Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Ogólnym celem tej procedury jest szybka homogenizacja fragmentów tkanek ludzkich w zawiesinę jednokomórkową bez trawienia enzymatycznego w celu analizy jakościowej i ilościowej oraz izolacji określonych subpopulacji limfocytów. Osiąga się to poprzez uprzednie użycie sterylnego skalpela do pokrojenia fragmentów tkanki na małe kawałki. Następnie zawiesina tkankowa jest przenoszona do mechanicznie zdysocjowanej probówki, gdzie po odłamkach są dalej homogenizowane w zawiesinę pojedynczej komórki.

Komórki są następnie zbierane przez odwirowanie w celu dalszej analizy. Ostatecznie cytometria przepływowa może być wykorzystana do analizy naciekających limfocytów, subpopulacji Azjatów. Moje laboratorium opracowało tę technikę, ponieważ szukaliśmy sposobu, w jaki moglibyśmy obrazować limfocyty naciekające guz bez dramatycznego wpływu na ich naturalny stan.

Chcieliśmy czegoś, co pozwoliłoby nam szybko wyizolować komórki i przeanalizować je tak, jak wyglądały podczas operacji. Technika ta została zastosowana na ponad 300 guzach piersi i normalnych tkankach w naszym laboratorium i jest łatwa w użyciu i może być stosowana na co dzień. Może być stosowany do badania markerów prognostycznych, odpowiedzi na leczenie i długoterminowych wyników klinicznych.

Dzisiaj tę technikę zademonstruje John Nicola Loic. Technik w moim laboratorium Zacznij od zważenia próbki tkanki, a następnie zmierz długość, szerokość i wysokość tkanki. Następnie przenieś fragment tkanki na małą szalkę Petriego zawierającą jeden mililitr odpowiedniej, chemicznie zdefiniowanej pożywki z komórek krwiotwórczych wolnych od surowicy i użyj sterylnego skalpela, aby pokroić próbki na małe kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów kwadratowych.

Następnie przenieś zawartość naczynia do rurki C do dysocjacji mechanicznej i opłucz naczynie i skalpel dwoma mililitrami pożywki. Dodaj płukanie do probówki C, a następnie uruchom program dysocjacji mechanicznej 0,01 dwa razy z rzędu, aby delikatnie homogenizować fragmenty tkanki w zawiesinę pojedynczej komórki. Po drugim cyklu zdekantować homogenat przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie użyj tego samego szkodnika, co pipeta z mycia szalki Petriego, aby przenieść płyn pozostały w probówce C do sitka komórkowego. Następnie za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra przenieś przefiltrowaną ciecz do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i przepłucz rurkę C dodatkowymi trzema mililitrami pożywki. Przelej ten płyn przez sitko do 50-mililitrowej probówki.

Następnie delikatnie przesuwaj niehomogenizowaną tkankę wokół sitka czystą końcówką o pojemności jednego mililitra, aby wycisnąć maksymalną ilość pozostałego płynu uwięzionego w tkance do 50-mililitrowej tubki. Teraz umieść sitko komórkowe do góry nogami na oryginalnej probówce C i przepłucz sitko trzema dodatkowymi mililitrami pożywki, aby niehomogenizowana tkanka wpadła z powrotem do probówki C. Ponownie homogenizuj tkankę przez dwa kolejne cykle, jak właśnie pokazano, a następnie przelej ten drugi homogenat przez sitko komórkowe.

Ponownie przepłucz rurkę C kolejnymi trzema mililitrami pożywki. Następnie przefiltrować supernatant przez sitko i wycisnąć pozostałą ciecz z tkanki, jak pokazano powyżej. W tym momencie objętość około 2,5 mililitra zawiesiny jednokomórkowej powinna być obecna w 15-mililitrowej probówce, a około dziewięciu mililitrów powinna być obserwowana w 50-mililitrowej probówce.

Aby oddzielić supernatant tkankowy od komórek, najpierw odwiruj, obie probówki homogenate przez 15 minut w temperaturze 600 G i temperaturze pokojowej, zdekantuj supernatant z 15-mililitrowej probówki do 1,5-mililitrowej probówki, umieszczając ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć supernatant z 50-mililitrowej probówki. Następnie delikatnie postukaj każdą rurką o twardą powierzchnię, aby rozbić każdą z granulek komórek. Ponownie zawiesić luźne ogniwa w 50-mililitrowej probówce z 500 mikrolitrami pożywki i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki w celu ponownego zawieszenia drugiej kulki.

Następnie przepłucz 50-mililitrową probówkę kolejnymi 500 mikrolitrami pożywki i przenieś popłuczynę do 15-mililitrowej probówki, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek. Po zliczeniu liczby żywotnych komórek za pomocą wykluczenia z błękitu trianowego osad zawiesinę komórek. Na koniec odwirować zarezerwowany supernatant tkankowy.

Następnie ostrożnie przenieść supernatant do co najmniej jednej czystej probówki, nie dotykając ani nie naruszając osadu i przechowując go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej dalszej analizy. Na tych wykresach pokazano reprezentatywne wykresy punktowe cytometrii przepływowej zdysocjowanych homogenatów komórek nowotworowych, a następnie znakowanie specyficznymi przeciwciałami przeciwko leukocytom i markerom komórek nabłonkowych, jak pokazano. Protokół ten nie zmienia znacząco żywotności komórek CD 45 dodatnich.

Dochodzi jednak do znacznej utraty żywotnych komórek dodatnich EPAM. Mimo to żywotne podzbiory EPAM dodatnie i CD 45 dodatnie można segregować na podstawie ich wielkości i struktury na duże nabłonkowe komórki nowotworowe, małe komórki nabłonkowe lub duże i małe komórki CD 45-dodatnie. Pokazano tutaj reprezentatywne wykresy punktowe cytometrii przepływowej głównych podzbiorów naciekających guz z limfocytami bramkowanymi na żywotność komórek CD 45 dodatnich.

Wreszcie, ekspresję cytokin lub całkowitych immunoglobulin obecnych w supernatancie raka piersi można porównać z supernatantem z normalnej tkanki piersi, ujawniając, jak wykazano w tym reprezentatywnym eksperymencie, wzrost obu typów białek związanych z tkanką nowotworową Podczas gdy uczestnik jest w procedurze, ważne jest, aby pamiętać o szybkiej i czystej pracy oraz o odzyskaniu maksymalnej ilości materiału na każdym etapie procedury, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analiza punktu końcowego.