Name: Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich do analizy naciekających limfocytów CD45+. Technika zachowuje naturalny stan komórek i umożliwia cytometrię przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Belgijskiego Funduszu Badań Naukowych (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer of Belgium, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds J.C. Heuson i Fonds Barsy.

UWAGA: Wszystkie próbki zostały pobrane przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Komisję Etyki Medycznej Instytutu Jules Bordet z pisemną świadomą zgodą uzyskaną od każdego pacjenta.
1. Przygotowanie homogenatu tkankowego
<ol>
	<li>Wycięte tkanki (złośliwe i normalne tkanki wycięte z sali operacyjnej) są umieszczane w laboratorium patomorfologicznym przez przeszkolony personel w celu natychmiastowego odbioru. Guz, NANT (pobrany jak najdalej od guza) i normalne fragmenty tkanek są rutynowo przetwarzane w ciągu 1 - 3 godzin od wycięcia chirurgicznego w laboratorium BSL2 przy użyciu standardowych procedur bezpieczeństwa biologicznego dla tkanek ludzkich. Schemat blokowy protokołu jest zilustrowany na rysunku 1.</li>
	<li>Zważ wszystkie fragmenty tkanek (normalne, NANT i guz) i zmierz długość, szerokość i wysokość (długość x szerokość x wysokość). Jest to ważny krok dla późniejszej normalizacji subpopulacji komórek, wyekstrahowanego RNA itp. 
	UWAGA: Zakres wielkości próbki wynosi od 100 do 10 000 mm3 bez tłuszczu, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Odcisk fragmentu guza na szkiełku podstawowym w celu barwienia H&E, aby sprawdzić, czy tkanka jest rzeczywiście częścią guza.
	<ol>
		<li>Zrób to, naciskając szklane szkiełko mikroskopowe na fragment guza i delikatnie uciskając palcami przez kilka sekund.</li>
		<li>Zamocuj szkiełko izopropanolem na 2 minuty, a następnie przemyj je w wodzie. Przeciwbarwić tkankę przez 30 sekund hematoksyliną Mayera.</li>
		<li>Umyj szkiełko w sześciu kąpielach wodnych. Barwienie w floksynie B 2% przez 15 sek.</li>
		<li>Umyć w jednej kąpieli wodnej, następnie w czterech kąpielach izopropanolu i zakończyć jedną kąpielą w wodzie.</li>
		<li>Inkubować w izopropanolu przez 1 minutę i odcedzić. Klarowny w dwóch kąpielach ksylenu.</li>
		<li>Zamontuj za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu. Zbadaj komórkowość guza (ryc. 2). 
		UWAGA: Głównie komórki nowotworowe przyklejają się do odciśniętego szkiełka - komórki zrębowe, limfoidalne lub tłuszczowe rzadko pozostają, pozostawiając przestrzenie między komórkami nowotworowymi (ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić fragment tkanki w małym naczyniu hodowlanym zawierającym 1 ml chemicznie zdefiniowanej, pozbawionej surowicy pożywki z komórek krwiotwórczych (zwanej dalej pożywką) w temperaturze pokojowej i pokroić go w drobną kostkę (~1 - 2 mm2) za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Przenieś wszystko (fragmenty tkanki + pożywka) do mechanicznej rurki C dysocjatora.</li>
	<li>Przepłukać szalkę Petriego i skalpel 2 ml pożywki za pomocą pipety Pasteura i dodać ją do probówki C (objętość pożywki do dysocjacji = 3 ml).</li>
	<li>Użyj programu dysocjatora mechanicznego A.01 dla probówek C (najdelikatniejszy program), aby homogenizować fragmenty tkanek w zawiesinę pojedynczej komórki. Umieść rurkę C w aparacie i uruchom program dwa razy z rzędu (jeden cykl = 25 sekund). 
	UWAGA: Ta procedura homogenizacji została opracowana i zatwierdzona dla ludzkiej tkanki piersi, inne typy nowotworów lub tkanek mogą wymagać użycia innego programu i powinny być najpierw przetestowane.</li>
	<li>Wyjąć probówkę C z aparatu i zdekantować homogenat bezpośrednio do sitka o wielkości 40 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, przenieś płyn pozostały w probówce C do sitka do komórek.</li>
	<li>Przefiltrowaną ciecz przenieść do probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml. Tymczasowo należy zachować sitko do komórek i jego probówkę o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłukać probówkę C dodatkowymi 3 ml pożywki i przenieść ją, ponownie używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, do sitka do komórek, które nadal jest osadzone na probówce o pojemności 50 ml. Wycisnąć maksymalną ilość pozostałego płynu uwięzionego w niehomogenizowanej tkance do probówki o pojemności 50 ml, delikatnie przesuwając ją po sitku za pomocą czystej pipety Pasteura lub końcówki o pojemności 1 ml, którą następnie wyrzuca się, aby uniknąć zanieczyszczenia eluatu.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek do góry nogami na oryginalnej probówce C i spłucz 3 ml pożywki, aby niehomogenizowana tkanka wpadła z powrotem do probówki C.</li>
	<li>Przeprowadzić ponowną homogenizację jak w kroku 1.7 przez dwa cykle programu A.01.</li>
