dostosuj próg, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła. 
	UWAGA: Próg jest regulowany w interfejsie operacyjnym systemu obrazowania żelu. Zwiększ wartości po lewej stronie, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła; Zmniejsz wartości po prawej stronie, aby zwiększyć jasność rojów. W tym protokole region wynosi zwykle od 6 000 do 50 000.</li>
	<li>Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku .txt.</li>
</ol>
5. Określ ilościowo obszar roju za pomocą oprogramowania ImageJ
<ol>
	<li>Zaimportuj plik obrazu uzyskany za pomocą systemu obrazowania żelu.</li>
	<li>Ustaw pasek skali za pomocą oprogramowania ImageJ i zastosuj go do wszystkich obrazów.
	<ol>
		<li>Utwórz odcinek linii wyznaczający długość planszy, klikając narzędzie linii.</li>
		<li>Kliknij pozycję Analizuj | Ustaw skalę, aby otworzyć okno Ustaw skalę.</li>
		<li>Wpisz rzeczywistą długość w polach Znana odległość i Jednostka długości. 
		UWAGA: Ponieważ w tej pracy użyto kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 13 x 13 cm, rzeczywista długość to "130", a jednostką długości jest "mm".</li>
		<li>Zaznacz pole Globalne.</li>
		<li>Wstawianie podziałki liniowej kliknij przycisk Analizuj | Narzędzia | Pasek skali, wpisz Szerokość w mm, Wysokość w pikselach, Rozmiar czcionki i wybierz Kolor, Tło i Lokalizacja z menu rozwijanego. Możesz też wybrać opcję Pogrubiony tekst, Ukryj tekst, Czcionka szeryfowa i Nakładka, zaznaczając pola wyboru. 
		UWAGA: Wybór tych parametrów zależy od użytkowników i właściwości obrazów. W tym protokole szerokość w mm została ustawiona na 25, wysokość w pikselach na 20, rozmiar czcionki na 80, a pasek skali został umieszczony w prawym dolnym rogu, wybierając Lokalizacja | Prawy dolny róg. Inne parametry mogą być wybierane przez użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij opcję Process (Proces) | Cienie w celu zwiększenia ostrości obrazu, zwłaszcza granic (rysunek uzupełniający S2A). Kliknij opcję Process (Proces) | Przetwarzanie wsadowe obrazów. 
	UWAGA: Celem tego kroku jest zapewnienie bardziej precyzyjnego wyznaczenia granic.
	<ol>
		<li>Przetwarzaj obraz jako odniesienie, klikając przycisk Proces | Cienie | Południe.</li>
		<li>Kliknij opcję Process (Proces) | Partia | Makro, aby otworzyć okno Proces wsadowy. Poszukaj następujących poleceń wyświetlanych w oknie: 
		run("południe"); 
		run("Zapisz"); 
		close();</li>
		<li>Wpisz adres folderu oryginalnych obrazów i adres pliku wyjściowego, klikając przycisk Process (Przetwarzaj) w oknie Batch Process (Proces wsadowy). 
		UWAGA: Zaleca się eksportowanie obrazów z cieniami do innego folderu i zachowanie kopii oryginalnych obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj narzędzia Różdżka (śledzenie), aby wybrać roje pojedynczo i dostosować tolerancję (kliknij dwukrotnie narzędzie Różdżka (śledzenie)), aż wygenerowana linia będzie prawidłowo pasować do granicy roju (Rysunek uzupełniający S2B). 
	UWAGA: Najpierw kliknij narzędzie Różdżka (śledzenie) i wybierz rój na jednym obrazie. Jeśli obwiednie nie zostały przedstawione poprawnie, kliknij dwukrotnie narzędzie Różdżka (obrysowywanie), aby otworzyć okna narzędzia Różdżka, w których można dostosować Tolerancję.</li>
	<li>Kliknij Analizuj | Zmierz, aby wyeksportować wartość obszaru.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 5.1.1-5.1.5, aż wszystkie roje zostaną zmierzone, zapisz wyniki w pliku .csv do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+swarming%3A+a+re-examination+of+cell-movement+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847(2018).</li>
<li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Hellenic+Plant+Protection+Journal%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li>
<li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li>
<li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710(2018).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae%2C+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840(2018).</li>
<li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li>
<li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type%3A+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li>
<li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36(2008).</li>
<li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li>
<li>Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrahmachari%2C+PV+%22Implication+of+quorum+sensing+system+in+biofilm+formation+and+virulence%22">Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence</a>. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).</li>
<li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li>
<li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).</li>
<li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li>
<li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842(2017).</li>
<li>Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915(2020).</li>
<li>Hölscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752(2016).</li>
<li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102(2001).</li>
<li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+behavior%2C+growth%2C+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480(2020).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li>
<li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+swarming+motility%2C+biosurfactant+synthesis%2C+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie ruchliwości roju bakterii na półstałych płytkach gradientowych może być trudnym zadaniem 18,19,20, ponieważ obejmuje wiele czynników, takich jak lepkość podłoża, wilgotność i składniki podłoża. Wśród tych czynników stężenie agaru odgrywa decydującą rolę w określaniu powrotu drobnoustrojów do pływania lub ruchliwości roju. Wraz ze wzrostem stężenia agaru z 0,3% (w/v) do 1% (w/v), ruchliwość bakteryjna podczas pływania zos...

