Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Ogólnym celem tej procedury jest szybka homogenizacja fragmentów ludzkich tkanek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek bez użycia trawienia enzymatycznego, w celu przeprowadzenia analiz jakościowych i ilościowych oraz izolacji specyficznych subpopulacji limfocytów. Osiąga się to najpierw poprzez pocięcie fragmentów tkanki na małe kawałki za pomocą sterylnego skalpela. Następnie zawiesinę tkankową przenosi się do probówki do dysocjacji mechanicznej, w której fragmenty są dalej homogenizowane do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.

Następnie komórki są zbierane przez wirowanie do dalszych analiz. W końcowym etapie można wykorzystać cytometrię przepływową do analizy naciekających limfocytów oraz ich subpopulacji. Moje laboratorium opracowało tę technikę, ponieważ poszukiwaliśmy sposobu na obrazowanie limfocytów naciekających guz bez znaczącego wpływania na ich stan natywny.

Poszukiwaliśmy metody umożliwiającej szybką izolację komórek i ich analizę w stanie bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym. Technika ta została zastosowana w naszym laboratorium w ponad 300 przypadkach guzów piersi oraz tkanek prawidłowych; jest ona łatwa w obsłudze i może być stosowana w codziennej praktyce. Może służyć do badania markerów prognostycznych, odpowiedzi na leczenie oraz długoterminowych wyników klinicznych.

Technikę tę zaprezentuje dziś John Nicola Loic, technik w moim laboratorium. Należy rozpocząć od zważenia próbki tkanki, a następnie zmierzyć długość, szerokość i wysokość tkanki. Następnie fragment tkanki należy przenieść do małej szalki Petriego zawierającej 1 ml odpowiedniego, chemicznie zdefiniowanego bezserwatkowego medium do hodowli komórek krwiotwórczych i za pomocą sterylnego skalpela pociąć próbki na małe kawałki o wymiarach od 1 do 2 mm².

Następnie przenieś zawartość szalki do probówki C do dysocjacji mechanicznej, a szalkę i skalpel wypłucz dwiema mililitrami pożywki. Przelej płuczkę do probówki C, a następnie uruchom program dysocjacji mechanicznej 0,01 dwa razy z rzędu, aby delikatnie zhomogenizować fragmenty tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Po drugim cyklu przlej homogenat przez sito komórkowe 40 µm do probówki stożkowej 50 ml.

Następnie za pomocą tej samej pipety, której użyto do płukania szalki Petriego, przenieś pozostały w probówce C płyn do sita komórkowego. Dalej, używając mikropipety o objętości 1 ml, przenieś przefiltrowany płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wypłucz probówkę C dodatkowymi 3 ml pożywki. Przenieś ten płukanie przez sito komórkowe do probówki o pojemności 50 ml.

Następnie delikatnie przesuń niehomogenizowaną tkankę po sitku za pomocą czystego końcówki o pojemności 1 ml, aby wycisnąć maksymalną ilość resztkowej cieczy uwięzionej w tkance do probówki 50 ml. Teraz umieść sitko do komórek odwrócone dnem do góry na oryginalnej probówce C i wypłucz sitko kolejnymi 3 ml pożywki, tak aby niehomogenizowana tkanka spadła z powrotem do probówki C. Ponownie homogenizuj tkankę przez kolejne dwa cykle, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie przelej ten drugi homogenat przez sitko do komórek.

Ponownie wypłucz probówkę C kolejnymi trzema mililitrami pożywki. Następnie przefiltruj nadsącz przez sitko i wyciśnij pozostałą ciecz z tkanki, tak jak pokazano przed chwilą. Na tym etapie w probówce 15 mililitrów powinna znajdować się objętość około 2,5 mililitra zawiesiny pojedynczych komórek, a w probówce 50 mililitrów powinno być około dziewięciu mililitrów.

Aby oddzielić nadsącz tkankowy od komórek, najpierw odwiruj obie probówki z homogenatem przez 15 minut przy 600 Gs w temperaturze pokojowej, przelej nadsącz z probówki 15 ml do probówki 1,5 ml, umieszczając ją w temperaturze 4 °C, a nadsącz z probówki 50 ml odrzuć. Następnie delikatnie opukaj każdą probówkę o twardą powierzchnię, aby rozbić osady komórkowe. Resuspenduj rozluźniony osad komórkowy w probówce 50 ml w 500 µL medium, a następnie przenieś komórki do probówki 15 ml, aby resuspendować drugi osad.

Następnie przepłucz probówkę 50 ml kolejnymi 500 µl medium i przenieś płuczkę do probówki 15 ml, aby zmaksymalizować odzysk komórek. Po policzeniu liczby żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, odwirowuj zawiesinę komórkową. Na koniec odwirowuj zarezerwowany nadsącz tkankowy.

Następnie ostrożnie przenieś nadsącz do co najmniej jednej czystej probówki, nie dotykając i nie naruszając osadu, a następnie przechowuj go w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz. Na tych wykresach przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej homogenatów rozdzielonych komórek nowotworowych po znakowaniu swoistymi przeciwciałami przeciwko leukocytom i markerom komórek nabłonkowych. Niniejszy protokół nie wpływa znacząco na żywotność komórek CD 45 dodatnich.

Następuje jednak znaczna utrata żywotnych komórek EPAM-dodatnich. Mimo to żywotne subpopulacje EPAM-dodatnie oraz CD 45-dodatnie można wyodrębnić na podstawie ich wielkości i struktury na duże komórki nowotworowe nabłonkowe, małe komórki nabłonkowe oraz duże i małe komórki CD 45-dodatnie. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej głównych subpopulacji naciekających nowotwór, z limfocytami wyodrębnionymi na podstawie żywotności komórek CD 45-dodatnich.

Na koniec ekspresję cytokin lub całkowitą ilość immunoglobulin obecnych w supernatancie z raka piersi można porównać z supernatanten z prawidłowej tkanki piersi, co pozwala wykryć – jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie – wzrosty obu typów białek związanych z tkanką nowotworową. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i w czystych warunkach oraz odzyskiwać maksymalną ilość materiału na każdym etapie procedury, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy końcowej.