	<li>Przelać ten drugi homogenat przez sitko umieszczone na probówce o pojemności 50 ml, ponownie przepłukać probówkę C 3 ml pożywki (jak w kroku 1.10) i przenieść pipetą Pasteura do sitka komórkowego osadzonego na probówce o pojemności 50 ml, ponownie wyciskając maksymalną ilość płynu z pozostałej tkanki łącznej uwięzionej w sitku do komórek.</li>
	<li>W tym momencie objętość ~2,5 ml znajduje się w probówce 15 ml i ~9 ml w probówce 50 ml.</li>
</ol>
2. Oddzielenie supernatantu tkankowego od komórek
<ol>
	<li>Odwirować homogenaty w probówkach o pojemności 15 ml i 50 ml przez 15 minut przy 600 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować SN z probówki o pojemności 15 ml do czystej probówki i tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten supernatant = guz pierwotny, NANT lub SN w tkance prawidłowej (objętość końcowa 2,5 ml) jest następnie klarowany i podawany przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz (patrz poniżej).</li>
	<li>Odlać sklarowany osad z probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić oba granulki komórkowe w końcowej objętości 1 ml pożywki. Krótko mówiąc, najpierw delikatnie rozbij osad komórkowy w obu probówkach (stukając rurką o twardą powierzchnię). Zawiesić luźno komórkowy osad w 50 ml z 500 μl pożywki i przenieść tę zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml w celu ponownego zaparcia drugiej osadki. Powtórz ten krok raz z drugimi 500 μl pożywki, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek.</li>
	<li>Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:1) i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W tym momencie część zawiesiny komórkowej można również przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny wielkości komórki, ziarnistości i, w razie potrzeby, ograniczonej liczby markerów subpopulacji w celu bardziej precyzyjnej oceny względnego rozmieszczenia komórek w homogenacie przed obszerną analizą lub eksperymentami. Wszystkie analizy metodą cytometrii przepływowej obejmują znakowanie CD45 w celu normalizacji subpopulacji.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki z guza, NANT lub normalnej tkanki są teraz gotowe do dalszego oczyszczania lub analizy. Te dodatkowe kroki najlepiej wykonywać w tym samym dniu co zabieg. 
	UWAGA: Do analizy metodą cytometrii przepływowej, ale nie do sortowania komórek, resztki krwinek czerwonych powinny być poddane lizie po znakowaniu przeciwciałami poprzez dodanie 0,4 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do osadu komórkowego, natychmiastowe wirowanie przez 1 sekundę i inkubację przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) przed analizą.</li>
</ol>
3. Klarowanie supernatantu tkankowego
<ol>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml z tkanką SN o stężeniu 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie dotykając ani nie naruszając osadu. Przenieść do czystej probówki (lub probówek) w zależności od pożądanej liczby i objętości podwielokrotności.</li>
	<li>Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
4. Krew pacjenta
<ol>
	<li>Pobrać próbkę krwi od każdego pacjenta jako kontrolę przez nakłucie żyły do heparynizowanych probówek dzień przed operacją. Odwirować krew o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C z wyłączonym hamulcem w celu uzyskania osocza i kożuchowego płaszcza.</li>
	<li>Usunąć osocze i sklarować je przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Podwielokrotność i przechowywać osocze w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Rozcieńczyć kożuszek w podłożu</li>
	<li>Oddzielić komórki jednojądrzaste za pomocą standardowego wirowania gradientu ficoll-hypaque przed natychmiastową analizą, izolacją subpopulacji, ekstrakcją DNA/RNA/białka lub kriokonserwacją.</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Oznaczyć ogniwa zgodnie z instrukcjami producenta w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Lizować czerwone krwinki w zawiesinach komórkowych z fragmentów tkanek po znakowaniu przeciwciałami, dodając 0,4 ml buforu do lizy komórek do osadu komórkowego.</li>
	<li>Wirować natychmiast przez 1 sekundę i inkubować co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przepuść oznakowane komórki w cytometrze przepływowym w celu uzyskania danych bez mycia.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%27elite+hacker%27%3A+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Quezada, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+tumor+infiltration+by+activated+T+effector+cells+restricts+the+therapeutic+activity+of+regulatory+T+cell+depletion+against+established+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma.</a> J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>McCauley, H. A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li>
<li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+B+cell+characterization+in+blood%2C+lymph+nodes%2C+and+tumors+from+patients+with+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+%3A+Density%2C+Composition+And+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