Ruchliwość roju bakterii odnosi się do zbiorowej migracji komórek bakteryjnych po powierzchni substancji. Oprócz półstałych płytek agarowych specjalnie przygotowanych w laboratorium1, fenotyp ten obserwuje się również na niektórych miękkich podłożach, takich jak tkanki zwierzęce2, powierzchnie uwodnione3 i korzenie roślin4. Podczas gdy półstała powierzchnia jest uważana za jeden z podstawowych warunków roju bakterii, niektóre gatunki wymagają również bogatego w energię podłoża, aby wspierać swoją ruchliwość roju5. Rotacja wici napędza zarówno pływanie, jak i ruchliwość roju - pływanie opisuje jednokomórkową ruchliwość w płynnym środowisku, podczas gdy rój to synchroniczny ruch populacji drobnoustrojów po półstałych powierzchniach.
Lepkość podłoża wpływa na ruchliwość bakterii; badania drobnoustrojów chorobotwórczych, takich jak Helicobacter pylori, wykazały, że ruchliwość patogenu zmienia się w zależności od lepkości warstwy mucyny, na którą wpływ ma zakwaszenie środowiska u ludzkiego gospodarza6. Aby odtworzyć te środowiska, wcześniejsze badania z użyciem stężenia agaru powyżej 0,3% (w/v) ograniczają ruchliwość pływania bakterii, aby spowodować stopniowe przejście do roju powierzchniowego. Stosowanie stężenia agaru powyżej 1% (w/v) zapobiega ruchliwości roju wielu gatunków7. Wzory kolonii powstające na powierzchni są różnorodne, w tym mat8, bull's eye9, dendryty10 i vortex11.
Chociaż znaczenie takich wzorców pozostaje niejasne, wydaje się, że są one zależne od sygnałów środowiskowych i chemicznych12. Sygnały środowiskowe obejmują różne aspekty, w tym temperaturę, zasolenie, światło i pH, podczas gdy wskazówki chemiczne obejmują obecność mikrobiologicznych cząsteczek wyczuwających kworum, biochemiczne produkty uboczne i składniki odżywcze. Cząsteczki sygnalizacyjne autoinduktora wykrywające kworum, takie jak AHL (lakton homoserynowy N-heksanoyl-L), mogą wpływać na roj powierzchniowy poprzez regulację produkcji środka powierzchniowo czynnego13,14. Resweratrol, związek fitoaleksyny, może ograniczać ruchliwość roju bakterii15.
W niniejszej pracy badamy wpływ gradientowych stężeń resweratrolu na dziki szczep Escherichia coli K12 i badamy indukowaną arabinozą ruchliwość roju zmodyfikowanych gatunków E. coli K12-YdeH i Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. Produkcja enzymu YdeH jest indukowana przez arabinozę za pośrednictwem promotora araBAD, co powoduje zaburzenia komórkowe c-di-GMP i wpływa na ruchliwość roju bakterii16,17. To indukowalne zachowanie roju jest badane za pomocą płytek roju gradientu arabinozy ze szczepami E. coli K12-YdeH i P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Gradientowe płyty roju są przygotowywane przez sukcesywne krzepnięcie dwuwarstwowego podłoża (Rysunek 1B). Dolna warstwa składa się z pożywki dodanej wraz z induktorem, wylanej na jedną stronę podpartej szalki Petriego. Po zestaleniu się dolnej warstwy, szalka Petriego jest ponownie umieszczana na płaskiej powierzchni, gdzie górna warstwa zawierająca pożywkę bez induktora jest dodawana z drugiej strony płytki. Po całkowitym zestaleniu się płyt roju, izometrycznie ułożone studnie podtrzymujące są wytwarzane przez wiercenie otworów w płytach roju zgodnie z ustalonym układem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C) lub przez odciskanie studzienek za pomocą wydrukowanego w 3D modelu pokrywy płyty zawierającej kołki podczas procesu utwardzania medium (Rysunek uzupełniający S1). System obrazowania żelowego służy do uchwycenia morfologii roju w różnych punktach czasowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Analiza roju powierzchniowego za pomocą oprogramowania ImageJ (rysunek uzupełniający S2) dostarcza ilościowych wyników procesu roju powierzchniowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