W badaniu tym opisano zoptymalizowaną metodę szybkiego przygotowania normalnych i złośliwych homogenatów tkanki piersi bez trawienia enzymatycznego do późniejszego sortowania komórek, ekstrakcji, kriokonserwacji i / lub analizy fenotypowej subpopulacji CD45 + . Celem tego eksperymentalnego podejścia jest uzyskanie obrazów TIL, które dokładnie odzwierciedlają ich stan in vivo i porównanie ich z normalnymi tkankami przy minimalnej manipulacji tkankami prosto z sali operacyjnej. Do tej pory nasze laborat...

Mikrośrodowisko guza składa się z różnych typów komórek, a liczne badania pokazują, że każda z nich odgrywa odrębną i ważną rolę w procesie nowotworzenia1,2. Należą do nich między innymi naciekające komórki odpornościowe, komórki zrębu, komórki śródbłonka i komórki nowotworowe3. Badania ex vivo limfocytów naciekających nowotwór (TIL; Komórki CD45 + lub leukocyty, które są głównie limfocytami w nowotworach piersi) ze świeżych próbek tkanek ludzkich jest utrudnione ze względu na ich niską częstotliwość, małe rozmiary próbek często dostępne do badań i możliwość utraty żywotności podczas ekstrakcji. Ponieważ komórki odpornościowe naciekające guzy są zwykle obecne jako pasażerowie, a nie stali mieszkańcy, są one łatwiejsze do uwolnienia z macierzy tkankowej.
Dysocjacja tkanki nowotworowej przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej jest technicznie trudna i tradycyjnie była wykonywana przy użyciu kombinacji mechanicznych i enzymatycznych etapów w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek4-8. Takie podejście obejmuje długie okresy inkubacji i wiąże się ze znacznym zmniejszeniem żywotności komórek, a także utratą receptorów powierzchniowych komórek w wyniku rozszczepienia enzymatycznego. Wysokiej jakości badania cytometrii przepływowej charakteryzujące TIL w mikrośrodowisku guza, a także czyste oczyszczanie subpopulacji CD45 + za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek pokrytych przeciwciałami są trudniejsze do osiągnięcia z trawionej enzymatycznie tkanki nowotworowej. Ponadto supernatant (SN) z otrzymanego homogenatu guza nie nadaje się do dalszej analizy, w tym do oznaczania ilościowego wydzielanych białek (cytokin, chemokin, immunoglobulin lub antygenów nowotworowych) lub eksperymentalnego traktowania normalnych komórek, ze względu na możliwość degradacji białek w trawieniach enzymatycznych.
W naszych poszukiwaniach metody przygotowania jednokomórkowych homogenatów z tkanek piersi [w tym z guza, niesąsiadujących tkanek nienowotworowych (NANT) i normalnych (z redukcji sutka) bez trawienia enzymatycznego, przetestowaliśmy różne techniki mechanicznej homogenizacji. Homogenaty przygotowane przy użyciu dysocjatora mechanicznego charakteryzowały się zwiększoną żywotnością komórek (2-krotnie) i całkowitym odzyskiem komórek (2-krotnie) przy zachowaniu ekspresji receptorów powierzchniowych. Trawienie enzymatyczne pozostałego nierozpuszczalnego materiału nie pozwoliło odzyskać dodatkowych komórek CD45 +, co sugeruje, że wszystkie zostały uwolnione w początkowym homogenacie. Tak więc to szybkie i proste podejście pozwala zarówno na jakościową, jak i ilościową ocenę subpopulacji CD45 + obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że SN z początkowego homogenatu (SN tkanki pierwotnej) może być pobierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>Dysocjator GentleMacs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine jest w pewnym sensie odpowiednikiem</td></tr><tr><td>Wirówka 5810</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td>lub inna standardowa wirówka stołowa</td></tr><tr><td>Wirówka 5417</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td>lub inna standardowa mikrowirówka</td></tr><tr><td>Esco Klasa II A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ESCO globalny</td><td></td><td>lub inny standardowy kaptur</td></tr> <tr><td>BSL2Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>lub inny mikroskop kompatybilny z hememytometrem</td></tr><tr><td>B&uuml; rker Chamber</td><td>Marienfield&nbsp;</td><td>640210</td><td>lub inny standardowy hemacytometr</td></tr><tr><td>Navios Cytometr przepływowy Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>lub inny cytometr przepływowy (zalecany 8-10 kolorów)</td></tr> <tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine używa</td></tr><tr><td>naczynia do hodowli komórkowych</td> Filcon <td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>lub innych niepirogennych wyrobów z tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>lub standardowy sterylny skalpel jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 &micro; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>lub inne niepirogenne tworzywa sztuczne</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>BD FACS Tubka 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>Sterylny Pasteur Pipeta 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>lub inne niepirogenne wyroby z tworzywa sztucznego</td></tr><tr><td>Probówka do mikrofuge 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>lub inne niepirogenne tworzywa sztuczne</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>zalecane podłoże bez surowicy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>standard fizjologiczny PBS</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>lub inna życiowa plama</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>do eksperymentów cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Możliwa do ustalenia żywotność Barwnik eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>do eksperymentów cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>anty-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>do eksperymentów cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>anty-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>do eksperymentów</td></tr> <tr><td>cytometrii przepływowejanty-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>anty-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>anty-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>anty-CD8</td><td>PerCP BD Biosciences</td><td>345774</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>anty-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>anty-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>do eksperymentów z cytometrią przepływową</td></tr></tbody></table>

prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Zdolność komórek nowotworowych do unikania układu odpornościowego, charakteryzująca się ucieczką guza zarówno od wrodzonej, jak i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, jest obecnie akceptowana jako ważna cecha charakterystyczna raka. Nasze badania nad rakiem piersi koncentrują się na aktywnej roli, jaką limfocyty naciekające guz odgrywają w progresji guza i wynikach leczenia. W tym celu opracowaliśmy metodologię szybkiej izolacji nienaruszonych komórek limfoidalnych z normalnych i nieprawidłowych tkanek w celu oceny ich stanu bezpośredniego do ich rodzimego stanu. Homogenaty przygotowane przy użyciu dysocjatora mechanicznego wykazują zarówno zwiększoną żywotność, jak i regenerację komórek, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji receptorów powierzchniowych w porównaniu z tkankami trawionymi enzymatami. Co więcej, trawienie enzymatyczne pozostałego nierozpuszczalnego materiału nie pozwoliło odzyskać dodatkowych komórek CD45 +, co wskazuje, że pomiary ilościowe i jakościowe w pierwotnym homogenacie prawdopodobnie rzeczywiście odzwierciedlają infiltrujące subpopulacje we fragmencie tkanki. Komórki limfoidalne w tych homogenatach można łatwo scharakteryzować za pomocą podejścia immunologicznego (fenotyp, proliferacja itp.) lub molekularnego (DNA, RNA i/lub białko). Komórki CD45+ mogą być również wykorzystywane do oczyszczania subpopulacji, ekspansji in vitro lub krioprezerwacji. Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że pierwotny supernatant tkankowy z homogenatów może być wykorzystany do scharakteryzowania i porównania cytokin, chemokin, immunoglobulin i antygenów obecnych w tkankach prawidłowych i złośliwych. Protokół ten działa bardzo dobrze w przypadku ludzkich tkanek piersi i powinien mieć zastosowanie do szerokiej gamy normalnych i nieprawidłowych tkanek.