Dlatego proponujemy prostą metodę badania ruchliwości roju powierzchniowego w zakresie stężeń induktorów. Metoda ta może być stosowana do badania wielu odpowiedzi stężeniowych innych induktorów poprzez zmieszanie induktora z podłożem dolnej warstwy i może być stosowana do innych gatunków ruchliwych (np. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Takie podejście może dostarczyć wiarygodnych wyników jakościowych i ilościowych do badań przesiewowych pojedynczego induktora chemicznego, a do oceny większej liczby induktorów chemicznych można zastosować oddzielne płytki.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td>25 g, &ge; 85% (GC)</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Aladyn</td><td>D103272</td><td>AR, > 99% (GC)</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinoza</td><td>Aladyn</td><td>A106195</td><td>98% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM90-15</td><td>Plastikowe szalki Petriego, okrągłe, 90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Resweratrol</td><td>Aladyn</td><td>R107315</td><td>99% (GC), 25 g</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>AR, 99,5% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Kwadratowe szalki Petriego</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM130F</td><td>Plastikowe szalki Petriego, kwadratowe, 13 mm x 13 mm</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0042</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0021</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>Blue pard</td><td>LRH-70</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 5200multi system obrazowania</td><td>Tanon</td><td>5200CE</td><td></td></tr><tr><td>Woda termostatyczna wanna</td><td>Jinghong</td><td>DK-S28</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Ruchliwość roju bakterii jest powszechnym fenotypem mikrobiologicznym, który społeczności bakteryjne wykorzystują do migracji po powierzchniach półstałych. W badaniach indukowanej ruchliwości roju, określone stężenie induktora może nie być w stanie zgłosić zdarzeń zachodzących w optymalnym zakresie stężeń, aby wywołać pożądane reakcje u gatunku. Płytki półstałe zawierające wiele stężeń są powszechnie stosowane do badania odpowiedzi w zakresie stężeń induktora. Jednak oddzielne płytki półstałe zwiększają wahania średniej lepkości i zawartości wilgoci w każdej płytce ze względu na niejednorodny czas krzepnięcia.
Ten artykuł opisuje jednoetapową metodę jednoczesnego testowania ruchliwości roju powierzchni na pojedynczej płycie gradientowej, gdzie izometrycznie ułożone studnie testowe pozwalają na jednoczesne uzyskanie odpowiedzi wielostężeniowych. W niniejszej pracy oceniano powierzchniowe rój Escherichia coli K12 i Pseudomonas aeruginosa PAO1 w odpowiedzi na gradient stężeń induktorów, takich jak resweratrol i arabinoza. Okresowo morfologie roju były obrazowane za pomocą systemu obrazowania, aby uchwycić cały proces roju na powierzchni.
Ilościowy pomiar morfologii roju został uzyskany za pomocą oprogramowania ImageJ, dostarczając możliwych do analizy informacji o obszarze roju. W artykule przedstawiono prostą metodę płytek gradientowych, która dostarcza jakościowych i ilościowych informacji na temat wpływu induktorów na rój powierzchniowy, które można rozszerzyć w celu zbadania wpływu innych induktorów na szerszy zakres ruchliwych gatunków bakterii.