Trawienie enzymatyczne fragmentów tkanek z użyciem komercyjnie dostępnych roztworów do dysocjacji tkanek lub różnych laboratoryjnych mieszanin kolagenazy, DNazy i/lub inhibitorów hialuronianazy powoduje odszczepienie szerokiej gamy receptorów z powierzchni komórek. W naszych badaniach, początkowo skoncentrowanych na limfocytach T CD4+ naciekających guzy piersi, szybko pojawił się poważny problem techniczny wynikający z odszczepiania receptorów CD4 z powierzchni komórek podczas stosowania standardowych protokoł...

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka homogenizacja fragmentów ludzkich tkanek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek bez użycia trawienia enzymatycznego, w celu przeprowadzenia analiz jakościowych i ilościowych oraz izolacji specyficznych subpopulacji limfocytów. Osiąga się to najpierw poprzez pocięcie fragmentów tkanki na małe kawałki za pomocą sterylnego skalpela. Następnie zawiesinę tkankową przenosi się do probówki do dysocjacji mechanicznej, w której fragmenty są dalej homogenizowane do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie komórki są zbierane przez wirowanie do dalszych analiz. W końcowym etapie można wykorzystać cytometrię przepływową do analizy naciekających limfocytów oraz ich subpopulacji. Moje laboratorium opracowało tę technikę, ponieważ poszukiwaliśmy sposobu na obrazowanie limfocytów naciekających guz bez znaczącego wpływania na ich stan natywny.Poszukiwaliśmy metody umożliwiającej szybką izolację komórek i ich analizę w stanie bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym. Technika ta została zastosowana w naszym laboratorium w ponad 300 przypadkach guzów piersi oraz tkanek prawidłowych; jest ona łatwa w obsłudze i może być stosowana w codziennej praktyce. Może służyć do badania markerów prognostycznych, odpowiedzi na leczenie oraz długoterminowych wyników klinicznych.Technikę tę zaprezentuje dziś John Nicola Loic, technik w moim laboratorium. Należy rozpocząć od zważenia próbki tkanki, a następnie zmierzyć długość, szerokość i wysokość tkanki. Następnie fragment tkanki należy przenieść do małej szalki Petriego zawierającej 1 ml odpowiedniego, chemicznie zdefiniowanego bezserwatkowego medium do hodowli komórek krwiotwórczych i za pomocą sterylnego skalpela pociąć próbki na małe kawałki o wymiarach od 1 do 2 mm².Następnie przenieś zawartość szalki do probówki C do dysocjacji mechanicznej, a szalkę i skalpel wypłucz dwiema mililitrami pożywki. Przelej płuczkę do probówki C, a następnie uruchom program dysocjacji mechanicznej 0,01 dwa razy z rzędu, aby delikatnie zhomogenizować fragmenty tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Po drugim cyklu przlej homogenat przez sito komórkowe 40 µm do probówki stożkowej 50 ml.Następnie za pomocą tej samej pipety, której użyto do płukania szalki Petriego, przenieś pozostały w probówce C płyn do sita komórkowego. Dalej, używając mikropipety o objętości 1 ml, przenieś przefiltrowany płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wypłucz probówkę C dodatkowymi 3 ml pożywki. Przenieś ten płukanie przez sito komórkowe do probówki o pojemności 50 ml.Następnie delikatnie przesuń niehomogenizowaną tkankę po sitku za pomocą czystego końcówki o pojemności 1 ml, aby wycisnąć maksymalną ilość resztkowej cieczy uwięzionej w tkance do probówki 50 ml. Teraz umieść sitko do komórek odwrócone dnem do góry na oryginalnej probówce C i wypłucz sitko kolejnymi 3 ml pożywki, tak aby niehomogenizowana tkanka spadła z powrotem do probówki C. Ponownie homogenizuj tkankę przez kolejne dwa cykle, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie przelej ten drugi homogenat przez sitko do komórek.Ponownie wypłucz probówkę C kolejnymi trzema mililitrami pożywki. Następnie przefiltruj nadsącz przez sitko i wyciśnij pozostałą ciecz z tkanki, tak jak pokazano przed chwilą. Na tym etapie w probówce 15 mililitrów powinna znajdować się objętość około 2,5 mililitra zawiesiny pojedynczych komórek, a w probówce 50 mililitrów powinno być około dziewięciu mililitrów.Aby oddzielić nadsącz tkankowy od komórek, najpierw odwiruj obie probówki z homogenatem przez 15 minut przy 600 Gs w temperaturze pokojowej, przelej nadsącz z probówki 15 ml do probówki 1,5 ml, umieszczając ją w temperaturze 4 °C, a nadsącz z probówki 50 ml odrzuć. Następnie delikatnie opukaj każdą probówkę o twardą powierzchnię, aby rozbić osady komórkowe. Resuspenduj rozluźniony osad komórkowy w probówce 50 ml w 500 µL medium, a następnie przenieś komórki do probówki 15 ml, aby resuspendować drugi osad.Następnie przepłucz probówkę 50 ml kolejnymi 500 µl medium i przenieś płuczkę do probówki 15 ml, aby zmaksymalizować odzysk komórek. Po policzeniu liczby żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, odwirowuj zawiesinę komórkową. Na koniec odwirowuj zarezerwowany nadsącz tkankowy.Następnie ostrożnie przenieś nadsącz do co najmniej jednej czystej probówki, nie dotykając i nie naruszając osadu, a następnie przechowuj go w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz. Na tych wykresach przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej homogenatów rozdzielonych komórek nowotworowych po znakowaniu swoistymi przeciwciałami przeciwko leukocytom i markerom komórek nabłonkowych. Niniejszy protokół nie wpływa znacząco na żywotność komórek CD 45 dodatnich.Następuje jednak znaczna utrata żywotnych komórek EPAM-dodatnich. Mimo to żywotne subpopulacje EPAM-dodatnie oraz CD 45-dodatnie można wyodrębnić na podstawie ich wielkości i struktury na duże komórki nowotworowe nabłonkowe, małe komórki nabłonkowe oraz duże i małe komórki CD 45-dodatnie. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej głównych subpopulacji naciekających nowotwór, z limfocytami wyodrębnionymi na podstawie żywotności komórek CD 45-dodatnich.Na koniec ekspresję cytokin lub całkowitą ilość immunoglobulin obecnych w supernatancie z raka piersi można porównać z supernatanten z prawidłowej tkanki piersi, co pozwala wykryć – jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie – wzrosty obu typów białek związanych z tkanką nowotworową. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i w czystych warunkach oraz odzyskiwać maksymalną ilość materiału na każdym etapie procedury, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy końcowej.

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych ludzkich tkanek do analizy infiltrujących limfocytów

Ten film opisuje nieenzymatyczną dysocjację świeżej tkanki ludzkiej w celu uzyskania żywotnych komórek. Technika ta służy do analizy jakościowej i ilościowej komórek CD45 dodatnich (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych prawidłowych i złośliwych tkankach ludzkich.

Dysocjacja mechaniczna: metoda uzyskiwania żywotnych komórek z tkanki

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.

Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich do analizy naciekających limfocytów CD45+. Technika zachowuje naturalny stan komórek i umożliwia cytometrię przepływową.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Przeglądaj więcej filmów