Przebieg pracy obejmujący przygotowanie gradientowych płytek do badania rojenia (swarm plates), inokulację oraz inkubację przedstawiono na Rysunku 1B. Aby przygotować gradientowe płytki do badania rojenia, medium warstwy dolnej wlewa się do podpartych naczyń pod kątem ~4,3° względem płaszczyzny poziomej (Rysunek uzupełniający S3), a następnie, po całkowitym zestaleniu warstwy dolnej, wlewa się medium warstwy górnej. Skład podwójnego medium przedstawiono w Tabeli 1</s...

Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.

Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Protokół jednocześnie śledzi reakcje roju bakterii na różne stężenia induktora na półstałym agarze . Osiąga się to w sposób opłacalny. Ta wysokoprzepustowa technika przesiewowa neguje potrzebę stosowania agaru o różnych stężeniach induktora w celu obserwacji odpowiedzi mikrochemotaktycznych.Technika ta jest przeznaczona do badań przesiewowych leków, a także do obserwacji odpowiedzi SD mikropatogenów. Może być również używany do badania mikroreakcji na różne sygnały biochemiczne w ludzkim gospodarzu. Ta metoda może zapewnić wgląd w chemotaksję bakteryjną.Bakterie będą reagować na różne stężenia atraktantów chemicznych znanych jako pozytywna chemotaksja lub repelenty chemiczne znane jako ujemna chemotaksja. Starannie przygotowana konfiguracja jest niezbędna, aby uniknąć różnic między kątem żelu dolnej warstwy, aby zapobiec problemowi z odtwarzalnością. Na początek oznacz szalki Petriego o wymiarach 13 na 13 centymetrów kwadratowych plamami i nazwami induktorów.Następnie podeprzyj naczynia nad krawędzią pokrywek. Dodaj roztwór arabinozy do ciepłej dolnej warstwy podłoża. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z dolnej warstwy.Pozwól pożywce dolnej warstwy utwardzić się bez przykrycia przez godzinę w okapie z przepływem laminarnym bez zakłóceń. Gdy dolna warstwa całkowicie zastygnie, zdejmij pokrywki i umieść szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z górnej warstwy za pomocą zmotoryzowanego filtra pipetowego.Utwardź dwuwarstwowe płytki przykryte i nienaruszone przez godzinę, a następnie przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Umieść oznaczony papier A4 pod dobrze zastygłą płytą gradientową. Wsuń szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu i dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części górnej warstwy podłoża.Gdy końcówka dotknie dna, przestań przykładać jakąkolwiek siłę pionową do końcówki i delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki. Przesuń poziomo końcówkę pipety na niewielką odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiego miejsca odłożonego na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki.Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas jej wyciągania. Dodaj 80 mikrolitrów nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Płytki roju należy wyjmować z inkubatora pojedynczo co 12 godzin i umieszczać je w systemie obrazowania żelu.Wybierz tryb obrazowania żelowego, wystaw płytkę roju na działanie białego światła i dostosuj ogniskową, aby uzyskać wyraźny widok rojów. Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać precyzyjną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 milisekund. Dostosuj próg, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła.Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku txt. Kliknij opcję Proces, a następnie Cienie, aby poprawić ostrość obrazu.Kliknij Proces, a następnie Partia, aby przetworzyć obraz. Następnie przetwórz obraz jako odniesienie, klikając Proces, Cienie i Południe. Kliknij przycisk Proces, Partia, Makro, aby otworzyć okno Proces wsadowy.Poszukaj poleceń wyświetlanych w oknie. Wpisz adres folderu oryginalnych obrazów w adresie pliku wyjściowego, klikając przycisk Proces w oknie Proces wsadowy. Użyj narzędzia do śledzenia różdżek, aby wybrać roje pojedynczo i kliknij dwukrotnie narzędzie do śledzenia różdżki, aby dostosować tolerancję, aż wygenerowana linia będzie prawidłowo pasować do granicy roju.Kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby wyeksportować wartość obszaru. E.coli K12 YdeH przetestowano na płytkach gradientowych arabinozy użytych do zademonstrowania procesu rojenia się powierzchni z nakładaniem się na siebie między sąsiednimi studzienkami. Płyta z trzema dołkami testowymi umożliwiła utworzenie nienakładających się na siebie granic.Ruchliwość roju P.aeruginosa PAO1 YdeH była promowana ze zwiększonym stężeniem arabinozy od najniższego stężenia, ale stopniowo ograniczanym przy wyższych stężeniach stężeń arabinozy. Szczepy E.coli K12 typu dzikiego testowane na płytkach gradientowych resweratrolu w zakresie stężeń od zera do 400 mikrolitrów wykazały umiarkowane ograniczenie ruchliwości roju wraz ze wzrostem stężenia resweratrolu. Obszary roju zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.Krzywa roju wyświetlała wielokrotne reakcje stężenia. Najważniejszą częścią tej procedury jest wyprodukowanie dwuwarstwowej płytki roju o określonym zakresie stężeń induktorów. Metoda ta umożliwia naukowcom zbadanie indukowanego roju powierzchniowego w określonym zakresie stężeń oraz ilościowe określenie wpływu innych induktorów i składników na rój.

quantifying-bacterial-surface-swarming-motility-on-inducer-gradient

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Źródło: Heering, J., et al. Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer cells. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukcję różnicowania komórek roju u Vibrio parahaemolyticus przy użyciu specjalnie przygotowanego podłoża agarowego. Manipulując sygnałami środowiskowymi, takimi jak wyczerpanie żelaza, suplementacja wapnia i kontakt powierzchniowy, bakterie są stymulowane do przejścia z formy pływaka w wydłużone komórki roju z...

Indukcja różnicowania Vibrio parahaemolyticus w komórki roju

Źródło: Morales-Soto, N. i wsp., Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia test roju z wykorzystaniem bakterii, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, w celu obserwacji ruchliwości powierzchni na miękkim agarze. Obrazowanie poklatkowe rejestruje skoordynowaną ekspansję i tworzenie wąsów, podkreślając ruchliwość powierzchni bakterii.

Test roju do wizualizacji ruchliwości powierzchni bakterii

Źródło: Guo, S., et al. Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora. J. Vis. Exp. (2022).Ten film demonstruje wykorzystanie dwuwarstwowej gradientowej płyty roju do badania zachowania roju bakterii przy różnych stężeniach inhibitorów. Płytkę z inhibitorem tworzącym gradient w dolnej warstwie zaszczepia się bakteriami i inkubuje. Obrazy są rejestrowane w regularnych odstępach czasu w celu analizy wpływu stężenia inhibitora na rozprzestrzenianie się...

Ocena roju bakterii za pomocą gradientowej płytki inhibitora

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.

Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ten protokół umożliwia mikroskopię pojedynczych komórek różnie różniących się komórek pływaka i roju Vibrio parahaemolyticus. Metoda ta tworzy populację komórek roju łatwo dostępnych do analizy pojedynczej komórki i obejmuje przygotowanie kultur komórkowych, indukcję różnicowania roju, przygotowanie próbki i analizę obrazu.

Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer

Szczegółowo opisujemy prostą metodę tworzenia filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości rojów Pseudomonas aeruginosa, które reagują na bakteriofagi (fagi) i stres antybiotykowy za pomocą płaskiego skanera dokumentów. Procedura ta jest szybką i prostą metodą monitorowania dynamiki roju i może być dostosowana do badania ruchliwości i wzrostu innych gatunków bakterii.

Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Poznaj metodę kwantyfikacji ruchliwości roju bakterii na płytkach gradientu induktora. Technika umożliwia jednoczesne śledzenie odpowiedzi chemotaktycznych w wysokiej przepustowości.

Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Przeglądaj więcej filmów